성인 마우스 망막에 MACS 정제 광 수용체 전구체 세포의 망막 이식

1CRTD / DFG-Research Center for Regenerative Therapies Dresden, Technische Universität Dresden
* These authors contributed equally
Published 2/22/2014
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Medicine

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Summary

세포 이식은 감광체 손실에 의해 특징 망막 변성의 치료를위한 방법을 나타낸다. 여기에서 우리는 이식 가능한 광 수용체의 농축 및 성인 마우스에 자신의 망막 이식하는 방법을 설명합니다.

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Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina. J. Vis. Exp. (84), e50932, doi:10.3791/50932 (2014).

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Abstract

때문에 망막, 광 수용체의 빛 감지 세포의 손실 시력 장애 및 실명은 산업화 된 국가에서 장애의 주된 이유를 나타냅니다. 세포 이식에 의한 퇴화 광 수용체의 교체는 향후 임상 적용에 가능한 치료 옵션을 나타냅니다. 사실, 최근의 임상 연구는 출생 후 4 일째에 신생아 마우스 망막에서 분리 미숙 한 광수는, 망막 이식 다음 성인 마우스 망막에 통합 할 수있는 가능성이 있음을 보여 주었다. 기증자 세포는 내부 및 외부 세그먼트, 바깥 핵 층에 위치한 라운드 세포체 및 내생 양극성 세포에 근접 시냅스 터미널을 포함하여 성숙한 광 수용체의 형태를 생성합니다. 사실, 최근의 보고서는 기증자의 광 수용체가 기능적으로 호스트 생쥐의 신경 회로에 통합하는 것을 보여 주었다. 휴대 교체 방법, 정제 된 현탁액의 미래 임상 응용 프로그램에 대한선택의 세포 생성 및 안구에 적절한 통합을위한 정확한 위치에 배치 할 수있다. 감광체 전구체 농축 들어, 정렬은 공여 세포의 유전 적 리포터 변형을 방지하기 위해 특정 세포 표면 항원에 근거한다. 세포 표면 마커 CD73에 따라 광수 별 기자 마우스의 신생아 망막에서 분리 이식 가능한로드 광 수용체 전구체의 농축 - 여기에서 우리는 (MACS)를 정렬 자석 관련 셀을 보여줍니다. 약 90 %에 MACS에 의해로드 광 수용체 전구체의 농축을 허용 마이크로 비드 복합 이차 항체 다음 항 CD73 항체와 부화. 유동 세포 계측법에 비해, MACS보다 쉽게​​ GMP 표준에 적용되고 셀의 많은 양이 상대적으로 짧은 시간 기간에 정렬 할 수있을 수 있다는 장점을 갖는다. 성숙한 야생형 마우스의 망막 하 공간에 농축 된 세포 현탁액의 주입은 3 배 더 높은 통합 레이트 비교 예 귀착정렬되지 않은 세포 현탁액에 에드.

Introduction

비전은 인간의 주요 감각 중 하나입니다. 이 감각과 실명의 손상은 산업화 된 국가에서 장애의 주요 원인 중 하나입니다. 이 황반 변성, 망막 색소, 콘로드의 영양 장애 및 기타 조건에서 관찰 할 수있는 시력 장애 또는 실명의 주된 원인은, 광 수용체 세포의 손실을 특징으로, 망막 변성이다. 지금까지 잃어버린 시력을 회복 할 수있는 효과적인 치료는 사용할 수 없습니다. 2006 년과 2008 년에 독립 서로보고 두 개의 서로 다른 실험실, 성인 야생형 생쥐에로드 광 수용체 전구체 세포의 성공적인 이식은 1,2 망막. 따라서, 또한 퇴화 망막에 광 수용체 전구체 세포 이식의 가능성을 발생, 변성 광 수용체를 교체하고 비전을 복원 할 수 있습니다. 실제로, 이러한 이식 감광체 전구 세포는 성숙 properl 야생형 감광체의 형태 학적 기준을 유도하는 것이 최근 입증되었다Y는 외부 세그먼트 3, 내생 양극성 세포에 근접하고 바깥 핵 층 2-4뿐만 아니라 호스트의 신경 회로를 5-7으로 기능적으로 통합 할 수있는 라운드 세포체에서 시냅스 터미널을 개발했다. 이 전략의 주요 원칙 중 하나는 이식을위한 다른 세포 유형의 혼합의 결과로, 젊은 쥐의 망막 (PN 4, PN0는 출생의 하루로 정의된다) 출생 후 4 일의 사용이다. 미래 치료 응용의 배경에,이 혼합물을 감광체 전구 세포에 대한 정제되어야한다. CD73는 망막 8-10 젊은 광 수용체에 대한 구체적인 첫 번째 세포 표면 마커로 설명하고있다. 여기서, 우리는이 세포 표면 마커 및 (MACS) 기술, 자기 정렬 - 관련 세포의 사용에 근거 감광체 전구체 세포의 정화 방법을 설명한다. MACS는 형광 활성화 된 셀 정렬 기법에 비해 장점을 가지고 있습니다,인해 빠른 GMP 조건에 시간과 쉽게 조정을 정렬. 우리는 ~ 90 %의 농축 및 성인 야생 형 망막의 망막 하 공간에 풍부한 인구를 이식 최대 3 배 더 높은 통합 비율을 설명 할 수 있습니다. 따라서 MACS 계 감광체 전구체 세포 농축 및 망막 이식, 망막 변성의 치료를위한 치료 전략의 회생 발전을위한 안정적이고 유망한 기술이다.

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Protocol

동물 문의 윤리적 사용 및 관리 :

모든 동물 실험은 유럽 연합 (EU)과 독일 법률 (Tierschutzgesetz)와 엄격한에 따라 실시하고 안과 및 비전 연구에서 동물의 사용에 대한 ARVO의 정책을 준수 하였다. 모든 동물 실험은 TU 드레스덴과 Landesdirektion 드레스덴 (: 24D-9168.11-1/2008-33 승인 번호)의 동물 윤리위원회에 의해 승인되었다.

1. 세포 해리와 셀 정렬을 시작하기 전에

  1. 와 레이블 세 15 ㎖의 반응 튜브 : 워시 (W), 긍정적 인 부분 (+)과 음의 부분 (-).

2. 망막 해리

  1. 가위를 사용하여 PN 4 새끼 목을 벨.
  2. 곧 PBS에 세척 한 다음 70 % 에탄올에 새끼의 머리를 씻어.
  3. 차가운 HBSS에 머리를 전송하고 눈 (머리의 모든에 대해이 단계를 반복)을 명백히하다. , 명백히하다 눈꺼풀을 열고 t을 흥분하기시신경 지역에서 곡선 집게로 그는 눈. 그런 다음 조심스럽게 궤도 눈을 당깁니다.
  4. 모든 눈을 탈핵 후, 망막 분리 : 시신경에 폐쇄 가위를 소개하고 블레이드를 엽니 다. 펄 RPE / 체크 아웃 chorid. 곡선 집게를 사용하여 렌즈와 혈관을 제거합니다.
  5. (파파인 해리 키트에서 제공) 파파인 용액을 함유하는 1.5 ml의 반응 관에 절연 망막을 전송.
  6. 37 ℃의 물을 욕조 나 통 (400 RPM)에서 30 ~ 60 분 동안 파파 솔루션의 망막을 품어
    1. 망막은 15 ㎖의 반응 관 ( "1"표시)으로 파파인 용액, 피펫 ovomucoid 용액 1 ㎖에서 배양 동안.
    2. 15 ㎖의 반응 관 (레이블 "2")에 DNA 분해 효소 I (10 ㎎ / ㎖)의 60 μL + (키트에서 제공) ovomucoid 솔루션의 60 μL + EBSS 520 μl를 추가합니다.
  7. 파파인 배양 후, 실온으로 부분적으로 소화 망막 함유 파파인 용액을 전송할eaction 튜브 "2".
  8. 화재 광택 피펫을 사용하여, 기계적 분리 (상하 10 배)을 수행합니다.
  9. 반응 관 "1"로 단일 세포 현탁액을 피펫. 부드럽게 ovomucoid 솔루션의 상단에 세포 현탁액을 적층하여 2 층을 생성하려고합니다.
  10. 300 XG (약 1,300 RPM)에서 5 분 동안 원심 분리기.
  11. 뜨는을 취소하고 MACS 버퍼 500 μL의 세포를 재현 탁.

3. 셀 (MACS)를 정렬 자석 관련 셀을 사용하여 정렬

  1. 10 μg / ML의 최종 농도를 달성하기 위해 500 μL에 쥐 항-CD73 항체 μL X를 추가합니다.
  2. 얼음에 5 분을 품어.
  3. MACS 버퍼와 300 × g으로의 속도로 5 분 동안 원심 분리기를 가진 15 ㎖의 반응 관 (10)에 ML을 입력합니다.
  4. 뜨는을 제거합니다.
  5. 480 μL의 MACS에서 펠렛을 재현 탁 버퍼와 염소 항 - 쥐 IgG의 마이크로 비즈의 120 μl를 추가합니다.
  6. 얼음에 15 분 알을 품다, N을구약 흔들고, 흔들거나 혼합.
  7. MACS 버퍼와 300 X g에서 5 분 동안 원심 분리기를 가진 15 ㎖의 반응 관 5 ML을 입력합니다.
  8. 반응 관을 원심 분리 한 바와 같이 :
    1. 자기 대에 LS 열을 조정합니다.
    2. LS 칼럼의 상단에 preseparation 필터를 넣습니다.
    3. 3 ㎖의 MACS는 버퍼와 preseparation 필터와 LS 열을 수화 및 세척 (W) 관으로 버퍼 MACS를 수집합니다.
  9. 뜨는을 제거합니다.
  10. 500 μL의 MACS 버퍼에 펠렛을 재현 탁.
  11. (-) 반응 관 필터에 500 ㎕의 세포 현탁액을로드 한 후 1 ㎖의 MACS 필터에 버퍼링과 부정적인 부분에 음의 부분을 수집 추가합니다.
  12. 다음으로, 열에 바인딩되지 않은 세포를 씻어하기 위해 열을 MACS 버퍼의 3 × 3 ㎖를 추가
  13. 이 9 ㎖를 LS 칼럼을 통해 일단, 자기 스탠드에서 열을 제거하고 긍정적 인 부분 (+) REAC의 상단에 설치기 관.
  14. 신속 LS 칼럼에 MACS 버퍼의 5 ㎖를로드하고 LS 열에 플런저를 넣고 전체 버퍼가 칼럼을 통해 때까지 아래로 누릅니다.
  15. 300 X g에서 5 분간 양성 분획을 함유하는 반응 관을 원심 분리기.
  16. MACS 버퍼 500 μL에 뜨는에 resuspend를 제거하고 4 ℃에서 보관
  17. 일반적인 셀 카운팅 장치를 이용하여 세포의 총계를 계산.
  18. MACS 버퍼에 2 × 10 5 세포 / μl를 포함하는 양의 정렬 부분에서 세포 현탁액을 준비하고 4 ° C에 보관

4. 마우스 망막에 MAC 정렬 된 광 수용체 전구 세포의 이식

  1. 반드시 다음과 같은 솔루션을 모두를 준비 할 수 있도록 : 1 ㎖ 멸균 PBS 또는 HBSS, 10 ㎕의 DNA 분해 효소 I, 1 ~ 2 ㎖의 살균 탈 H 2 O, 4 ℃에서 세포 현탁액의 분수 분주
  2. 성인 마우스를 마취 (즉, 2-4개월 세)medetomidine 염산염 (0.01 mg/10 g 체중)의 복강 내 주사와, 케타민 (825 mg/10 g 체중). 그 후 통증 완화를위한 프레 놀핀의 피하 주사 (0.05 ㎎ / ㎏ 체중)을 수행.
  3. Phenylephrin 2.5 % - Tropicamid 0.5 %의 하락으로 동공을 확장.
  4. 마우스 머리 홀더에 마우스를 수정하고 스테레오 현미경으로 배치합니다.
  5. 눈의 건조를 막기 위해 Visidic 겔의 저하를 적용한다.
  6. 바늘에 ½ 멸균 30 G를 사용하여 공막 및 각막 (각각 오라 참나무)의 경계에 작은 구멍을 확인합니다.
  7. 다이아몬드 펜을 사용하여 작은 (약 5mm × 5 ㎜) 조각으로 일반적인 커버 슬라이드를 잘라, 망막의 직접적인 시각화를 허용, 각막의 상단에이 조각 중 하나를 놓습니다.
  8. 탈 이온수로 presterilized 마이크로 리터 주사기를 여러 번 세척합니다.
  9. 세포 현탁액의 1 μL, 접선 방향으로 결막을 통해 직접 바늘로 마이크로 리터 주사기를로드망막의 코 반으로 시각적 인 통제하에 공막과 장소.
  10. , 망막 하 공간에 도달 할 때까지 온화하게 망막에 구멍을 펀치 망막 하 공간에 세포 현탁액을 주사.
  11. 출혈없이 약 ¼ 망막 공간을 커버, 균일해야 망막의 포성 분리를 관찰한다.
  12. 망막 구멍 물개 자동으로 조심스럽게 주사기를 철회.
  13. 탈 이온수로 마이크로 리터 주사기를 여러 번 세척합니다.
  14. 머리 홀더에서 마우스를 놓습니다.
  15. medetomidine 염산염 효과의 반전을 위해 atipamozole 염산을 주입하여 마우스를 일어나.
  16. 따뜻한 어두운 챔버 (약 25 ° C)에서 웨이크 업 시간 동안 마우스를 놓습니다.
  17. 다음 이일 이식 후, 부 프레 놀핀 (체중의 0.05 ㎎ / ㎏)는 통증 완화를위한 아침과 오후에 피하 주사로 투여해야한다.

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Representative Results

쥐의 망막에 통합로드 감광체의 능력을 평가하기 위해, 마우스 리포터 라인 GFP가 신경 망막 류신 지퍼 (NRL, NRL-GFP) 프로모터 (11)에 의해 구동되는, 사용 하였다. NRL은로드 감광체 도너로드 감광체 세포의 특정 라벨을 허용 성인기에 걸쳐 E12.5에서 그 발현의 개시 초기 마커이다.

PN 4 NRL-GFP 새끼가 참수 된 눈을 적출 하였다. 망막은 단리 및 상기 방법을 사용하여 분해 하였다. 생성 된 세포 현탁액을 CD73 기반 MACS (도 1 및도 2)를 사용하여 정렬시켰다. MAC의 정렬에 따라, 우리는이 절차를 수행하는 동안 달성 농축을 분석했다.

도 3a에 도시 된 바와 같이, 초기 세포 현탁액 (입력)은 30.4 %의 GFP-양성 세포, 예를 들어. 로드 광수. 다음 CD73 기반 MAC-정렬CD73 양성 분획 (CD73 +)에서 최대 86.9 %의 농축은 유동 세포 계측법에 의해 관찰되었다. CD73 음성 부분에서 (CD73-) 모든 세포의 9.9 %가 긍정적 인 GFP (그림 3A) 검출되었다. CD73 기반 Mac을 다음 NRL-GFP 양성 세포의 농축은 또한 체외 (그림 3B)을 도금 한 후 시각화됩니다.

MAC-정렬 후, CD73-양성 ​​분획 공여자 세포를 스핀 다운시키고 / μL 200,000 세포의 최종 농도로 재현 탁. 이 세포 현탁액을 추가 야생형 숙주 망막의 망막 하 공간 (도 4)에 이식 하였다. 3 ~ 4 주를 이식 다음, 호스트 망막은 고정 격리 및 단면했다. 몇몇 도너 세포의 호스트 외부 핵 층에 통합 외부 핵 층과 formatio에서 전지 본체의 지역화 성숙한 감광체의 형태를 취득 시냅스 소 구체 및 내부 세그먼트의 N (그림 5). 상세한 그림은 다른 그룹 4,6,10에 의해 망막 호스팅하는 이식 FAC 정렬 된 세포와 유사한 결과를 보여주는 우리 그룹 3,8에 의해 이전에 발표되었다. 이러한 모든 연구에서 일관 이식 된 세포가 수포 분리 된 호스트 망막에 의해 정의 된 주사 부위, 숙박, 멀리 이동하지 않는 것이 있습니다. 일부는 호스트 망막 (즉, 바깥 핵 층)에 통합, 일부는 망막 하 공간 (3)에 남아 있습니다. 또한 그것은 통합 부위에서 공여 세포의 분포가 5를 사용한 마우스 모델의 종류에 따라 달라, 도시되었다. 급성 호스트 / 거부 반응의 징후 C57BL/6J 마우스 사이의 이식에서 검출되지 않았다.

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그림 1. 다음 PN 4 NRL-GFP 새끼가 분리되어에서 성인 마우스 망막. 기증자의 세포에 광 수용체 전구체를 정제 MACS의 망막 이식의 전체 구조는 CD73 기반의 MAC-정렬 및 마우스 호스트 망막의 망막 하 공간에 이식. 보려면 여기를 클릭하십시오 큰 그림 .

그림 2
그림 2. MACS로 이식 가능한 광 수용체의 농축. 수집 된 모든 PN4 망막에서 생성 된 세포 현탁액을 마이크로 비즈가 결합 안티 ​​- 쥐 항체 세척 및 인큐베이션 차 쥐 항 CD73 항체와 함께 배양한다. 언 바운드 항체를 씻어됩니다. 세포 현탁액을 통해서 전달된다하 자기 스탠드와 연결되어 LS 열. 나머지 세포가 용출 (CD73 음성 부분)를 수집하는 동안 항체가 결합하는 세포는 컬럼에 장착이 가능합니다. 마지막으로, LS-열이 자기 스탠드에서 제거되고 나머지 세포가 용출 (CD73 양성 부분을) 수집된다. 전체 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 3
그림 3. CD73 기반의 MAC-정렬 다음 NRL-GFP 양성 세포 농축 분석. (A) 정렬하기 전에 기증자 세포의 초기 인구는 NRL-GFP 양성 세포의 30.4 %가 포함되어 있습니다. MAC-정렬을 따라, GFP 양성 세포의 농축은 CD73 + 분획 (86.9 %)에서 검출 될 수 있지만 CD73 분률 GFP + 세포만을 낮은 양 (9.9 %)을 함유 하였다. (B) PN4 NRL-GFP 세포의 CD73 기반 MAC-정렬의 결과를 설명하는 대표 화상. 모든 부분에서 1 백만 세포는 라미닌 코팅의 coverslips에 도금했다. 세포는 10 분 동안 4 % PFA와 도금 후 4 시간을 고정했다. 균체 DAPI (4 ',6-diamidino-2-페닐 인돌, 1:20,000)로 염색 하였다. 입력 부분 또는 CD73-부분에 비해 CD73 + 분획 GFP 양성 세포의 중요한 농축이 관찰되었다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 4
그림 4. 성인 마우스 망막에 이식 과정의 망막 주사. 회로도 도면. 바늘은 렌즈를 만지면 피함으로써 우안 유리의 공간을 통해 탐색과 시각적 통제하에 망막에 위치 오라 참나무에 구멍을 통해 삽입된다. 추진 완만하여 바늘 망막을 통해 펀칭 및 망막 공간에 배치. 결국, 세포 현탁액은 박리 과정을 평가하여 카메라 제어하에 신중하게 분사된다.

그림 5
그림 5. 이식 광 수용체 세포의 통합. 대표 사진 성인 마우스 망막에 이식을 다음 PN4 NRL-GFP 세포 정렬 통합 CD73 기반 Mac을 묘사. 이식 된 광 수용체 전구체가 제대로 외부 핵 층 (ONL)로 통합하고 성숙 광 수용체의 형태를 생성합니다.

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Discussion

광 수용체 전구체 세포의 망막 이식은 상당한 숫자 1, 2에서 호스트 망막에있는 빛에 민감한 세포의 통합을 달성하기 위해 신뢰할 수있는 도구를 나타냅니다. 이것은 향후 6 망막 퇴행성 질환의 치료를위한 세포 치료제의 설립을 허용 할 수 있습니다. 현재 PN 4 망막 고립 셀의 도너 인구 만 감광체 전구 세포는 망막 하 주사 후 통합되는 상이한 세포 유형의 혼합물이다. CD73 기반 MAC-정렬을 사용함으로써, 도너 세포 현탁액 내의 광 수용체의 비율은 ≈에 정렬되지 않은 세포 집단 (8)에 비해 야생형 숙주 망막의 약 3 배 더 높은 통합 레이트를 수 90 % 증가 될 수있다. 비교를 유동 세포 계측법에, MACS 빠른 정렬 절차의 장점을 가지고 있으며, 상대적으로 쉽게 GMP 표준에 적용될 수있다. 이식 가능한 광 수용체의 정화들입니다다 능성 줄기 세포 12-14에서 광 수용체의 체외 세대를위한 최근의 장점에 비추어 pecific 관심. 분화 다 능성 줄기 세포의 배양은 특정 정렬 절차 세포 이식 요법에서 장래 사용을위한 필수적인 전제 조건의 유용성을 만드는 다양한 세포 유형으로 구성된다.

MACS 정화 절차에 따라, 여러 지점의 주요 장애없이 워크 플로우를 보장 주목할 만하다. 정렬되는 망막의 개수 높을수록 시간이 그들의 소화 필요하다. 소화 후, 선별 과정 동안, 세포의 응집이 회피되어야한다. 이것은 바람직 이차 항체를 첨가하기 전에 및 배양하는 동안 발생합니다. 이 경우, 집계 피펫 즉시 제거되어야한다. MACS 버퍼의 용출 동안 MACS 부정적인 부분을 수집하는 동안,이 열 개 이상의 3 ㎖를 추가하지 절대적으로 필요하다.3 ㎖ 이상의 버퍼가 추가되는 경우에 열 버퍼의 압력이 너무 높을 것이다. 이것은 효율을 정렬 세포 및 하강에 항체의 결합을 방해 할 것이다. MACS-긍정적 인 부분을 수집을 시작하는 자기 스탠드에서 열을 제거 할 경우,이 단계를 신속하게 수행 할 수 있습니다. MACS 완충액 5 ㎖를 최대한 빨리 컬럼에 첨가한다. 전체 버퍼가 칼럼을 통해 때까지 또한, 플 런지 빠르게 넣고 눌러야한다. 이인가 된 압력에 대해 걱정할 필요가 없습니다. MACS 완충액은 등장 성이며, 변화 될 수있다. 또한 FACS 완충액, 세포 배양 배지, PBS, EBSS 또는 HBSS를 사용하는 것이 가능하다. 버퍼의 무균는 0.4 μm의 필터 막을 통해 여과에 의해 달성 될 수있다.

MACS에 의한 농축 후, 망막 하 공간 공여 세포의 성공적인 이식은 다음 사항을 유지함으로써 달성 될 수있다. 광 수용체 세포 치료 생체에 매우 민감한 것 같다, 이후그것은 필요한 것보다 4 ° C 이상에서 그들을 유지하지 않는 것이 좋습니다. 가능한 한 빨리 이식 진행합니다. 안구에 주사 바늘을 삽입 할 때, 상대적으로 날카로운 금속 바늘이 렌즈에 의한 포도막염의 유도의 결과로 렌즈에 손상을 줄 수 있으므로 렌즈에 닿지 않도록하는 것이 중요합니다. 망막 하 공간으로가는 길의 마지막 단계는 망막의 침투는 매우 중요합니다. 그것은 시각적으로 망막 하 공간에 도달하는지 여부를 관찰 할 수 없기 때문에 그 오른쪽 누름 압력 및 조직 저항의 감촉을 개발하는 것이 중요하다. 니들 머리가 제대로 들어 있는지, 테스트하려면, 작은 양을 적용 할 수 있고, 니들 머리에 망막의 분리주의 깊게 관찰해야한다. 출혈이없는 둥근, 수 포성 박리가 형성되는 경우, 위치는 정확하고 용액의 나머지는 신중하게 적용 할 수있다. 주입하는 동안 바늘 조직에 더 손상을 피하기 위해 그 위치를 유지한다. 망막 구멍 CRE바늘 서서히 후퇴하면 주사 바늘에 의해 ated 자체로 밀봉한다. 전체 공정은 상기 응력 및 동물의 손상을 피하기 위해 가능한 시간의 최소량에서 수행되어야한다. 이식 중에 세포 현탁액을 마이크로 리터 주사기를 응집하고 차단하는 경향이있다. 이 경우, 멸균 PBS 또는 HBSS를 사용하여 세포 현탁액의 희석이 좋습니다. 이 문제를 극복하기 위해 또 다른 가능성은 함께 살아있는 세포를 접착하는 경향이 죽은 세포에서 DNA 덩어리를 용해, 세포 현탁액에 DNA 분해 효소 I의 1 μl를 추가하는 것입니다.

이 프로토콜은 세포의 자기 정렬로 제한됩니다. 따라서, 세포가 선별 라운드 당 하나의 마커에 대해 정렬 될 수있다. 세포가 동시에 (생리적 특성뿐만 아니라 다른 세포 표면 마커를 포함) 다른 마커를 사용하여 정렬 될 수있는 곳을 비교, 유동 세포 계측법에, 이는이 기술의 주요 단점이다. 다른 마커에 대한 정렬을 할 때마다짧은 시간 창은 유동 세포 계측법은 더 나은 해결책있을 필요하다. 또한, transgenically 표현 GFP 또는 기타 생명 세포 마커와 같은 세포의 형광 특성에 대한 분류는이 기술을 할 수 없습니다. 그것은 현재 자성 비드가 결합 할 수있는 세포 표면 항체의 사용이 제한된다. 그럼에도 불구하고,이 기술이 사용 된 기술 장비에 따라 확장 할 수있다.

있는 Miltenyi Biotec은 현재 자기 세포 선별 도구의 유일한 공급자이기 때문에, 날짜에 사용할 대안이 없다. 세포 해리를 들면, 파파인 (즉, 트립신) 이외의 효소가 사용될 수있다. 이것이 우리의 손에 가장 부드러운 분해 효소 것으로 보인다 때문에 참고로, 우리의 실험실은, 파파인과 최상의 결과를 달성했다. 파파인 소화 (30-60 분)의 시간 창은 변수이다. 이 시간 창에서 최적의 소화는 우리의 실험실에서 이루어졌다. 짧거나 긴 배양 시간은, 샘플 크기에 따라 샘플 질 필요가있을 수도차 사용되는 효소. 개별 테스트를 권장합니다.

단일 단계 MACS는 유동 세포 계측법의 높은 순도의 수준에 도달하지 않는 것을 감안할 때,이 기술의 가능한 추가 응용 프로그램이 원치 않는 잠재적 인 유해 세포의 부정 정렬 될 수 있습니다. 이 주어진 세포 표면 마커에 대한 긍정적하지만 관심의 세포 분획을 통해 흐름에 고립 된 관심의 분율을 떠나 밖으로 정렬 할 수 있습니다. 이것은 사전에 또는 양성 선별 단계 후에 수행 및 허용 될 수있는 다른 세포 표면 표지뿐 아니라 그들의 잠재적 tumorgenic 위험이 다 능성 줄기 세포 배양에서 세포층 세포 또는 분화 세포와 같은 원치 않는 세포의 제거를 이용하여 세포의 추가 차별 . 이 배양 된 세포의 많은 양의 정제, 부드러운 빠르고 간단한 치료를 나타냅니다 따라서, MACS는 향후 치료 응용 프로그램의 ES 또는 만능 줄기 세포 배양에서 광 수용체의 정화에 적합 할 수 있습니다. MACS쉽게 정렬 단계의 상세 이후 GMP-조건에 적용 할 수있는, 기계, 유체 및 절차는 유동 세포 계측법에 비해 감소된다. 그것은 MACS 이미 일상적 혈액 또는 골수로부터 세포의 농축을 위해 임상 실험에 사용되는 것을 주목할 필요가있다. 어떠한 적합한 세포 표면 마커가 존재하지 않을 때 흥미롭게 MACS 심지어 유전자 후속 자기 세포 선별은 15 단계 "유능한"세포를 만들기 위해 표면 마커를 도입함으로써, 세포에 적용 할 수있다.

요약하면, MACS 이식 연구를위한 세포 표면 마커를 사용하여 광 수용체 전구체 세포를 풍부하게 할 수있는 안정적이고 빠른 도구를 나타냅니다. 또한 그것은 GMP-조건을 요구하는 미래의 임상 적용을위한 쉽게 employable 방법입니다.

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Disclosures

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

우리는 NRL-GFP 마우스, 기술 지원 조센 하스, 그리고 Sindy Böhme 및 축산에 대한 Emely Lessmann를 제공 아난드 스와 루프에게 감사를.

- 재생 치료 드레스덴, CRTD 씨 그랜트 프로그램, SFB (655), 및 ProRetina 에버스 재단, 파기-BB 대학원 과정 드레스덴하고 Fundação 파라의 센터 FZT 111 :이 작품은 독일 Forschungsgemeinschaft (DFG)에 의해 지원되었다 Ciência 전자 Tecnologia (SFRH/BD/60787/2009)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Papain Dissociation System Worthington Biochemical Corporation LK003150 supplied DNase I is not used in the method
Purified rat anti-mouse CD73, clone TY/23 BD Pharmingen 550738 Stock concentration 0.5 mg/ml
Goat Anti-Rat IgG MicroBeads Miltenyi 130-048-501 Total volume of 2 ml
PBS Gibco 10010-015 Used to count the total number of cells
DNase I Sigma D5025-150KU
HBSS Gibco 14025050 Used for dissociation of the retinas
Trypan blue Sigma Fluka93595 Used to count the total number of cells
Vidisic Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG
Domitor Pfizer 76579
Ketamine 10% Ratiopharm 7538843
Antisedan Pfizer 76590
Phenylephrin 2.5%-Tropicamid 0.5% University Clinics Dresden Pharmacy
Preseparation Filters Miltenyi 130-041-407
LS Columns Miltenyi 130-042-401
MACS MultiStand Miltenyi 130-042-303
QuadroMACS Separator Miltenyi 130-090-976
Fire polish glass Pasteur pipette Brand 74777 20 The pipette’s tips need to be fire-polished and autoclaved.
MACS 15 ml tube rack Miltenyi 130-091-052
Cell count chamber Carl Roth T728.1
Sterile 15 ml tubes Greiner Bio-One 188271
Leica M651 MSD Leica M651 MSD can be used instead of Olympus SZX10
Olympus SZX10 Olympus SZX10 can be used instead of Leica M651 MSD
Olympus inverted stereo microscope CKX41 Olympus CKX41
Cell culture hood Thermo Scientific MSC-Advance Thermo Scientific 51025411
1.5 ml Reaction tube Sarstedt 727706400
2 ml Reaction tube Sarstedt 72695
Eppendorf Centrifuge 5702 VWR (Eppendorf) 521-0733
Mouse head holder myNeurolab 471030
BD Microlance 3 30 G 1/2 in BD Pharmingen 304000
Hamilton microliter syringe 5 µl, 75RN Hamilton 065-7634-01 delivered without needles
Hamilton RN special needle 34 G Hamilton 065-207434 Blunt, 12 mm length
Vannas-Tübingen Spring Scissors - 5 mm Blades Straight Fine Science Tools 15003-08
Dumont #7 Forceps - Titanium Biologie Fine Science Tools 11272-40
Diamond pen Tools-tech
15 mm x 15 mm Cover slips Sparks MIC3366

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References

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