압력 Myography를 사용하여 저항 장간막 동맥에서 근육 조직 대응 및 Vasoactivity 평가

1Section of Gastroenterology and Hepatology, Georgia Regents University, 2Division of Gastroenterology and Hepatology, University of Pittsburgh School of Medicine, 3Vascular Biology Center, Georgia Regents University
Published 7/06/2015
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Medicine

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Summary

압력 myography는 가압 할 때 지속적인 수축을 개발하는 작은 동맥의 vasoactivity을 평가하는 데 사용됩니다. 이 원고는 쥐, vasoactivity 혈관 직경에 관내 압력의 영향에서 작은 장간막 동맥의 고립 된 세그먼트에서 평가하기위한 세부 프로토콜을 제공합니다.

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Jadeja, R. N., Rachakonda, V., Bagi, Z., Khurana, S. Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography. J. Vis. Exp. (101), e50997, doi:10.3791/50997 (2015).

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Abstract

작은 저항 동맥 수축 증가 또는 관내 압력의 감소에 응답하여 각각 팽창; 근육 조직 응답이라고하는이 현상은 로컬 혈류 키 레귤레이터이다. 동중 조건에서 작은 저항 동맥 전신 혈관 저항 (SVR)의 주요 결정 요인 인 근육 조직 톤 (MT)로 알려진 수축을 지속 개발한다. 따라서, 작은 저항 동맥의 생체 가압 준비는 거의 생리적 상태에서 미세 혈관의 기능을 연구하는 중요한 도구입니다. 이를 달성하기 위해, 작은 저항 동맥 (~ 260 μm의 직경)의 갓 고립 세그먼트는 손대지 개의 작은 유리 캐 뉼러 및 가압에 장착된다. 이들 제제는 생체 동맥의 특성과 실시간으로 혈관의 색조 평가에 허용 최대한 유지. 여기에서 우리는 쥐에서 가압 작은 저항 장간막 동맥에 vasoactivity을 평가하기위한 상세한 프로토콜을 제공한다; 이러한 동맥 개발지속적인 혈관 수축 - 최대 직경의 약 25 % - 70 mmHg로에서 가압. 이러한 동맥 제제는 다양한 질병의 동물 모델에서 미세 혈관 기능의 변화를 동맥 압력 및 vasoactivity 사이의 관계에 대한 임상 시험 화합물의 효과를 연구하고 결정하는데 사용될 수있다.

Introduction

작은 저항 동맥 SVR의 주요 결정 요인이며, 많은 질병 1, 2의 병태 생리에 중요한 역할을한다. 당뇨병 3, 임신 4, 허혈 - 재관류 5, 비만과 고혈압 6,7 등의 조건은 자주 변경된 미세 혈관 기능과 연관되어 있습니다. 혈관 myography 다양한 질환에서 미세 혈관 기능의 변화에​​ 중요한 통찰력을 제공 할뿐만 아니라, 치료 목표를 식별하고 혈관 활성 화합물의 효능을 평가할 수 있습니다뿐만 아니라. 혈관 기능이 아이소 메트릭 또는 등압 선박 조건 (8)에서 고립 된 작은 동맥을 이용하여 연구하고있다. 아이소 myography의 상세한 설명은도 9 곳이 제공된다. 그러나 동중 준비 10 ~ 12 대 아이소 메트릭에서 얻은 정보에 차이가 있습니다. 가압 된 제제는 동맥 거의 생리적 조건에서 미세 혈관 기능 연구를 허용하기 때문에,얻어진 결과는 혈관 침대 8, 13의 생체 내 행동을 더 잘 상관 관계 수 있습니다.

1902 년 베일리스 먼저 혈관 직경 14 전층 압력의 효과를 설명했다. 그는 압력의 감소는 혈관 확장으로 이어졌습니다 토끼, 개와 고양이의 다양한 혈관 침대에서 작은 저항 동맥에서 관찰, 압력의 증가는 혈관 수축으로 이어졌습니다. 이 현상은 근육 조직 반응으로 알려져있다. 베일리스 이후 연구자들은 동중 조건에서 작은 저항 동맥 MT (15, 16)로 알려진 지속적인 수축을 개발하는 것을 관찰했다. 근육 조직 응답 및 MT 모두 myography 압력 (PM) 기법을 사용하여 평가할 수있다. 오후는 작은 동맥, 정맥 및 기타 선박의 vasoactivity를 결정하는 데 주로 사용된다. 이름에서 알 수 있듯이 - - 혈관 직경의 혈관 활성 화합물의 효과를 평가뿐만 아니라, 혈관 내 압력 PM 매개 CH 관용법혈관 직경에 ANGES. 지난 수십 년 동안 비디오 현미경 유리 피펫은, PM을 수행하기 쉽게 만든 당기기 향상된 컴퓨터 소프트웨어에 진행한다. 그러나, 작은 혈관의 가능한 손상 부분의 절개는 지루하고 때로는 도전 남아있다. 여기에서 우리는 쥐에서 고립 된 작은 장간막 저항 동맥의 근육 조직 반응을 연구하기 위해 상세한 프로토콜을 설명합니다.

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Protocol

여기에 표시된 예는 조지아 리전트 대학에서 IACUC의 승인을 실험이다 - 프로토콜 번호 : # 2011-0408

시약 1. 준비

  1. 해부 솔루션 주식을 준비 : 스톡 해부 용액 (5 배)의 500 ml를 들어, 21.18 g의 NaCl, 0.875 g의 KCl, 0.739 g을 황산, 1.049 g을 MOPS와 밀리 Q 물 450 ㎖ 중의 0.019 g의 EDTA를 녹인다. 1 N의 NaOH를 사용하여 7.3-7.4로 산도를 조정합니다. 밀리 Q 물 500 ml의에 볼륨을 확인합니다. 원액 7-10 일 저장할 수 있습니다. 화학 물질과 그들의 공급 업체의 목록은 표 1을 참조하십시오. mM의 농도는 표 2를 참조하십시오.
  2. 작업 해부 솔루션을 준비 : 매일 신선한 작업 해부 솔루션을 준비합니다. 100 ㎖ 작업 솔루션의 경우, 0.091 g의 포도당, 밀리 Q 물 79.8 용액에 0.016 그램의 NaH 2 PO 4, 0.022 g의 피루브산 나트륨을 용해. volu을 가지고 0.2 ml의 1M 염화칼슘이 20 ml의 해부 솔루션 주식을 추가100 ㎖에 나.
  3. 생리 식염수 (PSS)를 준비 : 950 ml의에, 1000 ml의 PSS를 준비하려면 0.365 g의 KCl, 6.545 g의 NaCl, 0.296 g을 황산, 0.163 g의 KH 2 PO 4를 용해, 2.072 g의 포도당, 2.184 g을 NaHCO3 및 2.383 g을 HEPES 밀리 Q 물. 1 N의 NaOH를 사용하여 7.3-7.4로 산도를 조정합니다. 밀리 Q 물 1,000 ㎖의에 볼륨을 확인합니다. 용액 2 ㎖를 제거하고 1 M CaCl2를 2 ㎖로 교체합니다. (신선한 PSS는 매일 준비해야합니다)
  4. , 칼슘없이 100 ㎖ PSS의 경우 0.036 g의 KCl, 0.654 g의 NaCl, 0.029 g을 황산, 0.016 g의 KH 2 PO 4, 0.207 g의 포도당, 0.218 g을 NaHCO3를, 0.238을 용해 : 칼슘 (Ca 2+) 무료 PSS 준비 G HEPES, 0.015 g을 EGTA 및 0.0026 g의 나트륨 니트 로프 루시드 (SNP) 밀리-Q의 95 ml의 물에. 1 N의 NaOH를 사용하여 7.3-7.4로 산도를 조정합니다. 밀리 Q 물 100 ㎖에 볼륨을 확인합니다.

유리 캐 뉼러 2. 준비

  1. 유리 피펫을 당겨제조업체의 지침에 따라 피펫 풀러를 사용하여 100 ~ 150 μm의 팁 캐 뉼러를 생성합니다.
  2. 베벨 beveller 미세 전극을 이용하여 유리 캐 뉼러 팁 화재 그들 연마 및 히터 프로브를 사용하여 45 ~ 유리 캐 뉼러 팁 구부러.
  3. 마이크로 피펫 홀더에 캐 뉼러를 넣고 관류 챔버에 마이크로 피펫 홀더를 연결합니다.

관류 상공 회의소 3. 준비

  1. 5 분마다 해부 솔루션 다음에 밀리-Q의 물로 씻어 관류 실. 해부 시액 2 mL로 챔버를 넣습니다.
  2. 정맥을 통해 흡입 해부 솔루션 10 ML의 주사기를 사용하여 조심스럽게 기포없이 전체 정맥과 연결된 튜브를 입력합니다. 거품의 발생을 방지하기 위해 부드럽게 흡입을 적용한다.
  3. 각 무딘 집게를 사용하여 반 매듭이 봉합을 준비합니다. 안과 모노 필라멘트 나일론 봉합사 때문에 (10-0, 0.2 메트릭) 만있는 노트를 준비하는 데 사용됩니다직경 1-2mm은, 해부 현미경이 필요 할 수있다.
  4. 해부 현미경으로 시각화, 약간 멀리 끝에서 부분적으로 폐쇄 봉합 매듭으로 모두 캐 뉼러를로드 해부 집게를 사용합니다. 나중에이 노트는 유관 동맥 끝 부분에 조심스럽게 미끄러되고 완전히 마감했다.

흰쥐에서 장간막 동맥 아케이드 4. 컬렉션

  1. 이 실험을 수행하기 전에 지역 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 얻을 수 있습니다. 제어 온도와 조명과 물을 무료로 이용할 수 있도록하고 상업 쥐 차우와 동물 시설 하우스 동물.
  2. 케타민 복강 주사 하였다 (80 mg / kg)과 자일 라진 (10 밀리그램 / kg)로 쥐를 마취. 발가락 핀치에 의해 필요한 관리] 추가 마취제 경우 깊은 마취를 확인합니다.
  3. 외과 적 마취를 확인한 후, 단두하여 동물을 안락사. 요로 감염에 대한 AAALAC의 지침을 따르십시오동물 안락사에 대한 적절한 방법을 LIZING.
  4. 흉골 골반으로부터 중심선 개복 수술을 수행하기 위해 해부 가위와 집게를 사용한다. 이 두 단계로 수행된다 : 첫째, 피부를 절개하고 둘째, 기본 근육층 절개. 케어는 복강 내 장기를 손상하지 않도록주의해야합니다.
  5. 유문에 장 가까이 ileo - 맹장 접합에 가까운 선단의 근위 끝을 잘라. 모두 미즙 때문에 입욕 세포 용액의 오염을 방지 배설물 누설을 방지하기 위해 별도로 묶어 종료한다. 급전 혈관 즉, 상 장간막 동맥 근처의 기지 장간막을 절개하고 빙냉 해부 용액을 함유하는 50 ㎖의 비커에 전체 소장 장간막 침대 옮긴다.
  6. 수확 된 조직이 5 분 동안 차가운 얼음 해부 용액에 머물면서 혈액 없애 신선한 해부 용액으로 씻어 수 있습니다.

5. 분리 및 4의 캐 뉼러

  1. 실 가드 코팅 접시에 오른쪽에 소장의 기단부 아래에 핀. (도 1) 장간막 확산 아래 세그먼트를 피닝 및 혈관 노출, 반 시계 방향의 경로에 남아있는 부위를 확장. 참고 : 우리는 실온에서 동맥 세그먼트를 격리 할 것. 그렇지 않으면 우리는 얼음에 접시를 포함하는 장간막 아케이드를 놓습니다. 우리 기관에 포함 일부 실험실, 4 ℃에서 동맥을 해부하기 위해 냉각 장치를 사용합니다.
  2. 스테레오 줌 현미경 위해 작은 장간막 동맥 제 3 차 및 4 작은 가위를 사용하여 소장에 (~ 260 μm의) 평행을 해부하다. 우선 피복 지방을 멀리 해부하다. 그런 다음 정맥을 해부하고 V 자형 분기점과 동맥을 격리 할 것. 선택된 세그먼트에 구멍을하지 않도록주의하십시오. 2 차 주문 지점 근처에 지방을 해부 시작하고 3 번째 또는 4 번째 ORD에 방법을 찾아어 선박.
    1. 주 : 동맥과 정맥들은 벽의 두께에 기초하여 구별 될 수있다 - 동맥 벽 혈관의보다 두껍다. 또한, 결합 조직 인접 때하는 동맥하지 쉽게하면서 혈관, 정맥의 붕괴를 조심스럽게 수직으로 당겨진다. 루멘 직경 동맥 때문에 <400 μm의 우리가 (직경 <300 μm의 루멘) 주문 쥐 장간막 동맥 번째 4를 사용하는이 프로토콜에 대한 전신 혈관 저항의 주요 사이트입니다.
  3. 소장에 동맥 평행 4-5mm 섹션을 분리합니다. 소장에 포함 된 모든 5 번째 순서 지점을 시각화하고 약간 떨어진 지점의 원점에서 그들을 잘라 일부를 보존 할 수 있습니다. 지점이 보존 된 부분은 이후 자신의 삽관을 안내, 관류 챔버에 동맥 세그먼트를 전송 (해부 포셉) 사이트를 잡고 역할을한다.
  4. 이어서 2 절개 원위함으로써 동맥 세그먼트를 잘라5 번째 순서의 동맥의 각각의 측면에 분기 및 관류 챔버로 이동시켜 (도 1C 및 범례 참조).
  5. (: 100-150 ㎛의 직경) 해부 집게 동맥 세그먼트의 끝을 잡고 해부 집게를 사용하여 유리 마이크로 피펫의 하나에 용기의 한쪽 끝을 Cannulate. 유관 끝에 이전에로드 된 부분적으로 폐쇄 봉합을 밀어 고정합니다. 주 : 동맥의 기단부는 동일계 환경에서 모방하는 서보 제어 압력 조절 장치에 연결되어 유리 캐 뉼러로 캐 뉼러를 삽입 할 수있다.
  6. 박리 용액을 캐 뉼러와 스톱 콕을 접속 배관에 박리 액을 주사기에두고 병합되도록이 캐 뉼러에 접속 콕에 10 ㎖ 주사기를 연결로드. 조심스럽게 주사기를 올립니다. 용액에 중력이 용기의 개방 단부에서의 혈관 내 혈액을 제거 할 것이다. 동맥 혈액을 제거한 후,, 꼭지를 닫습니다.
    대안 적으로, 상기 압력 컨트롤러에 콕을 부착를 켜 부드럽게 동일한 결과를 얻을 5-10 mmHg 이상으로 압력을 증가 참고.
  7. 신중 동맥 세그먼트의 묶이지 단부에 가능한 한 가까운 다른 뉼러를 가져와 2 유리 캐 뉼러 상 혈관의 말단부 넥타이. 유관 끝에 이전에로드 된 부분적으로 폐쇄 봉합을 밀어 고정합니다. 케어는 예인선 또는 동맥 세그먼트 당기지 않도록주의해야합니다. 모두 캐 뉼러에 부착 된 마개가 닫혀 있는지 확인하십시오.
  8. 라이브 비디오 녹화를 갖춘 거꾸로 현미경의 무대에 관류 챔버를 전송합니다.
  9. 서보 제어 압력 조절 장치에 동맥 세그먼트 (segment)의 기단부에 연결 정맥의 꼭지를 연결하고 안정된 관내 압력을 유지하기 위해 폐쇄 상태를 유지 꼭지는 다른 정맥에 연결해야합니다.
  10. 이어서, 흡입 포트를 진공 튜빙을 첨부ND 관류 챔버의 관류 포트 튜빙.
    참고 : 경 사진 바늘 포트가 관류에 대한 흡입 및 무딘 바늘 포트에 사용됩니다.
  11. 단일 인라인 용액 히터 통해 따뜻한 PSS와 용기의 관류 시작 (37 ° C, 기체 혼합물로 평형화 : 중성 pH 및 충분한 산소 (17)을 유지하기 위해 5 % CO 2, 5 % O 2, 90 % N)이 용액에 / min의 연동 펌프. 뿐만 아니라에 진공을 돌립니다. 연속적으로 온도를 모니터링하기 위해 챔버 내에 서미스터를 배치.
  12. 챔버의 PSS의 온도가 가까워지면 ~ 37 ° C (보통 5 분 이내), 천천히 20 ~ 100 mmHg로에서 관내 압력을 증가시키고 혈관 누출을 확인합니다. 이것은 압력 조절기의 압력을 자동 설정을 사용하여 수행된다. 누출과 혈관을 취소하고 다른 세그먼트로 교체. 누수와 혈관의 압력을 유지 할 수 없습니다.
  13. 100 mmHg의 압력에서 유지하면서 굽힘위한 동맥 분절을 평가.나사 레버를 사용하여 동맥 세그먼트를 곧게 캐 뉼러를 이동합니다. 이상 동맥 세그먼트를 늘리지 않습니다; 목표는 생체 동맥 세그먼트 길이에 모방하는 것이다.
  14. 70 mmHg로에 압력을 감소 (장간막 아케이드 (18) 생체 내 압력의 모방)과 동맥 세그먼트 안정과 근육 조직 톤을 개발 할 수 있습니다. 동맥은 (40 ~ 70 mmHg로) 실험 전략 및 혈관 침대에 따라 가변적으로 가압 할 수있다. 이전에 출판 된 리뷰는 다른 혈관 침대 8에서 동맥 부문에서 MT에 변화의 우수한 리뷰를 제공합니다.

동맥 직경의 6 측정

  1. 단색 영상 전하 결합 소자 카메라를 구비 10X 현미경 대물 렌즈에 볼 동맥. 비디오 프레임 그래버 실시간 에지 검출 시스템을 사용하여 내강 직경을 측정한다. 사용 된 장비의 목록은 표 3에 제공된다.
  2. 모니터 및 기록 용기 D계속 iameter.
  3. MT의 개발을위한 관찰한다. 참고 : 우리는 쥐 장간막 저항 동맥, 70 mmHg로에서, MT의 개발은 직​​경이 20 % 감소 ~ 특징입니다 것을 관찰했다. MT는 혈관 침대와 동물 종에 따라 달라집니다.
  4. 1 μM의 페닐 (Phe가) 1 μm의 아세틸 콜린 (ACH)에 혈관 수축과 혈관 확장 반응을 평가하여 혈관 가능성을 확인합니다.
  5. 각 실험의 끝에서 20 분 동안 불 함유 PSS 칼슘으로 동맥을 배양함으로써 수동적 직경 (PD)를 결정한다.

7. 근육 조직 응답

  1. 20mm 수은에 압력을 줄이고 직경이 안정 될 수 있도록. 증분 단계 (20, 40, 60, 80, 100)의 관내 압력을 증가시키고, 각 압력 단계에서 동맥 (통상 5 분 이내) 직경 안정을 달성 할 수있다.
  2. 20 mmHg로에 관내 압력을 줄이고 2+ - 무료 PSS 0.39 mM의를 포함하는 칼슘의 동맥 세그먼트를 품다EGTA 및 0.1 mM의 SNP. 동맥 직경이 (보통 15 분)을 안정화 할 수 있습니다.
  3. 0.39 mM의 EGTA 0.1 mM의 SNP를 포함하는 칼슘 - 무료 PSS의 압력 단계의 응답을 반복합니다.

데이터의 결과 및 계산 8. 해석

  1. 칼슘 관찰 직경 %의 차이는 다음과 같은 계산에 따라 각 압력에서 2 + - 무료 PSS 칼슘에 비해 함유로 MT를 계산한다 :
    식 (1)
  2. 직경 vasomotion 겪고 동맥 들어 1 분 동안 플래 위상을 평균함으로써 계산 될 수있다. 관계에 따라 최대 휴식 (%의 PD)의 퍼센트로 수집 된 데이터를 표현 %의 PD = 100 × [ΔD / PD] ΔD 전에 어떤 임상 화합물 (예 : Phe가)을 첨가 한 후, 직경의 차이이고; PD는 패시브 직경 (인최대 직경).

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Representative Results

전형적인 압력 myograph 설정의 개략적 인 대표도 1에 도시된다. 용기의 양단은 유리 마이크로 피펫으로 삽관과 양측 봉합사로 고정된다. 배관 및 오픈 콕 통해 하나 뉼러는 서보 제어식 압력 조절기에 접속되고; 다른 캐 뉼러가 클로즈 콕에 접속된다. 챔버는 CCD 카메라와 접속 도립 현미경으로 관찰 PSS 및 혈관 직경의 변화와 관류된다.

70 mmHg로 가압하는 동맥 분절은 2-4 ㎖ / 분으로 동맥 챔버 밖으로 흐르는 흡입 갓 준비한 따뜻한 PSS에서 배양된다. 동맥 직경은 모니터링 및 videomicroscopy 및 에지 검출 소프트웨어를 사용하여 기록한다. ~ 40 분 후, 동맥 세그먼트는 그들의 초기 직경 (도 2A) 20-40 %만큼 자발적으로 수축. 우리의 손에 작은 쥐의 저항 동맥은 25 % -30 % (평균 VARI에 의해 수축ES 설정, 운영자 및 동맥 침대에 따라). 그런 다음, 기능적인 가능성은 아세틸 콜린 (1 μM)과의 Phe (1 μM), 각각 (그림 2A)에 혈관 확장 및 혈관 수축 반응에 의해 평가된다. 다른 혈관 확장이 사용될 수 있지만, 아세틸 콜린은 내피 세포 의존적 혈관 확장을 유도하고, 따라서 내피 모두뿐만 아니라 혈관 평활근 생존력을 평가하는데 유용하다. 이어서 동맥 세그먼트 PSS 재 배양 직경이 안정되면, 실험에 대한 준비가되어있다. 각 실험의 끝에, 동맥 세그먼트는 PD (도 2B)을 측정하기 위해 칼슘 무료 PSS 배양된다. 도 2a 및도 2b에 기록 된 직경은도 2c에 정리 하였다. 절대 MT는 PD와 70 mmHg로에서 자발적으로 혈관 수축에 달성 안정 직경의 차이입니다. 따라서, 표시된 추적 관찰 MT는 PD의 33 %입니다. 여기에서 알 수있는 바와 같이, ACh에 (1 μM)에 대한 응답은 GE는 칼슘 무료 PSS에서 관찰 된 것과 유사한 nerally. 혈관 확장을 평가하는 실험에서, 혈관 수축의 사전 또한이 필요할 수도 있습니다.

근육 조직 반응을 결정하기 위해, 래트 장간막 동맥 세그먼트는 20 내지 100 mmHg의 사이 관내 압력을 증가시키는 단계를 실시한다. 일례가도 3a에 도시되어있다. 동맥은 각 단계 (; 점선 ~ 5 분) 후 안정적인 직경을 달성 할 수 있습니다. 이어서, 동일한 동맥 세그먼트는 0.39 mM의 EGTA, 0.1 mM의 SNP (도 3a)와 -free PSS 칼슘의 압력 응답을 받는다. 각각의 압력 단계의 끝에서 달성 직경은 선 그래프 (도 3b)로 표시 될 수있다. MT로 계산 CA의 직경 비율 차이 2+ 함유 캘리포니아 대 각 압력에서 2 + - 무료 PSS는 선 또는 막대 그래프 (그림 3C)로 표시 할 수있다.

NT "FO : 유지 - together.within 페이지 ="항상 "> 그림 1
그림 1 : 압력 myograph 설정의 그림 (A)의 핵심 구성 요소가 표시됩니다.. 모든 장비의 목록은 표 3을 참조하십시오. 실 가드 코팅 접시에 고정 (B)를 수확 장간막 침대가 표시됩니다. 장간막 동맥 아케이드의 (C) 만화 도시된다. 검은 점은 핀의 위치를​​ 나타낸다. 점선 부분은 해부되는 동맥 세그먼트를 나타냅니다. 작은 녹색 막대는 동맥의 절개 사이트를 나타냅니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

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도 2 : 70 mmHg로 가압하는 경우 (A)로 나타낸 바와 같이 추적은, 작은 쥐 장간막 동맥의 직경은 자발적으로 감소한다. ACh에 (1 μM)의 추가는 (거의 시작 직경) 직경을 증가했다. 조직 욕의 Phe (1 μM)의 첨가는 동맥의 직경을 감소시킨다. 칼슘 2 + (b)에서 배양는 - 무료 PSS는 동맥의 직경을 증가시킨다. (C)에 도시 된 다양한 관류 및 B의 단일 가압 동맥 세그먼트의 직경은 도표화된다.

그림 3
그림 3 : PSS의 존재와 칼슘 - 무료로 점진적으로 관내 압력을 증가시키면서 () 동맥 직경은 지속적으로 기록된다PSS. 각각의 압력 단계에서 달성 동맥의 직경 (B) 라인 곡선. MT의 (C) 막대 그래프는 각 압력 단계에서 달성했다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

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Discussion

중요한 단계, 문제 해결 및 수정

전형적인 동중 선박 대비, 동맥 따뜻한 (37 ° C) PSS와 관류이 유리 캐 뉼러 사이에 70 mmHg로에서 가압된다. 30-45 분 후에, 동맥 20-30 분에서 안정화 직경 감소에 의해 자발적 특징 MT 개발. 다양한 혈관 침대에서 저항 동맥 변수 MT를 개발한다. cremastric 동맥 PD의 MT ~ 40 %를 달성 할 수있다 예를 쥐 저항 장간막 동맥 ~ PD의 25 %를 MT를 개발한다. 60 분 이내에 MT를 개발하지 않는 동맥은 폐기되어야한다 이 기간은 혈관 침대와 종류에 따라 달라질 수 있습니다. 부적절한 응답 동맥 프하고 ACh에도 폐기해야합니다.

pH 및 온도는 PSS의 MT의 개발에 상당한 영향을 미친다. 포기하지 않고 오랜 기간 동안 앉아 PSS,,의 pH는 증가 할 수 있습니다. 또한, 상온에서의 동맥 D 않을 것이다evelop MT. 따라서, PSS는 지속적으로 모니터링하고 유동 히터를 이용 ~ 37 ° C로 유지되어야 관류 챔버의 프로토콜 부분과 온도에 표시된 가스 혼합물을 사용하여 가능한 한 빨리 폭기한다.

이러한 실험 기간에 3-5 시간이므로, 관류 챔버 및 관련 배관은 장시간 PSS에 노출된다; 소금 침전물 후속 실험을 방해 할 수 챔버와 튜브에 모두 구축 할 수 있습니다. 따라서 철저 관류 챔버를 씻어 각 실험 후 탈 이온수와 튜브를 씻어하는 것이 중요합니다. 마찬가지로, 케어 철저 각 절개 후 탈 이온수로 절개 사용 실 가드 코팅 된 접시를 깨끗하게주의해야한다.

제한

그 중요성에도 불구하고, 오후에는 다양한 제한 사항이 있습니다. 첫째, 집단 비용 조달 오후 장비가 높은 (~ 2만2천달러)과 라 확실하게 금지 할 수있다BS; 장비의 자세한 목록은 표 3에 도시되어 둘째, 새로운 혈관이 가장 실험이 필요하다.; 따라서 새로운 동물이 전체 비용에 추가, 각 실험에 대한 안락사된다. 작은 장간막 동맥의 셋째, 해부는 지루한 및 손상하는 경향이 해부 현미경과 미세 절제 도구와 같은 다른 도구가 필요합니다. 넷째, 학습 곡선이있다; 전문 지식을 얻고 실험실에서 오후를 구축하는 것은 헌신적 인 직원, 시간과 노력을 필요로한다.

다른 방법과 미래의 응용 프로그램에 대한 의미

동중과 아이소 메트릭 실험 프로토콜은 혈관 반응성을 결정하는 데 두 가지 방법을 제공합니다. 등압 제제와 대조적으로, 메트릭 제제에 vasoactivity는 와이어 myograph 시스템을 사용하는 혈관 평활근 장력을 측정함으로써 결정된다. 이들 두 실험 프로토콜에 필요한 장비의 차이에 더하여, 작용제-Induced 수축 크기, 시간 코스 및 혈관 벽의 긴장 11,19의 방향에 관해서 이러한 실험 방법 중 다르다. 때문에 기술적 인 편의 시설과 한계, 모두 준비가 중요한 역할을 제공합니다. 이 아이소 제제에 미세한 초점을 유지하기 쉽기 때문에, 예를 들어, 그들은 종종 혈관 반응성 및 혈관 평활근 칼슘의 변화를 동시에 측정에 사용된다. 한편, 근육 조직의 활동에 가장 밀접 생체 내 생리 학적 상태를 모방하는 것으로 간주되는 가압 된 제제에서 평가된다. 이러한 준비 간의 차이점에 대한 자세한 리뷰는 이전에 (19)가 제공된다.

결론적으로, 압력 myography은 거의 생리적 조건에서 작은 저항 혈관의 근육 조직 반응을 연구하는 신뢰할 수있는 기술이다. 그 한계에도 불구하고, 오후 변화의 이해에 중요한 기여를 제공하고 있습니다정상 및 병적 상태 3-7,20-23에서 혈관 기능. 전신적 혈관 톤의 규정은 매우 복잡하며, 따라서 생체 내에서 혈관 침대의 톤을 조절하는 특정 메커니즘 역할을 단리 로컬 및 신경 호르몬 요인 어렵다 포함한다. 이와 관련하여, 생체 가압 동맥 준비는 우수한 대리를 제공합니다. MT 및 근육 조직 반응의 전달 메커니즘에 관심이있는 사람들은 이전에 발행 된 우수 리뷰 (15, 19)라고합니다. 앞으로 우리는 근육 조직 반응과 같은 칼슘과 같은 다운 스트림 사자의 변화의 평가를 통합 2+ 우리가 장비 비용의 감소를 볼 가능성이 거의 불구하고 장비의 발전을 볼 수 있습니다. 이 기술은 다양한 배경을 가진 과학자들에 의해 채택된다 그러나, 우리는 가능성이 간경화, 드와 같은 고혈압, 당뇨병과 충격 이외의 다른 질환에서 미세 혈관 기능의 변화를 평가하기 위해 해당 응용 프로그램을 볼 수mentia

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Disclosures

저자는 재정적 충돌이 없습니다.

Acknowledgements

인 Sandeep Khurana는 NIH (K08DKO81479)에 의해 지원됩니다. Vikrant Rachakonda은 (T32DK067872)에 의해 지원됩니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemical
Acetylcholine Sigma Aldrich A6625
Calcium chloride (CaCl2) Sigma Aldrich 223506
D-(+)-Glucose Sigma Aldrich G5767
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetra acetic acid (EGTA) Sigma Aldrich E3889
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) Sigma Aldrich E9884
HEPES Sigma Aldrich H3784
Magnesium sulfate (MgSO4) Sigma Aldrich M7506
MOPS Sigma Aldrich M5162
Phenylephrine Sigma Aldrich P6126
Potassium chloride (KCl) Sigma Aldrich P3911
Potassium phosphate (KH2PO4) Sigma Aldrich P5655
Sodium bicarbonate (NaHCO3 ) Sigma Aldrich S6014
Sodium chloride (NaCl) Sigma Aldrich S7653
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma Aldrich S5881
Sodium nitroprusside Sigma Aldrich 13451
Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4) Sigma Aldrich S9638
Sodium pyruvate Sigma Aldrich P8574
Table 1.
Physiological salt solution (1,000 ml) mM
KCl 4.9 0.365 g
NaCl 112 6.545 g
MgSO4.7H2O 1.2 0.296 g
KH2PO4 1.2 0.163 g
Glucose 11.5 2.072 g
NaHCO3 26 2.184 g
HEPES 10 2.383 g
CaCl2 2 2 ml (1M stock)
De-ionized water 998 ml
Ca2+ free physiological salt solution (100 ml) mM
KCl 4.9 0.036 g
NaCl 112 0.645 g
MgSO4.7H2O 1.2 0.029 g
KH2PO4 1.2 0.016 g
Glucose 11.5 0.207 g
NaHCO3 26 0.218 g
HEPES 10 0.238 g
EGTA 0.39 0.015 g
Sodium nitroprusside 0.1 0.0026 g
De-ionized water 100 ml
Dissection solution, stock (500 ml) mM
NaCl 145 21.18 g
KCl 4.7 0.875 g
MgSO4 1.2 0.739 g
MOPS 2 1.049 g
EDTA 0.02 0.019 g
De-ionized water 500 ml
Working dissection solution (100 ml) mM
Dissection solution stock 20 ml
Glucose 1.2 0.091 g
NaH2PO4 5 0.016 g
Sodium pyruvate 2 0.022 g
CaCl2 2 0.2 ml (1M stock)
De-ionized water 79.8 ml
Table 2. Composition of Experimetnal solutions
Equipment
CCD Monochrome Camera The imaging Source DMK 21AU04
Single inline solution heater Warner Instruments 64-0102
Thermistor Warner Instruments 64-0108
Dual automatic temperature controller Warner Instruments TC-344B
Flaming/Brown micropipette puller Sutter Instruments P-97
Fluorescence System Interface IonOptix model FSI-700
Forceps and scissors World Precision Instruments
Ion Wizard-Core and Analysis IonOptix Ion Wizard 6.0
Laboratory tubing Silastic 508-005
Male Sprague Dawley rat Harlan Laboratories
Master flex console drive Cole-parmer
Milli-Q Plus Ultrapure Water System Millipore ZD5211584
Ophthalmic monofilament nylon suture Ethicon 9007G
Photometry and Dimensioning Microscope Motic AE31
Pressure Servo Controller with peristaltic pump and pressure transducer Living Systems Instrumentation PS-200
Stereomicroscope Nikon Instruments Inc SMZ660
Vessel Chamber Living Systems Instrumentation CH-1
Dissection dish Living Systems Instrumentation DD-90-S
Thin Wall Glass Capillaries World Precision Instruments TW120-6
Microforge Stoelting 51550
Table 3.

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References

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