Isolierung von Cellular Lipid Droplets: Zwei Reinigungstechniken Ausgehend von Hefezellen und menschlichen Plazenten

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Bioengineering

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Summary

Zwei Techniken zur Isolierung zellulärer Lipidtröpfchen von 1) Hefe-Zellen und 2) menschlichen Plazenten werden vorgestellt. Das Herzstück der beiden Verfahren ist die Dichte-Zentrifugation, wobei die resultierende Schwimmschicht, die die Tröpfchen leicht mit dem Auge sichtbar gemacht werden, extrahiert und mittels Western-Blot-Analyse für Reinheit quantifiziert.

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Mannik, J., Meyers, A., Dalhaimer, P. Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas. J. Vis. Exp. (86), e50981, doi:10.3791/50981 (2014).

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Abstract

Lipidtröpfchen dynamischen Organellen, die in den meisten eukaryotischen und prokaryotischen Zellen bestimmte gefunden werden können. Strukturell die Tröpfchen bestehen aus einem Kern aus neutralen Lipiden durch eine Phospholipid-Monolayer umgeben. Eine der nützlichsten Techniken zur Bestimmung der zellulären Funktionen von Tröpfchen wurde Proteom Identifizierung von gebundenen Proteinen, die zusammen mit den Tröpfchen, die isoliert werden können. Hier werden zwei Methoden beschrieben, um Lipidtröpfchen und ihre gebundenen Proteine ​​aus zwei weit reich Eukaryoten zu isolieren: Die Kernspaltung Hefe und menschlichen Plazenta villous Zellen. Obwohl beide Techniken haben Unterschiede, die wichtigste Methode - Dichtegradientenzentrifugation - wird von beiden Präparaten geteilt. Dies zeigt die breite Anwendbarkeit der vorgestellten Tröpfchenisolationstechniken.

Im ersten Protokoll werden in Hefezellen-Sphäroplasten durch enzymatischen Verdau der Zellwände umgewandelt. Die daraus resultierenden Spheroplasten werden dann gently lysiert in einem locker sitz Homogenisator. Ficoll ist mit dem Lysat zugegeben, um einen Dichtegradienten zu schaffen, und das Gemisch wird dreimal zentrifugiert. Nach dem ersten Durchlauf werden die Lipidtröpfchen auf die weiß gefärbte Schwimmschicht der Zentrifugenröhrchen zusammen mit dem endoplasmatischen Retikulum (ER), der Plasmamembran und Vakuolen lokalisiert. Zwei aufeinanderfolgende Drehungen verwendet werden, um diese drei Organellen zu entfernen. Das Ergebnis ist eine Schicht, die nur Tröpfchen und die gebundenen Proteine ​​hat.

Im zweiten Protokoll werden plazentaren Zotten-Zellen aus menschlichen Plazenten Zeit durch enzymatischen Verdau mit Trypsin und DNase I. Die Zellen werden in einem locker sitzenden Homogenisator isoliert. Low-Speed-und mittelschnell Zentrifugationsschritte werden verwendet, um aufgebrochene Zellen, Zelltrümmer, Zellkerne, Mitochondrien und zu entfernen. Sucrose wird zu dem Homogenat zugegeben, um einen Dichtegradienten liefern und die Mischung wird zentrifugiert, um die Lipidtröpfchen von der anderen zu trennen cellular Fraktionen.

Die Reinheit der Lipidtröpfchen in beiden Protokollen wird durch Western-Blot-Analyse bestätigt. Die Tröpfchen Fraktionen aus beiden Preps sind geeignet für die anschließende Proteom-und der Lipid-Analyse.

Introduction

Cellular Lipidtröpfchen sind dynamische Organellen, die mehrere Funktionen in Zellen dienen. Sie sind lager Hubs für neutrale Lipide, die in Energie umgewandelt oder Phospholipid-Synthese verwendet werden können. Die Tropfen spielen eine zentrale Rolle in physiologischen und pathologischen Bedingungen, einschließlich Atherosklerose, Fettleibigkeit und die damit verbundenen Stoffwechselerkrankungen, Infektionskrankheiten und auch 1,2. Darüber hinaus sind sie faszinierende Quellen für die Biodiesel-Kraftstoffen.

Viele Informationen über die Rolle der zellulären Lipidtröpfchen wurde von Proteom-und der Lipid-Analyse von Tröpfchen aus weitreichenden Organismen gereinigt 3 erhalten. Diese Organismen sind Bakterien, 4,5, Hefe 6-11 enthalten, pflanzen 12,13, Nematoden 14, 15,16 und fliegt. Angesichts des Interesses in der Rolle von Fetttröpfchen in der menschlichen Stoffwechselerkrankungen, haben auch Tröpfchen von kultivierten tierischen Zellen und eine isoliertenimal Gewebe. Kultivierte Zelllinien 3T3-L1 Adipozyten 17, chinesische Hamster-Eierstock (CHO)-K2-Zellen 18, die menschliche hepatocyes 19,20 und epithelialen Zelllinien 21 enthalten. Tierische Gewebe, aus dem Tröpfchen isoliert wurden, Maus Skelettmuskel 22, Leber 23 und 23 Milchdrüsen enthalten. Wie oben erwähnt, ist das Ziel der meisten Tröpfchen Isolationsstudien zur Proteom-Analyse der Faktoren gebunden und der Lipid-Analyse auf die neutrale Phospholipide und auszuführen.

Seit neutralen Lipiden - die zahlreichen Komponenten von Lipidtröpfchen - sind weniger dicht als die meisten anderen zellulären Materialien, Isolierung von Tröpfchen hat traditionell durchgeführt unter Verwendung von Dichtegradientenzentrifugation. Diese Technik ist das Herzstück der beiden Preps hier vorgestellt. Zurück Techniken 6,24 kombiniert und in eine visuelle Darstellung der Isolierung von Tröpfchen aus kultivierten Zellen Spalthefe geändertnoncultured und menschliche Zellen aus Plazentagewebe erhalten. Ziel ist es, die breite Anwendbarkeit dieser Technik, indem Sie zwei sehr unterschiedliche Zelltypen als Ausgangspunkte für die Tröpfchen Isolation zu zeigen. Diese Technik sollte nützlich für diejenigen, die Tröpfchen von den meisten Organismen zu isolieren.

Protokoll 1 beschreibt die Isolierung von Lipidtröpfchen von der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe, die als Modell für die Beobachtung der Tropfenbildung während der eukaryotischen Zellteilung 25 verwendet wurde. Die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae wurde ausgiebig als Modellorganismus für das Studium der Biologie Fetttröpfchen verwendet. Protokoll 1 ist auf beiden Organismen und Unterschiede in den Zubereitungen sind hervorgehoben.

Protokoll 2 beschreibt die Isolierung von Lipidtröpfchen aus Plazentazellen Villi, die wiederum aus menschlichen Plazenten Ausdruck erhalten werden. DieSammlung von Zeit Plazenten bietet eine einzigartige Gelegenheit, um sicher und ethisch zu erhalten 200-250 g leicht verfügbar menschlichen Gewebe 26, die eine erhebliche Anzahl von Lipidtröpfchen enthält. Dies steht im Gegensatz zu den meisten Lipidtröpfchen Isolierung Arbeit in höheren Eukaryonten, wo die Tropfen stammen aus kultivierten Zellen. In diesen Studien werden Fettsäuren häufig zu der Kultur zugegeben, um die Synthese von Neutrallipiden und somit das Wachstum der Tröpfchen zu fördern. Dies steht im Gegensatz zu der Arbeit hier wo Lipidtröpfchen unter nativen Bedingungen in Plazentagewebe gebildet.

Die Reinheiten der Lipidtröpfchen Fraktionen durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung von Organellen Marker-Antikörper bestimmt. Diese beiden Protokolle werden Lipidtröpfchen Fraktionen, die sich für nachfolgende Proteom-und der Lipid-Analyse sind zu erhalten.

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Protocol

1. Trenn Lipid Droplets aus (Fission) Hefezellen

Isolation von Tröpfchen aus der beliebten Modellorganismus Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae ist fast identisch mit dem folgenden Protokoll 6. Unterschiede in den Vorbereitungen zur Kenntnis genommen.

1. Wachsende Hefezellen

  1. Bereiten Sie die Medien. Kombinieren Sie 36 g Pulver pro Liter YE5S dH 2 O in Glasflaschen oder Kulturflaschen. Etwa 2 l Medien benötigt werden. Autoklavieren der Medien bei 121 ° C für 20 min. Ermöglichen, dass die Medien auf Raumtemperatur abkühlen. Für S. cerevisiae ersetzen YE5S mit YPD.
  2. Platzieren 10-20 ml der gekühlten YE5S Medium in einem 250 ml-Kulturkolben unter Verwendung von sterilen Techniken. Inokulieren, die Medien mit einer kleinen Menge der Hefezellen von einer Agarplatte mit einem sterilen Holzstäbchen oder gleichwertig. Ließ die Zellen wachsen, um die gewünschte optische Dichte bei 30 ° C. Messung der optischen Dichte bei einerWellenlänge von 595 nm mit einem Spektralphotometer.
  3. Die restlichen Medien in den 2,8-l-Flaschen. Verwenden Sie nicht mehr als 1 L Medium pro 2,8-l-Flasche auf richtige Mischung während des Zellwachstums im Schüttelinkubator gewährleisten. Die endgültige Ausbeute an nassen Zellen sollten etwa 10 g in der Lage sein, genügend Lipidtröpfchen für Proteomik und der Lipid-Analyse zu erwerben.
  4. Einführung der Zellen aus Schritt 1.2 in den 2,8-l-Kolben mit jeweils 1 l Medium, das in Schritt 1.1 hergestellt wurden.
  5. Wachsen die Zellen auf die gewünschte Dichte bei 30 ° C
  6. Stellen Sie sicher, dass die Zellen Lipidtröpfchen. Reserve 1 ml der Zellen. Die optische Dichte (OD) der Probe. In 0,1 ml einer 100 mM Stamm von BODIPY 493/503 in Ethanol pro OD von Zellen auf die Probe. Platz 3 ul der Probe zwischen einem Objektträger und einem Deckglas. Visualisierung unter einem Fluoreszenzmikroskop mit einem GFP-Filter (Fig. 1A).
  7. Pelletierung der Zellen aus Schritt 4 und 1,5 bei #176; C bei 3.800 × g für 10 min. Arbeiten chargenweise in Abhängigkeit von der Kapazität der Zentrifugenröhrchen.
  8. Gießen Sie die YE5S Medien und waschen Sie die Zellen mit einem Puffer von EMM + 600 mM Sorbit. Sorbitol bietet osmotischen Unterstützung.
  9. Übertragen der Zellen in ein steriles 50 ml-Zentrifugenröhrchen pelletieren und die Zellen bei 4 ° C bei 2.000 × g für 10 min. Entfernen Sie den Überstand. Wiegen Sie die Nasszellen. Resuspendieren der Zellen in 2 ml (EMM + 600 mM Sorbit) Puffer pro Gramm Zellen.

2. Konvertieren Spalthefe Zellen in Spheroplasten und anschließender Lyse

  1. Jeweils 1 5 mg) Hefe lytischen Enzym und 2) Hefe-Lyse Enzyme aus Trichoderma harzianum pro Gramm Nasszellen, die in Schritt 1.9 gewogen wurden. Für S. cerevisiae ergänzen diese Enzyme mit der gleichen Menge von Zymolyase.
  2. Inkubieren der Zellen bei 30 ° C unter leichtem bei 100 rpm für 60 min schütteln.
  3. Stellen Sie sicher, dass die Spheroplasten haben Lipid droplets. Durch Wiederholen von Schritt 1.6 (Fig. 1B).

3. Dichtegradientenzentrifugation

  1. Pellet die Sphäroplasten durch Zentrifugation bei 4 ° C bei 2.000 × g für 5 min.
  2. Den Überstand mit einem Kunststoff-Transferpipette vorsichtig entfernen.
  3. Vorsichtig resuspendieren pelletiert Spheroplasten mit eiskaltem 10 mM Tris-HCl, 600 mM Sorbitol und 200 uM EDTA. Beachten Sie, dass die Spheroplasten sind sehr zerbrechlich.
  4. Pellet die Spheroplasten wieder mit den gleichen Einstellungen wie in Schritt 3.1. Vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sphäroplasten mit einem Kunststofftransferpipette in 12% Ficoll, 10 mM Tris-HCl und 200 &mgr; M EDTA in einer Konzentration von 2 ml / g-Zellen.
  5. Übertragen Sie die resuspendiert Spheroplasten zu einem Glas-Homogenisator homogenisieren und sanft auf dem Eis, 20-30 Schläge, mit der locker sitz Stößel der Glas-Homogenisator.
  6. Übertragen Sie die lysiert Spheroplasten in Zentrifugenröhrchen überlagern und mit dem gleichen volumen von 12% Ficoll, 10 mM Tris-HCl und 200 &mgr; M EDTA-Puffer. Wählen der Anzahl der Reaktionsgefäße auf, so daß jedes Rohr etwa zwei Drittel voll zu nutzen.
  7. Zentrifuge bei 4 º C bei 100.000 × g für 1,5 Stunden in einem SW28 Rotor oder gleichwertig. Lassen Rotor bis zum Stillstand (Rotor Verzögerung = 0).
  8. Sie vorsichtig die oben schwimmenden weißen Schicht (2A), die die Tröpfchen enthält, Transfer in ein neues Zentrifugenröhrchen (n) entweder mit einem Pipette oder einer gebogenen Pasteur-Pipette. Add genug Volumen von 12% Ficoll, 10 mM Tris-HCl und 200 &mgr; M EDTA-Puffer zu der Probe, so dass sie etwa ein Drittel des Zentrifugenrohrs ausfüllt.
  9. Hinzufügen des äquivalenten Volumen von 8% Ficoll, 10 mM Tris-HCl und 200 &mgr; M EDTA-Puffer, um der Oberseite der Probe (n) in der neuen Zentrifuge Röhre (n). Nach Zugabe dieses Puffers sollte die Rohre etwa zwei Drittel voll.
  10. Zentrifuge bei 4 º C bei 100.000 g für 1 h in einem SW28-Rotor oder gleichwertig. Lassen Rotor bis zum Stillstand (rotor Verzögerung = 0).
  11. Sanft übertragen Sie die oben schwimmenden weißen Schicht (2B), die die Tröpfchen enthalten wird, um ein neues Zentrifugenröhrchen (n) entweder mit einem Pipette oder einer gebogenen Pasteur-Pipette. Add 600 mM Sorbit, 8% Ficoll, 10 mM Tris-HCl und 200 &mgr; M EDTA-Puffer zu der Probe, so dass sie etwa ein Drittel des Zentrifugenrohrs ausfüllt.
  12. Hinzufügen des äquivalenten Volumens von 250 mM Sorbit, 10 mM Tris-HCl und 200 &mgr; M EDTA-Puffer, um der Oberseite der Probe (n) in der neuen Zentrifuge Röhre (n). Nach Zugabe dieses Puffers sollte die Rohre etwa zwei Drittel voll.
  13. Zentrifuge bei 4 º C bei 100.000 g für 1 h in einem SW28-Rotor oder gleichwertig. Lassen Rotor bis zum Stillstand (Rotor Verzögerung = 0).
  14. Übertragen oberen weißen Schicht (2C), die nur die Lipidtröpfchen und gebundene Proteine ​​enthalten sollte, in einen Dialyseschlauch und dialysiert O / N in 10 mM Tris-HCl und 200 &mgr; M EDTA-Puffer, um das Ficoll beseitigen.

Plazenten wurden von gesunden Frauen mit Einlingsschwangerschaften elektiven Kaiserschnitt Lieferung vor dem Einsetzen der spontanen Arbeits am Termin gesammelt. Themen gab schriftliche informierte Zustimmung zur Sammlung ihrer Plazenta. Die Sammlung und die anschließende Verwendung der Plazenta wurde mit Genehmigung von der University of Tennessee und der University of Tennessee Graduate School of Medicine in Knoxville Institutional Review Board (# 8757B und # 3338, respectively) durchgeführt.

1. Isolierung menschlicher Plazenta villous Zellen

Teil 1 des Protokolls ist eine Modifikation eines früher veröffentlichten Protokoll von Petroff et al. 26

Bereiten Sie folgende Lösungen:

  • NaCl (1 L): 9 g NaCl auflösen (M 58,4 g / mol) in dH 2 O, um eine 1 L Lösung ergeben. Filter zu sterilisieren (0,2, Um Membran).
  • 10x Hanks ausgewogener Salzlösung (10x HBSS) (1 l): 4 g KCl (M 74,5 g / mol), 0,6 g KH 2 PO 4 (M 136,086 g / mol), 80 g NaCl (M 58,44 g / mol); Na 2 HPO 4 (M 141,96 g / mol), 10 g D-Glucose (M 180,16 g / mol). Lösen Sie jedes der Bestandteile in dH 2 O, um eine 1 L Lösung ergeben. Filter zu sterilisieren (0,2 um Membran).
  • Enzym-Verdauungspuffer (0,6 ml): 70 ml kombinieren 10x HBSS mit 3,3 ml 7,5% Na Biscarbonats, 17,5 ml 1 M HEPES und 266,1 ml dH 2 O; Filter zu sterilisieren (0,2 um Membran). Lagern bei 4 ° C
  • DNase I: kurz vor Gebrauch 5 ml steriler 0,9% NaCl in ein Fläschchen von DNase. Halten bis zur Verwendung auf Eis oder bei -20 ° C
  1. Vorbereiten Plazenta für die Präparation
    1. Besorgen Sie sich eine menschliche Plazenta und Verfahren möglichst nahe an dem Zeitpunkt der Lieferung wie möglich. Verwenden einen abgedichteten Behälter, wie einen Kühler, die Plazenta transportiert. Seien Sie immer vorsichtig, wenn die Handling menschlichen biologischen Materialien.
    2. In der biologischen Schutzhaube, übertragen Sie die Plazenta in einen sterilen Behälter autoklavierbar und vorsichtig waschen Blut aus der Plazenta und Membranen mit steriler 0,9% NaCl (Kochsalzlösung) Lösung. Entsorgen blutigen Kochsalzlösung in der 1-Liter-Becher als flüssige biologische Abfälle.
    3. Legen Sie die Plazenta auf einem sterilen Bereich, mit der glatten Seite mit der Nabelschnur nach oben ein. Mit scharfen, fein-Punkt-Schere und Pinzette entfernen Eihäute und Nabelschnur.
    4. Klappen Sie den Plazenta um, so dass der mütterliche Oberfläche (raue Oberfläche) nach oben zeigt. Entfernen Sie den darüber liegenden Grundplatte Gewebe, ca. 3 mm von der Oberfläche.
  2. Lagen zur Plazenta
    1. Präparieren Sie ein Keimblatt in einer Zeit, die Vermeidung der Chorionplatte. Sammeln Zottengewebe in ein 250 ml Becherglas mit Kochsalzlösung.
    2. Gewebe mehrmals gründlich in einem getrennten Becherglas mit 0,9% NaCl durch Verwirbelung mit der Pinzette, mit Hilfe der 1 L-Becherglas für flüssige Abfälle.
    3. Ein Keimblatt übertragen zu einem Zeitpunkt auf eine 150 mm Petrischale. Halten Sie mit einer Pinzette und kratzen Gewebe mit Rasierklinge von Schiffen auf Petrischale. Zeigen abgekratzt Gewebe in separaten Becherglas mit 0,9% NaCl. Wiederholen Sie für alle Gewebestücke.
    4. Übertragen kleinen Teil des Gewebes in die Zelle Dissoziation Sieb und spülen mit 0,9% NaCl ausgiebig, bis das Eluat deutlich. Wiederholen aller Gewebe.
    5. Nach dem Spülen der abgekratzt Gewebe in der Zelle Dissoziation Sieb abtropfen lassen überschüssige Flüssigkeit und Gewicht.
      An diesem Punkt kann das Gewebe bei 4 º C in DMEM gespeichert O / N in einem sterilen Erlenmeyerkolben werden.
  3. Enzymatische Verdauung der Plazentagewebe
    1. Bereiten Sie das Gewebe Verdauung Mischung: 100 ml vorgewärmten Enzymverdünnungspuffer, 1 ml DNase I und 20 ml 2,5% 10x Trypsin.
    2. Teilen Sie die Gewebe, die Übertragung von insgesamt 60 g gesammelten Gewebe (in der Regel etwa 250 bis 300 g) in einen 500 ml sterilen Erlenmeyerkolben.
  4. Das Sammeln der dissoziierten Zellen
    1. Nach der ersten 45 min Dissoziation, stellen Sie den Aufschlusskolben in einem Neigungs bis Gewebe absetzt.
    2. Die überstehende Flüssigkeit, dabei nicht zu undissoziierten Gewebe zu sammeln. In die gleiche Menge HBSS auf den Überstand gesammelt und übertragen in sterile 15 ml Zentrifugenröhrchen. Weitere Teile der undissoziierten Gewebe, wiederholen Vorgang ab Schritt 3.2 mit dem undissoziierten Gewebe.
    3. Zentrifugieren des Homogenats bei 4 ° C bei 1.000 × g für 15 min.
    4. Für jede Partie nach der Zentrifugation, saugen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Die Plazenta villous Zellen sind überwiegend im weißen Teil des Pellets, die über den roten Blutkörperchen.
    5. Übertragen Sie die Zotten-Zellen (weiße Teil des Pellets) zu einem sterile 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen und auf Eis zu halten.
    6. Nach dem Sammeln der Zellen, die aus allen drei Phasen der Verdauung, filtern die Suspension mit einer 100 &mgr; m Nylon-Zellfilter in der Spitze einer sterilen 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen eingeführt. Wenn die Filtration der Zellsuspension verlangsamt Heben nach oben auf den Filter, um ein Vakuum in der Röhre zu ziehen.
    7. Zentrifuge bei 4 ° C bei 1.000 × g für 10 min. Überstand vorsichtig entfernen, ohne das Pellet zu stören.

2. Homogenisieren Plazentazellen villous

  1. Bevor mit der Isolationsprozess vorzubereiten 50 ml hypotonische Lyse Medium (HLM), enthaltend 20 mM Tris-HCl, pH 7,4 und 1 mM EDTA. In Protease-Inhibitoren zu HLM kurz vor der Verwendung und halten das Medium auf Eis.
  2. In der biologischen Schutzhaube, fügen Sie den 4-fachen Zellpellet Volumen eiskaltem HLM zu den Zellen. Sanft und gründlich resuspendieren Zellen durch Pipettieren der Zellen-up eind-down unter Verwendung einer 10 ml Pipette.
  3. Inkubieren Sie die suspendierten Zellen auf Eis für 10 min.
  4. Übertragen der Zellen an die Dounce-Homogenisator, der auf Eis sein sollte. Langsam homogenisieren die Zellen durch die Anwendung 20-25 sanfte Schläge mit der locker sitzenden Stößel des Homogenisators.
  5. Zentrifuge das Zelllysat bei 4 ° C bei 3.000 × g für 10 min, um aufgebrochene Zellen, Zelltrümmer und Zellkerne zu entfernen.
  6. Sammeln Sie den Überstand und Transfer in ein SW28 Rohr (oder Alternative, die bei 25.000 g zentrifugiert werden kann). Zentrifuge bei 4 ° C bei 25.000 × g für 20 min, um die Mitochondrien zu entfernen.

3. Trennlipidtröpfchen durch Ultrazentrifugation

  1. Vorbereitung 50 ml 100 mM Natriumcarbonat (M 106 g / mol)-Puffer (pH 11,5) und 50 ml 60% Sucrose (w / w) Lösung. In Protease-Inhibitoren auf die Natriumcarbonat-Puffer kurz vor Gebrauch und auf Eis zu halten.
  2. Sammeln des Überstands aus Schritt 2.6 in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen, justierenbis 20% Saccharose und Übertragung in den Boden ein Ultrazentrifugenröhrchen für einen SW28-Rotor, oder gleichwertig. Overlay Dichte angepasst Stand mit ~ 10 ml eiskaltem 100 mM Natriumcarbonat-Puffer (pH-Wert 11,5) und 0,5 bis 1 ml eiskaltem HLM, um die Röhre zu füllen.
  3. Zentrifuge bei 4 º C bei 130.000 · g für 45 min unter Verwendung SW28 Ausschwingrotor. Lassen Rotor bis zum Stillstand (Rotor Verzögerung = 0).
  4. Sammeln der schwimmenden Schicht beträgt, auf 10% Saccharose und Übertragung in den Boden einer 13,2 ml Ultrazentrifugenröhrchen für ein SW41Ti-Rotor, oder gleichwertig. Overlay Dichte angepasst Stand mit etwa 5 ml eiskaltem 100 mM Natriumcarbonat-Puffer (pH-Wert 11,5) und 0,5 ml eiskaltem HLM.
  5. Zentrifuge bei 4 º C bei 274.000 · g für 60 min unter Verwendung SW41Ti Ausschwingrotor. Lassen Rotor bis zum Stillstand (Rotor Verzögerung = 0) zu einer Störung der Lipidtropfenschicht zu minimieren.
  6. Die obere Schwimmschicht (2D), die sorgfältig sammelnLipidtröpfchen mit einer 1 ml Pipette und wiederholen Sie Schritt 3.4.
  7. Zentrifuge bei 4 º C bei 274.000 · g für 30 min unter Verwendung SW41Ti Ausschwingrotor. Lassen Rotor bis zum Stillstand (Rotor Verzögerung = 0).
  8. Sorgfältig sammeln die obere weiß gefärbte Schicht, die schwimmende Lipidtröpfchen mit einem gebogenen Pasteur-Pipette in drei 1,5-ml-Röhrchen mit 100 ul HLM.

Charakterisierung von Lipidtröpfchen Fraktion (Protokolle 1 und 2)

Die Rückgewinnung und Reinheit der Lipidtröpfchen Fraktion kann durch Western-Blot in Kombination mit Licht-oder Elektronenmikroskopie bestätigt werden. Darüber hinaus können nach verschiedenen Aliquots Zentrifugationsschritte gesammelt und zur Bestimmung Reinigungsleistung beibehalten werden. In Western Blot, ist es zweckmäßiger, ein Volumen der Lipidtröpfchen Fraktion, die ein Äquivalent des Ganzzelllysat stellt als Vergleich die Lipidtröpfchen zu anderen Membranfraktionen auf T vergleichener aufgrund der Gesamtproteingehalt 24.

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Representative Results

Wenn die Dichte-Zentrifugation wie erwartet funktioniert, sollte das Schwimmschicht Lipidtröpfchen und anderer Organellen während der Verlauf der Hochgeschwindigkeits-Spins aufgebraucht werden.

Bei Protokoll 1 wurden Western Blots mit Marker-Antikörper gegen Lipidtröpfchen (Erg6p) und Organellen, die gefunden wurden, um mit Lipidtröpfchen in Hefe, ER (Dpm1p), Mitochondrien (Por1p) interagieren durchgeführt, Plasma-Membran (Pma1p) und Vakuolen (Vma1p).

Gleiche Volumina der Schwimmschicht zu je drei Drehungen (Schritte 3.7, 3.10 und 3.13), wurden gesammelt, ausgefällt mit Trichloressigsäure (15% Endkonzentration) und in Wasser gelöst. 13 ml der Zell-Lysat (3A, "Lys") und Protein prep von je drei Spins (3A "Spin1", "Spin2" und "Spin3") wurden auf 12% SDS-PAGE getrennt, auf Nitrocellulose transferiert Membran und Organellen mit Spezi immungeblottetFic-Antikörper. Wie erwartet, ist die Lipidtröpfchen Markerprotein Erg6p in der Schwimmschicht nach jeder der drei Spins (3A) vorhanden ist; Por1p nicht in der Schwimmschicht nach Spin1 vorhanden (3A); Vma1p wird von der Schwimmschicht nach Spin2 erschöpft (3A) und Dpm1p Pma1p und sind nicht in der schwimmenden Schicht nach Spin3 (3A) vorhanden ist.

Für Protokoll 2 wurde die Gegenwart von Lipidtröpfchen aus menschlichem Plazenta Begriff villous Zellen isoliert durch Anfärben mit einem neutralen Lipid spezifischen Fluoreszenzfarbstoff, BODIPY 493/503 überprüft. Die Tröpfchen wurden dann unter einem Fluoreszenzmikroskop (3B) visualisiert. Die Reinheit der isolierten Lipidtröpfchen Fraktionen wurde durch Western-Blotting mit Markerproteinen für die Lipid-Tröpfchen (Perilipin 2), ER (Calnexin), Golgi (GM130), Mitochondrien (COX IV) und Plasmamembran (MEK1) (Fig. 3C) bewertet. Die Lipid droplets wurden mit kaltem Aceton de-lipidierten und die Proteine ​​wurden extrahiert. Equal Prozentsätze der post-nuklearen Überstand (PNS), die Fraktion unter der Schwimmschicht der letzten Spin (Schritt 3.6, "Spin4" auf 3C), der nachfolgenden Waschschritt (Schritt 3.8, "Spin5" auf 3C) und de-lipidierten Protein prep Schwimmender Lipidtröpfchenschicht (Schritt 3.8, "LD" auf 3C) wurden auf 12% SDS-PAGE aufgetrennt, transferiert und mit angegebenen Antikörpern immuno-geblottet. Perilipin 2 (auch als ADRP bekannt), die Lipidtröpfchen-Protein wurde in post-nuklearen Überstand und in den isolierten weißen schwimmende Schicht, die Lipidtröpfchen nachgewiesen. Spezifisch für Plasmamembran (MEK1) und Golgi (GM130) Proteine ​​wurden in Lipidtröpfchen in beiden Fraktionen Schicht unterhalb der Schwimmschicht für Spin4 und Spin5 erkannt. Wie bereits berichtet, das ER-Protein Calnexin 18,27,28 und eine schwache Färbung der mitochondrialen Membranprotein COX IV wurden Deteanderswo in der Lipidtropfenbruch 22 cted. Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Berichten, die die den Lipidtröpfchen in Wechselwirkung mit Mitochondrien in Säugetierzellen 29 und mit dem ER 30,31.

Figur 1
Fig. 1 ist. Cellular Lipidtröpfchen in Spaltung Hefezellen. (A) Hellfeld (BF) und Weitfeld-Fluoreszenz (Fluor.) Bilder von sechs Vertreter Spalthefe Zellen, in denen die Lipidtröpfchen mit BODIPY 493/503 gefärbt. (B) Hellfeld (BF ) und Weitfeld-Fluoreszenz (Fluor.) Bilder einer repräsentativen Sphäroplast wo die Lipidtröpfchen mit BODIPY 493/503 gefärbt. Maßstabsbalken sind 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen of diese Zahl.

Figur 2
2. Schwimmschicht nach Dichtegradientenzentrifugation. Zentrifugenröhrchen nach (A) Spin1 (Schritt 3.8), (B) Spin2 (Schritt 3.11), und (C) Spin3 (Schritt 3.14) des Protokolls 1. (D) Zentrifugenröhrchen nach Spin4 (Schritt 3.6) des Protokolls Nr. 2. Die schwimmenden Schichten, die die Lipidtröpfchen werden durch Pfeile angezeigt.

Fig. 3
3. Die Analyse der Reinheit der isolierten Lipidtröpfchen. (A) Western-Blots der wichtigsten Schritte in Protokoll Nr. 1. Gleiche Volumina jedes Proteins prep (Spin1 - Schritt 3.7, Spin2 - Schritt 3.10 und Spi n3 - Schritt 3.13) wurde durch SDS-PAGE getrennt, auf Nitrozellulosemembranen transferiert und mit Antikörpern für Erg6p (LD, Lipidtröpfchen immungeblottet) Dpm1p (ER), Por1p (MT, Mitochondrien), Pma1p (PM, Plasmamembran) und Vma1p (Vakuolen). (B) Phasenkontrast (PC) und Weitfeldfluoreszenz (Fluor.) Bilder von BODIPY 493/503-stained Lipidtröpfchen, die aus menschlicher Plazenta villous Zellen isoliert wurden. (C) Western-Blots von Schlüsselschritten Protokoll Nr. 2. Gleichprozentig pf PNS (post Kernüberstand), Überstand unterhalb der Schwimmschicht nach dem letzten Spin (Spin4 - Schritt 3.6) anschließenden Wasch (Spin5 - Schritt 3,8) und Schwimmschicht (LD) wurden durch SDS-PAGE getrennt, übertragen Membranen und mit Antikörpern für Perilipin 2 (LD, Lipidtröpfchen) immungeblottet, Calnexin (ER), GM130 (Golgi-Matrix-Protein, Golgi), COX IV (Cytochrom-c-Oxidase, MT, Mitochondrien) und MEK1 (MAPK-Kinase, PM, Plasma Membran).ad/50981/50981fig3highres.jpg "target =" _blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Kritische Schritte innerhalb dieses Protokolls

Sicherzustellen, dass während des Wachstums von kultivierten Zellen, die mit Medium und die Zelldichten werden. Cellular Lipidtröpfchen sind einzigartig, ihre assoziierten Proteine ​​sind stark abhängig von der Umgebung, in der die Zellen kultiviert werden, 17. Daher sollten die Medien, in denen die Zellen gezüchtet und die Dichte der Zellen vor der Lyse eng überwacht werden.

Die Proteinzusammensetzung der Lipidtropfen eine Funktion der Wachstumsphase der Hefezellen. Weniger Proteine ​​werden auf den Tröpfchen in log-Wachstumsphase gegenüber der stationären Phase gebunden. Auch Spheroplasting Effizienz ist eine Funktion der Wachstumsphase der Hefezellen. Zellen in log-Wachstumsphase werden höhere Ausbeuten an Sphäroplasten als Zellen in der stationären Phase, weil die letzteren sind widerstandsfähiger gegen enzymatischen Behandlung.

Zelt ">

Achten Sie darauf, sanfte Techniken verwenden, um die Zellen aufzubrechen. Techniken, die Sie die Hefe-Zellwand brechen durch enzymatische Verdauung über Techniken, die die Zellwand durch aufgebrachte Kraft brechen bevorzugt. Das letztere Verfahren kann die strukturelle Integrität der Tröpfchen, was zum Verlust der gebundenen Proteine ​​oder Lipide zu stören.

Einfrieren vermeiden Proben, nachdem die Zellen lysiert worden sind. Friert Tröpfchen nicht empfohlen, da sie ihre strukturelle Integrität, die zum Verlust von gebundenem Protein oder Lipide beeinflussen. Freezing könnte auch dazu führen, die Tröpfchen zu verschmelzen oder Fragment 24. Dies kann besonders wichtig sein, da Tröpfchen beobachtet wurden, um in lebenden Hefezellen 25 in kleinere zu fragmentieren oder zu unterziehen Spaltung und somit Zusammenbruch der größeren Tropfen möglich. Stück von Tröpfchen, dass Fragment kann nicht den Auftrieb an der f erscheinen habenloating Schicht während Dichtegradientenzentrifugation. Dies könnte künstlich verringern die Anzahl der Tröpfchen Faktoren, die durch diese Technik identifiziert würde, da die Proteinzusammensetzung von Tröpfchenoberflächen kann eine Funktion der Tröpfchengröße 32 sein.

Achten Sie darauf, um die Lokalisierung von Lipidtröpfchen assoziierten Faktoren zu Lipidtröpfchen zu testen. Eines der Merkmale von Lipidtröpfchen ist, dass sie mit anderen Organellen 33-37 interagieren. Daher sind Faktoren, die von diesen Organellen oftmals in der Lipidtröpfchen Fraktion gefunden. Daher ist es wichtig, zusätzliche Techniken verwenden, um sicherzustellen, dass diese Faktoren zu lokalisieren, auf die Tröpfchen. Studien mit einer fluoreszierenden Fusionsproteins mit dem Protein von Interesse in Zellen, in denen die Lipidtröpfchen mit einer unterschiedlichen fluoreszierenden Marker gefärbt verbunden sollte verwendet werden, um das Ausmaß der Kolokalisation 15 zu bestimmen. Techniken, wie Protein Korrelations profiling können weitere Quantifizierung der Reinheit des Lipidtröpfchen Fraktion 15 werden. In dieser Strategie werden die zwei Komponenten mit jeweils unterschiedlichen Isotopen enthaltenden Aminosäuren markiert. Die erste Komponente ist eine bekannte Lipidtröpfchen Faktor und die zweite Komponente ist die Fraktion, die analysiert wird. Vergleiche werden dann zwischen den Bruchstellen der zwei Komponenten.

Änderungen und Fehlersuche

Änderungen des Protokolls Nr. 1 zur Isolierung von Lipidtröpfchen aus den Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae werden zur Kenntnis genommen. Beachten Sie, dass die Größen der Lipidtröpfchen kann stark variieren. Dichtegradientenzentrifugation Geschwindigkeiten eventuell auf kleinere Tröpfchen in der Schwimmschicht ansammeln erhöht werden.

Grenzen der Technik

Zugang zu einer Ultrazentrifuge wiealata-Rotor ist für die Isolierung von zellulärer Lipidtröpfchen wesentlich. Obwohl dieses Gerät ist Standard in den meisten zellbiologischen und biochemischen Laboratorien ist es teuer.

Bedeutung der Technik in Bezug auf bestehende Methoden oder andere alternative Methoden

Wie oben erwähnt, wird ein Protokoll genau auf die Arbeit der Leber et al. 6 und Teil 1 des Protokolls Nr. 2 ist eine Modifikation eines früheren veröffentlichten Protokoll von Petroff et al. 26 basierend

Anwendungen

Lipidtröpfchen Isolation ist sehr nützlich für die spätere Proteom-und der Lipid-Analyse der gebundenen Proteine, neutrale Lipide und Phospholipide. Vorräte von Lipidtröpfchen-assoziierten Proteinen und Lipiden wurden zusammengestellt 4,6-17,19,20,22,23,28.

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Disclosures

Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der American Heart Association Award 13SDG14500046 PD, eine nachhaltige Energie Education & Research Center Award (Univ. of Tennessee) PD unterstützt und von den Ärzten "Medical Education and Research Foundation (Univ. of Tennessee) Auszeichnung an JM Die Autoren danken Caroline Leplante (Yale Univ.) für das Protokoll für die Umwandlung von Spalthefe zu Spheroplasten; Eric T. Boder (Univ. of Tennessee) für die Nutzung seiner Schüttelinkubatoren, Tischzentrifuge, und Western-Blot-Analysegeräte, und das Zentrum für Umweltbiotechnologie (Univ. Tennessee) für die Nutzung ihrer ultra-Zentrifuge; Günther Daum für Hefe-Antikörper (Graz Univ of Technology, Österreich.), das Personal der Abteilung für Gynäkologie und Geburtshilfe (Univ. Tennessee Medical Center) für die technische Unterstützung .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protocol 1
1. Growing yeast cells and converting to spheroplasts
Edinburgh Minimal Media (EMM) Sunrise Science Products 2005
Yeast extract with 5 supplements (YE5S) Sunrise Science Products 2011 YE5S media with 225 mg/ml of each supplement: adeninie, histidine, leucine, lysine, uracil. The equivalent for budding yeast would be YPD.
YPD powder Sunrise Science Products 1875 For S. cerevisiae
Sorbitol Fisher Scientific BP439
Yeast Lytic Enzyme MP Biomedicals 215352610
Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum Sigma-Aldrich L1412
Zymolayse-20T Sunrise Science Products N0766391 For S. cerevisiae
BODIPY 493/503 Invitrogen D-3922
Microscope Slides Fisher Scientific 12-544-7
Microscope Cover Glass Fisher Scientific 12-542-B
Plastic transfer pipette Fisher Scientific 137115AM
1 L glass bottle
250 ml flask
2.8 L flasks
2. Yeast lipid droplet isolation
Tris-HCl Fisher Scientific BP153
EDTA Fisher Scientific BP120
Ficoll 400 Fisher Scientific BP525
12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane SpectrumLabs 132680
EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets Roche Diagnostics 11873580001 irritant
Dounce Homogenizer  Sigma-Aldrich D9938
Ultracentrifuge Tubes 25 mm x 89 mm (for SW28) Beckman-Coulter 355642
12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane SpectrumLabs 132680
Temperature-controlled shaker New Brunswick Scientific C25KC
Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge Thermo-Scientific 75004521
Swinging Bucket Centrifuge Rotor Thermo-Scientific 75003607
Fiberlite* F15-6x100y Fixed-Angle Rotor Thermo-Scientific 75003698
Ultracentrifuge LB-M Beckman-Coulter
SW28 Ultracentrifuge Rotor Beckman-Coulter 342204
Protocol 2
1. Placental villous cells isolation
Disposable underpads Fisher Scientific 23666062
Autoclavable pan (container), 3 L Fisher Scientific 1336110
Fine scissors, sharp-sharp, straight Fine Science Tools 1406011
London Forceps Fine Science Tools 1108002
Dumont #7b Forceps Fine Science Tools 1127020
Razor blades Fisher Scientific S65921
Screen cup for CD-1 Fisher Scientific S1145
40 mesh screen  Fisher Scientific S0770
Fisherbrand cell stainers 100 μm Fisher Scientific 22363549
150 mm Petri Dishes Fisher Scientific NC9054771
NaCl Fisher Scientific S642
KCl Fisher Scientific P333
KH2PO4 Fisher Scientific P386
Na2HPO4 Fisher Scientific S374
D-Glucose Fisher Scientific D16
HEPES Fisher Scientific BP310
2.5% Trypsin 10x Invitrogen 15090046
DNase I grade II, from bovine pancreas Roche Applied Science 10104159001
Sodium bicarbonate solution Sigma-Aldrich S8761
500 ml Erlenmeyer flasks
250 ml Beakers
15 ml Centrifuge tubes
10 ml Serological pipettes
50 ml Centrifuge tubes
DMEM Invitrogen 11965084
2. Lipid droplets isolation from villous placental cells
Tris-HCl Fisher Scientific BP153
EDTA Fisher Scientific BP120
D-Sucrose Fisher Scientific BP220
Sodium Carbonate  Fisher Scientific BP357
EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets Roche Diagnostics 11873580001 irritant
Dounce homogenizer  Sigma-Aldrich D9938
Ultracentrifuge tubes 25 mm x 89 mm (for SW28) Beckman-Coulter 355642
Ultra-Clear centrifuge tubes 14 mm x 89 mm (for SW41) Beckman-Coulter 344059
Disposable borosilicate glass Pasteur pipets Fisher Scientific 1367820C
Biological safety hood  Thermo-Scientific
Waterbath Fisher Scientific
Temperature-controlled shaker New Brunswick Scientific C25KC
Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge Thermo-Scientific 75004521
Swinging Bucket Centrifuge Rotor Thermo-Scientific 75003607
Ultracentrifuge LB-M Beckman-Coulter
SW28 Ultracentrifuge Rotor Beckman-Coulter 342204
SW41 Ti Ultracentrifuge Rotor Beckman-Coulter 331336
Western blot
IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG LI-COR 926-68071 dilution 1:15,000
IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG LI-COR 926-32210 dilution 1:5,000
NuPAGE Novex 12% Bis-Tris gels Invitrogen NP0341
Primary antibodies for Protocol 1
Erg6p gift from Dr. G. Daum Graz University of Technology, Austria dilution 1:5,000
Dpm1p Abcam ab113686 4 μg/ml
Por1p gift from Dr. G. Daum Graz University of Technology, Austria dilution 1:5,000
Pma1p gift from Dr. G. Daum Graz University of Technology, Austria dilution 1:10,000
Vma1p (anti-ATP6V1A) Abcam ab113745 0.5 μg/ml
Primary antibodies for Protocol 2
Perilipin 2 (anti-ADFP) Abcam ab52355 2 μg/ml
Calnexin Cell Signaling Technology 2679 dilution 1:1,000
GM130 Biorbyt orb40533 dilution 1:25
COX IV Cell Signaling Technology 4850 dilution 1:1,000
MEK1 Biorbyt orb38775 dilution 1:50

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References

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