Einzel-Anlage, steril Mikrokosmen für Knöllchenbildung und des Wachstums der Pflanze Hülsenfrucht * These authors contributed equally

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Summary

Wachstum von Medicago truncatula Pflanzen in Symbiose mit der Stickstoff-fixierenden Bakterien Sinorhizobium meliloti einzeln steril Mikrokosmen von Standard-Laborplatten ermöglicht häufige Prüfung der Wurzelsysteme und Knötchen, ohne Sterilität. Pflanzen in den Wachstumskammern für bis zu 9 Wochen aufrechterhalten werden.

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Jones, K. M., Mendis, H. C., Queiroux, C. Single-plant, Sterile Microcosms for Nodulation and Growth of the Legume Plant Medicago truncatula with the Rhizobial Symbiont Sinorhizobium meliloti . J. Vis. Exp. (80), e50916, doi:10.3791/50916 (2013).

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Abstract

Rhizobia Bakterien bilden symbiotische, Stickstoff-fixierende Knöllchen an den Wurzeln der Leguminosen-kompatible Host-Pflanzen. Einer der gut entwickelten Modellsysteme für die Untersuchung dieser Wechselwirkungen ist die Pflanze Medicago truncatula cv. Jemalong A17 und die rhizobial Bakterium Sinorhizobium meliloti 1021. Wiederholte Bildgebung von Pflanzenwurzeln und Scoring von symbiotischen Phänotypen erfordert Methoden, die nicht-destruktive entweder Pflanzen oder Bakterien sind. Die symbiotische Phänotypen von einigen pflanzlichen und bakteriellen Mutanten offensichtlich nach relativ kurzer Perioden des Wachstums und haben langfristige Beobachtung der Wirt / Symbionten Interaktion erfordert. , Feine Unterschiede in der Effizienz und symbiotische Knoten Seneszenz Phänotypen, die in den frühen Stadien der Knöllchen Verfahren ersichtlich sind, erfordern jedoch relativ lange Wachstumsperioden, bevor sie bewertet werden können. Mehrere Verfahren wurden für langfristiges Wachstum und Beobachtung dieser Wirt / Symbionten Paar entwickelt.Viele dieser Verfahren erfordern jedoch wiederholt Wässern, die die Möglichkeit der Verunreinigung durch andere Mikroorganismen erhöht. Andere Verfahren erfordern einen relativ großen Raum für das Wachstum einer großen Zahl von Pflanzen. Die hier beschriebene Methode, symbiotische Wachstum von M. truncatula / S. meliloti in sterilen Einweg-Anlage in Mikrokosmen, hat mehrere Vorteile. Pflanzen in diesen Mikrokosmen ausreichend Feuchtigkeit und Nährstoffe, um sicherzustellen, dass die Bewässerung nicht bis zu 9 Wochen erforderlich, eine Kreuzkontamination verhindert wird beim Gießen. Dies ermöglicht Phänotypen zu quantifizieren, die in kurzfristigen Wachstumssysteme, wie subtile Verzögerungen bei der Entwicklung und Knötchen Knötchen frühen Seneszenz verpasst werden könnte. Auch werden die Wurzeln und Knollen im Mikro leicht durch die Deckelplatte betrachtet, so up-Verwurzelung der Pflanzen für die Beobachtung ist nicht erforderlich.

Introduction

Die Interaktion zwischen der Hülsenfrüchte Wirtspflanze Medicago truncatula A17 und dem Bakterium rhizobial Sinorhizobium meliloti 1021 ist eine der am meisten gefügig Modellsysteme für die Untersuchung von Knöllchenentwicklung und Stickstoff-fixierenden Symbiose. Die Genome der beiden Symbiosepartnern wurden sequenziert 1,2 und sowohl Pflanzen-und Bakterium sind zugänglich für genetische Manipulation 3,4. Analyse der Phänotypen von sowohl pflanzlichen und bakteriellen Mutanten erfordert die Fähigkeit, die Stufen des Knotens Entwicklung zu beobachten und die symbiotische Produktivität über die Zeit quantifiziert. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Beobachtung der Knöllchen Entwicklung M. truncatula cv. Jemalong A17 mit S. geimpft meliloti 1021 innerhalb der einzelnen Mikrokosmen von Standard, rund 100 mm Durchmesser, 15 mm tief Laborplatten (1A) gemacht. Das Shooting wird durch eine Kerböffnung an der Seite der Platte (ausgesetzt und wächst Figurn 1B, 1C und 1E). Wurzeln in den Mikrokosmen enthalten und steril gehalten, während eine Beobachtung durch den Deckel der Platte (Fig. 1D). Da die Aufnahmen zugänglich ist, wird sein Wachstum nicht eingeschränkt und es können in periodischen Zeitabständen, ohne die Sterilität des Wurzel gemessen werden. Das Verfahren zum Erzeugen von Kerbplatte Mikrokosmen wurde ursprünglich von Leigh et al. 5 für wachsende Alfalfa-Pflanzen entwickelten, aber es war nicht weit trotz seiner vielen Vorteile gegenüber anderen Verfahren angewandt. Eine Variante dieses Verfahrens wurde auch für die Analyse der Wechselwirkung zwischen Pflanzenwurzeln und Mykorrhiza 6 entwickelt. Wir haben nun eingerichtet und für das Wachstum von M. optimiert dieses Verfahren truncatula Pflanzen. Die Vorteile dieses Protokolls über häufigsten verwendeten Verfahren sind nachstehend beschrieben.

Es gibt mehrere Methoden, die derzeit im breiten Einsatz für Knöllchen Studien von M. truncatula inokuliertlated mit S. meliloti 7. Das am häufigsten verwendete Verfahren für die großtechnische Herstellung von knotige Wurzeln ist das Wachstum in aeroponischen Senkkästen 7. Bei diesem Verfahren werden die Pflanzen in einem großen Gefäß suspendiert und Wurzeln werden mit einer Mischung aus S. belüftet meliloti-und Nährstofflösung 7. Diese Methode ist praktisch, wenn nur ein Genotyp von S. meliloti getestet werden. Da es Aerosolisierung von hohen Konzentrationen von Bakterien erfordert, gibt es eine hohe Wahrscheinlichkeit einer Kreuzkontamination zwischen den Kästen mit verschiedenen Bakterienstämmen beimpft. Ein weiteres Verfahren, das oft verwendet wird, um große Mengen von inokulierten Pflanzen herzustellen, ist das Wachstum in Kübeln oder Töpfen, Perlit, Vermiculit, Sand oder calcinierten Ton, die mit Nährstofflösung infundiert werden und mit S. inokuliert meliloti 7. Diese Methode erfordert die Verwendung von offenen Kübeln oder Töpfen und erfordert Bewässerung und die Wiederauffüllung der Nährlösung. Ein weiterer Nachteil ist, dass Pflanzen Töpfemuss dieses teilchenförmige Matrix zur Prüfung der Wurzeln und Knollen entfernt werden. Ein weiterer Nachteil dieser Methode ist, dass ein großer Bereich der Inkubator Platz benötigt, wenn viele verschiedene S. meliloti Genotypen zu vergleichen sind, weil ein separater Topf muss für jeden Bakterien Genotyp verwendet werden. Die "Leonard jar" ist eine Variante dieser Methode 8,9. Ein Leonard Glas besteht aus zwei sterilisierte Gefäße übereinander gestapelt der anderen und durch einen Docht verbunden sind. Wachstumsmedium ist in dem unteren Gefäß gegeben und durch den Docht durch Kapillarwirkung in eine Wachstumsmatrix von Perlit, Vermiculit, Sand oder calcinierten Ton im oberen Gefäß gezogen. Der Keimling (s) in der Wachstumsmatrix eingebracht und mit S. inokuliert meliloti. Dieses Verfahren erfordert keine Bewässerung, aber Prüfung der Wurzeln und Knollen erfordert, dass der Keimling aus dem teilchenförmigen Wachstumsmatrix entfernt werden.

Es gibt mehrere Methoden, die einfach nicht zulassen Prüfung roots. Eine davon ist die transparente Kunststoff "Wachstumsbeutel" 7. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist, dass häufige Bewässerung da nur ≤ 10 ml flüssiges Medium ist optimal für wachsende M. erforderlich truncatula in Beuteln 7. Pouch Experimente sind in der Regel auch nach ~ 2 Wochen 7 begrenzt, bedingt durch den Zerfall des Papiers Docht in dem Beutel. Zwei weitere Methoden, die üblicherweise verwendet werden, sind ähnlich unserer Verfahren, daß die Pflanzen auf Agarplatten gezüchtet und die Wurzeln sichtbar sind, aber diese Verfahren weisen Nachteile auf, die unserem Verfahren vermeidet. Bei diesen Verfahren werden die Pflanzen vollständig in 24,5 cm x 24,5 cm Agar-Platten um die Spitze mit porösen chirurgischen Band versiegelt oder in Agar-Schrägröhrchen mit Baumwolle Topfen oder Kunststoffkappen verschlossen gewachsen 7 enthalten. Beide Methoden ermöglichen eine einfache Prüfung der Wurzeln und steril gehalten werden. Jedoch werden die Agar-Schrägröhrchen in der Regel mit 20 ml Agarmedium gewachsen 7 und erfordern eine Bewässerung und Nährstoffddition für langfristige Wachstum der Pflanzen. Pflanzen innerhalb der 24,5 cm x 24,5 cm gewachsen Agar-Platte Mikrokosmen ausreichend Feuchtigkeit und Nährstoffe, die für langfristiges Wachstum, aber die wachsende Shooting wird schnell in die geschlossene Platte Mikrokosmos und Ethylengas aufbauen kann Hemmung Nodulation 7 eingeschränkt. In dem hier beschriebenen Verfahren wird der Shooting ausgesetzt und wächst frei außerhalb des Mikrokosmos, der ~ enthält 70 ml Medium, so dass langfristige Wachstum.

Das hier beschriebene Verfahren kann nicht nur für die Untersuchung der Nodulation von Hülsenfruchtpflanzen, aber auch für die Untersuchung der Wurzel Phänotypen anderen mittelgroßen Anlagen nützlich sein. Der Unterschied zwischen diesen Mikrokosmen und einem traditionellen Polycarbonat Pflanzengewebe-Kulturgefäß ist, dass Wurzeln in den hier beschriebenen Platten Mikrokosmen wachsen auf der vertikalen Oberfläche des Agars anstatt nach unten in eine horizontale Schicht aus Agar am Boden des Glases. Dies ermöglicht die Wurzel aus der Agar-Oberfläche mit minimaler d angehoben werdenAmage Wurzelhaare und minimale Haftung Agar zu der Wurzeloberfläche, der die Prüfung der Wurzelhaare durch Mikroskopie ermöglicht.

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Protocol

Ausführen der Schritte 1, 2, 4 und 6 in einem sterilen Abzug mit laminarer Strömung wird empfohlen.

1. Vorbereitung von M. truncatula A17 Sämlinge

Hinweis: M. truncatula A17 Samen in diesen Studien verwendet werden unter Gewächshausbedingungen gekühlt bei ~ 22 ° C, oder in einem Pflanzenwachstumsraum bei 22-26 ° C mit ~ 150-400 mmol / m -2 s -1 Licht gehalten hergestellt.

  1. Gießen Sie die Keimung der Samen Platten: Mit 100 mm quadratische Platten (15 mm tief) und gießen autoklaviert 1,1-1,2% w / v Agar-10 bis zu einer Tiefe von 3-5 mm gereinigt. Jede Platte wird verwendet, um ~ 0,25 bis 0,5 g Samen (entspricht 63 bis 125 Samen / Platte) keimen werden.
    Hinweis: Es ist wichtig, Pflanzenzellkultur-geprüft, gereinigt Agar für alle in diesem Protokoll beschriebenen Platten zu verwenden. Der Verkäufer und Katalognummer Informationen für den Agar ist in der Tabelle der spezifischen Reagenzien und Geräten angegeben.
  2. Scarify / sterilisieren M. truncatula A17 Saatguts: Wiege ausreichend Samen für die gewünschte Anzahl von Keimlingen. (M. truncatula A17 Samen ~ 4 mg) Platz Samen in sterile 125 ml-Kolben mit einer sterilen Folienabdeckung (0,25-0,5 g Samen / Kolben; dies ~ 63-125 Samen) und Pipette 20 ml konzentrierter (96%) H 2 SO 4 an den Seiten des Kolbens.
    Hinweis: Säure Skarifikation werden die Samen zu sterilisieren. Auch durch Pipettieren der Säure entlang der Seiten des Kolbens, wird es erneut sterilisieren das Innere des Kolbens, die in Kontakt mit den nicht sterilisierten Samen gekommen ist.
  3. Break up Klumpen von Saatgut mit einem sterilen Glaspipette. Der Kolben schwenken häufig für 10-12 min. Klein, braun Gruben werden auf die Samen sichtbar. Dies sind winzige Löcher in der Samenschale 11.
    Hinweis: Tragen Sie einen Augenschutz und Handschuhe bei der Arbeit mit konzentrierter H 2 SO 4.
  4. Entfernen H 2 SO 4 und spülen Samen: Wenn mindestens 10% der Samen haben kleine braune Gruben, oder 12 Minuten vergangen sind, je nachdem, welcherzuerst kommt, entfernen Sie alle Säure aus den Kolben mit einem sterilen Glaspipette. (Ort Abfallsäure in eine 1-2 L Becherglas mit mindestens 300 ml Leitungswasser. Dadurch wird die Säure zu verdünnen und eine Überhitzung zu vermeiden.) Neigen Sie den Kolben, um die verbleibende Säure in der Kurve der Flasche sammeln und mit einem kleinen Glaspipette auf entfernen Sie alle verbleibenden Säure. Wenn Restsäure bleibt, wird es mit dem Spülwasser reagieren, heizen die Samen und sie töten.
    1. Spülen von Samen schnell Gießen 100 ml sterile Reinstwasser in jeden Kolben. Die überschüssige Menge Wasser wird die Säure verdünnt und während der Reaktion der Säure mit dem Wasser Überhitzung und Saatgut Schäden zu vermeiden. Gießen Sie das Wasser ab und Flamme sterilisieren die Lippe der Flasche.
    2. Spülen Samen 8-10x mit 50 ml sterilem Reinstwasser. Schwenken Sie die Flasche bei jeder Spülung. Der Kolben ist an dieser Stelle als steril zu betrachten und die Lippe der Flasche sollte vor jeder Spülung geflammt werden.
  5. Lassen Samen trinken über Nacht: Nach derletzten Spülgang, gießen Sie 50 ml sterile Reinstwasser in jeden Kolben, ersetzen Sie die sterile Folienabdeckung auf jeder Flasche und bei 4 ° C über Nacht im Dunkeln.
  6. Platz Samen auf die Keimung Platte: Nach dem Lösen Samen über Nacht trinken, Wasser abgießen, spülen 2x mit ~ 25 ml ultrareines Wasser, dann mit 20 ml sterilem Reinstwasser, Wirbel um Samen zu suspendieren und gießen Sie sie auf eine 1,1-1,2% Agar Keimung Platte aus Schritt 1.1. Wenn Samen in der Flasche bleiben, fügen Sie mehr Wasser und wieder zu gießen. Verteilen Sie die Samen von jeder Flasche eine Platte (63 bis 125 Samen / Platte).
    1. Schwenken Sie die Platte, um die Samen zu verteilen. Die Samen sollten gleichmäßig in einer 4-5 cm-Band an einem Ende der Platte verteilt werden. Dies wird die "top" der Platte sein. Der "Boden" 5-6 cm sollte frei von Samen (2A) gehalten werden.
    2. Zeichnen Sie das Wasser mit einer sterilen Pipette. Kippen die Platte in einem 45 °-Winkel zu den verbleibenden Wasserablauf an der Unterseite der Platte lassen. Setzen Sie den Deckel auf der tilted Platte und vor Licht schützen. Die Platten sollten auf 10-20 min ablaufen gelassen werden. (2B).
  7. Richten Sie Keimung: Entfernen Sie alle Wasser, das an der Unterseite des geneigten Platte mit einer sterilen Pipette gesammelt hat.
    1. Setzen Sie den Deckel und verschließen Sie die Platte mit Parafilm. Handschuhe und steril zu halten (Abbildung 2C).
    2. Stapeln Sie die Keimung Platten und dann wieder alle von ihnen bis zu einem Winkel von 90 °. Die Samen werden auf der vertikalen Oberfläche des Agars zu liegen. Voll eingesogen Samen sollten einfach auf die Agar haften. Die Wurzeln werden nach unten wachsen (Abbildung 2D).
    3. Wickeln Sie die Stapel von Keimen Platten in Folie, um Licht zu blockieren und halten bei 25 ° C für 3 Tage.

Hinweis: Wenn die Keimung Erlös für weniger als 3 Tagen kann Wurzeln zu kurz, um den Agar in Mikrokosmen zu erreichen. Wenn Keimung geht mehr als 4 Tage vor der Übertragung auf Mikrokosmos Platten, Überleben von Keimlingen werdenarm sein. Wenn M. verglichen werden truncatula Ökotypen oder Mutanten mit langsameren Keimraten sind, sollte die langsam keimenden Ökotyp dürfen länger als 3 Tage, um zu keimen.

2. Vorbereitung der einzelnen Platten Mikrokosmen

  1. Bereiten Jensen-Medium 12 (siehe Tabelle 1 für Komposition), so dass ~ 70 ml Medium für jeden Mikrokosmos. Bereiten Sie in Krüge oder Flaschen, die sind praktisch für schnelle Gießen (nicht mehr als 1-2 l pro Krug) und hinterlassen einen magnetischen Rührstab in den Krug beim Autoklavieren.
    1. Nach Medium gekühlt, um ~ 55-65 ° C, Ergänzungen hinzugefügt wurden, und pH-Wert überprüft (siehe Tabelle 1), gießen in Runde 100 mm Durchmesser, 15 mm tiefe Teller. Die Platten sollten gegossen werden ~ 0,9-1 cm tief (~ 70 ml / Platte).
    2. Komponenten der Jensen-Medium kann eine trübe Niederschlag zu bilden, so ist es wichtig, den Krug auf den Magnetrührplatte regelmäßig zurück, um Komponenten aus Absetzen zu verhindern. Niederschläge können überIVK in der Platte, nachdem sie zu verfestigen, und müssen sich nicht auf die Leistung, solange sie gleichmäßig auf die Platten verteilt sind.
    3. Stapel Platten während des Gießens, um die Bildung von Kondenswasser auf den Plattendeckel zu verhindern.
  2. Nach Jensen Platten erstarrt, Kerbe beide Platten und Deckeln mit einem Gewicht von Spatel, der in eine U-Form 5 (Fig. 3A) gebogen worden ist. Erhitzen Sie die Biegung der Spatel mit einem Brenner, bis Red Hot, Kerb 5-6 Platten und dann wieder erwärmen. Wenn die Kerb Deckel auf dem Kerbplatte gelegt, wird dies eine ovale Portal, über das die Aufnahmen der Sämling wachsen (3B) erstellen. Wenn gekerbten Platten gespeichert werden sollen, einzeln zu wickeln mit Paraffinfilm ..

3. Vorbereitung der Kulturen Sinorhizobium meliloti

Zwei Tage vor Pflanzen Impfungen, starten Kulturen aller S. meliloti-Stämme auf Sämlingen inokuliert werden. Cultures sollte LBMC (Luria-Bertani [Miller])-Medium mit 13 2,5 mM MgSO 4, 2,5 mM CaCl 2 und entsprechenden Antibiotika (TY-Medium funktioniert auch gut), gezüchtet werden. So wenig wie 2-3 ml jeder Kultur wird ausreichend sein.

  1. Wachsen bei 30 ° C unter Schütteln für 2 Tage, bis die Zellen dicht sind.
  2. Für die meisten Pflanzen Impfungen, der Wachstumsphase des S. meliloti ist nicht kritisch. Typischerweise spät angemeldet oder frühen stationären Phase-Zellen verwendet werden.

4. Aufbahrung M. truncatula Sämlinge zu einzelnen Mikrokosmen

  1. Nach 3 Tagen, öffnen Sie eine Keimplatte (in Schritt 1) ​​hergestellt und sofort mit sterilem Reinstwasser fluten. Dip-Zange in Ethanol und Flamme kurz zu sterilisieren. Verwenden sterilen Pinzette vorsichtig schieben die Wurzelspitzen aller Sämlinge unter dem Wasser um ein Austrocknen zu verhindern. Wurzeln werden 2-6 cm lang reichen. Die Mehrheit wird 3-4 cm sein. Wählen Sämlinge mit geraden Wurzeln und ohne erkennbareDefekte.
  2. Überprüfen Sie die Deckel der mittel Mikrokosmen der Jensen für den Aufbau von Kondensation. Streichen Sie den Deckel, um die Kondensation zu entfernen oder ersetzen sie durch eine neue Kerb Deckel. Wenn es einen Überschuss von Kondensation am Deckel kann der Sämling Wurzel an dem Deckel haftet und dann sterben nach der Kondensation trocknet.
  3. Mit Hilfe der Pinzette vorsichtig wählen Sie einen Sämling von der Keimung Platte durch den Keimblättern und legen den Root auf mittlere Mikrokosmos eines Jensen. Stellen Sie sicher, dass die Wurzelspitze in Kontakt mit dem Agar.
  4. Entfernen Sie vorsichtig die Samenschale, wenn sie noch vorhanden ist. Die Samenschalen sollten nach dem Einweichen in Wasser für 5-10 Minuten locker sein. Necken Sie vorsichtig die Samenschale mit der Zange, bis es nachgibt, und entsorgen. Die Keimblätter und etwa 0,5 cm von Aufnahmen sollten aus dem U-Kerbe in der Platte (4A) vorstehen. Den Deckel der Platte vorsichtig wieder mit der U-Kerbe der Deckel über den Keimling, die Schaffung eines Portals für den Keimling (4B).Stellen Platten in horizontaler Stapel beiseite, bis alle Sämlinge auf Mikrokosmen gelegt.
  5. Nutzen Sie alle Sämlinge von jeder Platte, die Keimung lebensfähig aussehen und haben einen geraden Stamm. (Wenn möglich, lassen Sie eine Platte von Sämlingen ungeöffnet als Ersatz für verwelkten Sämlinge kurz vor der Impfung zu verwenden.)
  6. Nach dem Verlegen Sie alle Sämlinge, damit sie auf der horizontalen Jensen Mikrokosmen zu sitzen, während die S. meliloti Inokulum Suspensionen sind in Vorbereitung.

5. Vorbereitung von S. meliloti Inokulum Suspensionen

  1. Überprüfen S. meliloti-Kulturen in regelmäßigen Abständen nach der Impfung sicher sein, dass sie wachsen. Nach 2 Tagen Wachstum sollte die OD600 zwischen 2 und 4 liegen.
  2. Pipette 0,5 ml jeder Kultur in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen und Zentrifuge pelletieren. Überstand entfernen.
  3. Entweder in 0,85% NaCl oder sterile sterile Reinstwasser Waschen der Zellen zweimal. Die Zellen in 0,5 ml 0,85% steärgern NaCl oder Reinstwasser.
  4. Messung der OD 600 von einer 1/10 Verdünnung von S. resuspendiert meliloti-Kulturen aus Schritt 5.3. Auf Basis dieser Messwert, machen eine Suspension von jeder Kultur in sterilem Reinstwasser bei OD 600 = 0,05. Wenn die Zelldichte zu hoch ist, kann die Knöllchenbildung gehemmt werden. Machen Sie genug von der verdünnten Suspension, so dass 100 ul kann auf jede Sämling geimpft werden. Die Trübung der OD 600 = 0,05 Suspension sollte mit dem Auge gerade noch wahrnehmbar sein.

6. Inokulation und Abdichtung von Mikrokosmen

  1. Unmittelbar vor Beginn der Impfungen, überprüfen verwelkten Sämlinge, die nicht den Transfer zum Medium Mikrokosmen der Jensen überlebt haben. Ersetzen Sie diese mit frischen Setzlinge Setzlinge von der Keimung Platten.
  2. Öffnen Sie jeden Mikrokosmos und impfen 100 ul der entsprechenden S. meliloti-Suspension auf die Keimlingswurzel. Setzen Sie den Deckel und beiseite in horizontaler stacks von 6-10 Mikrokosmos. Für jede S. meliloti Stamm verglichen werden, zu inokulieren mindestens 15 Pflanzen. Für Stämme, die feinen Unterschiede in symbiotische Produktivität, impfen 30-35 Pflanzen. Lassen Sie mindestens 10 Pflanzen als Negativkontrolle unbeimpfte. Impfen 30-35 Pflanzen mit S. meliloti 1021 oder andere geeignete Wildtyp-Stammes, die als Positivkontrolle dienen.
  3. Nachdem der S. meliloti Suspension Zeit zu adsorbieren auf der Wurzeloberfläche hatte und die Suspension Flüssigkeit in das Agar (mindestens 20 min.) eingeweicht, wickeln jede Platte individuell mit Paraffinfilm. Platten sollten an den Rand der Kerbe gewickelt werden, aber die Paraffinfilm sollte nicht das Wachstum des Keimlings (4C) zu blockieren.
  4. Zum Zeitpunkt der Verpackung, eine abschließende Überprüfung zum Wurzeln in das Innere des Deckelplatte geklebt. Halten Wurzeln aus dem Deckel entfernen, lag die Platte flach auf der Bank und tippen Sie auf oder blättern Sie den Deckel, um die Wurzel wieder nach unten auf die Agar-su klopfenn-Schnittstelle.
  5. Richten Sie die Sämling-Portale der einzelnen Stapel von 6-10 Platten. Lag die Stapel in einem 90 ° Winkel mit der nach oben weisenden Sämlingen (Fig. 4D). Die Klebrigkeit der Paraffinfilm werden die Platten an Ort und Stelle lange genug, um den gesamten Stapel in Folie wickeln zu halten, so dass ein 1-2 cm breiter Streifen ausgepackt, wo die Keimlinge entstehen (4E). Die Folie wird die Wurzeln vor Licht zu schützen.
  6. Legen Sie die Folie verpackten Stapeln in einem beleuchteten Wachstumskammer oder Wachstums Zimmer zu 21-25 ° C, 60-70% relativer Luftfeuchtigkeit und 100-175 mmol / m -2 s -1 Licht auf einem 16 Stunden Licht / 8 h Dunkel-Zyklus ( Abbildung 1a). Unter diesen Wachstumsbedingungen, verlängerte Inkubation bei Lichtstärken von mehr als 200 mmol / m -2 s -1 kann eine nachteilige Wirkung auf das Pflanzenwachstum haben.

7. Die Untersuchung der Wurzelsysteme und Quantifizierung der Symbiose Phänotypen

Pflanzen können in halten werdenMikrokosmen für bis zu 9 Wochen.

  1. Knoten-Nummer kann bei einer Reihe von Zeitpunkten nach dem Entfernen der Folie von jedem Stapel und Zählen Knoten quantifiziert werden. Entwicklung von Knötchen auf Pflanzen mit S. geimpft meliloti 1021-Wildtyp sind von 10 bis 14 Tage nach der Impfung deutlich.
  2. Symbiotische Produktivität kann auch zu jedem Zeitpunkt durch Messen der Länge der entstehenden Aufnahmen gemessen werden.
  3. Schluss Quantifizierung der symbiotischen Produktivität ist in der Regel mit 7 Wochen nach Inokulation durch Abnehmen des Shooting und Messung der Frischgewicht des Shootings durchgeführt. Dieser Schritt kann so spät zu 9 Wochen, wenn mehr Wachstum erwünscht ist, durchgeführt werden.

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Representative Results

Die Herstellung und die Impfung von diesen Mikrokosmen Platte ist relativ einfach im Vergleich zu den meisten anderen in der Einleitung beschrieben sind. Die Verwendung dieser Mikrokosmos ermöglicht auch längere Pflanzenwachstum (bis zu 9 Wochen) ohne Wasser-oder Nährstoffergänzung, Pflege von Stamm Sterilität, sowohl einfache Prüfung der Wurzeln und der Schutz der Wurzeln vor Licht, ungezwungen Wachstum von Pflanzen schießt, einfachen Zugang zu den Dreharbeiten für Längenmessung und Entfernen von Pflanzen aus den Mikrokosmen mit minimalen Schäden an Wurzelhaaren. 1A zeigt junge Sämlinge wachsen in Mikrokosmen in einem Inkubator. Die Bilder in den 1B-1E zeigen verschiedene Ansichten der Mikrokosmen enthalten M. truncatula A17 Pflanzen mit Wildtyp-S geimpft meliloti 1021. Wenn dicht gepackt, wird> 220 Mikrokosmen auf einem 73,8 cm x 67,5 cm Inkubator Regal passen. 1B und 1C zeigen Mikrokosmen in einFolie einge Stapel mit Pflanzen, die aus den Portalen in den Mikrokosmen. 1D zeigt einen einzelnen Mikrokosmos mit der Folie entfernt und die Wurzel und Knötchen, die durch die Vorderseite der Platte. 1E zeigt die gleiche Mikrokosmos flach mit der Pflanze, die aus das Portal in der Platte. Die Trieblänge kann von der Austrittsstelle aus dem Mikrokosmos (1C), ohne dass dies Störungen gemessen werden. 5A zeigt Trieblänge Daten für M. truncatula A17 Pflanzen mit Wildtyp-S geimpft meliloti 1021, verglichen mit nicht-inokulierten Pflanzen mit 7 Wochen und 9 Wochen nach der Impfung. Das Wachstum in den Mikrokosmen ist ideal für die Erfassung einer Reihe von Zeitpunkten von Knötchen Entwicklung und Trieblänge. Bei der Abschluss Zeitpunkt werden die Triebe aus für die Messung von Spross-Frischgewicht (5B) abgeschnitten. Abbildung 6 zeigt Beispiele von 3 symbiotische Phänotypen mit 7 Wochen post-Impfung. Die relative symbiotische Produktivität der M. truncatula A17 Pflanzen mit unterschiedlichen S. geimpft meliloti-Stämme wird durch Trieblänge (6A) quantifiziert und schießen Frischgewicht (6B). Die Anzahl der Wurzelknöllchen von Pflanzen mit diesen Stämmen beimpft ist in 6C gezeigt. Eine rosa Farbe durch die Produktion von Leghemoglobin zeigt an, dass Knötchen sind funktional und in der Lage, Stickstoff-Fixierung, während kleine weiße Knötchen sind in der Regel nicht funktionsfähig und / oder abgebrochen und braune Knötchen seneszenten und nekrotischen 14-18. Der Vergleich in Abbildung 6 zeigt, dass die Produktivität der symbiotischen M. truncatula A17 Pflanzen mit S. geimpft meliloti 1021 trägt die PSTB-LAFR5 exoY-Plasmid, das die ExoY Undecaprenyl-Phosphat-Galactose-Phosphotransferase überexprimiert, ist größer als die der Wildtyp S. meliloti 1021 und Stämme, die den negativen c ontrol PSTB Plasmid-LAFR5. Diese ExoY überexprimierenden Stämme produzieren mehr von der symbiotischen Exopolysaccharid Succinoglycan als die Kontrollstämme. Die Fähigkeit, Unterschiede in symbiotischer Phänotypen, die mehrere Wochen dauern, bis manifestieren quantifizieren ist ein Hauptvorteil dieses Verfahrens. Für alle Maßnahmen von symbiotischen Produktivität auf M. truncatula A17, die Sinorhizobium medicae Stämme WSM419 und ABS7 besser als S. meliloti 1021 (6A-6C). (Die Daten aus Abbildung 6 erschien ursprünglich in Jones (2012) 19.) Zu der Zeit, dass der Mikrokosmos wird demontiert und schießen Frischgewichte gemessen, Wurzeln können auch durch Mikroskopie abgebildet werden. Abbildung 7 zeigt repräsentative Ansichten von M. A17 truncatula Wurzeln nach der Entnahme aus Mikrokosmen. Die Wurzelhaare haben minimale Schäden erlebt, da die Wurzeln lag auf der Oberfläche des Agar und sind nicht bis verwurzelten von einer horizontalen Schicht Agar.

_content "> Pflanzen kann bis zu 9 Wochen in diesen Mikrokosmen gehalten, da ~ 70 ml Agar-Wachstumsmedium in der Platte ist. Nach längeren Wachstumszeiten, einige Pflanzen können sieben Wochen Wachstum beginnt zu trocknen. ist optimal für die Symbiose mit S. meliloti 1021. Für die effizientere Symbiose von M. truncatula A17 mit S. medicae WSM419 oder S. medicae ABS7, einer kürzeren Wachstumsperiode von 4-5 Wochen, ist optimal.

Endkonzentration pro L Anzahl der Stammlösung Auf Konzentration
1 g CaHPO4 NA NA
0,2 g MgSO 4 · 7H 2 0 1 ml 0,2 g / ml
0,2 g K 2 HP0 4 1 ml 0,2 g / ml
0,2 g NaCl 1 ml 0,2g / ml
0,1 g FeCl 3 · 6H20 1 ml 0,1 g / ml
11,5 g Agar-gereinigt (siehe Tabelle der spezifischen Reagenzien für Agar-Spezifikationen)
Milli-Q H 2 0 auf 1 L

Tabelle 1. Jensen-Medium-Agar-Protokoll für Platte Mikrokosmen. Präparationshinweise für Jensen-Medium.

Schritte:

  1. In oben genannten Zutaten und mit magnetischen Rührstab mischen.
  2. Autoklav 45 min, Flüssigkeitskreislauf, der mit einem Rührstab in den Krug.
    Hinweis: CaHPO 4 und FeCl 3 wird beim Autoklavieren auszufallen. Umrühren, bis sie wieder in Suspension zu erhalten, die Medien wird immer noch bewölkt bleiben
  3. Unter Rühren abkühlen, bis es ist nicht schmerzhaft, mit bloßen Händen abholen Krug.
  4. 1 ml pro Mineralien Spuren L (siehe unten für Rezept) while Rühren
    Hinweis: Achten Sie darauf, den Niederschlag in den Spurenelementen vor der Abgabe zu suspendieren.
  5. In 0,25 ml 4 N NaOH pro L, unter Rühren.
  6. PH-Wert prüfen, indem ~ 100 ul Medium mit sterilen Pipette und Anwendung von pH-Papier
    Hinweis: pH 5-10 Bereich Papier gut funktioniert. pH-Wert sollte ~ 7 Lassen Sie ein paar Sekunden für Vollfarbentwicklung. Wenn der pH-Wert nicht korrekt ist, kann es gewesen, eine Vorbereitung Fehler.
  7. Gießen Platten so dick wie möglich, Remixing Kolben von der Rückkehr in die Magnetrührplatte
    Anmerkung: Wenn eine Platte überfüllt ist (dh die Flüssigkeit saugt auf der Unterseite des Deckels)
    Hinweis: Rechnen Sie mit 15 Platten pro Liter bekommen ~.

Spurenelemente Lager 1 L (durch Autoklavieren sterilisieren)

1 g H 3 BO 3
1 g ZnSO 4 · 7H 2 0
0,5 g CuSO 4 · 5H 2 0
0,5 g MnCl 2 · 4H 2 0
1 g Namoo 4 · 2H 2 0
mili-Q H 2 0 auf 1 L

Figur 1
Fig. 1 ist. Ansichten von Mikrokosmen haltigen Pflanzen mit S. geimpft meliloti 1021 A) Pflanzen im Mikrokosmos Platten wächst in einem Inkubator. B) M. truncatula A17 Pflanzen mit S. geimpft meliloti 1021-Wildtyp wächst durch die Kerbe in der Oberseite des Jensen-Agar Mikrokosmen. C) Zusätzliche Nahaufnahme der Platten in B, die Pflanzen wachsen durch Kerben in Mikrokosmen. D) Eine der Mikrokosmos Platten von B und C mit der Wurzel Knötchen durch den Deckel abgebildet. E) Die Platte herD m flach mit dem Shooting, die aus der Kerbe.

Figur 2
2. Samenkeimung Platte Set-up. A) Die Samen werden über die Hälfte der 100 mm quadratische Platte. B verteilt) Agar Oberfläche, indem sie Wasser in den Boden einer geneigten Platte sammeln abgelassen. C) Die Platten werden in Paraffin Folie verpackt, gestapelt und D) auf den Stapel bei einem Winkel von 90 ° gedreht und in Folie eingewickelt.

Fig. 3
3. Bau von Mikrokosmen von Jensen Platten Ausklinken mit einem gebogenen Spachtel. A) Ein Metall, das mit einem Gewicht Spatel gebogen wurde, um eine ovale Form flamm erwärmt und verwendet, um ein U-förmiges Loch in der Seite der KerbePlatte und in der Seite des Deckels. Der Boden des U-Kerbe in der Platte sollte am Anfang der Agar-Oberfläche sein. Der Boden des U-Kerbe in dem Deckel sollte ganz auf der Oberseite des Deckels. B Austauschen des Deckels auf der Platte erzeugt eine ovale Portal, über das die Keimlings vorstehen kann).

Fig. 4
4. Einsetzen der Jungpflanzen in Mikrokosmen. A) Zwei Ansichten zeigen, wie der Keimling Wurzel sollte auf der Agar-Oberfläche mit den Keimblättern und ~ 0,5 cm von Spross aus der U-Kerbe hervor in der Platte. B) und C lag) Platzieren Sie den Deckel auf der Platte mit Kerben aufgereiht wird eine ovale Portal für die Keimlings erstellen. Wrapping die Platte fest mit Paraffin Film wird den Deckel von Bewegung zu halten und zu verhindern, Trocknen. D) Platten kann dann zusammen gestapelt werden in Gruppen von 6-10 und E) mit Folie eingewickelt. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Figur 5
5. Repräsentative symbiotische Phänotypen nach 7 Wochen Wachstum und 9 Wochen Wachstum von M. truncatula A17 in einzelnen Mikrokosmen. A) Sprosslänge von Pflanzen mit S. geimpft meliloti 1021, und der Trieblänge von nicht inokulierten Pflanzen wurden mit 7 Wochen, ohne die Pflanzen aus Mikrokosmen gemessen. Um 9 Wochen nach Inokulation Trieblänge wurde gemessen (A), und dann wurden Triebe abgeschnitten und gewogen (B).

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6. Repräsentative symbiotische Phänotypen nach 7 Wochen Wachstum von M. truncatula A17 in einzelnen Mikrokosmen. exoY-überexprimierenden Stämme von S. meliloti 1021 haben Symbiose an der Wirtspflanze Medicago truncatula A17 verbessert. Die symbiotische Produktivität von S. meliloti 1021 auf M. truncatula A17 ist in Stämme, die die Undecaprenyl-Phosphat-Galactose-Phosphotransferase kodiert durch exoY überexprimieren verbessert. Symbiotische Produktivität wird als (A) Trieblänge in cm gemessen und (B) schießen Frischgewicht in Gramm. Die Zahlen von rosa, Funktions Knötchen (untere Grafik bar), weiß, unwirksam Knötchen (mittlere Kurve bar) und braun, nekrotischen Knoten (obere Linie bar) sind in (C) gezeigt. Die symbiotische Produktivität und Knötchen Anzahl von Pflanzen mit S. geimpft medicae Stämme WSM419 und ABS7 sind ebenfalls dargestellt. Sterne über Diagrammbalken bezeichnen eine statistischely signifikanten Unterschied von der 1021 Wildtyp-Referenzstamm in einem ungepaarten t-Test. Pflanzen mit einer exoY :: Tn5 Nullmutante, die keine Succinoglycan nicht produziert impft hatte ähnliche Aufnahmen Längen und Frischgewicht zu nicht inokulierten Pflanzen und produziert nur weiß, unwirksam Knötchen. Die Graphen in (A) und (B) wurden ursprünglich in 19 veröffentlicht. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Fig. 7
Abbildung 7. Wurzeln auf einem Präpariermikroskop nach Entnahme aus Mikrokosmen abgebildet. Roots leicht von den Mikrokosmen zur Bildgebung mit minimaler Schädigung Wurzelhaare entfernt werden, da sie auf der Oberfläche des Agar liegen. Bilder zeigen Wurzeln von M. truncatula A17 bei 10 Tage nach der Impfung (A, B) (C). Die gezeigten Wurzeln wurden mit S. geimpft meliloti 1021-Wildtyp (A), ein S. meliloti Stamm, der eine EGLC :: GUS Fusion (B) und eine S. meliloti Stamm, der eine SMc00911 :: GUS Fusion 20 (C). GUS-Färbung von S. meliloti Zellen, die das SMc00911 :: GUS Fusion ist sichtbar auf die Wurzelhaare und der Wurzeloberfläche in E. Bar bis 100 um entspricht. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

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Discussion

Es gibt mehrere Schritte des Protokolls, die kritisch für den Erfolg sind: 1) die Notwendigkeit der Verwendung von gereinigtem, Pflanzenzellkultur getestet Agar kann nicht überbetont werden. Dies ist nicht kritisch für Alfalfa Keimlingen, aber es kritisch für das Wachstum von M. ist truncatula A17. 2) Es ist wichtig, um Setzlinge auf vertikalen Agarplatten keimen wie in Schritt 1 beschrieben. Die weit verbreitete Technik der keimenden Sämlinge auf einem invertierten horizontalen Fläche in einer 15 mm tiefen Teller 7 ist nicht für dieses Protokoll empfohlen, weil die Keimlingswurzeln zu kurz und / oder nicht gerade sein. Sämlinge mit geraden wachsenden Wurzeln von 2-4 cm in der Länge sind ideal für die Übertragung von Keimen Platten Mikrokosmen. Drei Tagen Wachstum in den vertikalen Platten in der Regel Keimung ideal für Wurzeln, um diese Länge zu erreichen. 3) Es ist auch wichtig, um eine Kontamination der Sämlinge mit Rhizobien vor der Impfung vermeiden. Vor der Keimlinge von der Keimung Platten MicroCO übertragensms, sollte der Arbeitsbereich gründlich mit Ethanol gereinigt werden und alle in der Übertragung verwendeten Instrumente sollten häufig Flamme sterilisiert. Eine weitere potentielle Verunreinigungsquelle kann durch Herstellung des S. vermieden werden meliloti Stamm Suspensionen für die Impfung von Mikrokosmen in einem separaten Arbeitsbereich von der für Sämling Zubereitung verwendet. Pilzbefall der Mikrokosmen kann auch durch alle Reste der Samenschale entfernt vom Inneren des Mikrokosmos vermieden werden, da Pilzsporen in der Beschichtung eingebettet werden. 4) Sämling Überleben können, indem sie Sämling Wurzeln feucht und in Kontakt mit Agar zu allen Zeiten, und durch eine sehr schonende Behandlung während der Übertragung maximiert werden. Einem Sämling mit der Wurzel in Agar in der Keimplatte gefangen sorgfältig herausgeschnitten werden, um Schäden an der Wurzel zu vermeiden. Eine hohe Ausbeute von lebensfähigen Pflanzen können durch eine endgültige Prüfung für verwelkten Sämlinge in den Stapeln von Mikrokosmen vor Beginn der Impfungen, und ersetzt sie wit erreicht werdenh neue Sämlinge. Wenn Sämlinge in gutem Zustand sind und nicht auf der Innenseite der Deckelplatte haftet, sollte weniger als 5% der Sämlinge müssen zu diesem Zeitpunkt ersetzt werden. Behinderung der Triebwachstum aus dem Mikrokosmos, indem Sie sicherstellen, dass keine Reste der Samenschale sind Beschränken der Keimblätter und der Mikrokosmos ist Parafilm umwickelt sorgfältig, so dass die Dreharbeiten nicht behindert wird, verhindert werden.

Wir verwenden diese Methode, um routinemäßig Symbiose in der Wirtspflanzen zu studieren M. truncatula A17 und Luzerne, und wir sind derzeit die Optimierung der Technik für Wachstum anderer M. truncatula Orten, andere Arten von Medicago und Arten von Melilotus (sweetclovers). Wir haben noch nicht getestet diese Methode mit M. truncatula A20, die eine Ökotypen, die als genetische Kartierung Partner mit A17 verwendet wird. Wir haben gefunden, dass M. truncatula cv. R108 nicht gut wachsen auf dem gereinigten Pflanzenzellkultur getestet agar, die wir derzeit mit und wir versuchen, einen anderen Agar-Agar Zubereitung oder ein-Ersatz für den Einsatz als Mikrokosmos Wachstums-Substrat für diese Sorte zu identifizieren.

Beim Vergleich der hier mit anderen allgemein verwendeten Methoden für die Analyse der M. beschriebenen Verfahren truncatula A17 / S. meliloti Symbiose, die wir gefunden haben, dies mit Abstand das beste Verfahren zur gleichzeitigen Vergleich der symbiotischen Leistungsfähigkeit einer großen Anzahl von S sein meliloti-Stämme. Wir routinemäßig bis 250 Mikrokosmos, zu einer Zeit (10 verschiedene Stämme von S. meliloti auf je 25 Pflanzen geimpft.) Wenn nur ein Genotyp von S. oder S. meliloti medicae verwendet werden soll, und eine Kreuzkontamination ist nicht ein Risiko, kann aeroponischen Senkkästen oder Wachstums Beutel eine geeignetere Methode. Diese Platte Mikrokosmos Methode ist auch die beste Methode für die Herstellung von regelmäßigen Beobachtungen der Progression der Knoten Entwicklung und symbiotische Produktivität über einen langen Zeitraum vonZeit. Phänotypen, die in den späteren Stadien der Symbiose manifestieren, wie Knötchen Seneszenz, leichter mit diesem Verfahren als bei anderen Protokollen untersucht werden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der USDA National Institute of Food and Agriculture, Landwirtschaft und Nahrungsmittelforschung Initiative 2010-65108 Zuschuss finanziert - 20582 zu KMJ Wir danken Brian K. Washburn für kritische Durchsicht des Manuskripts.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar purified, plant cell culture-tested Sigma A7921

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