Spremere cellulare come un robusto, Microfluidic intracellulare Delivery Platform

1Department of Chemical Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2David H. Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology
Published 11/07/2013
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Bioengineering

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Summary

Rapida deformazione meccanica delle cellule è emerso come un metodo promettente, libero da vettori per la consegna intracellulare di macromolecole e dei nanomateriali. Questo protocollo fornisce la procedura dettagliata su come utilizzare il sistema per una vasta gamma di applicazioni.

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Sharei, A., Cho, N., Mao, S., Jackson, E., Poceviciute, R., Adamo, A., et al. Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform. J. Vis. Exp. (81), e50980, doi:10.3791/50980 (2013).

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Abstract

Rapida deformazione meccanica delle cellule è emerso come un metodo promettente, libero da vettori per la consegna intracellulare di macromolecole e dei nanomateriali. Questa tecnologia ha dimostrato il potenziale per affrontare applicazioni precedentemente impegnative, tra cui, la consegna alle cellule immunitarie primarie, riprogrammazione cellulare, nanotubi di carbonio, e la consegna quantum dot. Questa piattaforma microfluidica libero da vettori deduce rottura meccanica della membrana cellulare per facilitare la consegna citosolico del materiale bersaglio. Qui, si descrive il metodo dettagliato di uso per questi dispositivi microfluidici compresi, montaggio del dispositivo, preparazione cellulare, e il funzionamento del sistema. Questo approccio consegna richiede una breve ottimizzazione di tipo di dispositivo e le condizioni operative per le applicazioni precedentemente rimanere sconosciuti. Le istruzioni fornite sono generalizzabili alla maggior parte dei tipi di cellule e materiali di consegna in quanto questo sistema non richiede buffer specializzati o passi modificazione chimica / coniugazione. Questo lavoro fornisce anches raccomandazioni su come migliorare le prestazioni del dispositivo e problemi-shoot potenziali problematiche relative a intasamento, l'efficienza di consegna bassi, e la vitalità cellulare.

Introduction

Consegna delle macromolecole nel citoplasma delle cellule è un passo fondamentale in applicazioni terapeutiche e di ricerca. Nanoparticelle mediata consegna, per esempio, ha dimostrato una potenziale nella terapia genica 1,2, mentre la consegna proteina è un mezzo promettente di influenzare la funzione cellulare sia clinico 3 e 4 impostazioni di laboratorio. Altri materiali, come ad esempio farmaci a piccole molecole, i punti quantici, o nanoparticelle d'oro, sono di interesse in applicazioni che vanno dal cancro terapeutica 5,6 all'etichettatura intracellulare 7,8 e singola molecola di monitoraggio 9.

La membrana cellulare è sostanzialmente impermeabile alle macromolecole. Molte tecniche esistenti utilizzano nanoparticelle polimeriche 10,11, liposomi 12 o modificazioni chimiche 13 per facilitare rottura della membrana o la consegna intracellulare. In questi metodi, la vitalità efficienza consegna e cellulari sono spesso dipendente dalla struttura del secoloe molecola target e il tipo di cella. Questi metodi possono essere efficaci nella fornitura di materiali di struttura uniforme, come acidi nucleici, ma spesso sono poco adatti per la consegna dei materiali più strutturalmente diverse, come le proteine ​​14,15 e nanomateriali 7. Inoltre, il meccanismo di interruzione endosome che la maggior parte di questi metodi si basano su è spesso inefficiente, lasciando quindi molto materiale intrappolato in strutture vescicole 16. Infine, i metodi che sono spesso sviluppati per essere utilizzati con linee cellulari stabilizzate non si traducono bene alle cellule primarie.

Metodi di membrana all'incorporazione, come elettroporazione 17,18 e sonoporazione 19, sono una valida alternativa in alcune applicazioni, tuttavia, sono noti per causare la vitalità cellulare bassi e possono essere limitate dal responsabile del materiale consegna bersaglio.

Rapida deformazione meccanica delle cellule, un approccio microfluidica alla consegna, ha recentemente demonstrated suoi vantaggi rispetto alle tecniche attuali nel contesto di riprogrammazione cellulare 20 e consegna nanomaterial 21. Questo metodo si basa sulla distruzione meccanica o la membrana cellulare per facilitare la consegna citosolico dei materiali presenti nel buffer circostante. Il sistema ha dimostrato che consenta potenziale in precedenza sfidare tipi di cellule (ad esempio cellule immunitarie primarie e cellule staminali) e materiali (ad esempio anticorpi e nanotubi di carbonio). Qui, la procedura generale di utilizzare questi dispositivi per la consegna intracellulare di macromolecole bersaglio è descritto. La procedura è generalizzabile a maggior parte dei tipi di cellule e materiali di consegna, tuttavia, è consigliabile una condurre una breve ottimizzazione delle condizioni, come descritto nelle nostre linee guida progettuali precedentemente segnalati 20, per tutte le applicazioni precedentemente non. Ad oggi, il sistema è stato usato con successo per la consegna di RNA, DNA, nanoparticelle di oro, punti quantici, i nanotubi di carbonio, proteines, e polimeri destrano 20,21.

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Protocol

1. Conservazione

  1. Conservare i serbatoi, i titolari, O-ring e dispositivi microfluidici in etanolo al 70%. Utilizzare un contenitore (ad esempio vaso o bicchiere) che ha un coperchio per evitare l'evaporazione e la contaminazione da particelle di polvere o all'esterno. Posizionare i dispositivi in ​​un contenitore (1), serbatoi e O-ring in un secondo contenitore (2), e titolari nel terzo (3).

Nota: L'uso di etanolo al 70% per il rimessaggio è di mantenere la sterilità. Se gli unici componenti della soluzione sono etanolo e acqua (cioè senza denaturanti), tutti i componenti di sistema dovrebbe essere pienamente compatibile e non si degrada nel tempo.

  1. Cambiare soluzione etanolica in contenitori (2) e (3) prima di ogni uso per evitare la contaminazione incrociata di tutti gli esperimenti e minimizzare la presenza di particelle indesiderate che possono causare l'intasamento.

2. Esperimento Preparazione

  1. Contenitori Consiglio (2) e (3) in un bagno ad ultrasuoni for 5-10 minuti prima di ogni utilizzo. Questo aiuta a rimuovere eventuali particelle contaminanti da esperimenti precedenti.
  2. Pulire lavoro in armadio biosicurezza con una soluzione di etanolo al 70%.
  3. Spruzzare tutti i materiali (3 contenitori e pinzette) con una soluzione di etanolo al 70% prima di collocarli all'interno dell'armadio biosicurezza.

3. Montaggio

  1. Deporre 2-3 salviette low-lint nell'area di lavoro.
  2. Rimuovere i serbatoi di plastica dal loro contenitore con le pinzette e metterli sulle salviettine per favorire l'evaporazione della soluzione di etanolo da superfici interne. Battere delicatamente i serbatoi in superficie o soffiare aria attraverso di loro per facilitare la rimozione della soluzione di etanolo.
  3. Inserire gli O-ring nel loro alloggiamento del serbatoi.
  4. Rimuovere il supporto e patatine da rispettivi contenitori e lasciare evaporare l'etanolo (~ 1-2 min).
  5. Utilizzare le pinzette per posizionare il chip faccia-up desiderato (ad esempio fori di accesso su) nel supporto. Sollevare il titolarecon il chip di visione orizzontale per assicurarsi che il chip sia posizionato orizzontalmente nel supporto e regolare, se necessario, con le pinzette. IMPORTANTE: Se il dispositivo non si inserisce correttamente nel suo supporto, c'è il rischio che si romperà durante le fasi successive.
  6. Quindi, posizionare delicatamente i serbatoi sul supporto e allinearle con le clip. Fare attenzione che O-ring non cadono fuori dai loro alloggiamenti durante questo processo.
  7. Premere delicatamente verso il basso i serbatoi finché non scattano in posizione. Assicurarsi che entrambi i lati dei serbatoi siano sicure e che il chip sembra essere nella posizione corretta.

4. Preparazione cellulare

  1. Per cellule aderenti (linee primarie o creare): cellule piastra 1-2 giorni prima dell'esperimento tale che essi non sono confluenti più del 80% il giorno dell'esperimento.
  2. Posizionare cellule in sospensione (in PBS o supporto rilevante) e puntare ad una concentrazione operativa di 1,0 x 10 6 cellule / ml a 1,0 x 10 7 cells / ml. NOTA: Non abbiamo osservato cambiamenti significativi nelle prestazioni di consegna a causa di concentrazione cellulare.
  3. Mescolare cellule e la consegna materiale desiderato in un tubo separato per ottenere la concentrazione desiderata materiale per l'esperimento. IMPORTANTE: Poiché il metodo di consegna descritto si basa sulla diffusione per facilitare la consegna, una concentrazione di materiale superiore produrrà consegna superiore. Se possibile, si raccomanda di utilizzare una soluzione 1 mM del materiale desiderato per prove iniziali. Questa concentrazione può essere titolato al esperimenti futuri come necessario. La concentrazione più bassa segnalato utilizzato con questo dispositivo è 10 nM 21.

5. Funzionamento

  1. Pipettare miscela di cellule e la consegna materiale in un serbatoio (disegno corrente ha un max 150 microlitri). NOTA: La maggior parte dei disegni di periferica sono completamente reversibili, pertanto la direzione del flusso attraverso i canali non importa. I campioni possono essere caricati in uno dei due serbatoi. Collegare il tubo di pressione al serbatoio riempito e serrare il dado per garantire la corretta tenuta (dito stretto è spesso sufficiente).
  2. Regolare la pressione al livello desiderato sul regolatore. Questo controlla la velocità con cui le cellule attraverso il dispositivo. Si noti che il flusso delle cellule non inizia fino a quando si preme il pulsante.

NOTA: Nel lavoro precedente, azoto o aria compressa hanno lavorato altrettanto bene come gas di trasporto.

  1. Sollevare dispositivo all'altezza degli occhi e orientarlo in modo che il liquido nel serbatoio è facilmente visibile. NOTA: Traccia colonna di liquido per spegnere il sistema prima che il serbatoio si svuota.
  2. Premere il pulsante per pressurizzare il serbatoio e iniziare il flusso delle cellule.
  3. Quando il livello del liquido è circa 2 mm dal fondo del serbatoio, girare rapidamente il regolatore a 0 psi per arrestare il flusso. IMPORTANTE: Se uno non riesce a fermare il flusso prima che il serbatoio si svuota, si rischia l'espulsione del campione dal collection serbatoio. Si noti inoltre che se la colonna di fluido non si muove ad un ritmo apprezzabile, o ha rallentato notevolmente rispetto alla sua portata iniziale (ad esempio 3x lento), il dispositivo montato è probabilmente sporco e deve essere sostituito. La gestione di un dispositivo intasato può portare alla morte delle cellule superiore.
  4. Raccogliere le cellule trattate dal serbatoio appropriato e metterli nel tubo di raccolta / piastra desideri. IMPORTANTE: Non diluire le cellule raccolte in tutti i buffer in questa fase, le cellule porati continueranno ad assorbimento di materiale per un massimo di 10 min 20. Dopo questa finestra è passato, diluire le cellule nel desiderato media / buffer.
  5. Per raccogliere le cellule trattate più o provare condizioni sperimentali alternativi, ripetere i passaggi 5,1-5,7 come necessario. Ricordiamo che i chip sono reversibili, quindi i campioni possono essere montati in uno dei serbatoi. Assicurati di scambiare i chip come necessario se si intasano. Eliminare i dispositivi ostruiti.

6. Smontaggio

  1. Collocare ogni parte nel contenitore di archiviazione appropriato (descritto nel paragrafo 1).
  2. Posizionare chip utilizzati in un contenitore separato per lo smaltimento.

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Representative Results

Figura 1 contiene uno schema descrittivo del sistema di erogazione microfluidica. Figure 2a-b illustrano i risultati tipici della trattando le cellule HeLa con disegni diversi dispositivi in presenza di coniugato fluorescente 3 kDa destrano 20. Se la procedura viene seguita correttamente, le prestazioni del sistema sarà sensibile al tipo di dispositivo e velocità operativa. Pertanto, si dovrebbe ottimizzare queste condizioni per una data applicazione prima di procedere a esperimenti più complessi. Nella gamma di condizioni operative illustrate nella figura, vitalità cellulare rimane al di sopra dell'80%, tuttavia, si deve notare che i parametri di consegna non ottimali (tipo di chip per esempio appropriato) potrebbe portare alla Viabilità di sotto del 30%. Così la redditività e l'efficienza di consegna devono essere ottimizzati simultaneamente per qualsiasi tipo di cellula precedentemente non dichiarata. Se un disegno dispositivo non è appropriato per il tipo di cellula bersaglio, si vedrà risultati che vanno dalla consegna non alta, cmorte ell (ad esempio 10% vitalità). Se le condizioni sperimentali erano appropriati, per esempio il materiale bersaglio legato alla superficie cellulare, si potrebbe non essere in grado di misurare la consegna precisione il segnale vincolante superficie può mascherare il segnale citoplasmatico.

Figure 2c-d illustrano il nostro metodo preferito per misurare l'efficienza di consegna all'interno della popolazione cellulare dal vivo. Il caso di controllo in Figura 2c intende riflettere tutti vincolanti superficie e gli effetti di endocitosi come le cellule sono esposte al materiale consegna per almeno finché i casi trattati. La popolazione cellulare erogata viene definita come la regione ombreggiata tale che solo 1-5% della popolazione di controllo rientra in tale regione. Si noti che lavoro precedente ha stabilito che la consegna in questo approccio non è mediato da endocitosi 20. La distribuzione doppio picco osservato nell'esempio consegnato non è necessariamente caratteristica del sistema come noi have osservato distribuzioni più e meno uniformi per diverse condizioni sperimentali.

Figura 1
Figura 1. S chematic del sistema completo e la sua interfaccia per i dispositivi microfluidici. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 2
Figura 2. Risultati rappresentativi con cellule HeLa 20. A) efficienza di consegna e b) vitalità cellulare delle cellule HeLa trattate da 3 disegni diversi dispositivi in presenza di cascata blu coniugato 3 kDa destrano (0,2 mg / mL). In questi esperimenti, la s cellaoluzione era ad una concentrazione di 10 6 cellule per ml in PBS contenente 3% di siero fetale bovino e 1% Pluronics F68. La vitalità è stata misurata mediante ioduro di propidio colorazione delle cellule morte e dei risultati di consegna sono mostrati solo a cellule vive. Tutti i punti di dati sono stati eseguiti in triplicato, e le barre di errore rappresentano 2 SDS. C) Un istogramma rappresentativo per un controllo sperimentale in cui le cellule HeLa sono state esposte a cascata blu coniugato 3 kDa destrano per almeno la stessa quantità di tempo come un caso periferica trattata. d) Il caso corrispondente dove le cellule sono stati passati attraverso il dispositivo per facilitare la consegna. La frazione della popolazione di cellule vivo che è nella regione ombreggiata dell'istogramma è definita come la popolazione 'consegnato'. clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

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Discussion

Taluni aspetti della procedura sperimentale descritta (cioè fattori diversi progettazione di chip e velocità operativa) possono avere bisogno di essere ottimizzato a seconda del tipo di cellula e materiale consegna il sistema viene applicato. La discussione che segue indirizzi alcuni dei fattori più comuni da considerare quando si progetta esperimenti.

Per migliorare il segnale di consegna per i composti fluorescente, si ha la necessità di affrontare le fonti di fluorescenza di fondo. Superficiale vincolante e endocitosi, per esempio, possono essere affrontate lavando cellule 5-10 min dopo la consegna per rimuovere il materiale in eccesso prima coltura o trasformazione. Se si decide di rinunciare a una fase di lavaggio, sarebbe meglio per diluire le cellule trattate con 5-10x nel supporto desiderato per ridurre la concentrazione di materiale bersaglio nella soluzione circostante e quindi ridurre i tassi di endocitosi. In alcuni casi, per consegna esemplificativa proteina, si può trovare necessario bloccare attivamente la superf cellace (ad esempio utilizzando non marcato sieroalbumina bovina) per ridurre il legame non specifico del materiale consegna. In una data applicazione, se l'intensità di fluorescenza del caso trattata, come misurata mediante citofluorimetria a flusso, è più di un decennio inferiore al controllo endocitosi poi superficie legante / endocitosi può essere un problema. Si noti che i problemi con segnale di fondo sono rilevanti solo per il rilevamento di fluorescenza diretta del materiale consegna, saggi funzionali (ad es riprogrammazione cellulare) sono generalmente influenzati da endocitato o superficie del materiale legato sono spesso inattivi.

Per migliorare la vitalità delle cellule dopo il trattamento, si ha la necessità di ridurre al minimo la quantità di elaborazione post-parto. Si raccomanda di evitare un eccessivo centrifugazione o lavare passi e le cellule di trasferimento nei loro supporto desiderato in un incubatore 5-10 minuti dopo la consegna è completa. In linee aderenti, cellule sono spesso completamente rispettate e dividendo entro 24 ore dopo il trattamento. Come prev discussoiously 20, non abbiamo osservato alcun a lungo termine effetti collaterali derivanti dall'uso di questa tecnica.

I dispositivi microfluidici utilizzati in questo sistema di erogazione sono inclini a intasamento nel tempo. Zoccoli spesso formano alla costrizione in quanto è la caratteristica più stretto sul dispositivo. Ostruzione può essere causata da cellule danneggiate o da contaminanti ambientali. L'effetto di quest'ultimo può essere minimizzato garantendo un ambiente privo di polvere pulita per il funzionamento dei dispositivi (ad esempio, un armadio biosicurezza ben mantenuto). Per linee cellulari, si consiglia di cellule Passaging 1-2 giorni prima della consegna in modo da ridurre al minimo la presenza di detriti cellulari in sospensione risultante. Durante l'impiego, si deve essere consapevoli della portata volumetrica del fluido nel serbatoio. Se la portata scende a meno di un terzo del suo tasso iniziale, il dispositivo può causare morte cellulare eccessiva e deve essere scambiata, o la direzione di flusso invertito. Problemi di intasamento potenziale può anche essere mitigated facendo passare la sospensione cellulare attraverso un filtro di cella 40 pm. Questo processo assicura una sospensione singola cella evitando così potenziali zoccoli formazione nelle sezioni più ampie, basse velocità di flusso del chip.

Nel progettare esperimenti per diversi materiali consegna, si deve tenere conto della dimensione del materiale bersaglio e la sua concentrazione. Dato che questa tecnologia si basa sulla diffusione passiva del materiale attraverso la membrana cellulare interrotto, il gradiente di concentrazione molare e il raggio idrodinamico del materiale consegna regoleranno la velocità di trasferimento di massa - assumendo le interruzioni di membrana sono abbastanza grande per accogliere il materiale. È pertanto consigliabile utilizzare concentrazioni molari elevate (ad esempio, 1 mM) di grandi materiali bersaglio rispetto ai loro contro parti più piccole. La tecnica si è dimostrata efficace erogazione a concentrazioni inferiori ai 10 nm nel caso di quantum dot consegna 21. Inoltre, la tecnica è not pensato di essere limitato dalla natura del materiale consegna bersaglio eccetto nel contesto della dimensione materiale e diffusività (cioè materiali a bassa diffusività avranno efficienze di consegna inferiori e materiale maggiore della dimensione delle interruzioni probabilmente non può entrare nel citoplasma).

Studi in riprogrammazione delle cellule e la consegna quantum dot hanno illustrato i punti di forza dell'approccio spremitura cella relativa ad elettroporazione. Sulla base della corrente comprensione dei meccanismi di turbativa membrana in queste due tecniche, sembrerebbe che spremitura cella ha un vantaggio significativo in applicazioni che coinvolgono proteine, piccole molecole e nanomateriali 20,21. Il contrasto tra i due metodi in applicazioni che coinvolgono acidi nucleici (che sono altamente addebitate rispetto ai suddetti materiali) è chiaro.

Questo approccio microfluidica di consegna deduce rottura meccanica della membrana cellulare perfacilitare la diffusione passiva di materiale nella cellula e ha dimostrato di essere applicabile ad una gamma di tipi di cellule 20. Il sistema è quindi in caso principale per la consegna citosolico di quasi tutto il materiale a quasi qualsiasi tipo di cellula. Crediamo che i vantaggi del sistema sono più evidenti nei casi che riguardano tradizionalmente difficile trasfezione cellule primarie (ad esempio, immunitario e cellule staminali) e materiali tradizionalmente difficili (ad esempio, le proteine, i punti quantici, i nanotubi di carbonio, e RNA). Il potenziale di cui sopra nelle applicazioni delle cellule immunitarie e staminali è sottolineata dalle carenze dei metodi tradizionali per affrontare questi tipi di cellule. Tuttavia, il sistema può richiedere ulteriori miglioramenti per facilitare l'erogazione genica mediante vettori plasmidici come queste applicazioni richiedono consegna al nucleo. In sintesi, riteniamo che l'approccio deformazione microfluidica alla consegna potenzialmente in grado di affrontare le molte sfide esistenti alla consegna intracellulare. Il systeindipendenza m dalla vettori chimici o campi elettrici consente la sua applicazione robusto per una serie di studi. Le istruzioni qui fornite dovrebbero consentire eventuali ricercatori interessati ad operare un tale sistema indipendente e adattarlo per i loro scopi di ricerca.

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Disclosures

Gli autori Armon Azionei, Robert Langer, e Klavs F. Jensen sono azionisti di SQZ Biotecnologie Società che produce i dispositivi microfluidici utilizzati in questo articolo.

Acknowledgements

Ringraziamo T. Shatova per l'utile discussione sul design sperimentale e analisi dei dati. L'assistenza e la competenza di G. Paradis, il personale della citometria a flusso principale presso l'Istituto Koch, e il personale della Microsystems Technology Laboratory presso il Massachusetts Institute of Technology sono riconosciuti con gratitudine. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health Grants RC1 EB011187-02, DE013023, DE016516, EB000351, e in parte dal National Cancer Institute Cancer Center Support (Core) concede P30-CA14051 e MPP-09Call-Langer-60.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Device Holder & Plastic reservoir SQZ Biotechnologies Holder
LSRFortessa Analyzer Becton Dickinson N/A Flow cytometry machine used at the Koch Institute Core Facilities
Microfluidic device SQZ Biotechnologies Cell Squeeze
O-Rings McMaster 9452K311
Pressure system to operate device SQZ Biotechnologies Pressure System
Tweezers
Ultrasound bath

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References

  1. Schaffert, D., Wagner, E. Gene therapy progress and prospects: synthetic polymer-based systems. Gene. Ther. 15, 1131-1138 (2008).
  2. Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 8, 129-138 (2009).
  3. Leader, B., Baca, Q. J., Golan, D. E. Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 21-39 (2008).
  4. Kim, D., et al. Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells by Direct Delivery of Reprogramming Proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
  5. Dhar, S., Daniel, W. L., Giljohann, D. A., Mirkin, C. A., Lippard, S. J. Polyvalent Oligonucleotide Gold Nanoparticle Conjugates as Delivery Vehicles for Platinum(IV) Warheads. J. Am. Chem. Soc. 131, 14652-14653 (2009).
  6. Jiang, Z. -X., Zhang, Z. -Y. Targeting PTPs with small molecule inhibitors in cancer treatment. Cancer and Metastasis Reviews. 27, 263-272 (2008).
  7. Derfus, A. M., Chan, W. C. W., Bhatia, S. N. Intracellular Delivery of Quantum Dots for Live Cell Labeling and Organelle Tracking. Adv. Mater. 16, 961-966 (2004).
  8. Michalet, X., et al. Quantum Dots for Live Cells in Vivo Imaging, and Diagnostics. Science. 307, 538-544 (2005).
  9. Dahan, M., et al. Diffusion Dynamics of Glycine Receptors Revealed by Single-Quantum Dot Tracking. Science. 302, 442-445 (2003).
  10. Slowing, I. I., Trewyn, B. G., Lin, V. S. Y. Mesoporous Silica Nanoparticles for Intracellular Delivery of Membrane-Impermeable Proteins. J. Am. Chem. Soc. 129, 8845-8849 (2007).
  11. Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. Design and development of polymers for gene delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 4, 581-593 (2005).
  12. Joseph, Z. Cationic lipids used in gene transfer. Advanced Drug Delivery Reviews. 27, (97), 17-28 (1997).
  13. Verma, A., et al. Surface-structure-regulated cell-membrane penetration by monolayer-protected nanoparticles. Nat. Mater. 7, 588-595 (2008).
  14. Yan, M., et al. A novel intracellular protein delivery platform based on single-protein nanocapsules. Nat. Nano. 5, 48-53 (2010).
  15. Shi Kam, N. W., Jessop, T. C., Wender, P. A., Dai, H. Nanotube Molecular Transporters: Internalization of Carbon Nanotube-Protein Conjugates into Mammalian Cells. J. Am. Chem. Soc. 126, 6850-6851 (2004).
  16. Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151, 220-228 (2011).
  17. li, S. Electroporation Gene Therapy: New Developments In Vivo and In Vitro. Current Gene Therapy. 4, 309-316 (2004).
  18. Fox, M., et al. Electroporation of cells in microfluidic devices: a review. Anal. Bioanal. Chem. 385, 474-485 (2006).
  19. Miller, D. L., Pislaru, S. V., Greenleaf, J. F. Sonoporation: Mechanical DNA Delivery by Ultrasonic Cavitation. Somatic Cell and Molecular Genetics. 27, 115-134 (2002).
  20. Sharei, A., et al. A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 2082-2087 (2013).
  21. Lee, J., et al. Nonendocytic Delivery of Functional Engineered Nanoparticles into the Cytoplasm of Live Cells Using a Novel, High-Throughput Microfluidic Device. Nano Lett. 12, 6322-6327 (2012).

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