Fare Akut Beyin Dilimleri Neuroblast Göç vivo Doğum Sonrası Elektroporasyonla ve Time-lapse Görüntüleme

* These authors contributed equally
Published 11/25/2013
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Neuroblast göç postnatal nörojenezindeki temel bir olaydır. Biz akut beyin dilimleri zaman atlamalı görüntüleme kullanarak in vivo doğum sonrası elektroporasyon ve onların göç sonraki görselleştirme tarafından neuroblasts verimli etiketleme için bir protokol açıklar. Biz video izleme tarafından neuroblast dinamiklerinin kantitatif analiz için bir açıklama içerir.

Cite this Article

Copy Citation

Sonego, M., Zhou, Y., Oudin, M. J., Doherty, P., Lalli, G. In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices. J. Vis. Exp. (81), e50905, doi:10.3791/50905 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Subventricular bölgesi (SVZ) doğum sonrası beyindeki ana nörojenik niş biridir. Burada, sinir atalarıdır çoğalır ve koku ampul (OB) doğru rostral göçmen akışı (RMS) birlikte hareket edebilmek nöroblast doğuran. Bu uzun mesafe göç OB yenidoğan nöronların sonraki olgunlaşması için gereklidir, fakat bu süreci düzenleyen moleküler mekanizmalar hala belirsiz olmasıdır. Neuroblast hareketliliğini kontrol sinyal yollarını araştıran nörojenezindeki temel bir adım anlamak değil, aynı zamanda yaralanma, inme veya dejenerasyon etkilenen beyin sitelerini hedeflemek için bu neuroblasts yeteneği verilmiş, tedavi rejeneratif potansiyele sahip olabilir sadece.

Bu yazıda; in vivo sonrası elektroporasyon ve fare RMS neuroblast göç sonraki zaman atlamalı görüntüleme için ayrıntılı bir protokol açıklar. Doğum sonrası elektroporasyon verimli SVZ'una dede transfect olabilirsırayla RMS boyunca göç neuroblasts oluşturmak hücreleri. Akut beyin dilim kültürleri disk time-lapse mikroskopi iplik konfokal kullanarak, neuroblast göç yakından in vivo durumu andıran bir ortamda izlenebilir. Ayrıca, neuroblast hareketliliği izlenen ve kantitatif analiz edilebilir. Örnek olarak, biz RMS boyunca göç neuroblasts etiket ve görselleştirmek için bir GFP-ifade plazmid in vivo doğum sonrası elektroporasyon nasıl kullanılacağını açıklar. LoxP sistemi vasıtası ile koşullu knockout farelerde shRNA veya CRE rekombinaz-sentezleyen plasmidlerin Elektroporasyon de ilginç genlerin hedeflenmesi için kullanılabilir. Akut beyin dilim kültürlerin Farmakolojik manipulasyon neuroblast göç farklı sinyal moleküllerin rolünü araştırmak için yapılabilir. Time-lapse görüntüleme ile vivo elektroporasyon bağlanmasıyla, biz neuroblast hareketliliği kontrol eden moleküler mekanizmaları anlamak ve geliştirmek için katkıda bulunmayı umuyoruzRomanın Ment beyin tamir teşvik yaklaşır.

Introduction

Memeli beyninde, yeni nöron (nöron) 'nin üretimi başlıca iki bölgede doğumdan sonra ortaya çıkar, hipokampus 1 kıvrımlarının lateral ventriküllere ve subgranular bölgesinin subventricular bölgesi (SVZ). Son yıllarda toplanan önemli kanıtlar hipokampus ve koku alma ampul hafıza fonksiyonları 1-3 doğum sonrası nöron için kritik bir rol destekler. Önemlisi, doğum sonrası nörogenezis aynı zamanda terapötik çünkü dejeneratif nörolojik bozuklukları ile ilişkisi potansiyelini ve beyinde 4-6 yaralı sitelere göç neuroblasts yeteneğini tutar.

Subventricular bölgesi (SVZ) son zamanlarda önemli bir nörojenik niş olarak ortaya çıkmıştır. SVZ'una türetilmiş Nöroblastlar bu doğum sonrası beyin 1,7,8 en uzun göç süreci yapma, rostral göçmen akışı (RMS) aracılığıyla koku ampul (OB) doğru göç ederler. Memeli SVZ / RMS / OB sistemi haline gelmiştirBöyle çoğalması, göç ve farklılaşma 1,8 nörogenezin farklı adımlar, incelemek için yararlı bir model. Birçok büyüme faktörleri ve hücre dışı ipuçları RMS boyunca SVZ'una nörogenezi ve göç düzenleyen, ancak hücre içi moleküler mekanizmalar tam olarak uzak olmaktan 1,9 anlaşılamamıştır. RMS boyunca doğru göç yenidoğan nöronların 10 sonradan olgunlaşması için çok önemlidir. Ayrıca, bazı çalışmalar SVZ'una türetilmiş Nöroblastlar beyin hasarı sitelere 4-6,11-13 için RMS dışına göç olduğunu göstermiştir. Bu durumda, sinyal düzenleyici mekanizmalar neuroblast göç soruşturma nöron anlamak için sadece temel hem de potansiyel terapötik uygulamalar içindir.

Burada, in vivo doğum sonrası elektroporasyon ile SVZ'una sinir atalarıdır etiket ve time-lapse dönen disk konfokal microsco kullanarak akut beyin dilim kültürlerde RMS boyunca onların göç izlemek için ayrıntılı bir protokol açıklarpy. Elektroporasyon yaygın embriyonik yetişkin evrelerinde 14-18 gelişimsel çalışmalarında kullanılmaktadır. Bu SVZ'una sinir atalarıdır hedef ve işlemek için güçlü bir araçtır ve transgenik modeller 1,15,19,20 viral vektörlerin veya kuşak stereotaktik enjeksiyonu için daha ucuz ve çok daha hızlı bir alternatif temsil eder. Bu ameliyat gerekir ve yüksek sağkalım oranlarına sahip değildir nispeten basit bir işlemdir. ShRNA veya loxP sistemi ilgi genlerin hedeflenmesi ya da SVZ progenitörlerinin kalıcı etiketleme elde etmek, böylece yetişkin nöron çalışmalar 21,22 için yararlı bir araç temsil kullanılabilir kullanılarak fare Genetik modellerde CRE rekombinaz-sentezleyen plasmidlerin Elektroporasyon.

Sağlam bir beyin görüntüleme RMS neuroblast göç nedeniyle hala geçerli teknik kısıtlamalar nedeniyle zordur. Ancak, bu süreç uygun bir Sist sağlamak akut beyin dilimleri, konfokal dönen disk time-lapse mikroskopi kullanılarak izlenebilirem yakından farmakolojik manipülasyon 23,24 için de müsait in vivo durum benzer. Time-lapse görüntüleme ile vivo doğum sonrası elektroporasyon Kavrama neuroblast hareketliliğini kontrol moleküler mekanizmaların anlaşılmasını kolaylaştırmak ve beyin tamir teşvik etmek için yeni yaklaşımların gelişmesine katkıda bulunacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu prosedür, İngiltere İçişleri Bakanlığı Yönetmeliği (Hayvan Bilimsel Usul Yasası, 1986) ile uyumludur. Bilim adamları kurulan ve kendi kurumsal ve ulusal hayvan düzenleyici kuruluşlar tarafından onaylanan yönergeleri takip etmelidir.

1.. Doğum Sonrası Elektroporasyon

1.1. Cam kapillerleri, DNA Çözüm ve Electroporator hazırlanması

  1. DNA enjeksiyon için çekti cam kılcal damarları (0.86 mm: 1,5 mm, ID OD) hazırlayın. (Sutter P-97 kılcal çektirmesi için Gösterge ayarları şunlardır: Isı 283; 50 çekin, Velocity 90, gün 50). Yaklaşık 2 ul bir hacme karşılık gelen kılcal bir iz yapın.
  2. 850 msn aralıklarla (100 V, 50 milisaniye ON nabız, 850 msn'den, nabız 5 OFF darbe) ile, 100 V, 5 kare bakliyat, 50 msn / darbe elektroporatörü voltajını ayarlayın.
  3. 1-2 mg / ml bir son konsantrasyona kadar, yüksek saflıkta (OD> 1,80 260/280) seyreltin endotoksin içermeyen plazmid DNAEndotoksin ile Tris-EDTA tampon maddesi ya da PBS boşaltın. Bu, DNA çözeltisi (başarılı bir şekilde enjekte edildiğinde boya ventrikülde yaymalıdır)% 0.1 hızlı yeşil ilave edilmesi tavsiye edilmektedir.
  4. , 5-7 mm elektrotlar hazırlayın elektrot jeli ve ısıtma pedi ısınmak.

1.2. Elektroporasyon

  1. Kafes bir doğum sonrası gün 2 yavru fare çıkarın ve (~ 0.6 L / dk 'lık bir akış hızında) izofluran teneffüs bunu anestezi.
  2. Yaklaşık 1 dakika sonra, ayak tutam yanıt kullanarak anesthetization durumunu belirlemek. Herhangi bir hareket olursa, intraventriküler enjeksiyonu ile devam edin.
  3. Kılcal bağlı bir aspiratör tüpü kullanılarak DNA 1-2 ul kılcal iğne yerleştirin.
  4. Bir soğuk ışık kaynağı altında, başparmak ve daha az dominant elin işaret parmağı arasında yavru kafa tutun. Biraz doğru enjeksiyon noktası tanınmasına yardımcı olmak için kafasına cilt geri çekin.
  5. Göz ve t arasında sanal bir çizgi dikkateO dönüm lambda (Şekil 1A) kraniometrik. Lambda (hattı orta noktasından yaklaşık 1 mm) 15 bu hattın uzunluğunun yaklaşık üçte bir kılcal iğne takın. Beyinde derin penetrasyonu önlemek için emin olun, derin 2 mm hakkında kılcal yerleştirin.
  6. Ağız yoluyla yavaş yavaş üfleyerek plazmid enjekte edilir (kılcal bağlı bir şırınga da kullanılabilir). Bu başarılı plazmid enjeksiyonu önlemek gibi bu işlem sırasında, parmaklarınız beyin üzerinde çok fazla baskı uygulamadan olmadığından emin olun.
  7. DNA çözeltisinin bir minimum miktarda kılcal bırakıldığında enjeksiyon durdurun. Bu, intrakraniyal basınç artışı zararlı önlemek için en az 1 ul enjekte etmek için tavsiye edilir.
  8. Coat hem jel ile elektrotlar ve DNA (Şekil 1A) enjekte edildi yarımkürenin yan tarafında olumlu tarafı ile koyun. Için rostral SVZ'unda içine DNA eklenmesi için, yer elektrotlar biraz rostralenjeksiyon noktası. Elektrot konumu değişen SVZ'unda 22,25 farklı alanlarda elektroporasyon bölgesel özgüllük elde edebilirsiniz.
  9. Darbe Ayak pedalına basarak geçerli transferini başlatmak. Elektroporasyon tamamlandığında, (düşük voltaj değerleri zayıf elektroporasyon verimliliği ile ilişkili beri voltaj değerleri, 90 V altında olmamalıdır) elektroporatör ekranda gerilimi kontrol edin.
  10. Birkaç dakika ısıtma pedi üzerinde oksijen altında yavru canlandırdığı ve uzak anneden yerleştirerek, kafese geri. Anne yavru alır ve çöp geri kalanı ile tekrar bir araya emin olun. Elektroporasyondan sonra, bir sonraki adımdan önce 4-7 gün boyunca anneleri ile yavrular bırakın.

2. Akut Beyin Dilim Kültürler hazırlanması

2.1. Çözümleri ve Araçları hazırlanması

  1. Aşağıdaki çözeltiler (bu kesme ve görüntüleme için yüksek glikoz DMEM kullanmak da mümkündür gerekmektedir17):
    Diseksiyon Medium (500 mi)
    Gey Dengeli medya - 500ml
    % 45 Glukoz - 5ml
    Film Medium (10 mi)
    % 45 Glukoz - 0.110 mi
    HEPES 1 M - 0,100 mi
    Pen / Strep - 0,100 mi
    FCS - 0.500 ml
    B27 - 0.100 mi
    Glutamine - 0.200 mi
    Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (fenol kırmızı içermeyen) - 8.89 mi
  2. 37 ° C'de ısıtın kadar film orta
  3. Sıra Millicell 37 ° C /% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde film orta ve yer 1 ml içeren, 35 mm cam alt kültürü çanağı içine yerleştirir.
  4. Vibratome aksesuarları (tornavida, odasını, jilet, yapıştırıcı) hazırlayın.
  5. Makas, küçük spatula, düz forseps: diseksiyon araçları hazırlayın.
  6. Dilimleri taşıma araçları hazırlayın: küçük fırça veya yumuşak bir aşılama döngü (boyut: 10 ul), plastik Pasteur pipetler, bir buz kutusu ve birkaç 6 cm plastik tabaklar.
  7. Diseksiyon orta ön soğutma2-4 ° C'de

2.2. Beyin Dilimleri hazırlanması

  1. Önceden ısıtılmış diseksiyon orta ile 6 cm çanak doldurun ve (taze kesilmiş dilimleri tutmaya) buz üzerine yerleştirin.
  2. Servikal dislokasyon ardından, yavru fare başını kesmek için makas kullanın. , Bir neşter ile kafa derisi kaldırmak beyinciğe OB orta sagital sütür boyunca kafatası kesilmiş ve hafifçe forseps kullanarak kranial kapaklarını çıkarın. Tüm beyin maruz olduğundan emin olun ve dikkatli bir dokusuna zarar vermemek için özel dikkat, bir spatula kullanarak teşrih. Diseksiyon dikkatli yapılması gereken, ancak aynı zamanda çok hızlı bir şekilde (eğer mümkünse bir dakikadan daha az). Uyuşturucu / gaz anestezik terminal anestezi nöroblast ve hayvan kurban aşağıdaki nispeten hızlı bir şekilde yansıması gereken beyin dilim kültürlerin sağlıklı devletin göçmen özelliklerini etkileyebilir çünkü Servikal dislokasyon bizim tercih edilen bir yöntemdir.
  3. Bir raz ile beyin Hemisectya da bıçak (Şekil 2). Uninjected Yarımküreyi atın veya diğer deneyler için kullanın.
  4. Vibratome tutucuya bant küçük bir parça koyun ve bunun üstüne beyin yarımkürede (Şekil 2) eklemek için tutkal gerekli minimum miktarda kullanın. Bu, tekrarlanan uygulamalara tutkal tutucu yüzeyinin hasar görmesini önler.
  5. Tutkal birkaç saniye kurumasını sağlayın.
  6. Önceden ısıtılmış diseksiyon çözümü ile dolu vibratome tepsisine tutucu yerleştirin. Bıçağın doğru koku ampul (Şekil 2) yöneltin.
  7. Uygun ayarları kullanarak beyin yarımkürede kesme başlar. Aşağıdaki parametreler önerilir: dilim kalınlığı 300 mikron; hız ~ 3-5; frekans ~ 9. Yüksek frekans ve düşük hızlı dilim zarar görmesini önlemek için önerilmektedir.
  8. Küçük bir fırça veya yumuşak bir aşılama döngü kullanarak dilimleri toplayın. Sadece görünür OB (genellikle 2-3 dilim / beyin) ile dilimleri tutun. Tipik olarak, RMS çoğu içeren dilim can alt yüzeyinden ~ 300 um bulunabilir.
  9. (Her iki tarafta floresan kontrol etmek için onları çevirmek için emin) GFP sinyali için standart bir floresan mikroskop altında dilimleri kontrol edin ve RMS çoğu boyunca parlak floresan gösteren olanları seçin.

2.3. Kültürleme Beyin Dilimleri

  1. Bir hücre kültürü kaputu, beyin dilim en kaudal üçte kesip ve ince düz bir cımbız veya bir mikrodisseksiyon neşter kullanarak herhangi bir tutkal izlerini kaldırmak.
  2. İncelikli bir plastik Pasteur pipet kullanarak dilim aspire (daha büyük bir açıklık oluşturmak için pipet ucu kesilmiş, bu dilim zarar görmesini önleyecek) ve insert önceden ısıtılmış Millicell ortasına yerleştirin.
  3. En parlak flüoresan sinyali ile yan Millicell (bir inverted mikroskop ile görüntüleme için) girişi ile temas halinde yerleştirilir emin olun.
  4. Bir pipet ile insertin üst fazla diseksiyon çözüm çıkarın.
  5. Için dilim kültürleri bırakıngörüntüleme önce en az 1 saat boyunca 37 ° C /% 5 CO2 inkübatörü içinde yerleşirler.

3. Neuroblast Göç Time-lapse Görüntüleme

  1. En az 2 saat görüntüleme önce, sabit ayarlanmış Hamamatsu C10600-10B (ORCA-R2), dijital CCD kamera soğutmalı Perkin Elmer UltraViewVoX konfokal dönen disk sistemi, ters Nikon Ti-E mikroskop, ve ısıtma sistemi (Solent Scientific) açın 37 ° C'de sıcaklığı
  2. Volocity yazılım Toplama modülü açın ve "VIZ" butonuna tıklayın ve görüntüleme için lazer (lar) ı seçin.
  3. Beyin dilim hazırlık 2 saat içinde, mikroskop sahnede görüntüleme odasında beyin dilim içeren cam alt çanak yerleştirin.
  4. Yansıması olacak dilimin alanı (örneğin, sadece enjeksiyon yerinde sonra RMS ilk inen kısmı veya ELBO seçmek ve odaklanmak için uygun floresan ışığı altında Nikon CFI Süper Planı Fluor ELWD 20X/0.45 objektif kullanınRMS bölge w, ya da sadece Nöroblastlar OB girmeden önce dirsek sonra).
  5. Aşağıdaki eylemlerden ile time-lapse görüntüleme ayarlayın:
    1. Mikroskop, numunenin lazer tarama izin L100 butonuna tıklayın.
    2. Volocity, uygun lazer (GFP örneğin 488 nm lazer) seçerek ultraview Lazer Changer açın.
    3. Floresan sinyal yoğunluğuna bağlı olarak pozlama süresini (genellikle 100-500 arasında msn) ve lazer yoğunluğu (genellikle% 20-30) ayarlayın.
    4. Hücre görselleştirme geliştirmek için görüntü dijital kazanç ayarlayın.
    5. Beyin dilim içindeki görüntüye z-yığın aralığı (genellikle üzerinde 100-120 mikron aralık) seçin. (Bu, daha sonraki izleme analizi kolaylaştıracak) mümkün olduğu kadar örtüşen mümkün önlemek için bir izole edilmiş hücre uygun bir sayısı ile bir aralık seçin.
    6. Her z-yığın görüntü (genellikle 2-4 mikron) arasındaki boşluğu seçin.
    7. Zaman int seçinHer z-yığın yakalama (örneğin 3 dk) ve toplam görüntüleme süresi (örneğin 3 saat) arasında erval.
    8. Görüntüleme parametrelerinde değişiklikleri kaydetmek için "kaydet" ikonuna tıklayın.
    9. Görüntüleme başlamak için kayıt düğmesine basın.
  6. Kontrol ve deney numunelerinin Alternatif görüntüleme aynı gün boyunca (örneğin bir araç / ilaç tedavisi veya farklı elektroporasyona plazmid için).

4. Neuroblast Göç Analizi

  1. Volocity Kantitasyon modülünde, bir time-lapse deneyi tamamladıktan sonra oluşturulan istenen kitaplığı açın. Sol üst kutuya (Şekil 4A, adım 1) "Extended Odaklama" öğesini seçin.
  2. (Şekil 4A, adım 2) Ölçüm penceresini görüntülemek için "Ölçümler" sekmesine tıklayın.
  3. Görevlerin bir listesi ekranın sol alt köşesinde görünür. Drag "Track" ("Diğer" başlığı altında bulunan alt başlığıYukarıdaki uzay liste). Bu ekranın sol üst kısmında "İz" adlı yeni bir pencerenin açılması (Şekil 4A, adım 3) isteyecektir.
  4. Parça pencerede "Giriş" sekmesinde (Şekil 4A, adım 4) den "Puan" seçeneğini seçin.
  5. Nokta Aracı (Şekil 4A, adım 5) tıklayın.
  6. Hücre vücudun merkezi alanında fare ile tıklayarak göç neuroblast izleme başlatın ve zaman sukut son noktaya kadar hücre hareketlerini takip tutmak ulaşılır (3 hr-uzun film için örnek nokta sayısı 61 için) .
  7. Veri seçmek edinmek için Ölçüm Menüsü (Şekil 4B, 6-7 adım) dan "Ölçüm Item". Bir pencere ekranın merkezindeki görünür.
  8. Bu pencerede, "adı verilen yeni bir ölçüm öğe:" seçin ve (Şekil 4C, adım 8) bir ad yazın. PR önce "All zamannoktaları" seçeneğini seçmeyi unutmayınessing OK (Şekil 4C, adım 9). Bir ölçüm öğesi dosyası time-lapse dosyası altında görünecek ve kantitatif analiz için parametreleri (örneğin göç mesafe, hız, yer değiştirme ve yer değiştirme oranı) içerecektir.
  9. Bir pencerede (Şekil 4D, adım 10) olarak açmak için ölçüm öğe dosyasına çift tıklayın.
  10. , Analiz hücrelerin tek parça görselleştirmek "Display" seçeneği (Şekil 4D, adım 11) adlı "Paletli Point" seçin.
  11. Sağ Ölçüm Ürün dosyasını tıklayın ve ardından göç parametreleri analiz etmek Excel gibi programlarda ithal edilebilir bir metin dosyası olarak dışa aktarın.
  12. , Filme dönemde her bir hücresi tarafından yapılan ölçüm Öğe dosyasında "Display" seçenekleri "Nokta" veya "Nüfus" seçin ve (her parça benzersiz bir kimliği vardır) kimliği tıklayın ardışık çerçeve ve duraklar arasındaki hareketlerini ölçmek için. Devam ile sonuçlanan dosya İhracatadımda 4.10 açıklandığı gibi ing.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

SVZ türevi göç neuroblasts işaretlenmesi genellikle 4-8 gün başarılı bir elektroporasyon (Şekil 1 B) sonra, RMS boyunca gözlenebilir. Daha uzun süre noktaları da seçilebilir, ancak çoğu OB girmiş olacağından daha az hücre RMS bulunacaktır. Nöroblastomun yaklaşık 2-3 hafta sonra, elektroporasyon (gösterilmemiştir), OB olgun granül hücrelerin morfolojisi ve tipik özellikleri elde başlar. ~ 1 saat kültür işleminden sonra, elektroporasyona fare yavrularından Beyin dilimleri güvenilir bir şekilde 3-4 saat boyunca görüntülenebilir. Daha önce 23,26 bildirildiği gibi, Nöroblastlar kantitatif hücre izleme (Şekil 4) kullanılarak analiz olabilir ki, (Şekil 3 ve Video 1) karmaşık göç dinamikleri görüntüleyebilirsiniz.

Şekil 1
Şekil 1. Postnatal tal in vivo elektroporasyon. (A), bir doğum sonrası gün 2 fare yavru in vivo elektroporasyon şematik çizimi. Craniometrical dönüm lambda gözü bağlayan bir noktalı çizgi (kırmızı) kılcal yerleştirilmesi için bir konumsal marker olarak hizmet vermektedir. Enjeksiyon noktası yeşil bir nokta olarak belirtilir. Boutin ve diğerleri de tarif edildiği gibi Gri oval şekiller elektrot konumu gösterir. 15 (B) Sagital fare ön beyin dilim 5 gün bir GFP-ifade plazmidi elektroporasyon sonra GFP immunohistokimyasal. SVZ'una kaynaklı göç Nöroblastlar RMS boyunca görülebilir ve bazıları OB ulaşmaya başladı. Ctx: korteks; SVZ'una: subventricular bölge; RMS: rostral göçmen akışı; OB: koku alma ampul. Bar, 400 mikron. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

n "src =" / files/ftp_upload/50905/50905fig2.jpg "width =" 500px "/>

Şekil 2. Görüntüleme için akut beyin dilim kültürlerinin hazırlanması için şematik adım. (A) ve kuyruk intrahemisferik kesimler (noktalı çizgiler) bir taze kesilmiş beyin üzerinde gerçekleştirilir. (B) Elektroporasyona beynin bir yarı küresi bir vibratome tutucu üzerine yerleştirilmiştir. (C) Sagital dilimleri bir vibratome ile elde edildi ve standart bir floresan mikroskop altında gözlenir En iyi GFP sinyali. (D) Dilimler bir cam alt çanak içine yerleştirin ve (E), daha sonra dönen bir disk sistemi ters konfokal tarafından görüntüleme için bir çevre bölmesi içine yerleştirilir, bir Millicell üzerinde en az 1 saat boyunca kültürlenir. tıklayın Daha büyük resmi görmek için .

les/ftp_upload/50905/50905fig3.jpg "width =" 500px "/>
Şekil 3,. Neuroblasts göç Time-lapse görüntüleme. (A) 5 gün GFP-ifade plazmid elektroporasyon sonra bir fare sagital beyin dilim alınan neuroblasts İplik disk zaman atlamalı görüntüler. Görüntüler dışında 1 saat vardır. Her panel 4 mikron ayrı 28 ardışık görüntülerin bir z-yığın projeksiyon olduğunu. Ok uçları (sağ alt köşede resmin dışında bulunan) koku ampul doğru RMS boyunca göç eden 4 temsilci neuroblasts göstermektedir. (B) 4 neuroblasts time-lapse görüntüleme elde Temsilcisi göç yolları (A) vurgulanmıştır. (C) Grafik 2 temsilci nöroblast tarafından zamanla göç mesafeyi gösteren. Hücreler tipik sıçramalı hareketli davranışlar sergilerler. Bar, 70 mikron. resmi büyütmek için buraya tıklayın .


Şekil 4. Neuroblasts göç izleme analizi. Volocity yazılımı kullanılarak göç neuroblasts izlemek için kullanılır Sıralı adımlar. Ayrıntılı bilgi için metne bakınız. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Video 1:. Göç neuroblasts Time-lapse görüntüleme film GFP-ifade plazmid elektroporasyon 5 gün sonra elde edilen GFP etiketli göç nöroblast ile fare RMS bir bölümünü göstermektedir. OB sağ alt köşesine doğru görünümü dışında yer almaktadır. Konfokal z-yığınları bir 20x objektif bir 120 mikron aralığı içinde, 3 saat boyunca her 3 dakika ile dönen bir disk konfokal üzerinde alınmıştır. 10 kare / sn: hız oynamak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

RMS boyunca sinir atalarıdır Verimli göç fonksiyonel nöronlar 10 onların sonraki olgunlaşmasını sağlar. OB yönelik sinir atalarıdır Tanınmış akışları insan bebeklik görülebilir ve erken doğum sonrası insan beyin gelişiminde 27 önemli bir rol oynaması olasıdır. Ayrıca, bu hücreler, yaralanmaya ve nörodejenerasyon 4,28 etkilenen beyin siteleri hedef edebiliyoruz. Gerçek zamanlı neuroblast dinamikleri üzerinde gen manipülasyonu etkisini izlemek için güçlü olmak tamamen neuroblast hareketi güdümlü ve nasıl düzenlendiğini anlamak için gerekli olur.

Burada akut beyin dilim kültürlerin zaman atlamalı konfokal dönen disk mikroskobu ile in vivo doğum sonrası elektroporasyon bağlanmasıyla SVZ'una türetilen neuroblast göç izlemek için bir protokol tanımlanmıştır. Özellikle, sinir progenitörlerin göç SVZ'unda bir plazmid enc electroporating etiketlenebilir nasıl göstermiştirGFP oding. Çalışmanın amacı bağlı olarak, plazmidler çeşitli türleri (örneğin, diğer floresan proteinleri veya birlikte floresan proteinleri ile vahşi tip / ilgi, CRE rekombinaz veya shRNA mutant proteinleri eş ifade ekspresyonuna imkan veren) kullanılabilir. Önemle in vivo ifade için tavuk beta aktin CAG destekleyicisi 29 içeren plazmidler kullanmanızı öneririz. Elektroporasyona hayvanlardan elde edilen beyin dilimlerin görüntüleme de elektroporasyon 30 sonra daha uzun zaman noktalarında (7-10 gün) de OB nöral progenitörlerin radyal geçişi izlemek için kullanılabilir.

Uygulamada bir başlangıç ​​döneminden sonra, in vivo doğum sonrası elektroporasyon time-lapse görüntüleme ve immünoflüoresans analizi için hem sağlam neuroblast etiketleme sağlayan, çok güvenilir bir yöntem olur. Ayrıca, bu teknik, neuroblast özgü promoterler altında floresan proteinleri ifade eden transjenik fareler üzerinde temel bir avantaj sunarneuroblasts çoğunluğu etiketlenir burada. Nitekim, elektroporasyon böylece morfoloji ve göç dinamikleri ayrıntılı analizini sağlayan, neuroblasts seyrek etiketleme sağlar. Viral vektörler 31 stereotaktik teslim ile karşılaştırıldığında, bu teknik, daha hızlı, daha ucuz ve çok iyi bir fare yavrular tarafından iyi tolere edilir. En büyük dezavantajı, erken doğum sonrası aşamada sınırlı olmasından ibarettir. Viral teslimat yöntemleri 31 daha uygun hale sonraki zamanlarda, etiketleme verimlilikte önemli bir düşüş gözlenen beri Nitekim, şiddetle, doğum sonrası 2. gün fare yavrular kullanmanızı öneririz. Ancak, uygun bir fare genetik modelinde CRE-sentezleyen plasmidlerin elektroporasyon gibi stratejiler yetişkin nörogenezi incelemek için kullanılabilecektir 22 aşamaları.

İki foton, standart konfokal, dönen bir disk konfokal ve geniş alan floresan mikroskobu tüm neuroblast göç 17,23,24 görselleştirmek için kullanılabilir. Spinning Disk confokal mikroskopi iki-foton mikroskopi için ucuz bir alternatif olduğunu. Bu standart konfokal mikroskopi göre Photobleaching ve geniş alan floresan görüntüleme 31-33 daha yüksek çözünürlük sunan sınırlayıcı, çoklu z uçaklar aracılığıyla yüksek hızda 3D görüntüleme sağlar. Göç neuroblasts çoğunluğu açıkça görülebilir soma ve büyüme konisinin uçlu bir derece dinamik lider süreç var.

Başkaları 17 tarafından açıklandığı gibi, bir perfüzyon odaya sahip, doğrudan aynı beyin dilim üzerinde kontrol ve ilaç tedavilerinin etkilerini değerlendirmek için izin verecek. Bu önemli bir avantaj olarak kabul ederken, burada açıklanan protokolü oksijenli yapay beyin omurilik sıvısı (CSF) ya da yüksek glukoz DMEM 17,33 ile perfüze edilmesi için dilimleri, hücre canlılığı için kesinlikle gerekli olmadığını göstermektedir. Ayrıca, ters bir mikroskop kullanılarak su daldırma hedefleri ile donatılmış dik mikroskoplar ile karşılaştırıldığında daha kolay objektif düzenleme sağlar.Biz 20X uzun mesafe objektif kullanarak hücrelerin iyi bir sayı (dilim başına genellikle 25-40) takibini sağlayan ve iyi çözünürlüklü görüntüleri (Video 1) üreten, optimal bir uzlaşma olduğunu buldu. Otomatik izleme ancak her zaman güvenilir değildir, aynı zamanda mümkündür. Bu nedenle biz, görsel ve, gerekirse, otomatik veri izleme manuel doğrulama öneririz. Tek neuroblasts yüksek büyütme görüntüleme Nikon Fluor DIC M/N2 40X/0.80W objektif kullanılarak yapılabilir. MTrackJ ayrıca temel parça istatistikleri 33 ölçmek için kullanılabilir serbestçe kullanılabilir ImageJ eklentisi, ancak bazı ham veri toplama dosyaları bu yazılım ile uyumsuz olabilir ve bazı durumlarda zaman alıcı olabilir, analiz için uygun formatlara dönüştürülebilir gerekebilir . Volocity yazılım tarafından sağlanan görüntü toplama ve analiz modülleri kombinasyonu sağlar göçmen parametreleri olmasına kantitatif analiz, görüntü yakalama / işleme hemen bir geçişkolayca grafikler çeşitli görüntülendi olabilir ters (hız, deplasman, vb), (göçmen desenler / mesafe / yönselli / hız / kalıcılık / saatini gösteren, örneğin, vb hareketsiz geçirdi).

Nöroblastomun sabit fazlarda 34,35 (Şekil 3C) Göçmen, alternatif bir sıçramalı hareket gösterilecek. Sabit fazlar 4-10 dakika 32 arasında olabilir gerçeği ışığında, biz görüntüleri her 3 dakikada yakalayan minimum aydınlatma ve fotohasar ile neuroblasts göç takip etmek iyi bir uzlaşma olduğuna inanıyoruz. Biz nadiren 3 saatlik süre içinde, genellikle 30 dakika Immobile ortalama harcama, hücreler fazla 6 dakika durdurma görmek ve bulmak. Önceki haberlere göre, Nöroblastlar gözlemlerimiz ile anlaşma içinde olan, biraz 0.6 23,36 yukarıda, 60-100 mikron / saat ortalama hız ve ortalama bir kıvrımlı endeksi (göç mesafe üzerinde fiili deplasman) var. Typicmüttefiki, hücrelerin yaklaşık% 60 bir "göç" davranışı gösterir (örneğin 0,6-1 arasında bir kıvrımlı indeksi ile, neredeyse doğrusal bir göç yollarını takip) ve 20-25 (% 0-0,4 arasında bir kıvrımlı indeksi ile) "keşif" olarak Kalan ~ 20% (0.4-0.6 arasında bir kıvrımlı indeksi ile, göç ve keşif fazların) "orta" olarak sınıflandırılabilir iken.

Biz onların hareketliliğinde önemli değişiklikler gözlemleyerek olmadan fazla 3-4 saat neuroblasts filmi değil çünkü biz, bu tekniğin sınırlamalar hala var olduğunu biliyoruz. Filme süresi görüntüleme frekansı (ancak bu göç analizin doğruluğunu etkiler) yanı sıra görüntüleme için çevresel koşulları optimize etmek için bir perfüzyon odayı benimseyerek düşürerek artış olabilir. Ancak, protokol bir 3-4 saatlik görüntüleme dönemi kantitatif analiz için yeterli veri toplanmasını sağlayan uygun bir uzlaşma temsil dahil olmak üzere burada anlatılangöç. Nitekim, bugüne kadar biz uygun kontrollerin (SONEGO ve Zhou, yayınlanmamış sonuçlar) ile karşılaştırılmasından sonra protein overekspresyonu / baskılanması 37 veya farmakolojik manipülasyon yoluyla göç üretilen etkileri tespit başarmışlardır.

Sonuç olarak, beyin dilim kültürlerinin dönen disk görüntüleme ile doğum sonrası in vivo elektroporasyon kombinasyonu derinlemesine kontrol eden molekül mekanizmalarının incelenmesi için imkanı sunan yakından in vivo ortamı benzer bir sistem içinde neuroblast göç dinamiklerini izlemek için güçlü bir aracı temsil eder hareketliliğini neuroblast.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgements

MS ve YZ KCL ve KCL-Çin Doktora studentships tarafından desteklenmektedir. MO Bir Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi Doktora öğrencilikle tarafından finanse edildi. Biz Elektroporasyondan değerli tavsiye için Masaru Okabe ve Haziran-ichi Miyazaki PCX-EGFP plazmid ve Alain Chedotal ve Athena Ypsilanti teşekkür ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Millicell Millipore PICM0RG50
35 mm Glass bottom culture dish MatTek P35G-0-14-C
Gey's Balanced media Sigma G9779-500ML
Glucose, 45% Sigma G8769-100ML
HEPES Sigma H3375-25G
Pen/Strep GIBCO 15140-122
FCS GIBCO 10109-163
B27 supplement Invitrogen Life Technologies 17504044
L-Glutamine Invitrogen Life Technologies 25030-081
DMEM (phenol red-free) GIBCO 31053-028
Fast Green Sigma F7252-5G
Glass capillaries for injection Harvard Apparatus 30-0057
Aspirator tube Sigma A5177
Sutter P-97 capillary puller Sutter Instrument P-97
ECM830 Square Wave Electroporator Harvard Apparatus 45-0052
Platinum Tweezertrodes 7 mm Harvard Apparatus 45-0488
Footswitch Model 1250F Harvard Apparatus 45-0211
Gel for electrodes Cefar Compex 6602048
Isoflurane Merial AP/DRUGS/220/96
Vibratome Leica VT1000S
Glue Roti coll Roti coll 1
UltraViEW VoX spinning disk system Perkin Elmer Customized setup (multiple laser sources can be used) equipped with Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD camera
Volocity software Perkin Elmer Acquisition, Quantitation, Visualization Modules
Environmental chamber for microscopy Solent Scientific Custom-made
Ti-E inverted microscope Nikon CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA objective is recommended for the application described in this paper

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
  2. Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and. 11, 339-350 (2010).
  3. Lazarini, F., Lledo, P. M. Is adult neurogenesis essential for olfaction? Trends Neurosci. 34, 20-30 (2011).
  4. Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z., Lindvall, O. Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke. Nat. Med. 8, 963-970 (2002).
  5. Emsley, J. G., Hagg, T. alpha6beta1 integrin directs migration of neuronal precursors in adult mouse forebrain. Exp. Neurol. 183, 273-285 (2003).
  6. Sundholm-Peters, N. L., Yang, H. K., Goings, G. E., Walker, A. S., Szele, F. G. Subventricular zone neuroblasts emigrate toward cortical lesions. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 1089-1100 (2005).
  7. Doetsch, F., Alvarez-Buylla, A. Network of tangential pathways for neuronal migration in adult mammalian brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 14895-14900 (1996).
  8. Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system. Annu. Rev. Neurosci. 28, 223-250 (2005).
  9. Pathania, M., Yan, L. D., Bordey, A. A symphony of signals conducts early and late stages of adult neurogenesis. Neuropharmacology. 58, 865-876 (2010).
  10. Belvindrah, R., Nissant, A., Lledo, P. M. Abnormal neuronal migration changes the fate of developing neurons in the postnatal olfactory bulb. J. Neurosci. 31, 7551-7562 (2011).
  11. Gotts, J. E., Chesselet, M. F. Mechanisms of subventricular zone expansion after focal cortical ischemic injury. J. Comp. Neurol. 488, 201-214 (2005).
  12. Goings, G. E., Sahni, V., Szele, F. G. Migration patterns of subventricular zone cells in adult mice change after cerebral cortex injury. Brain Res. 996, 213-226 (2004).
  13. Romanko, M. J., et al. Roles of the mammalian subventricular zone in cell replacement after brain injury. Prog. Neurobiol. 74, 77-99 (2004).
  14. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
  15. Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PloS One. 3, e1883 (2008).
  16. Barnabe-Heider, F., et al. Genetic manipulation of adult mouse neurogenic niches by in vivo electroporation. Nat. Methods. 5, 189-196 (2008).
  17. Platel, J. C., et al. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
  18. Pathania, M., et al. miR-132 enhances dendritic morphogenesis, spine density, synaptic integration, and survival of newborn olfactory bulb neurons. PloS One. 7, e38174 (2012).
  19. dal Maschio, M., M,, et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nat. Commun. 3, 960 (2012).
  20. Oudin, M. J., et al. Endocannabinoids regulate the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 31, 4000-4011 (2011).
  21. Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Front. Neurosci. 4, (2010).
  22. Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. Neonatal subventricular zone electroporation. J. Vis. Exp. (72), e50197 (2013).
  23. Nam, S. C., et al. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
  24. James, R., Kim, Y., Hockberger, P. E., Szele, F. G. Subventricular zone cell migration: lessons from quantitative two-photon microscopy. Front. Neurosci. 5, 30 (2011).
  25. Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis. Neural Dev. 6, 13 (2011).
  26. Saha, B., Ypsilanti, A. R., Boutin, C., Cremer, H., Chedotal, A. Plexin-b2 regulates the proliferation and migration of neuroblasts in the postnatal and adult subventricular zone. J. Neurosci. 32, 16892-16905 (2012).
  27. Sanai, N., et al. Corridors of migrating neurons in the human brain and their decline during infancy. Nature. 478, 382-386 (2011).
  28. Tattersfield, A. S., et al. Neurogenesis in the striatum of the quinolinic acid lesion model of Huntington's disease. Neuroscience. 127, 319-332 (2004).
  29. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
  30. Lledo, P. M., Alonso, M., Grubb, M. S. Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).
  31. Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Time-lapse imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain. J. Vis. Exp. (67), e4061 (2012).
  32. Snapyan, M., et al. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
  33. Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone. J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).
  34. Schaar, B. T., McConnell, S. K. Cytoskeletal coordination during neuronal migration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 13652-13657 (2005).
  35. Valiente, M., Marin, O. Neuronal migration mechanisms in development and disease. Curr.Opin. Neurobiol. 20, 68-78 (2010).
  36. Comte, I., et al. Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb. J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).
  37. Sonego, M., et al. Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats