التعرف على الفئران أرومة الحمراء حيوانية المخصب في Enucleating الأحداث بواسطة متعدد الأطياف التصوير التدفق الخلوي

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة جديدة لتحديد عدد سكانها enucleating الأرومة الحمراء سوي اللون عن طريق التدفق التصوير متعددة الأطياف الخلوي، وتوفير التصور لعملية استئصال أرومة الحمراء.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Konstantinidis, D. G., Pushkaran, S., Giger, K., Manganaris, S., Zheng, Y., Kalfa, T. A. Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (88), e50990, doi:10.3791/50990 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الكريات الحمر في الثدييات يختتم عملية دراماتيكية من قلع التي تؤدي الى تكوين الخلايا الشبكية. آلية قلع لم يتم حتى الآن توضيح بالكامل. وهناك مشكلة مشتركة واجهت عند دراسة توطين البروتينات والهياكل الرئيسية في الأرومة الحمراء enucleating بواسطة المجهر هو صعوبة مراقبة عدد كاف من الخلايا التي تمر قلع. قمنا بتطوير بروتوكول تحليل رواية باستخدام multiparameter التصوير الخلية عالية السرعة في تدفق (متعددة الأطياف التصوير التدفق الخلوي)، وهو الأسلوب الذي يجمع بين مناعي المجهري مع التدفق الخلوي، من أجل تحديد كفاءة عدد كبير من enucleating الأحداث، التي تسمح ل الحصول على القياسات وإجراء التحليل الإحصائي.

علينا أولا وصف هنا اثنين في المختبر الكريات الحمر أساليب الثقافة استخدامها من أجل مزامنة الأرومة الحمراء الفئران وزيادة احتمال التقاط قلع في الالوقت (ه) من التقييم. ثم، نحن تصف بالتفصيل تلطيخ الأرومة الحمراء بعد تثبيت وpermeabilization من أجل دراسة توطين البروتينات داخل الخلايا أو الطوافات الدهنية خلال قلع بواسطة التدفق الخلوي التصوير متعددة الأطياف. جنبا إلى جنب مع حجم وDNA/Ter119 تلطيخ التي تستخدم لتحديد الأرومة الحمراء سوي اللون، ونحن الاستفادة من المعلمات "نسبة الارتفاع" خلية في القناة مشرق الميدان أن يساعد في التعرف على الخلايا ممدود و "دلتا النقطه الوسطى XY Ter119/Draq5 "الذي يسمح بتحديد الأحداث الخلوية التي وسط Ter119 تلطيخ (الخلايا الشبكية الوليدة) هو متباعدة من وسط Draq5 تلطيخ (نواة تمر قذف)، مما يدل على أن الخلية على وشك أن استأصل. يتم التخصيب مجموعة فرعية من السكان أرومة الحمراء السوية التلون مع ارتفاع النقطه الوسطى الدلتا ونسبة الارتفاع المنخفض في enucleating الخلايا.

Introduction

التمايز النهائي ضمن النسب محمر في الثدييات يختتم عملية مثيرة للقلع، التي من خلالها أرومة الحمراء السوية التلون يطرد نواة المغطى الغشاء (pyrenocyte) وتوليد الخلايا الشبكية 2. الآلية الدقيقة لهذه العملية، والذي هو أيضا خطوة تحد من معدل النجاح، وعلى نطاق واسع، وإنتاج خلايا الدم الحمراء في المختبر، لم يتم حتى الآن توضيح بالكامل. توطين البروتينات والهياكل الرئيسية في الأرومة الحمراء enucleating تعتمد على استخدام الفلورسنت والإلكترون المجهري 3-5. النتائج هذه عملية شاقة عادة في التعرف على عدد محدود من الأحداث وقلع لا تسمح دائما التحليل الإحصائي ذات مغزى. التوسع في طريقة لتحديد أرومة الحمراء وصفت من قبل ماكغراث وآخرون. وقد وضعنا نهجا جديدا لتحديد ودراسة الأحداث من قبل قلع متعددة الأطياف إيماجينج التدفق الخلوي (multiparameter عالية السرعة التصوير الخلية في التدفق، والأسلوب الذي يجمع بين المجهر الفلورسنت مع التدفق الخلوي) والتي يمكن أن توفر عدد كاف من الملاحظات للحصول على قياسات وتحليل احصائى.

هنا، نحن تصف الأولين في المختبر الكريات الحمر الأساليب المستخدمة في ثقافة أجل مزامنة الأرومة الحمراء وزيادة احتمال التقاط قلع في وقت التقييم. ثم نحن تصف بالتفصيل تلطيخ الأرومة الحمراء بعد تثبيت وpermeabilization من أجل دراسة توطين البروتينات داخل الخلايا أو الطوافات الدهنية خلال قلع بواسطة التدفق الخلوي التصوير متعددة الأطياف.

يتم تشغيل العينات على تدفق عداد الكريات والتصوير هي بوابات الخلايا التي تم جمعها بشكل مناسب لتحديد الأرومة الحمراء سوي اللون 6. ثم يتم تحليل الأرومة الحمراء سوي اللون على أساس نسبة الارتفاع، والتي تقاس في brightfield معهد العالم العربيجينج، مقابل قيمتها لدلتا المعلمة النقطه الوسطى XY Ter119 الحمض النووي، الذي يعرف بأنه المسافة بين مراكز المناطق الملون لTer119 والحمض النووي، على التوالي. يتم التخصيب السكان من الخلايا مع نسبة الارتفاع المنخفضة والعالية دلتا النقطه الوسطى XY Ter119/DNA في enucleating الخلايا. باستخدام البرية من نوع (WT) الأرومة الحمراء مقابل الأرومة الحمراء مع MX-لجنة المساواة العرقية بوساطة الشرطي حذف RAC1 على Rac2 - / - أو مجتمعة Rac2 - / -؛ Rac3 - / - الخلفية الوراثية وهذا البروتوكول تحليل رواية من تدفق التصوير متعددة الأطياف الخلوي، ونحن في الآونة الأخيرة أظهرت أن استئصال يشبه الانقسام السيتوبلازمي غير المتماثلة وأن تشكيل عصابة أكتوميوزين ينظم في جزء من راك GTPases مهم لتطور قلع 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. طويل الأجل في المختبر الكريات الحمر الثقافة (خارج الحي محمر بروتوكول ثقافة التمايز التي كتبها Giarratana وآخرون. التعديل وتكييفها لخلايا الفأر)

هذا هو 3 خطوات طويلة الأجل في بروتوكول الكريات الحمر المختبر. في الخطوة الأولى (0-4 أيام) توضع 2 × 10 5 خلية / مل في متوسطة النمو أرومة الحمراء تستكمل مع عامل الخلايا الجذعية (SCF)، انترلوكين 3 (IL-3)، والإريثروبويتين (EPO). في الخطوة الثانية (5-6 أيام)، ومعلق الخلايا في 2 × 10 5 خلية / مل وشارك في تربيتها على الخلايا الملتصقة سدى (MS5) في الطازجة المتوسطة النمو أرومة الحمراء تستكمل فقط مع إبو. في الخطوة الثالثة (7-9 أيام)، والخلايا المستزرعة على طبقة من MS-5 خلايا جديدة في متوسطة النمو أرومة الحمراء دون السيتوكينات تصل إلى قلع (الشكل 1A).

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات الحيوان من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) منمستشفى المركز الطبي سينسيناتي للأطفال.

  1. حصاد العظام وعزل منخفض الكثافة خلايا نخاع العظام
    1. إضافة 2 مل IMDM العقيمة التي تحتوي على 2٪ مصل بقري جنيني (FBS) في أنبوب مخروطي 15 مل والحفاظ على الجليد.
    2. الموت ببطء 2-6 أشهر من العمر النوع البري C57/BL6 الماوس (جنبا إلى جنب مع أو بدون الماوس المستهدفة وراثيا من الفائدة) التالية التي وافقت عليها مؤسسة بروتوكول (مثل CO 2 الاستنشاق، تليها خلع عنق الرحم).
    3. عزل عظام الحوض، عظام الفخذ، وظنبوب من ساقيه باستخدام ملقط ومشرط، وإضافتها إلى أنبوب يحتوي IMDM +2٪ FBS والحفاظ على الجليد.
    4. إضافة 1 مل IMDM +2٪ FBS في أنبوب معقم التدفق الخلوي والعظام دافق باستخدام ملقط وحقنة السلين مع 25-G × 5/8 "الإبرة. IMDM فلوش +2٪ FBS من خلال العظام عدة مرات بلطف ( بواسطة الشفط ~ 500 ميكرولتر من تعليق خلية والتنظيف مرة أخرى من خلال العظام)، وجمع خلايا نخاع العظام في تدفق cytometrذ الأنبوب. فلاشينغ اكتمال عندما تظهر عظام بيضاء.
    5. تصفية خلية تعليق من خلال 40 ميكرون مجموعة مصفاة الخلية على رأس أنبوب مخروطي 50 مل. غسل مصفاة الخلية مع IMDM +2٪ FBS وباستخدام نفس ضبط المتوسطة الحجم النهائي من تعليق الخلية إلى 5 مل.
    6. إعداد منخفض الكثافة خلايا نخاع العظام (LDBM) من خلال التدرج الكثافة الطرد المركزي: طبقة بعناية 5 مل من تعليق خلية في 5 مل من فصل الخلية التدرج الكثافة المتوسطة 1.083 جم / مل في أنبوب 15 مل وتدور في 750 x ج لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) مع عدم وجود فرامل / منخفضة التسارع.
    7. نقل طاف (كل شيء حتى عن علامة 2 مل من الأنبوب 15 مل من أجل الحصول على معطف الشهباء) إلى أنبوب 15 مل جديدة وأداء أكثر واحد يغسل مع IMDM +2٪ FBS في 525 x ج لمدة 5 دقائق في RT.
    8. طاف نضح وليز أي المتبقية خلايا الدم الحمراء (RBC) من خلال تعليق بيليه في 3 مل العازلة تحلل RBC لمدة 5 دقائق على RT. إذا كان النقاء أكبر من الأرومة الحمراء هوالمطلوبة في الخطوة النهائية (على سبيل المثال للدراسات كيميائية حيوية)، وتنقية الخلايا LDBM أخرى في هذه الخطوة لخلايا NEG لين بواسطة مغناطيس.
  2. فيفو السابقين محمر تمايز بروتوكول الثقافة بدءا من LDBM أو خلايا NEG لين (الشكل 1A)
    1. إضافة 7 مل IMDM +2٪ FBS، وتدور في 525 x ج لمدة 5 دقائق على RT وresuspend الخلايا مكعبات في 2 مل النمو أرومة الحمراء المتوسطة (غير العادية)، ويتألف من:
      أ. StemPro-34 المتوسطة، التي تحتوي على
      ب. 2.6٪ StemPro-34 متوسطة الملحق،
      ج. 20٪ BIT-9500،
      د. 900 نانوغرام / مل كبريتات الحديدوز،
      ه. 90 نانوغرام / مل نترات الحديديك،
      و. 100 وحدة / مل البنسلين / الستربتوميسين، 2 مم L-الجلوتامين
      ز. 10 -6 M الهيدروكورتيزون
      ح. وأضاف طازجة السيتوكينات:
      ط) 100 نانوغرام / مل SCF،
      ب) 5 نانوغرام / مل IL-3، و
      ج) 3 وحدة دولية / مل إبو.
    2. عد الخلايا باستخدام عداد الخلية الآلي أو يدويا في المجهر باستخدام تنحنحocytometer.
    3. في لوحة 6 جيدا لوحة خلية ثقافة بتركيز 5 × 5 10 خلايا / جيد إلى الحجم النهائي من 2.5 مل في الجمعية العامة غير العادية (2 × 10 5 LDBM خلية / مل)، واحتضان عند 37 درجة مئوية (يعتبر هذا كيوم # 0 للثقافة).
    4. تغيير المتوسط ​​عن طريق الشفط 1.5 مل من طاف، والغزل في 525 x ج لمدة 5 دقائق على RT، إعادة التعليق في 1.5 مل من المتوسط ​​الطازجة التي تحتوي على جميع السيتوكينات 3 وإضافة إلى الآبار كل يوم في أيام # 2، 3، 4، لتحسين المرحلة التكاثري. في يوم 3، وإزالة جميع الخلايا، عد وتنقسم إلى العدد المناسب من الآبار من أجل الحفاظ على تركيزات الخلية جيدا ~ 2 × 10 5 خلية / مل. الحفاظ على الثقافة في 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2.
    5. في يوم 4، وخلايا لوحة MS5 (الفئران خط الخلية اللحمية) لآبار خلية ثقافة وحة 6 جيدا جديدة. وMS5 خلية مستنبت وα-MEM تحتوي على 20٪ FBS، 100 وحدة / مل البنسلين / الستربتوميسين، و 2 مم L-الجلوتامين.
    6. في يوم 5، عد عدد منالخلايا (الآن المخصب بدرجة كبيرة في الأرومة الحمراء) في كل بئر من لوحة الثقافة الأصلية باستخدام عداد الخلية الآلي أو يدويا في المجهر باستخدام عدادة الكريات.
    7. رفع جميع الخلايا من كل بئر ونقل إلى أنابيب مخروطية 15 مل، وتدور باستمرار في 525 x ج لمدة 5 دقائق على RT، نضح طاف وحل الكريات مع الجمعية العامة غير العادية الطازجة التي تحتوي على إبو فقط (3 وحدة دولية / مل) إلى تركيز 2 × 10 5 خلية / مل.
    8. نضح طاف من الآبار حيث كانت مطلية MS-5 خلايا في اليوم السابق (تستهدف 70-80٪ confluency في وقت شارك في الثقافة) وإضافة خلايا محمر في هذه الآبار في الجمعية العمومية غير العادية التي تحتوي فقط إبو (وإن لم يكن لهم سيلة لل الاختيار، MS-5 خلايا البقاء على قيد الحياة بشكل جيد في الجمعية العمومية غير العادية لعدة أيام).
    9. تغيير المتوسطة مضيفا EPO الطازجة في يوم # 6.
    10. تغيير المتوسطة في يوم # 7، وذلك باستخدام غير العادية مع عدم وجود السيتوكينات المضافة. في أيام من 7 إلى 9، وعينات اختبار لقلع مع التدفق الخلوي بعد تلطيخ مع المضادة للTer119 وSyto-16 يوميا وعroceed لتلطيخ عينات للمتعددة الأطياف التصوير التدفق الخلوي (كما هو مفصل في القسم 3).
      ملاحظة: قبل الطلاء وفي يوم 2، 4، 6، و 7 من الثقافة، ورصد الخلايا المستزرعة لتخصيب أرومة الحمراء وتمايز مع التدفق الخلوي عن طريق تقييم علامات سطح CD44 وTer119 مقابل حجم (FSC) 9 بدلا من ذلك CD71، Ter119، وFSC ويمكن أيضا أن تستخدم 10، 11.

2. سريعة سمل الفحص، وفقا للبروتوكول وصفها يوشيدا وآخرون 12 مع تعديلات (الشكل 1B)

  1. الإجهاد الكريات الحمر والحث سدى إعداد الخلايا في المختبر للثقافة الكريات الحمر
    1. تخدير 2-6 أشهر من العمر النوع البري C57/BL6 الماوس في المبادئ التوجيهية IACUC (على سبيل المثال مع حل isoflurane و). تأكد من أن الماوس تم تخدير كاف عن طريق التحقق من عدم وجود استجابات انعكاسية لطيف الخلفيتين، ومخلب قرصة لالتنفس العادية أثناء العملية. استخدام البيطري مرهم للعين على العينين لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
    2. لحث على الإجهاد الكريات الحمر عبر الذيل النزيف إلى الحجم النهائي من 500 ميكرولتر. باستخدام حقنة الأنسولين، وضخ حجم مساو من محلول ملحي الغشاء البريتونى لضمان إنعاش السوائل من الحيوان (عقد الحيوان في موقف تراند قبل الحقن وحقن في أسفل البطن حتى لا تلحق الضرر الأعضاء الداخلية).
    3. لا تترك الماوس غير المراقب حتى استعاد ذلك التحكم في المحركات كما يتبين من الحيوان بدأت تتحرك حول القفص والقدرة على الوقوف والمشي من دون الوقوع. يتم وضع الماوس مفصود في قفص الفئران دون غيرها.
    4. 2 بعد أيام، لوحة MS-5 خلايا في آبار من 24 لوحة جيدا خلية ثقافة. احتضان MS-5 الخلايا عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2 في MS5 المتوسطة الخلية (أ-MEM تحتوي على 20٪ FBS، 100 وحدة / مل البنسلين / الستربتوميسين، و 2 مم L-الجلوتامين) وذلك بهدف أن تكون 70-80 ٪ متموجة طن الآبار لوحة بعد 48 ساعة.
  2. حصاد الطحال وتجهيز splenocytes
    1. أربعة أيام (96 ساعة) بعد الإجهاد الكريات الحمر الاستقراء، والموت ببطء الماوس نزف سابقا من خلال بروتوكول افق IACUC (مثل CO 2 الاستنشاق تليها خلع عنق الرحم).
    2. الحصاد الطحال ووضعها في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على IMDM 2٪ FBS والحفاظ على الجليد.
    3. مرة أخرى في المختبر، في الثقافة هود الأنسجة تحت ظروف معقمة، عكس أنبوب يحتوي الطحال على مصفاة الخلية 40 ميكرومتر تعيين على رأس أنبوب 50 مل. سحق الطحال باستخدام المكبس من حقنة بلاستيكية 5 مل.
    4. غسل مصفاة الخلية مع IMDM +2٪ FBS وباستخدام نفس المتوسطة، وضبط الحجم النهائي من تعليق الخلية إلى 5 مل.
    5. طبقة بعناية خلية طحالية تعليق على 5 مل 5 مل كثافة الفصل المتدرج خلية متوسطة 1.083 جم / مل في أنبوب 15 مل وتدور في 750 x ج لمدة 25 دقيقة في RT مع عدم وجود فرامل / منخفضة التسارع.
    6. نقلطاف (وصولا الى حل حول علامة 2 مل من الأنبوب 15 مل من أجل الحصول على معطف الشهباء) إلى أنبوب 15 مل جديدة وأداء أكثر واحد يغسل مع IMDM +2٪ FBS في 525 x ج لمدة 5 دقائق على RT .
    7. طاف نضح وخلايا الدم الحمراء ليز من خلال تعليق بيليه في 3 مل العازلة تحلل RBC لمدة 5 دقائق على RT.
    8. إضافة 7 مل IMDM +2٪ FBS لغسل الخلايا وإلى تمييع وتحييد العازلة تحلل RBC وتدور في 525 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    9. طاف نضح وتعليق الخلايا في مكعبات 2 مل من أرومة الحمراء المتوسطة النمو (غير العادية).
  3. ثقافة معزولة splenocytes منخفض الكثافة، مما أثرى في الأرومة الحمراء، على البلاستيك (المرحلة الأولى من الصيام في المختبر الثقافة الكريات الحمر)
    1. عد الخلايا على مكافحة الخلايا الآلي أو يدويا عن طريق عدادة الكريات. العدد المعتاد من الخلايا المعزولة في الطحال في هذه المرحلة هو ~ 15 × 10 6.
    2. تعليق خلايا أخرى في الجمعية العامة غير العادية التي تحتوي على السيتوكينات (في وتركيزات إينال): SCF 50 نانوغرام / مل، IL-3 5 نانوغرام / مل، وإبو 2 U / مل.
    3. لوحة 1-5 × 10 6 خلايا في الحجم النهائي من 1 مل / جيد (نفس عدد الخلايا لكل بئر اعتمادا على العدد الكلي للخلايا) من 24 لوحة جيدا خلية ثقافة واحتضان O / N عند 37 ° C / 5٪ CO 2.
  4. ثقافة الأرومة الحمراء على الخلايا MS5 (المرحلة الثانية من سرعة في المختبر الثقافة الكريات الحمر
    1. نضح طاف من البلاستيك جيدا ورفع الخلايا (عالي التخصيب في الأرومة الحمراء) وذلك بإضافة 2 مل من EDTA 10 ملي الباردة في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق، على الجليد إلى كل بئر.
    2. وضع الخلايا في أنابيب جديدة، ويغسل مرة واحدة في الجمعية العامة غير العادية (بدون السيتوكينات) و resuspend في نفس.
    3. لوحة 5 × 10 5 -1 × 10 6 خلايا في حجم 1-2 مل لكل MS5 بئر من لوحة 24 جيدا المغلفة الخلية. إذا كان يتم استخدام مثبطات الدوائية في التجربة، وإضافتها بتركيزات مناسبة الآن.
    4. احتضان لمدة 6-8 ساعة (الوقت تسترشدالملاحظة المجهرية من حوالي 30٪ -40٪ في استئصال عينة WT غير المعالجة). الربط من الأرومة الحمراء إلى MS-5 خلايا يسرع قلع بهم.
    5. رفع الخلايا من كل بئر وذلك بإضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني الباردة + 10 ملي EDTA، لمدة 5 دقائق، على الجليد. جنبا إلى جنب مع الأرومة الحمراء، كما سيتم جمعها MS-5 ولكن هذه الخلايا يمكن فيما بعد استبعاد بسهولة أثناء تحليل تدفق cytometric كما FSC مرحبا Ter119 - الخلايا.
    6. في هذه المرحلة، والخلايا يمكن ان تكون ثابتة وملطخة لتحليلها من قبل متعددة الأطياف التصوير التدفق الخلوي.

3. تلون الأرومة الحمراء لتوطين البروتينات داخل الخلايا أو الدهون الطوافات خلال قلع بواسطة متعدد الأطياف التصوير التدفق الخلوي

  1. غسل الخلايا في برنامج تلفزيوني، وتدور 525 x ج لمدة 5 دقائق على RT ونضح طاف.
  2. إصلاح الخلايا عن طريق إعادة التعليق الكريات الخلية في 500 ميكرولتر من 3.7٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة (قد تختلف وقت التثبيت اعتمادا على المضادةجنرال يجري بحثها) وpipetting بلطف.
  3. نقل إلى 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي البلاستيك واحتضان لمدة 15 دقيقة في RT.
  4. تدور على مقعد ميكروسنتريفوج 2،000 x ج لمدة 20 ثانية، ونضح طاف وأداء واحد يغسل بإضافة 500 ميكرولتر PBS إلى كل أنبوب وpipetting بلطف.
  5. تدور على مقعد ميكروسنتريفوج 2،000 x ج لمدة 20 ثانية، ونضح طاف والحفاظ على أنابيب على الجليد لمدة 15 دقيقة على الأقل. Permeablization الخطوات 3،6-3،9 وينبغي أن يتم بسرعة وكفاءة، وبعد الغزل / تطلع على RT، يجب على الفور أن توضع الكريات الخلية مرة أخرى على الجليد، وذلك للخلايا للاحتفاظ أفضل سلامتها.
  6. اتخاذ حلول الأسيتون الخروج من الثلاجة -20 درجة مئوية وضعت على الجليد. Permeabilize الخلايا عن طريق إعادة التعليق الكريات الخلية الأولى في 500 ميكرولتر 50٪ الجليد الباردة الأسيتون (01:01 مع DH 2 O) وpipetting بلطف.
  7. تدور على مقاعد البدلاء ميكروسنتريفوج 2،000 x ج لمدة 20 ثانية، وطاف نضح والخلايا في resuspend الكريات في 500 ميكرولتر60، 100٪ الأسيتون الجليد الباردة من قبل pipetting بلطف.
  8. تدور على مقاعد البدلاء ميكروسنتريفوج 2،000 x ج لمدة 20 ثانية، وطاف نضح والخلايا في resuspend الكريات مرة أخرى في 500 الجليد الباردة ميكرولتر 50٪ الأسيتون بواسطة pipetting بلطف.
  9. تدور على مقاعد البدلاء ميكروسنتريفوج 2،000 x ج لمدة 20 ثانية، ونضح طاف وغسل خلايا مرة واحدة في البرد FACS العازلة (PBS + 0.5٪ BSA) من قبل pipetting بلطف.
  10. تحضير الكوكتيل وضع العلامات مع الأجسام المضادة أو علامات لجزيئات من الفائدة: 0.1 ميكرولتر U/100 AF488-phalloidin لتلطيخ F-الأكتين و 1 ميكرولتر μl/100 Ter119-PECy7 لتلطيخ الخلايا محمر. يمكن أيضا أن يتم تلطيخ بديلة أو إضافية باستخدام AF-488 المضادة لل-β تويولين الأضداد (1:50)، AF-594-مترافق الكوليرا السم الوحيدات B لتسمية الطوافات الدهنية (1:200)، ومكافحة pMRLC (Ser19) الأجسام المضادة الأولية للميوسين فسفرته سلسلة ضوء التنظيمية (1:50)، تليها المضادة للأرنب AF-488-مترافق الضد الثانوية (1:400)، ومكافحة γ-الأنبوبةلين أرنب الضد الابتدائي (1:100)، يليه المضادة للأرنب الضد الثانوية AF-555-مترافق (1:300).
  11. التالية تطلع طاف، في resuspend الكريات الخلايا في 100 ميكرولتر من علامة الكوكتيل، ماصة بلطف واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT.
  12. إعداد نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة التي تحتوي على 2.5 ميكرومتر من وصمة عار Draq5 النووية.
  13. غسل الخلايا في عازلة نظام مراقبة الأصول الميدانية، وتدور باستمرار على مقاعد البدلاء ميكروسنتريفوج 2،000 x ج لمدة 20 ثانية، ونضح وطاف resuspend في 60 ميكرولتر FACS العازلة التي تحتوي على Draq5.
  14. عينات تعمل على تدفق عداد الكريات التصوير لجمع ما لا يقل عن 10،000 الأحداث في التجربة، وتعويض ملفات البيانات الخام كما نشرت سابقا 13، وتحليل النتائج كما هو مبين في الشكل 2، وذلك باستخدام تحليل برامج معينة لتدفق عداد الكريات التصوير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

أولا، يتم تحليل الخلايا استنادا على Brightfield نسبة الارتفاع (نسبة طول الطفيفة بهم مقابل محور رئيسي بهم) وBrightfield منطقتهم (يدل على حجمها). الأحداث مع انخفاض قيمة Brightfield المنطقة من 20 وأعلى من 200 معظمهم من الحطام والركام الخلية، على التوالي، ويتم استبعادها من التحليل (الشكل 2A). الخلايا واحد (البوابة "R1") ثم يتم تحليلها على أساس قيمتها للمعلمة التدرج RMS، مما يدل على الحدة من الصورة. يتم إنشاء بوابة "R2" الخلايا التي تحتوي على قيمة التدرج RMS مع أكثر من المئين ال 50 في الترتيب لتحديد الصور التي التقطت بشكل جيد في التركيز (الشكل 2B). ثم هي بوابات الخلايا استنادا حجمها مقاسا Brightfield منطقتهم، والإيجابية من أجل Ter119 محمر علامة مقاسا الفلورسنت المعلمة صمة عار متوسط ​​بكسل Ter119 (البوابة "Ter119 إيجابية"، الشكل 2C). الخلايا منخفضة جدا أو مرتفعة جدا لTer119، هي إما غير erythroids أو المجاميع الخلية المتبقية، على التوالي، ويتم استبعادها من التحليل. في الخطوة التالية، ويتم اختيار الخلايا استنادا على Draq5 نسبة الارتفاع كثافة (نسبة طفيفة مقابل كثافة المحور الرئيسي للنواة الخاصة بهم) وكثافة Draq5 (الشكل 2D). يتم استبعاد Draq5 الخلايا السلبية (خلايا منزوعة النواة في الغالب، مثل الشبكيات وكرات الدم الحمراء)، والخلايا مع نسبة منخفضة الارتفاع Draq5 (ومعظمهم من الحلل) من التحليل. ثم يتم تحليل الخلايا إيجابية Draq5 (البوابة "الحمض النووي ايجابية"، الأرومة الحمراء في الغالب عند هذه النقطة) على أساس المساحة Ter119 بهم، مما يدل على حجم الخلية، وعلى Ter119 متوسط ​​بكسل / المنطقة (كثافة Ter119 التعبير)، مما يدل على سطوع Ter119 تلطيخ. يتم التعرف على الأرومة الحمراء سوي اللون (البوابة "OrthoE") كما، Ter119 خلايا صغيرة مرحبا (الشكل 2E). أخيرا، جزء من السكان من orthochroماتيتش الأرومة الحمراء التخصيب في enucleating الخلايا يتميز انخفاض نسبة الارتفاع Brightfield، وهو قياس استطالة الخلية، وتحسب على أساس نسبة طفيفة محور / المحور الرئيسي للصورة خلية في قناة Brightfield M01، وارتفاع دلتا النقطة الوسطى XY Ter119 / Draq5، والتي تم تعريفها من قبل المسافة بين وسط بدايته Ter119 +-الخلايا الشبكية ومركز Draq5 +-النواة (البوابة "خلايا enucleating" في الشكل 2F).

جنبا إلى جنب مع الأجسام المضادة ضد Ter119 وDraq5 الحمض النووي وصمة عار، كما تم ملطخة الخلايا لالأكتين الخيطية (F-الأكتين) مع phalloidin الفلورسنت لتقييم توطين F-الأكتين خلال قلع أرومة الحمراء 7. من المذكرة، والتقدم من قلع يمكن تصور في الخلايا الثابتة، والخلايا مع الجانب نسبة انخفاض (أي ممدود على نحو متزايد) ويلاحظ زيادة النقطه الوسطى دلتا XY Ter119/Draq5 (الشكللدى عودتهم 3). ويلاحظ F-الأكتين على التركيز في ثلم الانقسام خلال قلع ثم تتبدد بمجرد مقذوف النواة. وعلاوة على ذلك، وشارك في توطين الأكتين والميوسين في ثلم الانقسام بين الخلايا الشبكية بدايته ونواة يمكن البرهنة عن طريق التدفق التصوير متعددة الأطياف الخلوي بعد المشاركة في تلطيخ من الأرومة الحمراء WT لpMRLC (الميوسين فسفرته سلسلة ضوء التنظيمية) وF-الأكتين 7.

ويمكن أيضا البروتينات والهياكل التي تهم أخرى تكون ملطخة مع الأجسام المضادة المناسبة أو علامات الفلورسنت للسماح دراسات التصوير لدورهم خلال قلع. تشكيل أنيبيب الاستقطاب مرئيا في الأرومة الحمراء سوي اللون WT قبل قلع ولكن ليس في الأرومة الحمراء تعامل مع الكولشيسين (الشكل 4A). تثبيط تويولين البلمرة بواسطة الكولشيسين يقلل الاستقطاب الخلية، كما يتبين من قياس النقطه الوسطى دلتا المعلمة XY BF/Draq5 بين CEN(ثالثا) من جسم الخلية رأينا في قناة Brightfield ووسط تلطيخ النووية يتحقق مع Draq5 (الشكل 4B).

استخدام WT أو التي تعاني من نقص راك (بعد التلاعب وراثية أو دوائية) الأرومة الحمراء في تدفق التصوير متعددة الأطياف الخلوي دراسات التصوير يسمح التي تثبت دور راك GTPases في قلع. GTPases راك تنظيم على الأقل في جزء تشكيل عصابة أكتوميوزين فضلا عن التقاء الطوافات الدهنية في ثلم بين الخلايا الشبكية بدايته وpyrenocyte 7.

الشكل 1
الشكل 1. تخطيطي مظاهرة من الكريات الحمر في المختبر البروتوكولات المستخدمة من أجل إنتاج enucleating الأرومة الحمراء للدراسات. A. طويل الأجل في الثقافة الكريات الحمر المختبر initiatإد من LDBM أو لين - خلايا B. فحص استئصال سريعة بدأها splenocytes التخصيب في الأرومة الحمراء بعد الاستقراء الإجهاد الكريات الحمر في الجسم الحي من قبل الفصد الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
ويظهر الشكل 2. تحليل البيانات باستخدام تحليل برامج معينة لتدفق عداد الكريات التصوير. النابضة متتالية من السكان من الاهتمام في لوحات AF. عدد بين قوسين يشير إلى المئة تقريبا من السكان الأصل المقابلة، في هذه التجربة. A. النابضة الأولية من سكان R1 يزيل الركام الخليةوالحطام الخلوية. B. بوابة R2 R1 يشمل من الخلايا التي تم تصويرها بشكل واضح، باستثناء من خلايا التركيز. C. الخلايا Ter119 إيجابية (من R2) ويتم اختيار، باستثناء الخلايا التي إما أن تكون سلبية أو هي Ter119 الملون بشكل مكثف جدا بسبب وجودهم في المجاميع. يتم اختيار خلايا الحمض النووي D. إيجابية (خارج الخلايا Ter119 إيجابية)، وبعد التآمر لنسبة الارتفاع مقابل كثافة شدة وصمة عار النووية (هنا Draq5 قراءة في قناة 5). E. هي بوابات الخلايا DNA وTer119 إيجابية في مستقعد، متعدد التلون والأرومة الحمراء سوي اللون بناء على موقعها في Ter119 متوسط ​​بكسل مقابل Ter119 المنطقة (هنا قراءة في قناة 3)، كما هو مبين من قبل ماكغراث وآخرون 5. F. الخلايا enucleating هي تلك الخلايا من الأرومة الحمراء سوي اللون، والتي تعاني من انخفاض نسبة الارتفاع (قياس elongat الخليةايون في brightfield (BF) قناة) وعالية دلتا النقطة الوسطى XY Ter119/Draq5 (المسافة بين مركز تشكيل Ter119 +-الخلايا الشبكية ومركز النواة). وقد نشر هذا البحث في الأصل في الدم: كونستانتنيديس DG، Pushkaran S، وآخرون اشارة ومتطلبات هيكل الخلية في قلع أرومة الحمراء في الدم.. 2012؛. 119 (25) :6118-6127 من قبل الجمعية الأمريكية لأمراض الدم الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3
الرقم 3. صور الممثل enucleating الأرومة الحمراء مع زيادة تدريجية دلتا النقطة الوسطى XY Ter119/Draq5. WT الماوس الأرومة الحمراء سوي اللون، ملطخة Ter119-PECy7، phalloidin-AF488، وDraq5، هي بوابات في نسبة الارتفاع بهم ودلتا النقطه الوسطى XY Ter119/Draq5. وتظهر خلايا ثابتة في مختلف المراحل، من قلع المتعاقبة، مع التقدم الذي يتوافق مع تناقص نسبة الارتفاع وزيادة دلتا النقطه الوسطى XY Ter119/Draq5 (الخضراء عبر البوابة الصفراء داخل يبين موضع الخلية تصويرها على اليمين). في الصور الخلية من أعلى إلى أسفل، ويمكن ملاحظة F-الأكتين خلال قلع للتركيز على ثلم الانقسام ثم تتبدد بمجرد مقذوف النواة (كما هو موضح في الخلية # 4782 في صورة أقل). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الشكل 4. تشكيل جمعية أنيبيب أحادي القطب والاستقطاب من orthochromaالأرومة الحمراء التشنج يسبق قلع. A. المستقطبة تشكيل أنيبيب مرئيا في السيطرة الأرومة الحمراء WT (ملطخة المضادة للب تويولين-488-AlexaFluor وصمة عار Draq5 النووية)، في حين اتسخت ب تويولين منتشرة في الأرومة الحمراء حضنت مع الكولشيسين (5 ميكرومتر) لمدة 6 ساعة في الصيام في المختبر قلع الفحص. B. متعدد الأطياف التصوير التدفق الخلوي يمكن أن تقدم التقييم الكمي الاستقطاب الخلية عن طريق تحليل توزيع المعلمة دلتا النقطة الوسطى XY BF/Draq5، والذي يقيس المسافة بين وسط خلايا الجسم كما رأينا في مشرق الميدان ووسط تلطيخ النووية يتحقق مع Draq5 (التمثيل التخطيطي في الشكل). قيم دلتا النقطة الوسطى BF/Draq5 من المعالجة الكولشيسين الأرومة الحمراء سوي اللون WT هي إحصائيا من سيطرة القيم دلتا النقطة الوسطى BF/Draq5 (ع <0.001). وقد نشر هذا البحث في الأصل في Blooد:. كونستانتنيديس DG، Pushkaran S، وآخرون اشارة ومتطلبات هيكل الخلية في قلع أرومة الحمراء في الدم. 2012؛. 119 (25) :6118-6127 من قبل الجمعية الأمريكية لأمراض الدم الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في السنوات الأخيرة اكتسبت دراسة قلع أرومة الحمراء الزخم المتزايد لأنها هي خطوة في المختبر في الثقافات الكريات الحمر وهذا هو الأكثر صعوبة في إعادة إنتاج بكفاءة من أجل تحقيق النجاح والإنتاج على نطاق واسع من خلايا الدم الحمراء خارج الحي. حتى وقت قريب، ودراسة قلع أرومة الحمراء تستخدم المجهري مضان أساسا والتدفق الخلوي الأساليب. طرق مضان المجهري، وإن كان مفيدا في تحديد جزيئات المشاركة، تتطلب أيام من الملاحظة المجهرية للتعرف على عدد صغير من الأرومة الحمراء سوي اللون تمر قلع داخل مئات من الخلايا ثابتة عند نقطة معينة في الوقت المناسب. التدفق الخلوي طرق، من ناحية أخرى، هي مفيدة جدا في تقييم معدل قلع في الثقافة، فضلا عن آثار التلاعب الدوائية أو وراثية من جزيئات خاصة على هذه العملية، ولكن لا توفر أي بيانات عن intracellulع توطين هذه الجزيئات.

تدفق التصوير متعددة الأطياف يجمع الخلوي فوائد التدفق الخلوي المناعي والمجهر لأنه يتيح سرعة اقتناء كل من تدفق cytometric والبيانات الشكلية على عدة آلاف من الخلايا. هذا هو ميزة كبيرة مقابل تدفق الخلوي في الدراسات الكلاسيكية الكريات الحمر، منذ مراحل مختلفة من التمايز أرومة الحمراء وقد تم تحديد (proerythroblasts، قعد، متعدد التلون، وسوي اللون) باستخدام معايير مورفولوجية 6. ومع ذلك، متعددة الأطياف التصوير التدفق الخلوي هو الأمثل لرؤية الهياكل الخلوية بدلا من المقارنات الكميات النسبية في أعداد السكان. لمثل هذه المقارنات، روتينية التدفق الخلوي التي لا تتطلب الخطوة permeabilization المناعي اللازمة لهياكل داخل الخلايا أداء أفضل. على سبيل المثال النسبي للBasoE: بولي: OrthoE في الشكل 2E

يمكن معالجة بيانات التصوير بالتعاون مع التدفق الخلوي البيانات باستخدام تحليل برامج معينة لتدفق عداد الكريات التصوير، مما يتيح للمجموعة من الخلايا ذات الخصائص المورفولوجية معينة داخل البوابات. يمكن التعرف على ما يقرب من مائة الخلايا enucleating ضمن عدد سكانها 10،000 الأرومة الحمراء مع أسلوب التحليل المذكورة أعلاه بطريقة سريعة وفعالة مما يسمح الملاحظات أكثر وضوحا والتقييم الإحصائي.

علاوة على ذلك، ومما يسهل معالجة الصور مع تحليل برامج معينة لتدفق عداد الكريات التصوير مما يسمح التحليل الكمي لخصائص من قبيل دلتا النقطة الوسطى XY لدراسة مثل الموقف النسبي للنواة لالسيتوبلازم التي يمكن استخدامها كمقياس للالاستقطاب.

الخطوات الحاسمة ضمن بروتوكول واستكشاف الأخطاء وإصلاحها

ومن المعروف أنه حتى pipetting لطيف يمكن أن يؤدي إلى انفصال الشبكية وpyrenocyte 12. هذا لديه القدرة على تحد بشدة من عدد من الأحداث قلع تصويرها. ونتيجة لذلك، يجب توخي الحذر، خاصة عندما رفع الأرومة الحمراء متجهة إلى خلايا MS5 في الثقافة.

التثبيت مع الحل الفورمالديهايد يمكن أن يؤدي إلى تغييرات في مناطق خارج الخلية من علامات السطحية مما أدى إلى انخفاض الأجسام المضادة المحددة الملزمة و / أو زيادة الأجسام المضادة غير محددة ملزمة. ميزة تدفق عداد الكريات التصوير هو تصور أن تلطيخ السطح وبالتالي يمكن تقييم جودتها. منقط، بدلا من الزي، وتلطيخ لعلامات سطح فيرة مثل Ter119 يشير overfixation وينبغي معالجتها من خلال مزيج من انخفاض formaldeتركيز هايد ومدة أقصر من التثبيت.

بعد التثبيت، وحفظ الخلايا على الجليد لمدة 15 دقيقة على الأقل هو أمر حيوي من أجل منع الكسر الخلايا الزائدة أثناء عملية permeabilization بسبب الاختلافات في درجة الحرارة. على الرغم من الأسيتون permeabilization يحافظ على erythroids الهشة في وقت متأخر أفضل من بوساطة المنظفات permeabilization، فإن الخطوة التي تتطلب 100٪ الأسيتون يؤدي إلى ملحوظا، ولكن لا يضر، وفقدان الخلايا. في النهاية، بعد غسل مع العازلة FACS الباردة، ويسمح للخلايا في درجة حرارة الغرفة للخطوات الضد الحضانة.

تدفق عداد الكريات التصوير لديه نسبة محددة من تدفق (خلية / ثانية) اعتمادا على العدسة المستخدمة (وانخفض معدل كما يزيد التكبير). بعد غسل النهائي قبل القياس، فمن المستحسن أن الكريات الخلايا ومعلق في حجم صغير (50-60 ميكرولتر)، من أجل تسريع تجهيز العينة. بالنسبة لعدد كبير من العينات التي أعيدكراس مدة طويلة من شوط (أكثر من 30 دقيقة)، ويجب أن تبقى العينات على الجليد.

وقلع مقايسة طويلة الأجل يقدم فائدة لإنتاج خلايا محمر سعت من أجل إنتاج ما يكفي من الخلايا التي يمكن جمعها في مرحلة قلع لتقييم البيوكيميائية مثل immunoblotting وسحب هبوطا. وقلع فحص سريع يعطي فائدة من الوقت تتطلب فقط 2 أيام على القيام بها، على الرغم من أن الماوس يحتاج إلى مفصود 4 أيام قبل التجربة. ونحن لم يلاحظ اختلاف كبير في كفاءة قلع بين الطريقتين. من المذكرة، التدفق الخلوي التقييم، والتي لا تتطلب الخطوة permeabilization المناعي اللازمة لهياكل داخل الخلايا، كما هو موضح قبل هو الأكثر مناسبة للتقييم الكمي للكفاءة قلع.

القيود المفروضة على تقنية

الطريقة الموضحة هنا يدهlizes التوتر الناجم عن الكريات الحمر في الجسم الحي والثقافة في المتوسط ​​تحتوي على الهيدروكورتيزون في المختبر من أجل تضخيم السكان محمر ومزامنتها في مرحلة قلع. كل من هذه الظروف التي من شأنها تقليد أرومة الحمراء-قلع تحت الضغط. بالإضافة إلى ذلك، يزيد بشكل كبير الهيدروكورتيزون العائد محمر والبقاء على قيد الحياة. للحصول على العائد مماثلة من الأحداث قلع من خلايا نخاع العظام المستمدة من النوع البري الفئران مع الكريات الحمر ثابت للدولة ومثقف دون الهيدروكورتيزون (التزامن بالتالي تجنب)، ونحن بحاجة إلى ثقافة الخلايا من الفئران متعددة وتشغيل ومعالجة الكثير من الأحداث من خلال موضوع -الطيفي التصوير التدفق الخلوي. على الرغم من تدفق التصوير متعددة الأطياف يسرع الخلوي جمع البيانات المورفولوجية بشكل كبير مقارنة المناعي المجهري باستخدام عدسة التكبير حتى 60X، مقارنة الملاحظات التي تم الحصول عليها عن طريق التصوير تدفق عداد الكريات مع الكلاسيكية، Z-مكدس،والصور المجهري متحد البؤر هو قيمة للحصول على أفضل التفاصيل، لأن الهدف عدسة المجهر في التكبير يمكن أن توفر ما يصل إلى 100X والصور Z-مكدس يعطي انطباعا 3 الابعاد الهياكل، وهي ليست قابلة للتحقيق من قبل تدفق عداد الكريات التصوير في نفس الخلية. العدد الكبير نسبيا من الخلايا مماثلة جمعت في تدفق التصوير متعددة الأطياف الخلوي التجربة، في التوجه عشوائية، يعوض جزئيا هذا القيد السماح الملاحظات من مختلف نظرا نقطة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgments

المؤلفين أشكر التدفق الخلوي البحوث الأساسية في مؤسسة سينسيناتي مستشفى الأطفال في البحوث وريتشارد ماركو، Sherree صديق، وسكوت مردخاي من مؤسسة Amnis (جزء من EMD Milllipore) للحصول على الدعم الفني من الخبراء. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح K08HL088126 وR01HL116352 (TAK) وDK090971 P30 (YZ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
αMEM medium CellGro 15-012-CV
IMDM medium Hyclone (Thermo Scientific) SH30228.01
Stempro-34 SFM GIBCO (Life Tech) 10640
Stempro-34 nutrient supplement GIBCO (Life Tech) 10641-025
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta Biologicals 512450
BIT9500 Stemcell Technologies 09500
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher Scientific BP-1600-100
Phosphate buffered saline (PBS) Hyclone (Thermo Scientific) SH30028.02
Penicillin/Streptomycin Hyclone (Thermo Scientific) SV30010
L-glutamine Hyclone (Thermo Scientific) SH30590.01
Isothesia (Isoflurane) Butler-Schein 029405
Histopaque 1.083 mg/ml Sigma 10831
BD Pharmlyse (RBC lysis buffer) BD Biosciences 555899
Acetone Sigma-Aldrich 534064
Formaldehyde Fisher Scientific BP 531-500
Hydrocortisone Sigma H4001
Stem Cell Factor (SCF) Peprotech 250-03
Interleukin-3 (IL-3) Peprotech 213-13
EPOGEN Epoetin Alfa (Erythropoietin, EPO) AMGEN available by pharmacy
CD44-FITC antibody BD Pharmingen 553133
CD71-FITC antibody BD Pharmingen 553266
Ter119-PECy7 antibody BD Pharmingen 557853
Phalloidin-AF488 Invitrogen (Life Technologies) A12379
β-tubulin-AF488 antibody Cell Signaling #3623
anti-rabbit AF488-secondary antibody Invitrogen (Life Technologies) A11008
anti-rabbit AF555-secondary antibody Invitrogen (Life Technologies) A21428
AF594-cholera toxin B subunit Invitrogen (Life Technologies) C34777
pMRLC (Ser19) antibody Cell Signaling #3671
γ-tubulin antibody Sigma T-3559
Syto16 Invitrogen (Life Technologies) S7578
Draq5 Biostatus DR50200
Ferrous sulfate Sigma F7002
Ferric nitrate Sigma F3002
EDTA Fisher Scientific BP120500
15-ml tubes BD Falcon 352099
50-ml tubes BD Falcon 352098
6-well plates BD Falcon 353046
24-well plates BD Falcon 351147
Flow tubes BD Falcon 352008
Tuberculin syringe BD 309602
Insulin syringe BD 329461
Syringe needle 25-G 5/8 BD 305122
Capped flow tubes BD 352058
40-μm cell strainer BD Falcon 352340
Scalpel (disposable) Feather 2975#21
FACS Canto Flow Cytometer BD
ImagestreamX Mark II Imaging Flow Cytometer AMNIS (EMD Millipore)
Image Data Exploration and Analysis Software (IDEAS) version 4.0 and up. AMNIS (EMD Millipore)
Hemavet 950 Cell Counter Drew Scientific CDC-9950-002
NAPCO series 8000WJ Incubator Thermo scientific
Allegra X-15R Centrifuge Beckman Coulter 392932
Mini Mouse Bench centrifuge Denville C0801

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McGrath, K. E., Kingsley, P. D., Koniski, A. D., Porter, R. L., Bushnell, T. P., Palis, J. Enucleation of primitive erythroid cells generates a transient population of "pyrenocytes" in the mammalian fetus. Blood. 111, 2409-2417 (2008).
  2. Chasis, J. A., Mohandas, N. Erythroblastic islands: niches for erythropoiesis. Blood. 112, 470-478 (2008).
  3. Koury, S. T., Koury, M. J., Bondurant, M. C. Cytoskeletal distribution and function during the maturation and enucleation of mammalian erythroblasts. J Cell Biol. 109, 3005-3013 (1989).
  4. Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2. Nat Cell Biol. 10, 314-321 (2008).
  5. Keerthivasan, G., Small, S., Liu, H., Wickrema, A., Crispino, J. D. Vesicle trafficking plays a novel role in erythroblast enucleation. Blood. 116, 3331-3340 (2010).
  6. McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology. J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).
  7. Konstantinidis, D. G., et al. Signaling and cytoskeletal requirements in erythroblast enucleation. Blood. 119, 6118-6127 (2012).
  8. Giarratana, M. C., et al. Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells. Nat Biotechnol. 23, 69-74 (2005).
  9. Chen, K., Liu, J., Heck, S., Chasis, J. A., An, X., Mohandas, N. Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. (2009).
  10. Kalfa, T. A., et al. Rac1 and Rac2 GTPases are necessary for early erythropoietic expansion in the bone marrow but not in the spleen. Haematologica. 95, 27-35 (2010).
  11. Koulnis, M., Pop, R., Porpiglia, E., Shearstone, J. R., Hidalgo, D., Socolovsky, M. Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay. J Vis Exp. (2011).
  12. Yoshida, H., Kawane, K., Koike, M., Mori, Y., Uchiyama, Y., Nagata, S. Phosphatidylserine-dependent engulfment by macrophages of nuclei from erythroid precursor cells. Nature. 437, 754-758 (2005).
  13. Ortyn, W. E., et al. Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging. Cytometry A. 69, 852-862 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics