유괴와 콩과 식물의 성장을위한 단일 공장, 무균 소우주 * These authors contributed equally

Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

표준 실험실 접시에서 만든 개별 멸균 소우주의 질소 고정 박테리아 Sinorhizobium meliloti과의 공생에 개자리의 truncatula 식물의 성장 저하 불임없이 루트 시스템과 결절의 자주 검사를 허용합니다. 식물은 최대 9 주 동안 이러한 성장 챔버에서 유지 될 수있다.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jones, K. M., Mendis, H. C., Queiroux, C. Single-plant, Sterile Microcosms for Nodulation and Growth of the Legume Plant Medicago truncatula with the Rhizobial Symbiont Sinorhizobium meliloti . J. Vis. Exp. (80), e50916, doi:10.3791/50916 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Rhizobi​​al 박테리아는 호환 호스트 콩과 식물의 뿌리에 공생 질소 고정 결절을 형성한다. 이러한 상호 작용을 연구하기위한 가장 잘 개발 된 모델 시스템 중 하나는 개자리는 이력서를 truncatula 식물입니다. Jemalong A17와 rhizobial 박테리아 Sinorhizobium는 1021 meliloti. 식물 뿌리와 공생 표현형의 득점 반복 영상은 식물이나 박테리아 중 하나에 비 파괴적 방법이 필요합니다. 일부 식물 및 박테리아 변이주의 표현형 공생 성장의 상대적으로 짧은 기간 후에 명백하고, 호스트 / 공생 상호 작용의 장기 관측을 필요로하지 않는다. 그들이 득점하기 전에 그러나, 유괴 과정의 초기 단계에서 식별 할 수없는 공생의 효율성과 결절 노화 표현형에 미묘한 차이가 비교적 긴 성장 기간을 필요로합니다. 몇몇 방법들은 장기적인 성장 및이 호스트 / 공생 쌍의 관측을 위해 개발되었다.그러나, 이러한 방법의 대부분은 다른 미생물에 의한 오염의 가능성을 증가 반복 물을 필요로합니다. 다른 방법은 식물의 많은 수의 성장을 위해 상대적으로 큰 공간이 필요합니다. 상기 방법은 여기에서 M. 공생의 성장을 설명 truncatula / S. 살균, 단일 식물 소우주에 meliloti은 몇 가지 장점이 있습니다. 이 소우주에있는 식물은 물이 물을 때 교차 오염을 방지, 최대 9 주 동안 필요하지 않습니다 보장하기 위해 충분한 수분과 영양분이 있습니다. 이 표현형는 결절의 개발 및 초기 결절 노화의 미묘한 지연 등의 단기 성장 시스템에서 누락 될 수 있습니다 것을 정량화 할 수 있습니다. 업 응원 관찰 식물이 필요하지 않도록 또한, 소우주의 뿌리 결절은 쉽게 플레이트 뚜껑을 통해 볼 수 있습니다.

Introduction

콩과 식물 기주 식물 개자리의 truncatula A17와 Sinorhizobium는 1021 meliloti rhizobial 박테리아 사이의 상호 작용은 루트 결절 개발 및 질소 고정 공생의 연구를위한 가장 다루기 쉬운 모델 시스템 중 하나입니다. 모두 공생 파트너의 게놈은 1,2 염기 서열을 한 식물과 박테리아 모두 유전자 조작 3,4 의무가 있습니다. 식물과 박테리아의 돌연변이 모두의 표현형 분석 결절 개발의 단계를 관찰하고 시간이 지남에 따라 공생 생산성을 정량화 할 수있는 능력을 필요로한다. 여기에서 우리는 M.의 루트 결절 개발을 관찰하는 방법을 설명합니다 이력서를 truncatula. S. 접종 Jemalong A17 표준, 둥근 직경 100mm, 15mm 깊은 실험실 접시 (그림 1A)에서 만든 각각의 소우주 내 meliloti 1021. 촬영은 접시의 측면에있는 노치 포털 (를 통해 노출 및 성장한다 FigurES 1B, 1C 및 1E). 뿌리는 소우주에 포함 된 플레이트 (그림 1D)의 뚜껑을 통해 관찰을 허용하면서, 멸균 보관됩니다. 촬영에 액세스하기 때문에, 그 성장이 제한되지 않고 루트의 무균 저하없이 주기적으로 측정 될 수있다. 노치 플레이트 소우주를 만드는 방법은 원래 알팔파 식물 성장을위한 리, 등. (5)에 의해 개발 된,하지만 널리 다른 방법에 비해 수많은 장점에도 불구하고 채택되지 않았다. 이 방법의 변형은 식물 뿌리와 mycorrhizae (6) 사이의 상호 작용의 분석을 위해 개발되었다. 우리는 지금 M.의 성장에 적응이 방법을 최적화 한 truncatula 식물. 더 일반적으로 사용되는 방법을 통해이 프로토콜의 장점은 다음과 같습니다.

M.의 유괴 연구에 대한 폭 넓은 현재 사용중인 방법은 여러 가지가 있습니다 truncatula inocuS.와 lated meliloti 7. 마디가있는 뿌리의 대규모 준비를 위해 가장 일반적으로 사용되는 방법은 aeroponic 케이슨 7의 성장입니다. 이 방법에서는, 식물은 큰 용기에 일시 중단 뿌리는 S.의 혼합물로 폭기된다 meliloti 및 영양 솔루션 7. 이 방법은 실제적인 경우 S. 단 하나의 유전자형 meliloti 테스트 할 수 있습니다. 이 세균의 높은 농도의 에어로졸 화를 필요로하기 때문에, 서로 다른 박테리아 균주를 접종 케이슨 간의 교차 오염의 가능성이 높다. 종종 접종 식물의 대량 제조에 사용되는 또 다른 방법은 욕조 또는 펄라이트, 버미큘라이트, 모래 또는 양액 주입 및 S. 접종되어 소성 점토 냄비 성장이다 meliloti 7. 이 방법은 오픈 욕조 또는 포트의 사용을 필요로하고, 양액의 급수 및 보충을 필요로한다. 냄비의 또 다른 단점은 식물뿌리와 결절의 진단이 미립자 행렬에서 제거해야합니다. 이 방법의 또 다른 단점은 다양한 S. 때 인큐베이터 공간의 넓은 면적이 요구된다는 것이다 meliloti 유전자형은 별도 냄비 각 세균의 유전자형을 위해 사용되어야하기 때문에, 비교해야한다. "레너드 항아리는"이 방법 8,9의 변형입니다. 레너드 항아리는 하나가 다른 하나의 위에 스택 및 심지에 의해 연결된 두 개의 멸균 용기로 구성되어있다. 성장 배지는 하부 용기에 넣고, 펄라이트, 버미큘라이트, 모래 또는 상측 용기에서 하소 점토의 성장 매트릭스에 모세관 현상에 의해 심지를 통해 그려진다. 모종 (들)은 성장 행렬에 넣고 S.로 접종 meliloti. 이 방법은 물을 필요로하지 않지만, 뿌리와 결절의 검사는 모종은 입자 성장 매트릭스에서 제거해야합니다.

타나로 오의 쉬운 시험을 허용 않는 방법은 여러 가지가 있습니다TS. 이 중 하나는 투명 플라스틱 "성장 주머니"7입니다. 이 방법의 단점은 자주 물이 액체 배지가 M. 성장에 최적입니다 만 ≤ 10 ㎖ 때문에 필요한 것입니다 파우치 7 truncatula. 주머니 실험은 일반적으로 인해 주머니 안에 종이 심지의 고장, 2 주 ~ 7로 제한됩니다. 일반적으로 사용되는 두 가지 다른 방법은 식물이 한천에서 성장하고 뿌리를 볼 수 있습니다 것을 우리의 방법과 유사하지만, 이러한 방법은 우리의 절차는 피할 단점이 있습니다. 이러한 방법으로, 식물이 완전히 24.5 cm 다공성 외과 테이프를 맨 주위를 밀봉하거나면 마개 또는 플라스틱 캡 7 마개 한천 경사 관에서 재배 X 24.5 cm 한천 플레이트에 포함됩니다. 두 방법 모두 뿌리 쉽게 시험을 허용하고 멸균 유지 될 수있다. 그러나, 한천 기울기 튜브는 일반적으로 중간 7 한천 20 ㎖로 성장하고 물과 영양분이 필요합니다식물의 장기 성장 ddition. 24.5 cm 내에서 재배 식물은 24.5 cm 한천 플레이트 소우주 충분한 수분과 장기 성장을위한 영양분을 가지고 있지만, 성장 촬영이 빨리 동봉 판 소우주와 에틸렌 가스가 유괴 7을 억제 구축 할 수 있습니다 내에서 제한된다 x. 여기에 기술 된 절차에서, 촬영은 노출 및 장기 성장을 가능 매체 ~ 70 ㎖에 포함 축도 외측 자유롭게 성장한다.

여기에서 설명하는 절차는 콩과 식물의 유괴의 연구뿐만 아니라 다른 중간 크기의 식물의 뿌리 표현형의 연구뿐만 아니라 유용 할 수 있습니다. 이 소우주와 기존의 폴리 카보네이트 공장 조직 문화 단지의 차이는 여기에 설명 된 판의 소우주에 뿌리가 아래로 항아리의 맨 아래에있는 한천의 수평 층으로 한천의 수직 표면에 성장이 아닌 것입니다. 이 루트는 최소한의 개발과 한천 표면의 오프 해제 할 수 있습니다루트 머리와 현미경으로 루트 머리카락의 시험을 용이하게 뿌리 표면에 한천의 최소한의 접착에 amage.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

단계를 수행하는 1, 2, 4, 멸균 층류 후드에있는 6 좋습니다.

1. M.의 준비 truncatula A17 모종

참고 : M. 이 연구에 사용 truncatula A17 씨는 22 ° C ~에서, 또는 ~ 150-400 밀리몰 / m -2 -1의 빛 22 ~ 26 ° C에서 유지 식물의 성장 룸 냉각 온실 조건에서 생산됩니다.

  1. 종자 발아 판을 따르십시오 : 100mm 사각 접시 (깊이 15mm)를 사용하여 3 ~ 5 mm의 깊이에 10 한천 정제 V / w를 멸균 1.1 ~ 1.2 %를 붓는다. 각 플레이트 (63-125 씨 / 플레이트에 해당) 씨의 ~ 0.25-0.5 g 발아하는 데 사용됩니다.
    참고 :이 프로토콜에 설명 된 모든 플레이트에 식물 세포 배양 테스트, 정제 한천을 사용하는 것이 중요합니다. 한천의 공급 업체와 카탈로그 번호 정보는 특정 시약 및 장비의 표에 나열되어 있습니다.
  2. 혹평 / M.에게 소독 truncatula A17 씨의 : 모종의 원하는 번호에 대한 충분한 씨앗의 무게. (;이는 ~ 63-125 씨입니다 0.25-0.5 G 씨 / 플라스크) 피펫 집중 (96 %) 20 ㎖ 멸균 호일 커버와 함께 멸균 125 ㎖의 플라스크에 넣고 씨앗 (M.는 A17 씨가 각각 1 ~ 4 MG 있습니다 truncatula) H 2 SO 플라스크의 측면을 따라 4.
    참고 : 산 혹평이 씨앗을 소독합니다. 또한, 플라스크의 측면을 따라 산을 피펫 팅함으로써, 살균되지 않은 종자에 접촉 내용 플라스크의 내부를 다시 소독한다.
  3. 멸균 유리 피펫 씨의 대단히 짧은 시간을 휴식. 10 ~ 12 분 동안 자주 각 플라스크를 소용돌이 친다. 작은 갈색 구덩이 씨에 표시 될 것입니다. 이들은 종피 (11)에 작은 구멍이다.
    주 : SO 4 집중 H 2로 작업 할 때 눈 보호 장갑을 착용 할 것.
  4. SO 4 H 2를 제거하고 종자를 씻어 : 씨앗의 10 % 이상이 작은 갈색 피트, 또는 12 분을 할 때 '통과, 어느첫 번째 온다, 멸균 유리 피펫으로 플라스크에서 모든 산을 제거합니다. (최소 300 ㎖의 수돗물을 포함하는 1 ~ 2 L 비이커에 장소의 쓰레기 산.이 산을 희석하고 과열을 방지합니다. 것) 플라스크의 곡선에 남아있는 산을 수집 플라스크를 기울이고 작은 유리 피펫을 사용하여 남아있는 모든 산을 제거합니다. 잔여 산가 남아있는 경우는, 헹굼 물과 반응 씨앗을 가열하고 그들을 죽일 것입니다.
    1. 신속하게 각각의 플라스크에 멸균 초순수 100 ㎖를 부어 씨앗을 씻어. 과량의 물 볼륨이 산을 희석하고 물과 산의 반응시 발열 및 종자의 손상을 방지 할 것이다. 물을 붓고 플라스크의 입술을 화염 소독.
    2. 멸균 초순수 50 ㎖의 씨앗 8 배를 씻어. 각 린스 동안 플라스크를 소용돌이 친다. 플라스크를이 시점에서 멸균 간주되어야하고 플라스크의 립 각 린스 전에 골조한다.
  5. 씨앗이 하룻밤을 마시다 보자 후마지막 헹굼은 어두운 하룻밤에 4 ° C에서 각각의 플라스크와 장소에 멸균 호일 덮개를 장착, 각각의 플라스크에 50 ㎖ 멸균 초순수 물을 부어.
  6. 발아 접시에 장소 씨 :시키는 씨앗이 밤새 마시다 후, 씨앗을 재현 탁과에서 1.1 ~ 1.2 % 한천 발아 판에 그들을 부어 20 ㎖ 멸균 초순수, 소용돌이를 추가 한 후, ~ 25 ㎖를 초순수로 배를 씻어 물을 부어 1.1 단계. 씨앗 플라스크에 남아있는 경우, 더 많은 물을 추가하고 다시 붓​​는다. 각 플라스크에서 한 판 (63-125 씨 / 플레이트)에 씨앗을 배포합니다.
    1. 씨앗을 배포 판을 소용돌이 친다. 종자는 플레이트의 일단에 4~5cm 대역 균일하게 분포되어야한다. 이 판의 "최고"입니다. "바닥"5~6cm (그림 2A) 씨의 무료 보관해야합니다.
    2. 멸균 피펫으로 물을 그립니다. 접시의 바닥에 남아있는 물을 배수를하도록 45 ° 각도로 플레이트를 기울이십시오. 참깨에 덮개를 교체합니다테드 플레이트와 빛으로부터 보호합니다. 플레이트는 20 분을 배출 허용해야합니다. (그림 2B).
  7. 발아를 설정 : 멸균 피펫으로 기울어 진 판의 바닥에서 수집 한 모든 물을 제거합니다.
    1. 뚜껑을 교체하고 파라 필름과 플레이트를 밀봉. 장갑을 착용하고 (그림 2C) 무균 유지.
    2. 발아 플레이트 스택 다음 90 ° 각도로 그들 모두를 켭니다. 씨앗은 한천의 수직 표면에 누워됩니다. 완전히 흡수 된 씨앗 쉽게 한천을 준수해야합니다. 뿌리는 아래 (그림 2D)으로 성장할 것입니다.
    3. 빛을 차단하고 3 일 동안 25 ° C로 유지하기 위해 호일에 발아 판의 스택을 감싸십시오.

참고 : 미만 3 일간 발아가 진행되면 뿌리가 소우주에 한천에 도달이 너무 짧은 경우 일 수 있습니다. 발아는 4 일 이상 소우주 플레이트로 전송하기 전에 진행하는 경우, 모종의 생존 것가난. 만약 M. 느린 발아 속도로 truncatula의 생태형 또는 돌연변이 비교하기 위하여, 천천히 발아 생태형은 3 일 이상 발아 할 수 있어야합니다.

2. 개인 접시 소우주의 준비

  1. 각각의 소우주에 대한 Jensen의 매체 (12) (컴포지션 표 1 참조), 수 ~ 70 ml의 매체를 준비합니다. 편리한 투수 또는 플라스크에 준비 빠른 쏟아져 (투수마다 더 이상 1-2 이상의 L) 및 고압 증기 멸균시 투 자기 교반 막대를 둡니다.
    1. 매체 ~ 55 ~ 65 ° C의 보충이 추가 된 것으로 냉각, 및 pH가 (표 1 참조) 확인 한 후, 둥근 직경 100mm로 15mm 깊은 접시를 붓는다. 플레이트 ~ 0.9-1 cm 깊이 (~ 70 ㎖ / 플레이트) 주입해야한다.
    2. Jensen의 매질의 성분은 흐린 침전물을 형성 할 수있다, 그래서 아웃 침강 성분을 방지하기 위해 주기적으로 자기 교반 플레이트에 투수를 반환하는 것이 중요하다. 침전물을 마주 할 수있다그들은 응고 후 접시에 호 환, 등 그들이 균등 판에 분산되므로 성능에 영향을주지 않습니다.
    3. 접시 뚜껑에 응축의 형성을 방지하도록 붓는 도중 플레이트 스택.
  2. Jensen의 플레이트가 응고 한 후, U 자형 5 (그림 3A)에 구부러진 된 무게 주걱 두 접시와 뚜껑을 노치. 레드 핫, 노치 5-6 판까지 버너 주걱의 굴곡을 가열 한 후 다시 가열한다. 노치 뚜껑이 금이 간 접시에 배치되면,이 모종의 촬영 (그림 3B)를 성장할 통해 타원형 포털을 만들 것입니다. 노치 플레이트가 저장 될 경우에, 파라핀 필름으로 개별적으로 래핑 ..

3. Sinorhizobium의 준비 문화를 meliloti

이틀 식물 접종하기 전에, 모든 S.의 문화를 시작 meliloti 모종에 접종하는 변종. Cultu입술은 LBMC 2.5 mM의 망초, 2.5 mM의 염화칼슘, 적절한 항생제 (TY 매체도 잘 작동) 보충 (루리아 - 베르 타니 [밀러]) 매체 (13)에서 성장해야한다. 각 문화의 한 작은 2-3로 ML은 충분합니다.

  1. 세포 밀도가 될 때까지 2 일 동안 진탕 30 ° C에서 성장.
  2. 대부분의 식물 접종의 경우, S.의 성장기 meliloti는 중요하지 않습니다. 일반적으로, 후반 로그인 또는 초기 정지상 세포가 사용됩니다.

4. M.를 세우고 개인 소우주에 truncatula 모종

  1. 3 일 후에, (1 단계에서 준비) 발아 판을 열고 즉시 살균 초순수로 홍수. 딥 에탄올 및 살균하는 불꽃 간단히에 핀셋. 부드럽게 건조를 방지하기 위해 물 아래에있는 모든 모종의 뿌리 끝을 밀어 멸균 집게를 사용합니다. 뿌리는 긴 2-6센티미터 범위이다. 대부분 3 ~ 4 cm입니다. 바로 뿌리 명백한와 모종을 선택결함.
  2. 응축의 빌드 - 업에 대한 Jensen의 매체 소우주의 뚜껑을 확인합니다. 응축을 제거하거나 새로운 노치 덮개로 교체 뚜껑 톡. 뚜껑에 응축 과잉이 있으면, 모종 뿌리 덮개에 부착 될 결로가 건조 후에 후 죽는다.
  3. 집게를 사용하여 부드럽게 자엽에 의해 발아 판에서 모종을 선택하고 Jensen의 매체 소우주의 루트를하다. 루트 끝이 한천과 접촉해야합니다.
  4. 여전히 존재하는 경우 조심스럽게 종피를 제거합니다. 종자 코트 5 ~ 10 분 동안 물에 몸을 담근 후 푼다. 조심스럽게이 방법을 제공 할 때까지 집게와 종피를 애타게하고 폐기. 촬영의 자엽 약 0.5 cm 플레이트 (그림 4A)에서 U-홈 밖으로 돌출한다. 조심스럽게 모종 (그림 4B)에 대한 포털을 만들어 모종에 뚜껑의 U-노치 접시의 뚜껑을 교체합니다.모든 모종이 소우주에 배치 될 때까지 수평 스택에 옆에 접시를 설정합니다.
  5. 가능한 모양과 직선 루트가 각각의 발아 판에서 모든 모종을 사용합니다. (가능하면 그냥 접종 전에 시들지 모종 용 교체로 사용할 미개봉 모종의 한 판을 둡니다.)
  6. 모든 모종을 레이아웃 한 후, 그들이 수평 Jensen의 소우주에 앉아 할 수있는 동안 S. meliloti 접종 현탁액을 준비하고있다.

5. S.의 준비 meliloti 접종 정학

  1. S. 확인 그들이 성장하고 있는지 확인하기 위해 주기적으로 접종 문화를 meliloti. 이일 성장 후, OD (600)는 2와 4 사이 여야합니다.
  2. 피펫 멸균 1.5 ML 튜브 및 펠렛 원심 분리기에 각 문화의 0.5 ML. 뜨는을 제거합니다.
  3. 0.85 %의 NaCl 멸균 또는 살균 초순수 하나의 셀을 두 번 씻으십시오. 0.5 ml의 0.85 % 인트에 세포를 재현 탁염화나트륨 또는 초순수를 화나게.
  4. 재현 탁 S.의 1 / 10 희석의 OD 600을 측정 단계 5.3에서 문화를 meliloti. 이 독서를 바탕으로, OD 600 = 0.05 살균 초순수의 각 문화의 현탁액을 만든다. 셀 밀도가 너무 높으면, 유괴가 억제 될 수있다. 100 ㎕를 각 모종에 접종 할 수 있도록 희석 현탁액을 충분히 확인합니다. OD 600 = 0.05 현탁액의 구름 양이 눈으로 겨우인지 할 수 있어야한다.

6. 예방 접종과 소우주의 씰링

  1. 직전부터 예방 접종에, 젠슨의 매체 소우주로 전송 살아남은하지 않은 시들지 모종을 확인합니다. 발아 플레이트에서 신선한 모종과 그 묘목을 교체합니다.
  2. 각각의 소우주를 열고 해당 S. 100 μl를 접종 모종의 루트에 현탁액을 meliloti. 뚜껑을 교체하고 수평 STAC에 따로6-10 소우주 캔자스. 각 S.위한 meliloti 변형이 비교되는, 적어도 15 식물을 접종. 공생의 생산성에 미묘한 차이가있을 균주의 경우, 30 ~ 35 식물을 접종. 음성 대조군으로 uninoculated 최소 10 식물을 둡니다. S.와 30-35 식물을 접종 meliloti 1021 또는 기타 적절한 야생형 균주는 양성 대조군 역할을한다.
  3. S. meliloti 서스펜션은 루트 표면에 흡착하는 시간을 가졌으며 현탁액은 한천 (20 분 이상).에 배어있다, 파라핀 필름 개별적으로 판을 감싸줍니다. 플레이트는 노치의 매우 가장자리에 싸여해야하지만, 파라핀 필름은 모종 (그림 4C)의 성장을 차단되지 않아야합니다.
  4. 포장시에는, 접시 뚜껑의 안쪽에 부착 뿌리에 대한 최종적인 검사를한다. 뚜껑의 부착 뿌리를 제거 벤치에 플랫 플레이트를 놓고 한천 SU에 다시 아래로 뿌리를 노크 뚜껑을 누르거나 가볍게하려면rface.
  5. 6-10 플레이트의 각 스택의 모종 포털을 라인업. 모종 (그림 4D) 위쪽을 가리키는 90 ° 각도로 스택을 놓습니다. 파라핀 필름의 끈적 거림은 모종 (그림 4E)를 등장 곳에 풀린 1-2 센티미터 지구를 떠나, 호일에서 전체 스택을 바꿈에 충분히 장소에 접시를 개최한다. 호일은 빛으로부터 뿌리를 보호 할 것입니다.
  6. (16 시간 조명 / 8 시간 어두운주기에 21 ~ 25 ° C의 60 % ~ 70 %의 상대 습도와 100-175 μmol / m -2 -1의 빛을 조명 성장 챔버 또는 성장 방에 호일 포장 스택을 배치 그림 1A). 이러한 성장 조건에서 가벼운 수준에서 장기간 배양보다 높은 200 μmol / m -2 -1의 식물 성장에 해로운 영향을 미칠 수 있습니다.

7. 루트 시스템 및 공생 표현형의 정량 시험

식물에서 유지 될 수있다최대 9 주 소우주.

  1. 결절 번호는 각 스택에서 포일 언 래핑 및 결절 계수함으로써 일련의 시점들에서 정량화 될 수있다. S. 접종 식물에 결절 개발 meliloti 1021 야생형 접종 후 10-14일에 의해 명백하다.
  2. 공생 생산성 또한 새로운 싹의 길이를 측정함으로써 각 시점에서 측정 될 수있다.
  3. 공생 생산성의 최종 정량은 일반적으로 촬영을 분리하고 촬영의 신선한 무게를 측정하여 접종 후 7 주에 수행된다. 이상 성장이 요구되는 경우에는이 단계를 늦게 구주로서 수행 될 수있다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

이 판의 소우주의 준비 및 접종 소개 참조 대부분의 다른 방법에 비해 비교적 간단하다. 이 소우주의 사용은 또한 물이나 영양 보충, 루트 불임의 유지 보수, 모두 뿌리와 빛으로부터 뿌리를 보호 쉽게 검사하지 않고 (9 주간까지) 연장 식물의 성장을 허용, 식물의 제약 성장의 촬영에 쉽게 액세스를 촬영 길이 측정 및 루트 모발 손상을 최소화 소우주에서 식물의 제거. 그림 1A는 인큐베이터에서 소우주에서 성장 어린 모종을 보여줍니다. 그림 1B-1E 쇼의 이미지 M.를 포함하는 소우주의 여러 다른보기 야생형 S. 접종 truncatula A17 식물 meliloti 1021. 단단히 포장하는 경우> 220 소우주의 x 67.5 cm 인큐베이터 선반 73.8 cm에 맞는 것입니다.에 1B 및 1C 쇼 소우주 피규어포일 포장 소우주의 포털에서 신흥 식물 스택. 그림 1D 제거 포일 루트 플레이트의 전면을 통해 보여주는 결절을 가진 하나의 소우주를 보여줍니다. 그림 1E 같은 소우주가 신흥 공장 납작하게 보여줍니다 접시에 포털. 촬영 길이가 공장을 방해하지 않고 소우주 (그림 1C)에서 출현의 관점에서 측정 할 수있다. 그림 (a)는 M. 촬영을 위해 길이의 데이터를 보여줍니다 야생형 S. 접종 truncatula A17 식물 meliloti 1021 uninoculated 칠주에서 식물과 구주 후 접종과 비교. 소우주의 성장 결절 개발 및 촬영 길이 timepoints의 시리즈를 수집하기위한 이상적입니다. 최종 평가시기에서 촬영이 촬영 신선한 무게 (그림 5B)의 측정을 위해 잘립니다있다. 6 7 주 pos의 3 공생 표현형의 예를 보여줍니다T-접종. M.의 상대 공생 생산성 다른 S. 접종 truncatula A17 식물 meliloti 균주 촬영 길이 (그림 6A)에 의해 정량화와 신선한 무게 (그림 6B)를 촬영하고 있습니다. 이 균주를 접종 식물에 뿌리혹의 수는 그림 (c)에 표시됩니다. leghemoglobin의 생산으로 인해 핑크 색상은 흰색의 작은 결절은 일반적으로 비 기능 및 / 또는 중단하고 갈색 결절이 노화와 14-18 괴사 동안 결절이, 기능 및 질소 고정 능력이 있음을 나타냅니다. 그림 6의 비교를 보여줍니다 M.의 공생 생산성 S. 접종 truncatula A17 식물 meliloti 1021 ExoY undecaprenyl - 인산 갈락토오스 포스 포를 과발현 PSTB-LAFR5-exoY 플라스미드를, 운반 야생형 S.보다meliloti 1021 및 네거티브 형 C 운반 균주 ontrol PSTB-LAFR5 플라스미드. 이 ExoY 이상 발현 균주는 제어 계통 이상 succinoglycan 공생 엑소 폴리 사카 라이드의 이상을 생산하고 있습니다. 명시하는 몇 주 걸릴 공생 표현형의 차이를 정량화 할 수있는 능력은이 방법의 가장 큰 장점이다. M.에 공생 생산성의 모든 대책 truncatula A17는 Sinorhizobium medicae 변종 WSM419 및 ABS7는 S.보다 더 나은 수행 meliloti 1021 (그림 6A-6C). (그림 6의 데이터는 원래 19) 2012 (존스에 등장.) 소우주를 분해 신선한 무게를 촬영되는 시점에서이 뿌리는 또한 현미경으로 이미징 할 수있다, 측정된다. 그림 7은 M. 대표 전망을 보여줍니다 소우주에서 제거 후 truncatula A17 뿌리. 뿌리는 한천의 표면에 누워까지 뿌리 한천의 수평 층에서하지 않기 때문에 루트 머리는 최소한의 피해를 경험했다.

접시에 한천 성장 매체의 ~ 70 ㎖를가 있기 때문에 _content "> 식물이 소우주에서 최대 9 주 동안 유지할 수있다. 이상 성장 기간 후 일부 식물은 건조하기 시작할 수 있습니다. 성장, 7 주, 공생을위한 최적 S.는 1021 meliloti으로. M.의보다 효율적인 공생 S. medicae WSM419 또는 S. medicae ABS7 4-5 주 짧은 성장 기간과 A17을 truncatula 최적입니다.

L 당 최종 농도 스톡 용액의 양 주식 농도
1g CaHPO 4 NA NA
0.2 g 망초 · 7H 2 0 1 ㎖ 0.2 g / ㎖
0.2 g의 K 2 HP0 4 1 ㎖ 0.2 g / ㎖
0.2 g의 NaCl 1 ㎖ 0.2g / ㎖
0.1 g에 FeCl 3 · 6H20 1 ㎖ 0.1 ㎍ / ㎖
11.5 g 한천 - 정제 (한천 사양에 대한 특정 시약의 표 참조)
를 MilliQ H 2 0에서 1 L

표 1. 판 소우주에 대한 Jensen의 중간 한천 프로토콜입니다. Jensen의 매체를위한 준비 지침.

단계 :

  1. 재료 위에 추가하고, 자기 교반 막대로 혼합한다.
  2. 투수의 교반 막대와 오토 클레이브 45 분, 액체주기.
    참고 : CaHPO 4에 FeCl 3 고압 증기 멸균 동안 침전됩니다. 서스펜션에 다시 얻을 수 저어, 미디어는 여전히 흐린 남아
  3. 이 맨손으로 투수를 데리러 고통없는 때까지 교반하면서 냉각.
  4. 1 WH (제조법은 아래 참조) L 당 미량 미네랄 밀리리터 추가일 교반
    참고 : 분배하기 전에 미네랄 성분의 침전물을 재현 탁해야합니다.
  5. 교반하면서, L 당 0.25 ㎖의 4 N의 NaOH를 추가합니다.
  6. 멸균 피펫 ~ 100 ㎕의 미디어를 제거하고 pH를 종이에 적용하여 pH를 확인
    참고 : pH를 5-10 범위의 용지가 잘 작동합니다. pH는 7 ~ 풀 컬러 개발을위한 몇 초를 허용해야한다. pH가 정확하지 않으면, 준비 오류가 있을지도 모른다.
  7. 자기 교반 판에 반환하여 플라스크를 리믹스, 가능한 한 두꺼운 판을 붓고
    참고 : 접시가 지나치게 많이하는 경우 (즉, 액체가 뚜껑의 하단에 짜증)
    참고 : ~ 리터 당 15 판을 얻​​을 것으로 기대합니다.

미네랄에게 주식 1 L를 추적 (고압 증기 멸균)

1g의 H 3 BO 3
1g ZnSO 4 · 7H 2 0
0.5 g의 CuSO 4 · 5H 2 0
0.5 g의 MnCl 2 · 4H 2 0
1g의 NaMoO 4 · 2H 2 0
MILI-Q의 H 2 0 L 1

그림 1
그림 1. S. 접종 식물을 포함하는 소우주의 전망 meliloti 1021) 인큐베이터에서 성장 소우주 판에있는 식물. B) M. S. 접종 truncatula A17 식물 루트와 B와 C의 소우주 판의 한 소우주. D에있는 노치를 통해 성장하는 식물)를 표시하는 B의 판 Jensen의 한천 소우주의 상단에있는 홈을 통해 성장 meliloti 1021 야생형. C) 추가 확대보기 뚜껑을 통해 몇 군데 결절. E) 아프로 판M D 노치에서 신흥 촬영 평평 거짓말.

그림 2
그림 2. 종자 발아 접시 세트입니다. A) 씨는 100mm 사각형 접시. B의 절반에 분산되어있는) 한천 표면에 물이 기울어 진 판의 아래쪽에 수집 할 수 있도록하여 배출된다. C) 오븐은 스택에게), 파라핀 필름에 싸여 적층 D있다 90 O 각도 설정 및 호일에 싸여.

그림 3
그림 3. 구부러진 주걱으로 Jensen의 플레이트를 금을 내기로 소우주의 건설. A) 타원형을 형성하도록 절곡 된 금속 계량 헤라 화염 가열되고 측면에 U 자형 노치 구멍을 사용접시와 뚜껑의 측면에서. 접시에 U-노치의 바닥은 한천 표면의 맨 위에 있어야합니다. 뚜껑에있는 U-노치의 바닥은 모종이 돌출 할 수있는 타원형 모양의 포털을 만들어 접시에 뚜껑을 교체) 모든 방법 뚜껑. B의 맨 위에 있어야합니다.

그림 4
그림 4. 소우주에 모종의 삽입. A) 두 개의 뷰는 모종의 뿌리가 줄 노치와 함께 접시에 뚜껑을 배치) 촬영이 접시입니다. B)C의 U-홈 밖으로 돌출의 자엽 및 ~ 0.5 cm로 한천 표면에 배치하는 방법을 보여 모종을위한 타원형 포털을 만들 것입니다. 파라핀 필름 단단히 판을 포장하는 이동 뚜껑을 유지하고 건조를 방지 할 수 있습니다. D) 플레이트는 함께 누적 될 수있다 6-10의 그룹 및 E)에 호일로 싸서. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 5
그림 5. 대표 공생 표현형 칠주 성장과 M. 9 주 동안 성장 후 S. 접종 식물의 truncatula 개별 소우주에있는 A17.) 촬영 길이 meliloti 1021 및 uninoculated 식물의 싹의 길이는 소우주에서 식물을 제거하지 않고 칠주에서 측정 하였다. 구주에 접종 후, 촬영 길이 (A)를 측정하고, 다음 촬영은 클리핑 및 (B)을 칭량 하였다.

. JPG "/>
그림 6. 대표 공생 표현형 M. 7 주 동안 성장 후 truncatula A17 개별 소우주에. S.의 변종을 exoY 과발현 meliloti 1021 기주 식물 개자리의 truncatula의 A17에 공생을 강화했다. S.의 공생 생산성 meliloti 1021 M. 흥분 truncatula A17는 exoY로 인코딩 된 undecaprenyl - 인산 갈락토오스 포스 포를 과발현 균주 향상된다. 공생 생산성 cm의 (A) 촬영 길이로 측정하고 (B) 그램 신선한 무게를 촬영한다. 흰색, 효과 결절 (중간 그래프 막대), 핑크, 기능성 결절 (아래 그래프 막대)의 숫자와 브라운, 괴사 성 결절 (위 그래프 막대) (C)에 표시됩니다. S. 접종 식물의 공생 생산성과 결절 번호 medicae 변종 WSM419 및 ABS7도 표시됩니다. 그래프 막대에 별표 통계를 나타냅니다짝 t-검정에서 1,021 야생형 참조 균주에서 LY 유의 한 차이. 어떤 succinoglycan를 생성하지 않는 exoY :: TN5 NULL 돌연변이 접종 식물 uninoculated 식물과 유사한 촬영 길이와 신선한 무게를 가지고, 오직 흰색, 효과 결절을 생산. (A)와 (B)는 원래 19 일에 발표 된 그래프. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 7
그림 7. 그들은 한천의 표면에 놓여 있기 때문에 소우주에서 제거 후 해부 현미경에 몇 군데 뿌리. 뿌리는 쉽게 루트의 머리에 최소한의 손상과 영상의 소우주에서 제거 할 수 있습니다. 이미지는 M.의 뿌리를 보여 십일 후 접종 (A, B)에서 truncatula A17 (C). 도시 뿌리는 S로 접종 meliloti 1021 야생형 (A), S. meliloti eglC :: GUS 융합 (B)를 운반하는 변형 및 S. SMc00911 :: GUS 융합 (20) (C)를 ​​들고 meliloti 변형. S.의 GUS 염색 SMc00911 :: GUS 융합을 들고 meliloti 세포는 루트의 머리에 볼 수 있으며 E. 바의 루트 표면은 100 μm의에 해당한다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

성공을위한 중요한 프로토콜의 몇 가지 단계가 있습니다 : 1) 정제, 식물 세포 배양을 사용의 필요성은 한천은 아무리 강조해도 지나치지 않습니다 테스트. 이것은 알팔파 모종 중요하지이지만, M.의 성장에 중요 truncatula A17. 2) 1 단계에서 설명 된대로 수직 한천 플레이트에 모종을 발아하는 것이 중요합니다. 모종의 뿌리가 바로 너무 짧은 및 / 또는 일 것이다 때문에 15mm 깊이 판 (7)의 반전 수평 표면에 모종을 발아의 널리 사용되는 기술은이 프로토콜에 대한 권고하지 않습니다. 길이 2-4 ㎝의 직선 성장 뿌리 모종 소우주에 발아 플레이트에서 전송에 적합하다. 수직 발아 플레이트 성장의 세 가지 일이 길이를 달성하기 위해 일반적으로 뿌리에 이상적입니다. 3) 이전에 접종 박테리아 (Rhizobi​​a)와 모종의 오염을 방지하는 것도 중요하다. microco에 발아 판에서 모종의 양도하기 전에SMS는, 작업 영역 철저 에탄올로 세척해야하고 전송에 사용되는 모든기구는 멸균 자주 화염이어야한다. 오염의 또 다른 잠재적 인 소스는 S.를 제조함으로써 회피 할 수있다 준비 모종에 사용되는 별도 작업 영역에있는 소우주의 접종에 대한 meliloti 변형 현탁액. 곰팡이 포자 코트에 내장 될 수 있으므로 소우주 진균의 오염은 또한 축소판의 내부로부터 종피의 모든 잔존물을 제거함으로써 피할 수있다. 4) 모종의 생존은 전송하는 동안 항상 촉촉하고 한천과 접촉 모종의 뿌리를 유지하고, 아주 부드럽게 처리하여 극대화 할 수 있습니다. 발아 판에 한천에 갇혀 루트 어떤 모종은 뿌리의 손상을 방지하기 위해주의 깊게 절제해야한다. 가능한 식물의 높은 수율을 시작하기 전에 예방 접종 소우주의 스택에 시든 모종을위한 최종 점검을하고, 그들에게 지혜를 교체함으로써 달성 될 수있다H 새로운 모종. 모종 상태가 양호 플레이트 뚜껑의 안쪽에 부착하지 않은 경우, 모종의 5 % 미만이 단계에서 교체해야한다. 소우주에서 촬영 성장의 방해가 확인 종피 더 나머지는 자엽을 제한되지 않도록하고, 소우주는 파라 필름 감싸 촬영이 방해되지 않도록 조심스럽게 것을함으로써 방지 할 수있다.

우리는 일상적으로 기주 식물의 공생을 연구하기 위해이 방법을 사용 M. truncatula A17와 알팔파, 우리는 현재 다른 M.의 성장을위한 기술을 최적화하는 truncatula 품종, 개자리의 다른 종과 Melilotus (sweetclovers)의 종. 우리는 아직 M.으로이 방법을 테스트하지 않았습니다 A17와 유전자지도 파트너로 사용되는 생태형입니다 truncatula A20. 우리는 발견 그 M. 이력서를 truncatula. R108은 정제 된 식물 세포 배양 시험 AG에서 잘 성장하지 않습니다우리가 현재 사용하고 우리가 또 다른 한천 준비 또는이 품종에 대한 축소판 성장 기판으로 사용하기 위해 한천 대체를 식별하기 위해 노력하고있다 아칸소.

M.의 분석을위한 기타 일반적으로 사용되는 방법으로 여기에 설명 된 방법을 비교하면 truncatula A17 / S. 공생을 meliloti, 우리는이 동시에 S. 많은 수의 공생 성능을 비교하기 위해 지금까지 최선의 방법으로 수 발견 긴장을 meliloti. 우리는 정기적으로 한 번에 250 소우주를 설정 (S. meliloti 25 식물 각각에 접종의 10 가지 변종.) 때 S. 단 하나의 유전자형 meliloti 또는 S. medicae가 사용되는, 및 교차 오염 위험이없는, aeroponic 케이슨 또는 성장 주머니가 더 적절한 방법이 될 수 있습니다. 이 판의 축소판 방법은 오랜 기간 동안 결절 개발과 공생 생산성의 진행을 정기적으로 관찰을 만들기위한 가장 좋은 방법입니다시간. 이러한 결절 노화로 공생의 나중 단계에서 명시 표현형은 다른 프로토콜보다이 방법으로 더 쉽게 공부하실 수 있습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgments

우리는 원고의 중요한 검토를 위해 브라이언 K. 워시번 감사 KMJ에 20582 -이 작품은 USDA 국립 식량 농업 연구소, 농업 및 식품 연구 이니셔티브 부여 2010-65108에 의해 투자되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar purified, plant cell culture-tested Sigma A7921

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Galibert, F., et al. The composite genome of the legume symbiont Sinorhizobium meliloti. Science. 293, 668-672 (2001).
  2. Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480, 520-524 (2011).
  3. Glazebrook, J., Walker, G. C. Genetic techniques in Rhizobium meliloti. Methods Enzymol. 204, 398-418 (1991).
  4. Cheng, X., Wen, J., Tadege, M., Ratet, P., Mysore, K. S. Reverse genetics in medicago truncatula using Tnt1 insertion mutants. Methods Mol Biol. 678, 179-190 (2011).
  5. Leigh, J. A., Signer, E. R., Walker, G. C. Exopolysaccharide-deficient mutants of Rhizobium meliloti that form ineffective nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 6231-6235 (1985).
  6. Wong, K. K. Y., Fortin, J. A. A Petri Dish Technique for the Aseptic Synthesis of Ectomycorrhizae. Canadian Journal of Botany-Revue Canadienne De Botanique. 67, 1713-1716 (1989).
  7. Barker, D. G., et al. The Medicago truncatula handbook. Mathesius, U., Journet, E. P., Sumner, L. W. (2006).
  8. Leonard, L. T. A Simple Assembly for Use in the Testing of Cultures of Rhizobia. J Bacteriol. 45, 523-527 (1943).
  9. Trung, B. C., Yoshida, S. Improvement of Leonard jar assembly for screening of effective rhizobium. Soil Sci Plant Nutr. 29, 97-100 (1983).
  10. Penmetsa, R. V., Cook, D. R. Production and characterization of diverse developmental mutants of Medicago truncatula. Plant Physiol. 123, 1387-1398 (2000).
  11. Garcia, J., Barker, D. G., Journet, E. P. The Medicago truncatula handbook. Mathesius, U., Journet, E. P., Sumner, L. W. (2006).
  12. Vincent, J. M. A Manual for the Practical Study of the Root-Nodule Bacteria. Blackwell. (1970).
  13. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1982).
  14. Pladys, D., Vance, C. P. Proteolysis during Development and Senescence of Effective and Plant Gene-Controlled Ineffective Alfalfa Nodules. Plant Physiology. 103, 379-384 (1993).
  15. Vasse, J., de Billy, F., Truchet, G. Abortion of infection during the Rhizobium meliloti-alfalfa symbiotic interaction is accompanied by a hypersensitive reaction. The Plant J. 4, 555-566 (1993).
  16. Johnson, L. E. B., Vance, C. P. Histological and Biochemical Comparisons of Plant Induced Ineffective Nodules. Phytopathology. 71, 884 (1981).
  17. Vance, C. P., Johnson, L. E. B., Hardarson, G. Histological Comparisons of Plant and Rhizobium Induced Ineffective Nodules in Alfalfa. Physiological Plant Pathology. 17, 167 (1980).
  18. Van de Velde, W., et al. Aging in legume symbiosis. A molecular view on nodule senescence in Medicago truncatula. Plant Physiol. 141, 711-720 (2006).
  19. Jones, K. M. Increased production of the exopolysaccharide succinoglycan enhances Sinorhizobium meliloti 1021 symbiosis with the host plant Medicago truncatula. J Bacteriol. 194, 4322-4331 (2012).
  20. Queiroux, C., et al. A comparative genomics screen identifies a Sinorhizobium meliloti 1021 sodM-like gene strongly expressed within host plant nodules. BMC Microbiol. 12, 74 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics