In-vivo-Elektroporation und Postnatale Zeitraffer-Imaging Neuroblast von Migration in Maus Akute Hirnschnitten

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Neuroscience

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Summary

Neuroblast Migration ist ein grundlegendes Ereignis in der postnatalen Neurogenese. Wir beschreiben ein Protokoll für die effiziente Markierung von Neuroblasten durch in vivo Elektroporation postnatalen und anschließende Visualisierung der Migration mit Zeitraffer-Bildgebung der akuten Hirnschnitten. Wir sind eine Beschreibung für die quantitative Analyse von Neuroblast Dynamik von Video-Tracking.

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Sonego, M., Zhou, Y., Oudin, M. J., Doherty, P., Lalli, G. In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices. J. Vis. Exp. (81), e50905, doi:10.3791/50905 (2013).

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Abstract

Die Subventrikularzone (SVZ) ist einer der wichtigsten neurogenen Nischen in der postnatalen Gehirn. Hier neuralen Vorläuferzellen vermehren sich und führen zu Neuroblasten in der Lage, entlang des rostralen Migrationsstrom (RMS) zum Bulbus olfactorius (OB) zu bewegen. Diese Fern Migration für die anschließende Reifung neugeborener Neuronen im OB benötigt, aber die molekulare Mechanismen, die diesen Prozess sind noch unklar. Untersuchung der Signalwege steuern Neuroblast Motilität kann nicht nur helfen, zu verstehen, einen entscheidenden Schritt in der Neurogenese, sondern auch therapeutische regenerative Potenzial, da die Fähigkeit der Neuroblasten zu Hirn Websites durch Verletzung, Schlaganfall oder Degeneration betroffen Ziel.

In dieser Handschrift beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für in vivo-Elektroporation und anschließender postnatale Zeitraffer-Bildgebung Neuroblast von Migration in den Maus RMS. Postnatale Elektroporation kann SVZ Vorläufer effizient transfizierenZellen, die wiederum erzeugen Neuroblasten Migration entlang der RMS. Mit der konfokalen Spinning-Disk-Zeitraffer-Mikroskopie an akuten Hirnschnittkulturen, können Neuroblast Migration in einer Umgebung, sehr ähnlich der in vivo-Zustand überwacht werden. Außerdem kann Neuroblasten Motilität verfolgt und quantitativ analysiert werden. Als Beispiel beschreiben wir, wie man in vivo Elektroporation postnatale einer GFP-exprimierenden Plasmid verwenden, um zu kennzeichnen und zu visualisieren Neuroblasten Migration entlang der RMS. Elektroporation von shRNA oder CRE-Rekombinase-exprimierenden Plasmiden in Knockout-Mäusen unter Verwendung der loxP-System kann auch verwendet werden, um Gene von Interesse abzuzielen. Pharmakologische Manipulation von akuten Hirnschnittkulturen durchgeführt werden, um die Rolle der verschiedenen Signalmoleküle in Neuroblasten Migration zu untersuchen. Durch die Kopplung von In-vivo-Elektroporation mit Zeitraffer-Bildgebung, hoffen wir, die molekularen Mechanismen, die die Neuroblast Motilität verstehen und dazu beitragen, die Entwicklunglung neuer Ansätze zur Heilung des Gehirns zu fördern.

Introduction

Im Säugerhirn, die Erzeugung von neuen Neuronen (Neurogenese) erfolgt nach der Geburt vor allem in zwei Regionen, die Subventrikularzone (SVZ) der Seitenventrikel und der Subgranularzone im Gyrus dentatus des Hippocampus 1. Deutliche Beweise in den letzten Jahren gesammelt unterstützt eine entscheidende Rolle für die postnatalen Neurogenese im Hippocampus und Riechkolben Speicherfunktionen 1-3. Wichtig ist, daß die postnatale Neurogenese auch therapeutisches Potential aufgrund der Beziehung mit degenerativen neurologischen Störungen, und die Fähigkeit von Neuroblasten an verletzten Stellen im Gehirn 4-6 migrieren.

Die Subventrikularzone (SVZ) hat vor kurzem als ein entscheidender neurogenen Nische. SVZ abgeleiteten Neuroblasten wandern zur Riechkolben (OB) über dem rostralen Migrationsstrom (Effektivwert), so dass dies die längste Migration in der postnatalen Gehirn 1,7,8. Die Säugetier SVZ / RMS / OB-System hat sich zu einemnützliches Modell, um verschiedene Schritte der Neurogenese, wie Proliferation, Migration und Differenzierung 1,8 studieren. Viele Wachstumsfaktoren und extrazelluläre Signale regulieren SVZ Neurogenese und Migration entlang der RMS, aber die intrazellulären molekularen Mechanismen sind bei weitem nicht vollständig verstanden 1,9. Proper Migration entlang der RMS ist entscheidend für die spätere Reifung neugeborener Neuronen 10. Darüber hinaus haben einige Studien gezeigt, dass SVZ-derived Neuroblasten kann der RMS-Hirn-Verletzungen Websites 4-6,11-13 migrieren. So untersucht die Signalmechanismen Regelneuroblast Migration ist von grundlegender Bedeutung nicht nur für die Neurogenese zu verstehen, sondern auch für mögliche therapeutische Anwendungen.

Hier ein ausführliches Protokoll zu SVZ neuralen Vorläuferzellen durch in vivo Elektroporation postnatale beschriften und Überwachung ihrer Wanderung entlang der RMS in akuten Hirnschnittkulturen mit Zeitraffer-konfokale Mikroskopie drehenden Scheibe beschreiben wirpy. Elektroporation ist weit verbreitet in Entwicklungsstudien aus embryonalen zu adulten Stadien 14-18 verwendet. Es ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um gezielt manipulieren SVZ neuralen Vorläuferzellen und ist ein kostengünstiger und wesentlich schnellere Alternative zu stereotaktische Injektion von viralen Vektoren oder Erzeugung transgener Modelle 1,15,19,20. Es ist ein relativ einfaches Verfahren, das nicht braucht, Chirurgie und hat eine hohe Überlebensraten. Elektroporation von shRNA oder CRE-Rekombinase-exprimierenden Plasmiden in Maus-Modellen Verwendung der genetischen LoxP System kann verwendet werden, um gezielt Gene von Interesse oder dauerhafte Kennzeichnung von SVZ Vorläuferzellen zu erreichen, stellt somit ein nützliches Werkzeug für die adulte Neurogenese Studien 21,22 werden.

RMS Imaging Neuroblast Migration im intakten Gehirn ist immer noch eine Herausforderung aufgrund der aktuellen technischen Einschränkungen. Allerdings kann dieser Prozess mit Hilfe der konfokalen Spinning-Disk-Zeitraffer-Mikroskopie von akuten Hirnschnitten, die eine geeignete syst bieten überwacht werdenem sehr ähnlich der in vivo-Zustand, der auch offen für pharmakologische Manipulation 23,24. Kopplung in vivo Elektroporation mit postnatalen Zeitraffer-Imaging wird das Verständnis der molekularen Mechanismen, die die Neuroblast Beweglichkeit erleichtern und dazu beitragen, die Entwicklung von neuartigen Ansätzen zur Heilung des Gehirns zu fördern.

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Protocol

Dieses Verfahren steht im Einklang mit den britischen Home Office Verordnungen (Tier Scientific Procedures Act, 1986). Wissenschaftler sollten die etablierten und durch ihre institutionelle und nationale Regulierungsorganisationen Tier genehmigten Richtlinien zu folgen.

1. Postnatale Elektroporation

1.1. Herstellung von Glas-Kapillaren, DNA-Lösung und Electroporator

  1. Bereiten zogene Glaskapillaren (OD: 1,5 mm, ID: 0,86 mm) für die DNA-Injektion. (Richt Einstellungen für eine Sutter P-97-Kapillare Zieher sind: Wärme 283; Ziehen 50; Velocity 90; Zeit 50). Machen Sie eine Markierung an der Kapillare entspricht einem Volumen von ca. 2 ul.
  2. Stellen Sie die Spannung des Elektroporator bis 5 Rechteckimpulse, 50 ms / Puls bei 100 V, mit 850 ms Intervallen (100 V, 50 ms Puls ON, Puls 850 ms OFF, Puls 5).
  3. Verdünnen hochreinen (OD 260/280> 1,80) Endotoxin-freiem Plasmid-DNA bis zu einer Endkonzentration von 1-2 ug / ulmit Endotoxin frei Tris-EDTA-Puffer oder PBS. Es wird empfohlen, 0,1% Fast Green zu der DNA-Lösung (der Farbstoff in der Kammer verteilt, wenn erfolgreich injiziert) hinzuzufügen.
  4. Bereiten Sie die Elektroden 5-7 mm, das Elektroden-Gel und erwärmen Sie das Heizkissen.

1.2. Elektroporation

  1. Entfernen einer postnatalen Tag 2 Maus-Welpe aus Käfig und betäuben sie durch Isofluran-Inhalation (bei einem Fluß von ~ 0,6 l / min).
  2. Nach ca. 1 min, bestimmen den Zustand der Betäubung mit dem Fuß Prise Antwort. Wenn keine Bewegung stattfindet, fahren Sie mit intraventrikuläre Injektion.
  3. Laden Kapillarnadel mit 1-2 &mgr; l DNA mit einem Saugrohr mit der Kapillare verbunden ist.
  4. Unter einer Kaltlichtquelle, halten Sie den Kopf des Welpen zwischen Daumen und Zeigefinger der weniger dominanten Hand. Etwas ziehen Sie die Haut wieder auf den Kopf, um die Identifizierung des richtigen Injektionsstelle zu helfen.
  5. Betrachten Sie eine virtuelle Linie zwischen dem Auge und ter craniometric Wahrzeichen Lambda (Abbildung 1A). Legen Sie die Kapillarnadel bei etwa einem Drittel der Länge dieser Linie aus dem Lambda (ca. 1 mm von der Linie Mittelpunkt) 15. Legen Sie die Kapillare etwa 2 mm tief, achten Sie darauf, ein tiefes Eindringen in das Gehirn zu verhindern.
  6. Injizieren Plasmid durch Blasen langsam durch den Mund (eine Spritze mit der Kapillare verbunden ist, kann auch verwendet werden). Während dieser Prozedur sicher, dass Ihre Finger nicht zu viel Druck auf das Gehirn, da dies erfolgreich Plasmid-Injektion zu verhindern.
  7. Injektions stoppen, wenn eine minimale Menge an DNA-Lösung wird in die Kapillare verlassen. Es ist ratsam, weniger als 1 &mgr; l injiziert, um schädliche Hirndruckanstieg zu vermeiden.
  8. Mantel beide Elektroden mit Gel und sie mit der positiven Seite an der Seitenfläche der Halbkugel, wo die DNA injiziert wurde (Fig. 1A). Für die DNA-Einbau in den rostralen SVZ, Ort Elektroden etwas rostral derEinspritzstelle. Unterschiedliche Elektrodenposition regionale Spezifität der Elektroporation in verschiedenen Bereichen des SVZ 22,25 zu erreichen.
  9. Initiieren Stromübertragung durch Drücken der Puls Fußschalter. Wenn die Elektroporation abgeschlossen ist, überprüfen Sie die Spannung auf der Elektroporator Anzeige (Spannungswerte sollte nicht unter 90 V sein, da niedrigere Spannungswerte korrelieren mit schlechten Elektroporation Effizienz).
  10. Reanimate den Welpen unter Sauerstoff auf Heizkissen für ein paar Minuten und wieder in den Käfig, indem sie weg von der Mutter. Achten Sie darauf, die Mutter ruft den Welpen und vereint sie mit dem Rest des Wurfes. Nach der Elektroporation verlassen Welpen mit ihrer Mutter für 4-7 Tage vor dem nächsten Schritt.

2. Vorbereitung der akuten Hirnschnittkulturen

2.1. Herstellung von Lösungen und Werkzeuge

  1. Die folgenden Lösungen erforderlich sind (es ist auch möglich, mit hohem Glucose DMEM zum Präparieren und Bildgebung17):
    Dissection Medium (500 ml)
    Gey-Balanced Medien - 500ml
    45% Glukose - 5ml
    Film-Medium (10 ml)
    45% Glukose - 0.110 ml
    HEPES 1 M - 0.100 ml
    Pen / Strep - 0.100 ml
    FCS - 0.500 ml
    B27 - 0.100 ml
    Glutamin - 0.200 ml
    Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium (Phenol-frei), - 8,89 ml
  2. Warm up Film-Medium bei 37 ° C
  3. Zeigen Milli fügt in eine 35 mm Glasbodenkulturschale mit 1 ml Medium Film und in einem befeuchteten Brutschrank bei 37 ° C / 5% CO 2.
  4. Bereiten Vibratoms Zubehör (Schraubendreher, Kammer, Rasierklingen, Kleber).
  5. Bereiten Dissektion Werkzeuge: Schere, Spachtel, gerade Pinzette.
  6. Bereiten Sie Werkzeuge für den Umgang mit Scheiben: kleinen Pinsel oder weichen Impföse (Größe: 10 ul), Kunststoff-Pasteurpipetten, ein Eis-Box und mehrere 6 cm Plastikschalen.
  7. Vorkühlung der Dissektion Mediumbei 2-4 ° C.

2.2. Herstellung von Hirnschnitten

  1. Füllen Sie eine 6 cm Schale mit vorgekühlten Dissektion Medium und auf Eis (mit frisch geschnittenen Scheiben zu halten).
  2. Nach Genickbruch, mit einer Schere, um die Maus pup enthaupten. Entfernen Sie die Kopfhaut mit einem Skalpell, schneiden Sie den Schädel entlang der Mitte der Pfeilnaht von der OB an das Kleinhirn und entfernen Sie vorsichtig die Schädellappen mit einer Pinzette. Stellen Sie sicher, dass das gesamte Gehirn ausgesetzt ist und sorgfältig sezieren sie mit Hilfe einer Spachtel, die besondere Sorgfalt, nicht um das Gewebe zu beschädigen. Die Präparation muss sorgfältig durchgeführt werden, aber zur gleichen Zeit sehr schnell (weniger als eine Minute, wenn möglich). Genickbruch ist unsere bevorzugte Methode, weil Terminalanästhesie mit Drogen / Gas-Anästhetika können die Migrationseigenschaften der Neuroblasten und dem gesunden Zustand der Hirnschnittkulturen, die relativ schnell nach Tieropfer abgebildet werden müssen, beeinflussen.
  3. Hemisect das Gehirn mit einem razoder Klinge (2). Entsorgen Sie nicht injizierten Hemisphäre oder Verwendung für andere Experimente.
  4. Legen Sie ein kleines Stück Klebeband auf der Vibratom Halter und verwenden Sie die minimal notwendige Menge an Klebstoff, um die Gehirnhälfte oben drauf (Abbildung 2) zu befestigen. Dies verhindert eine Beschädigung der Halteroberfläche aufgrund von wiederholten Klebeanwendungen.
  5. Lassen Sie den Kleber trocknen für ein paar Sekunden.
  6. Zeigen Halter in der Vibratom Tablett mit vorgekühlten Dissektion Lösung gefüllt. Weisen den Riechkolben in Richtung der Klinge (2).
  7. Beginnen Schneiden der Gehirnhälfte mit geeigneten Einstellungen. Die folgenden Parameter werden empfohlen: Schichtdicke 300 um; Geschwindigkeit ~ 3-5; Frequenz ~ 9. Hochfrequenz-und Niedergeschwindigkeits werden empfohlen, um eine Beschädigung der Scheibe zu vermeiden.
  8. Sammeln Scheiben mit einem kleinen Pinsel oder einem weichen Impföse. Nur halten Scheiben mit sichtbaren OB (in der Regel 2-3 Scheiben / Gehirn). Typischerweise wird die Scheibe enthält die meisten der RMS can bei ~ 300 &mgr; m von der Bodenfläche festgestellt werden.
  9. Überprüfen Scheiben unter einem Fluoreszenzmikroskop Standard für GFP-Signal (achten Sie darauf, um sie umzudrehen, um die Fluoreszenz auf beiden Seiten überprüfen) und wählen Sie diejenigen, die helle Fluoreszenz entlang des größten Teils der RMS.

2.3. Kultivierung Hirnschnitten

  1. In einer Zellkultur Kapuze, schneiden Sie den meisten Schwanz Drittel der Hirnschnitt zu entfernen und mit feinen Pinzette oder gerade eine Mikrodissektion Skalpell keine Kleberspuren.
  2. Zart absaugen Scheibe mit einem Kunststoff-Pasteur-Pipette (schneiden Sie die Spitze der Pipette, um eine größere Öffnung zu schaffen, wird dies eine Beschädigung der Scheibe) und legen Sie es auf die Mitte eines vorgewärmten Millicell-Einsatz.
  3. Sicherzustellen, dass die Seite mit der hellsten Fluoreszenzsignal wird in Kontakt mit der Millicell Einsatz (für die Bildgebung mit einem umgekehrten Mikroskop) angeordnet ist.
  4. Entfernen überschüssiger Lösung Präparation auf der Oberseite des Einsatzes mit einer Pipette.
  5. Lassen Schnittkulturen zulassen sich in einem 37 ° C / 5% CO 2-Inkubator für mindestens 1 Stunde vor der Bildgebung.

3. Zeitraffer-Imaging Neuroblast von Migration

  1. Mindestens zwei Stunden vor der Bildgebung, schalten Sie den Perkin Elmer UltraViewVoX konfokale Spinning-Disk-System, invertiert Nikon Ti-E-Mikroskop, Hamamatsu C10600-10B (ORCA-R2) gekühlten CCD-Digitalkamera und Heizung (Solent Scientific) mit der konstanten eingestellt Temperatur von 37 ° C.
  2. Öffnen Sie die Volocity Software Anschaffungs Modul, und klicken Sie auf die Schaltfläche "Viz" und wählen Sie den Laser (s) für die Bildgebung.
  3. Innerhalb von 2 h von Hirnschnittpräparat, legen Sie das Glasbodenschale mit den Hirnschnitt in der Imaging-Kammer auf dem Mikroskoptisch.
  4. Verwenden Sie ein Super-Nikon CFI Plan Fluor ELWD 20X/0.45 Ziel unter der entsprechenden Fluoreszenzlicht zu wählen und sich die Fläche der Scheibe, der abgebildet werden soll (z. B. der ersten absteigenden Teil des RMS kurz nach der Injektionsstelle, oder die elbow Bereich der RMS, oder einfach nur nach dem Ellenbogen vor Neuroblasten geben Sie die OB).
  5. Richten Sie die Zeitraffer-Bildgebung mit den folgenden Aktionen:
    1. Auf dem Mikroskop, klicken Sie auf die Schaltfläche, um L100 Laser-Abtastung der Probe zu ermöglichen.
    2. In Volocity, öffnen Sie das Ultraview Laser Changer von der Auswahl des geeigneten Laser (z. B. 488 nm Laser für GFP).
    3. Stellen Sie die Belichtungszeit (in der Regel zwischen 100-500 ms) und die Laserintensität (in der Regel 20-30%) in Abhängigkeit von der Intensität des Fluoreszenzsignals.
    4. Passen Sie die Bild digitale Verstärkung zu Zelle Visualisierung zu verbessern.
    5. Wählen Sie die Z-Stapel-Intervall auf Bild im Hirnschnitt (in der Regel über ein Intervall um 100-120). Wähle ein Intervall mit einer geeigneten Anzahl von isolierten Zellen möglich zu vermeiden, überlagert, so viel wie möglich (dies die nachfolgenden Tracking-Analyse zu erleichtern).
    6. Wählen Sie den Abstand zwischen den einzelnen Bild Z-Stapel (in der Regel 2-4 um).
    7. Wählen Sie die Zeit interval zwischen jeder z-Stapelerfassung (z. B. 3 Minuten), und die Gesamtbilderzeugungszeitdauer (z. B. 3 Stunden).
    8. Klicken Sie auf den "Speichern"-Symbol, um die Änderungen der Bildparameter zu speichern.
    9. Drücken Sie die Aufnahme-Taste, um Bild starten.
  6. Alternative Abbildung der Kontroll-und experimentellen Proben (z. B. Fahrzeug / Arzneimittelbehandlung oder verschiedenen Plasmiden durch Elektroporation) während des gleichen Tages.

4. Analyse Neuroblast Migration

  1. In der Volocity Quantifizierung Modul, öffnen Sie die gewünschte Bibliothek nach Abschluss einer Zeitraffer-Experiment erstellt. Wählen Sie "Erweiterte Tiefenschärfe" von der linken oberen Feld (Abbildung 4A, Schritt 1).
  2. Klicken Sie auf der Registerkarte "Messungen", um das Messfenster angezeigt (Abbildung 4A, Schritt 2).
  3. Eine Liste der Aufgaben ist in der unteren linken Ecke des Bildschirms sichtbar. Ziehen Sie "Track" (unter dem "Verschiedenes" vorhanden Überschrift am unteren Rand desdie Liste) auf dem Raum über. Dies wird die Eröffnung eines neuen Fenster namens "Track" in der oberen linken Bereich des Bildschirms (Abbildung 4A, Schritt 3) aufgefordert.
  4. Wählen Sie "Punkte" von der "Input"-Reiter in der Track-Fenster (Abbildung 4A, Schritt 4).
  5. Klicken Sie auf das Point Tool (Abbildung 4A, Schritt 5).
  6. Starten Sie die Verfolgung der Migration Neuroblast, indem Sie mit der Maus auf den zentralen Bereich der Zellkörper und halten die Verfolgung der Zellbewegung bis zum letzten Zeitpunkt der Zeitraffer-erreicht wird (zum Beispiel Punktzahl 61 für eine 3 Stunden lange Film) .
  7. Um Daten zu erhalten, wählen Sie "Make Mess Item" aus dem Menü Messungen (4B, Schritte 6-7). Ein Fenster in der Mitte des Bildschirms angezeigt.
  8. In diesem Fenster wählen Sie "Ein neues Messpunkt genannt:" und geben Sie einen Namen ein (4C, Schritt 8). Denken Sie daran, die Option "Alle Zeitpunkten" vor pr wählenEssing OK (4C, Schritt 9). Ein Messpunkt Datei wird unter der Zeitraffer-Datei angezeigt und Parameter zur quantitativen Analyse (zB Migrations-Distanz, Geschwindigkeit, Weg und Verschiebungsrate) enthalten.
  9. Doppelklicken Sie auf die Messpunkt Datei, um sie wie ein Fenster (4D, Schritt 10) zu öffnen.
  10. Um die einzelnen Tracks der analysierten Zellen sichtbar zu machen, wählen Sie "Raupen Point" von den "Display"-Optionen (4D, Schritt 11).
  11. Rechtsklick auf die Mess Artikel-Datei und exportieren es als Text-Datei, die dann in Programmen wie Excel, um die Migration zu analysieren Parameter importiert werden kann.
  12. Um Bewegungen zwischen aufeinanderfolgenden Frames und Pausen von jeder Zelle während der Dreharbeiten Frist, in der Mess-Artikel-Datei aus den "Display" Optionen "Punkt" oder "Populationen", und klicken Sie auf ID (jeder Track hat eine eindeutige ID) zu messen. Exportieren Sie die resultierende Datei durch gehenten, wie in Schritt 4.10 erläutert.

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Representative Results

Kennzeichnung von SVZ-abgeleiteten Migrationsneuroblasten entlang der RMS beobachtet werden, in der Regel 4-8 Tage nach einer erfolgreichen Elektroporation (Abbildung 1B). Längere Zeitpunkte können auch gewählt werden, weniger Zellen werden in den RMS gefunden werden, da die meisten von ihnen die OB eingegeben. Neuroblasten starten Erwerb typische Morphologie und Eigenschaften von reifen Körnerzellen im OB etwa 2-3 Wochen nach der Elektroporation (nicht gezeigt). Nach Kultivierung für ~ 1 Stunde, kann Hirnschnitten von Elektroporation Maus Welpen zuverlässig für bis zu 3-4 Stunden abgebildet werden. Wie bereits berichtet 23,26 kann Neuroblasten komplexen Migrationsdynamik zeigen (Abbildung 3 und Video 1), was sein kann, mit Handy-Tracking (Abbildung 4) quantitativ analysiert.

Figur 1
Fig. 1 ist. Poštna tal in vivo Elektroporation. (A) Schematische Darstellung der in vivo Elektroporation von einer postnatalen Tag 2 Maus-Welpen. Eine gepunktete Linie (rot), der den Blick auf die Wahrzeichen craniometrical Lambda dient als Positionsmarkierung für die Kapillar-Insertion. Der Einspritzpunkt wird als grüner Punkt angezeigt. Grau ovale Formen zeigen Elektrodenposition in Boutin et al. 15 (B) Sagittal Maushirn Scheibe für GFP immun 5 Tage nach der Elektroporation einer GFP-exprimierenden Plasmids. SVZ-abgeleiteten Migration Neuroblasten sind entlang der RMS sichtbar und einige von ihnen haben begonnen, die OB zu erreichen. Ctx: Kortex; SVZ: Subventrikularzone; RMS: rostralen Migrationsstrom; OB: Riechkolben. Bar, 400 um. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

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2. Schematisch Schritte bei der Herstellung von akuten Hirnschnittkulturen für die Bildgebung. (A) und Caudal intrahemisphärische Schnitte (gestrichelte Linien) sind auf einem frisch sezierten Gehirn durchgeführt. (B) Die Elektroporation Gehirnhälfte ist auf einem Vibratom Halter platziert. (C) Sagittal Scheiben sind mit einem Vibratom erhalten und unter einem Standard-Fluoreszenzmikroskop beobachtet . (D) Scheiben mit der besten GFP-Signal kultiviert werden für mindestens 1 h auf einer Milli einfügen in einem Glasbodenschale und (E) anschließend in einer Klimakammer für die Bildgebung durch einen invertierten konfokalen Spinning-Disk-System platziert. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

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3. Zeitraffer-Bildgebung von Migration Neuroblasten. (A) Spinning Disk Zeitraffer-Bilder der Neuroblasten 5 Tage nach der Elektroporation von einem GFP-exprimierenden Plasmid von einer Maus sagittalen Hirnschnitt gemacht. Bilder 1 Stunde auseinander. Jede Platte ist ein Z-Stapel-Projektion von 28 aufeinander folgenden Bilder 4 um auseinander. Pfeilspitzen zeigen vier Vertreter Neuroblasten Migration entlang der RMS zu den Riechkolben (aus dem Bild in der unteren rechten Ecke). (B) Vertreter der Migrationspfade von Zeitraffer-Bildgebung der 4 Neuroblasten erhalten markiert (A). (C) Die Grafik zeigt den Abstand mit der Zeit durch zwei Vertreter Neuroblasten migriert. Die Zellen zeigen ein typisches Verhalten saltatory beweglich. Bar, 70 um. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .


4. Tracking-Analyse der Migration von Neuroblasten. Sequential Schritte zur Migration von Neuroblasten verfolgen mit Volocity Software. Bitte siehe Text für ausführliche Erläuterungen. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Video 1:. Zeitraffer-Bildgebung von Migration Neuroblasten Der Film zeigt einen Ausschnitt der Maus RMS mit GFP-markierten erhalten 5 Tage nach der Elektroporation von einem GFP-exprimierenden Plasmid Migration Neuroblasten. Der OB wird aus der Blick in Richtung der unteren rechten Ecke. Konfokale Z-Stapel wurden auf einer sich drehenden Scheibe mit einem konfokalen 20X Ziel alle 3 min für 3 Stunden über einem Intervall um 120 gefangen genommen. Spielgeschwindigkeit: 10 Bilder / Sek.

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Discussion

Effiziente Migration von neuralen Vorläuferzellen entlang der RMS sorgt für deren anschließende Reifung in funktionelle Neuronen 10. Prominent Streams von neuralen Vorläuferzellen in Richtung des OB gerichtet sind, sind in der menschlichen Kindheit sichtbar und werden wahrscheinlich eine wichtige Rolle in der frühen postnatalen Entwicklung des menschlichen Gehirns 27 zu spielen. Darüber hinaus sind diese Zellen in der Lage, Websites des Gehirns durch Verletzungen und Neurodegeneration betroffen 4,28 Ziel. Die Möglichkeit, in Echtzeit überwachen die Auswirkungen der Gen-Manipulation auf Neuroblast Dynamik ist unerlässlich zu verstehen, wie Neuroblast Bewegung geführt und reguliert.

Hier haben wir ein Protokoll zur SVZ-derived Neuroblast Migration durch Kopplung in vivo Elektroporation mit postnatalen Zeitraffer-konfokale Spinning-Disk-Mikroskopie von akuten Hirnschnittkulturen überwachen beschrieben. Genauer gesagt, haben wir gezeigt, wie die Migration neuralen Vorläuferzellen können durch Elektroporation in der SVZ ein Plasmid enc gekennzeichnet werdenOding GFP. Je nach Zweck der Studie, können mehrere Arten von Plasmiden verwendet werden (z. B., die die Expression von fluoreszierenden Proteinen oder anderen Co-Expression von Wildtyp / Mutante Proteine ​​von Interesse, die Cre-Rekombinase oder shRNA mit fluoreszierenden Proteinen). Wir empfehlen dringend, Plasmide, die das Huhn beta-Aktin 29 CAG-Promotor für in vivo-Expression. Bildgebung von Hirnschnitten von Tieren erhalten Elektroporation können ebenfalls verwendet, um die radiale Migration von neuralen Vorläuferzellen in dem OB in längeren Zeitpunkten (7-10 Tage) nach der Elektroporation 30 überwacht werden.

Nach einer anfänglichen Phase der Übung wird in vivo Elektroporation postnatale eine sehr zuverlässige Methode, so robust Neuroblast Kennzeichnung sowohl für Zeitraffer-Imaging-und Immunfluoreszenz-Analyse. Darüber hinaus bietet diese Technik eine wesentliche Vorteil gegenüber transgenen Mäusen, die fluoreszierende Proteine ​​unter Neuroblast-spezifische Promotoren,wobei die Mehrzahl der Neuroblasten markiert sind. Tatsächlich ermöglicht Elektroporation spärlich Kennzeichnung von Neuroblasten, so dass detaillierte Analyse der Morphologie und Dynamik der Migration. Verglichen mit dem stereotaktischen Lieferung von viralen Vektoren 31, ist diese Technik billiger, schneller und wird mit der Maus Welpen sehr gut verträglich. Der Hauptnachteil besteht in der Tatsache, dass es an der frühen postnatalen Stadien beschränkt. In der Tat, empfehlen wir dringend die Verwendung postnatalen Tag 2 Maus-Welpen, da wir beobachteten einen deutlichen Rückgang der Markierungseffizienz zu späteren Zeiten, als virale Versandmethoden werden besser geeignet 31. Allerdings können Strategien wie Elektroporation von CRE-exprimierenden Plasmiden in entsprechende Maus genetischen Modelle zur Neurogenese im erwachsenen studieren Stufen 22.

Zwei-Photonen-, Standard-konfokalen, sich drehende Scheibe konfokalen und Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie können alle verwendet werden, um Neuroblast Migration 17,23,24 visualisieren. Spinning Disk conBrenn Mikroskopie ist eine günstige Alternative zum Zwei-Photonen-Mikroskopie. Es ermöglicht die 3D-Bildgebung mit höherer Geschwindigkeit durch mehrere z-Ebenen, die Begrenzung Photobleaching Vergleich zu Standard-konfokale Mikroskopie und bietet eine höhere Auflösung als Weitfeld-Fluoreszenz-Bildgebung 31-33. Die Mehrheit der Migration von Neuroblasten haben eine deutlich sichtbare Soma und eine hochdynamische führende Prozess mit einem Wachstumskegel gekippt.

Wie von anderen 17 beschrieben, die eine Durchblutung Kammer würde es erlauben, direkt beurteilen die Auswirkungen der Steuer-und medikamentöse Behandlungen auf der gleichen Hirnschnitt. Während wir dies ein wichtiger Vorteil zu betrachten, das hier beschriebene Protokoll zeigt, dass es nicht für die Lebensfähigkeit der Zellen absolut notwendig, um Scheiben mit sauerstoff künstlicher Cerebrospinalflüssigkeit (aCSF) oder DMEM high glucose 17,33 strömen. Darüber hinaus mit einem inversen Mikroskop ermöglicht im Vergleich zum aufrechten Mikroskopen mit Wasserimmersionsobjektive ausgestattet einfacher Ziel Manipulation.Wir fanden, dass die Verwendung eines 20X Fernziel ist ein optimaler Kompromiss, so dass Tracking von einer guten Anzahl von Zellen (in der Regel 25 bis 40 pro Scheibe) und produzieren gute Auflösung Bilder (Video 1). Automatische Nachführung ist möglich, aber es ist nicht immer zuverlässig. Aus diesem Grund empfehlen wir visuelle und, falls erforderlich, manuelle Überprüfung der automatischen Spurdaten. Höhere Vergrößerung Abbildung einzelner Neuroblasten kann unter Verwendung eines Nikon Fluor DIC M/N2 40X/0.80W Ziel werden. Die frei verfügbare ImageJ Plugin MTrackJ kann auch verwendet werden, um grundlegende Statistiken Spur 33 zu messen, aber einige Roh-Datenerfassung-Dateien können mit dieser Software nicht kompatibel und müssen, um geeignete Formate für die Analyse überführt werden, die sich in bestimmten Fällen kann zeitaufwendig sein . Die Kombination von Bildaufnahme und Analyse-Module von der Software zur Verfügung gestellt Volocity ermöglicht eine unmittelbare Übergang von der Bildaufnahme /-verarbeitung, quantitative Analyse von Migrationsparameterter (Geschwindigkeit, Hubraum, etc.), die leicht in einer Vielzahl von Diagrammen visualisiert werden kann (z. B., die Migrationsmuster / Distanz / Richt / Geschwindigkeit / Ausdauer / Zeit damit verbracht, unbeweglich, etc.).

Neuroblasten zeigen eine saltatory Bewegung, abwechselnd zu wandern stationären Phasen 34,35 (3C). In Anbetracht der Tatsache, dass stationäre Phasen zwischen 4-10 min 32 sein, glauben wir, dass die Aufnahmen alle 3 min stellt einen guten Kompromiss zu folgen Migration Neuroblasten mit Mindestlichtstärke und Lichtschäden. Wir sehen nur selten zu stoppen Zellen für mehr als 6 min, und finden, dass über einen 3-Stunden-Zeitraum, sie in der Regel verbringen durchschnittlich 30 Minuten unbeweglich. Nach früheren Berichten, Neuroblasten haben eine Durchschnittsgeschwindigkeit von 60 bis 100 um / h und eine durchschnittliche mäandernden Index (tatsächliche Verschiebung über die migriert erreichbar), etwas über 0,6 23,36, die in Übereinstimmung mit unseren Beobachtungen ist. TypicVerbündeter, etwa 60% der Zellen eine "wandernde"-Verhalten (z. B. nach nahezu lineare Migrationspfade, mit einem mäandernden Index zwischen 0,6-1) und 20-25% sind "explorative" (mit einem mäandernden Index zwischen 0-0,4) während die restlichen ~ 20% als "Zwischen" (abwechselnd Zug-und Sondierungsphase, mit einem mäandernden Index zwischen 0,4 bis 0,6) eingestuft werden.

Wir erkennen, dass es immer noch Grenzen dieser Technik, da können wir nicht filmen Neuroblasten für mehr als 3-4 Stunden ohne Einhaltung erhebliche Veränderungen in ihrer Beweglichkeit. Filmen Dauer konnte durch Senkung Abbildungsfrequenz (aber dies wird die Genauigkeit der Analyse beeinflussen Migration) sowie durch die Annahme einer Perfusionskammer die Umweltbedingungen für die Bildgebung zu optimieren erhöht werden. Allerdings ist die hier beschriebene Protokoll einschließlich einer 3-4 Stunden Bild Zeitraum stellt einen geeigneten Kompromiss ermöglicht die Sammlung von ausreichend Daten für die quantitative Analyse vonMigration. In der Tat, so weit wir es geschafft haben, die erzeugten Effekte auf die Migration von Protein-Überexpression / 37 oder Herunterregulation durch pharmakologische Manipulation nach dem Vergleich mit den entsprechenden Kontrollen (Sonego und Zhou, unveröffentlichte Ergebnisse) zu erfassen.

Im Ergebnis ist die Kombination von In-vivo-Elektroporation mit postnatalen Spinning-Disk-Imaging von Gehirnschnittkulturen stellt ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Dynamik der Neuroblast Migration in einem System sehr ähnlich der in vivo-Umgebung zu überwachen, bietet die Möglichkeit, in die Tiefe, die molekularen Mechanismen, die zu untersuchen Neuroblast Beweglichkeit.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgements

MS und YZ werden von KCL KCL-und PhD student China unterstützt. MO wurde von einem Biotechnologie und Biologische Wissenschaften Research Council Doktoranden-Stipendium gefördert. Wir danken Masaru Okabe und Jun-ichi Miyazaki für die pCX-EGFP-Plasmid und Alain Chedotal und Athena Ypsilanti für wertvolle Erfahrungsberichte Elektroporation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Millicell Millipore PICM0RG50
35 mm Glass bottom culture dish MatTek P35G-0-14-C
Gey's Balanced media Sigma G9779-500ML
Glucose, 45% Sigma G8769-100ML
HEPES Sigma H3375-25G
Pen/Strep GIBCO 15140-122
FCS GIBCO 10109-163
B27 supplement Invitrogen Life Technologies 17504044
L-Glutamine Invitrogen Life Technologies 25030-081
DMEM (phenol red-free) GIBCO 31053-028
Fast Green Sigma F7252-5G
Glass capillaries for injection Harvard Apparatus 30-0057
Aspirator tube Sigma A5177
Sutter P-97 capillary puller Sutter Instrument P-97
ECM830 Square Wave Electroporator Harvard Apparatus 45-0052
Platinum Tweezertrodes 7 mm Harvard Apparatus 45-0488
Footswitch Model 1250F Harvard Apparatus 45-0211
Gel for electrodes Cefar Compex 6602048
Isoflurane Merial AP/DRUGS/220/96
Vibratome Leica VT1000S
Glue Roti coll Roti coll 1
UltraViEW VoX spinning disk system Perkin Elmer Customized setup (multiple laser sources can be used) equipped with Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD camera
Volocity software Perkin Elmer Acquisition, Quantitation, Visualization Modules
Environmental chamber for microscopy Solent Scientific Custom-made
Ti-E inverted microscope Nikon CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA objective is recommended for the application described in this paper

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References

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