Bedöma Myogenic Response och vasoaktivitet I Resistance mesenteriska artärer Använda tryck Myography

1Section of Gastroenterology and Hepatology, Georgia Regents University, 2Division of Gastroenterology and Hepatology, University of Pittsburgh School of Medicine, 3Vascular Biology Center, Georgia Regents University
Published 7/06/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Tryck myography används för att bedöma vasoaktivitet av små artärer som utvecklar ihållande sammandragning när tryck. Detta manuskript ger en detaljerad protokoll för att bedöma i isolerade segment av små mesenteriska artärer från råttor, vasoaktivitet och effekten av intraluminala trycket på vaskulära diameter.

Cite this Article

Copy Citation

Jadeja, R. N., Rachakonda, V., Bagi, Z., Khurana, S. Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography. J. Vis. Exp. (101), e50997, doi:10.3791/50997 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Små motstånd artärer tygla och vidgas respektive svar på ökad eller minskad intraluminal tryck; detta fenomen kallas myogenic svar är en viktig reglerare av lokalt blodflöde. I isobariska förhållanden små motstånd artärer utvecklar ihållande sammandragning kallas myogenic ton (MT), vilket är en viktig faktor för systemisk vaskulär resistans (SVR). Därför ex vivo trycksatta beredningar av små motstånd artärer är viktiga verktyg för att studera mikrovaskulära funktion i närheten av fysiologiska tillstånd. För att uppnå detta, är en färsk isolerad intakt segment av en liten resistans artär (diameter ~ 260 mikrometer) monteras på två små glas kanyler och trycksatt. Dessa arteriella preparat behålla de flesta in vivo egenskaper och tillståndsbedömning av kärltonus i realtid. Här ger vi ett detaljerat protokoll för att bedöma vasoaktivitet i tryck små motstånd mesenteriska artärer från råttor; dessa artärer utvecklaihållande vasokonstriktion - cirka 25% av maximal diameter - när tryck på 70 mmHg. Dessa arteriella beredningar kan användas för att studera effekten av prövnings föreningar på förhållandet mellan intraarteriell trycket och vasoaktivitet och fastställa förändringar mikrovaskulära funktion i djurmodeller av olika sjukdomar.

Introduction

Små motstånd artärer är viktiga faktorer för SVR och spelar en viktig roll i patofysiologin för många sjukdomar 1,2. Villkor som diabetes 3, graviditet 4, ischemi-reperfusion 5, övervikt och högt blodtryck 6,7 är ofta förknippade med förändrad mikrovaskulär funktion. Kärl myography kan inte bara ge viktiga insikter i förändringar i mikrovaskulära funktion i olika sjukdomar, men också hjälpa till att identifiera terapeutiska mål och utvärdera effekten av vasoaktiva föreningar. Kärl funktion har studerats med hjälp av isolerade små artärer i isometriska eller isobariska fartygsförhållanden 8. Detaljerad beskrivning av isometrisk myography föreskrivs någon annanstans 9. Men det finns skillnader i uppgifter från isometrisk kontra isobariska preparat 10-12. Eftersom tryck arteriella preparat tillåter studiet av mikrovaskulär funktion i nära fysiologiska förhållanden,erhållna resultaten kan korrelera bättre med in vivo beteende kärlbädden 8,13.

År 1902 beskrev Bayliss första effekten av transmural tryck på vaskulära diametern 14. Han observerade i små motstånds artärer från olika kärlbäddar av kaniner, katter och hundar som en minskning av trycket följt av vasodilatation, och en ökning av trycket följdes av vasokonstriktion. Detta fenomen är känt som myogenic svar. Bayliss och efterföljande utredare konstaterat att i isobariska förhållanden litet motstånd artärer utvecklar ihållande sammandragning kallas MT 15,16. Kan bedömas både myogenic respons och MT med tryck myography (PM) teknik. PM används främst för att bestämma vasoaktivitet små artärer, vener och andra fartyg. Förutom att bedöma effekten av vasoaktiva föreningar på vaskulära diameter, PM - som namnet antyder - används för att bedöma intravaskulär tryckförmedlad chAnges på vaskulära diameter. Under de senaste decennierna framsteg i dataprogram som förbättrad video mikroskopi och glaspipett dragning, har gjort PM lättare att utföra. Men dissektion av livskraftiga intakta segment av små blodkärl fortfarande tråkiga och ibland utmanande. Här redogör vi ett detaljerat protokoll för att studera myogenic svar i små mesenteriala motstånd artärer isolerade från råttor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Exemplen som visas här är från försök som godkänts av IACUC vid Georgia Regents universitet - protokoll nr: # 2011-0408

1. Beredning av reagenser

  1. Förbered dissektion lösning lager: För 500 ml lager dissektion lösning (5x), upplösa 21,18 g NaCl, 0,875 g KCl, 0,739 g MgSO 4, 1.049 g MOPS och 0,019 g EDTA i 450 ml Milli-Q-vatten. Justera pH till 7,3 till 7,4 med användning av 1 N NaOH. Gör upp volymen till 500 ml med Milli-Q-vatten. Stamlösning kan förvaras upp till 7-10 dagar. Se tabell 1 för en lista över kemikalier och deras leverantörer. Se tabell 2 för koncentration i mM.
  2. Bered arbets dissektion lösning: Bered färsk arbets dissektion lösning varje dag. För 100 ml arbetslösning, lös 0,091 g glukos, 0,016 g NaH 2 PO 4 och 0,022 g natriumpyruvat i 79,8 ml Milli-Q-vatten. Lägg 0,2 ml 1M CaCl2 och 20 ml dissektion lösning lager för att få VOLUmig till 100 ml.
  3. Förbered fysiologisk saltlösning (PSS): För att förbereda 1000 ml PSS, upplösa 0,365 g KCl, 6,545 g NaCl, 0,296 g MgSO 4, 0,163 g KH 2 PO 4, 2.072 g glukos, 2.184 g NaHCO 3 och 2,383 g HEPES i 950 ml Milli-Q-vatten. Justera pH till 7,3 till 7,4 med användning av 1 N NaOH. Gör upp volymen till 1000 ml med Milli-Q-vatten. Ta 2 ml av lösningen och ersätta det med 2 ml 1 M CaCl2. (Fresh PSS måste beredas dagligen)
  4. Förbered kalcium (Ca2 +) fri PSS: För 100 ml PSS utan Ca2 +, upplösa 0,036 g KCl, 0,654 g NaCl, 0,029 g MgSO 4, 0,016 g KH 2 PO 4, 0,207 g glukos, 0,218 g NaHCOs 3 0,238 g HEPES, 0,015 g EGTA och 0,0026 g natrium (SNP) i 95 ml Milli-Q-vatten. Justera pH till 7,3 till 7,4 med användning av 1 N NaOH. Gör upp volymen till 100 ml med Milli-Q-vatten.

2. Framställning av glas Kanyler

  1. Dra glaspipetteratt generera 100-150 pm tippade kanyler med en pipett avdragare enligt tillverkarens anvisningar.
  2. Bevel glaskanyl tips med hjälp av en mikro beveller, brand polera dem och böja glas kanyl tips från ~ 45 ° med en värmare sond.
  3. Ladda kanyler i mikropipett hållare och fäst mikropipett innehavaren till perfusionskammaren.

3. Framställning av perfusionskammare

  1. Skölj perfusionskammare med Milli-Q-vatten följt av dissektion lösning för 5 min vardera. Fyll kammaren med 2 ml dissektion lösning.
  2. Sug dissektion lösning genom kanyl med hjälp av 10 ml spruta och fyll noga hela kanylen och fäst slangen utan bubblor. Applicera sug försiktigt för att undvika uppkomst av bubblor.
  3. Förbered två suturer med en halv knut i varje med trubbiga pincett. Eftersom ögonmonofilament nylonsuturer (10-0, 0,2 metriska) används för att framställa de knutar som bara1-2 mm i diameter, kan dissektionsmikroskop behövas.
  4. Visualisera enligt dissektion mikroskop, använd dissektion pincett för att ladda båda kanyler med delvis stängda sutur knop aning bort från spetsen. Senare dessa knutar kommer att skjutas försiktigt på den kanyle arteriella ändarna och stängas helt.

4. Insamling av mesenterica artär Arcade från Sprague-Dawley råttor

  1. Ansöka om godkännande av den lokala Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) innan de utför dessa experiment. Hus djur i djur anläggning med kontrollerad temperatur och belysning och tillåta fri tillgång till vatten och en kommersiell gnagarfoder.
  2. Söva råttorna genom intraperitoneal injektion av ketamin (80 mg / kg) och xylazin (10 mg / kg). Bekräfta djup anestesi med toe-nypa och vid behov administrera ytterligare bedövningsmedel.
  3. Efter att ha bekräftat kirurgisk anestesi, avliva djuret genom halshuggning. Följ AAALAC riktlinjer för utilizing lämpliga metoder för avlivning.
  4. Använd en dissektion sax och en pincett för att utföra en mittlinjen laparotomi från bäcken till bröstbenet. Detta görs i två steg: först, incisionsfilm huden och andra, incisionsfilm det underliggande muskelskiktet. Man måste vara försiktig att inte skada de intra-bukorganen.
  5. Skär den proximala änden av tarmen nära pylorus och den distala änden nära den ileo-cecal junction. Knyt båda ändarna separat för att förhindra läckage av CHYMUS och avföring därmed undvika förorening av extracellulärt badlösning. Incise tarmkäxet vid sin bas nära matningskärl dvs mesenterica superior och överföra hela tunntarmen mesenterica säng till en 50 ml bägare innehållande iskall dissektion lösning.
  6. Låt Skördad vävnad för att stanna i iskall dissektion lösning under 5 minuter och skölj med färska dissektion lösning för att bli av med blod.

5. Isolering och Kanyle av 4: e

  1. Pin ner den proximala änden av tarmen på höger sida i en Sylgard-belagd skålen. Förläng den återstående tarmen i en moturs bana, sätter segmentet ner för att sprida krös och exponera blodkärlen (Figur 1). Obs: Vi isolerar arteriella segment vid rumstemperatur. Annars kan vi placera mesenteriala arkad innehållande skålen på is. Vissa laboratorier, inklusive de på vår institution, använder kylenheter att dissekera artärerna vid 4 ° C.
  2. Under ett stereozoom-mikroskop dissekera ut 3: e och 4: e ordningens små mesenteriska artärer (~ 260 | im) som är parallell till tunntarmen med hjälp av en liten sax. Först dissekera bort alla täck fett. Sedan dissekera ut venen och isolera artären med V-formad förgreningspunkt. Var noga med att inte punktera det valda segmentet. Börja dissekera fettet nära en 2: a för gren och hitta vägen till 3: e eller 4: e ordER fartyg.
    1. Obs: artärer och vener kan urskiljas baserat på deras väggtjocklek - artärväggen är tjockare än ven-talet. Dessutom, när angränsande bindväv dras försiktigt vinkelrätt mot fartyg, vener kollapsar lätt medan artärer inte. Eftersom artärer med lumen diameter <400 um är viktiga platser av systemisk vaskulär resistens, för detta protokoll vi använt 4: e för råtta mesenteriska artärer (lumen diameter <300 pm).
  3. Isolera en 4-5 mm sektion av artär parallell till tunntarmen. Visualisera alla 5: e ordningens grenar bädda in tunntarmen och skär dem något från ursprunget av grenar och bevara en del. Dessa bevarade delarna av grenarna fungerar som håller platser (med dissektion pincett) för överföring av arteriella segment till en perfusion kammare och därefter styra sin kanyl.
  4. Skär sedan de arteriella segment genom att göra 2 snitt distaltde 5: e ordningens grenar på varje sida av artären och överföra den till perfusionskammaren (se figur 1C och legend).
  5. Cannulate ena änden av fartygen på en av glasmikropipett (diameter: 100-150 nm) med hjälp av dissektion pincett genom att hålla spetsarna på artärsegmentet med dissektion pincett. Skjut tidigare laddats delvis stängda sutur på kanyl änden och säkra den. Obs: Den proximala änden av artären kan kanyleras på glaskanyl som är ansluten till servostyrd tryckreglerande anordning för att efterlikna in situ miljö.
  6. Fäst en dissektion lösning laddad 10 ml spruta till kranen ansluten till denna kanyl så att dissektion lösning i slangen som förbinder kanylen och kranen går samman med det i sprutan. Höja försiktigt sprutan. Gravitationskraften på lösningen kommer att ta bort intra vaskulär blod från den öppna änden av kärlet. Efter avlägsnande av intra-arteriellt blodStäng kranen.
    Obs! Du kan också fästa kranen till tryckregulator, slå på den och försiktigt öka trycket till 5-10 mm Hg för att uppnå samma resultat.
  7. Bind den distala änden av kärlen på en andra glaskanyl genom att försiktigt föra den andra kanylen så nära som möjligt till den obundna änden av den arteriella segmentet. Skjut tidigare laddats delvis stängda sutur på kanyl änden och säkra den. Man måste vara försiktig inte bogserbåt eller dra på arteriella segment. Kontrollera att kranarna kopplade till båda kanyler är stängda.
  8. Överför perfusionskammare på scenen av inverterat mikroskop utrustad med levande videoinspelning.
  9. Anslut kranen av kanylen bunden till den proximala änden av arteriellt segment till en servostyrd tryckreglerande anordning och se till att kranen fäst vid den andra kanylen förblir stängd för att upprätthålla en stabil intraluminala tryck.
  10. Därefter fäster vakuumslangen till sugporten ennd perfusionen slang till perfusionen sporten hos kammaren.
    Obs: Beveled nål port används för sugning och trubbig nål port för perfusion.
  11. Börja perfusion av fartyg med varmt PSS genom enda inline lösning värmare (37 ° C, jämviktad med gasblandning: 5% CO 2, 5% O2 och 90% N för att upprätthålla neutralt pH och adekvat syresättning 17) på 2 ml / min med användning av en peristaltisk pump. Vrid vakuum på också. Placera en termistor i kammaren för att kontrollera temperaturen kontinuerligt.
  12. När temperaturen i PSS i kammaren närmar ~ 37 ° C (vanligen inom 5 minuter), långsamt öka intraluminal tryck från 20 till 100 mmHg och kontrollera fartyg läckor. Detta görs med hjälp av den automatiska tryckinställning av tryckregulatorn. Kasta fartyg med läckage och ersätta med ett annat segment. Fartygen med läckage kommer inte att kunna hålla trycket.
  13. Bedöm arteriella segmentet för kurvor samtidigt som trycket på 100 mmHg.Använda skruv spaken, flytta kanylen att räta artärsegmentet. Inte över sträcka arteriella segment; Målet är att efterlikna in vivo arteriell segmentlängd.
  14. Reducera trycket till 70 mm Hg (för att efterlikna in vivo-tryck i mesenteriala hall 18) och låt den arteriella segmentet att stabilisera och utveckla myogena tonen. Artärer kan trycklöst (40-70 mmHg) enligt experimentell strategi och kärlbädden. En tidigare publicerad granskning ger en utmärkt översikt av variabilitet i MT i arteriella segment från olika kärlbäddar 8.

6. Mätning av Arterial Diameter

  1. Se artärer vid 10X objektiv på ett mikroskop utrustat med en monokrom videoladdningskopplad anordning kamera. Mät luminala diameter med hjälp av video frame grabber och realtidssystem kantdetektering. En lista över utrustning som används återfinns i tabell 3.
  2. Övervaka och spela in fartyg diameter kontinuerligt.
  3. Observera för utveckling av MT. Obs: Vi observerade att i råtta mesenteriala motstånd artärer, på 70 mmHg, utveckling av MT kännetecknas av ~ 20% minskning i diameter. MT varierar beroende på kärlbädden och djurarter.
  4. Bekräfta vaskulär lönsamhet genom att bedöma kärlsammandragande och kärlvidgande respons till 1 iM fenylefrin (Phe) och 1 | iM acetylkolin (ACH).
  5. Vid slutet av varje experiment bestämma passiv diameter (PD) genom att inkubera artärer i Ca2 + -fri PSS under 20 min.

7. Myogenic Response

  1. Reducera trycket till 20 mm Hg och medge att diametern för att stabilisera. Öka intraluminala trycket i stegvis (20, 40, 60, 80 och 100) och vid varje trycksteg tillåter artärer för att uppnå en stabil diameter (vanligtvis inom 5 min).
  2. Minska intraluminala trycket på 20 mmHg och inkubera artärsegmentet i Ca2 + -fri PSS innehållande 0,39 mMEGTA och 0,1 mM SNP. Låt arteriella diameter för att stabilisera (vanligen 15 minuter).
  3. Upprepa tryckstegsvar i Ca2 + -fri PSS innehållande 0,39 mM EGTA och 0,1 mM SNP.

8. Tolkning av resultat och beräkningen av data

  1. Beräkna MT som skillnaden i diameter observerades för Ca2 + procent -innehållande kontra Ca2 + -fri PSS vid varje tryck enligt följande beräkning:
    Ekvation 1
  2. För artärer som genomgår kärlrörelse diametern kan beräknas genom medelvärdesbildning platåfasen under 1 minut. Uttryck insamlade data som procent av maximal avslappning (% PD) enligt sambandet:% PD = 100 x [AD / PD]; AD är skillnaden mellan diametern före och efter tillsats av något investigational förening (t.ex. Phe); PD är passiv diameter (ävenmaximal diameter).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Schematisk representation av en typisk tryck myograph ställt upp visas i Figur 1. De två ändarna av kärlet kanyleras med en glasmikropipett och fästs med suturer på båda sidor. Via rör och en öppen kranar, är en kanyl ansluten till en servostyrd tryckregulator; den andra kanylen är ansluten till en sluten avstängningskran. Kammaren är perfusion med PSS och kärl diameter förändringar observeras av ett inverterat mikroskop ansluten till en CCD-kamera.

Den arteriella segmentet tryck på 70 mmHg inkuberas i nygjord varm PSS, som flyter genom artärkammaren vid 2-4 ml / min och sugs ut. Arterial diameter övervakas och registreras med hjälp av videomicroscopy och kantavkänning programvara. Efter ~ 40 min, arteriella segment sammandra spontant med 20-40% av sin utgångsdiameter (Figur 2A). I våra händer liten råtta motstånd artärer ihop med 25-30% (i genomsnitt varies enligt inställningar, operatör, och arteriell säng). Därefter funktionell livsduglighet bedömas av vasodilaterande och kärlsammandragande responser till ACh (1 | iM) och Phe (1 | iM), respektive (Figur 2A). Medan andra kärlvidgande kan användas, ACh inducerar endotelberoende vasodilatation och därmed är användbar vid bedömningen av såväl endotel samt vaskulär glatt muskulatur lönsamhet. Därefter det arteriella segmentet åter inkuberas i PSS och en gång diametern stabiliseras, är det klart för experimentet. Vid slutet av varje experiment, är arteriella segment inkuberas i Ca2 + fri PSS att mäta PD (Figur 2B). Diametrarna inspelade i fig 2A och 2B är tabellerade i figur 2C. Absolut MT är skillnaden mellan PD och stabil diameter uppnås på spontan kärlsammandragning på 70 mmHg. Därför är MT observeras från spårning visad 33% av PD. Som framgår här, svar på ACh (1 M) är GE nerally liknande den som observerades för Ca2 + gratis PSS. Observera att i experiment bedöma vasodilatation kan före tillsättningen av en vasokonstriktor behövas.

För att bestämma myogena respons, är rått mesenteriala arteriella segment utsattes för ökande intraluminala trycksteg mellan 20 och 100 mm Hg. Ett exempel visas i figur 3A. De artärer får uppnå en stabil diameter efter varje steg (~ 5 min, streckade linjer). Därefter samma artärsegment utsattes för tryck-respons i Ca2 + -fri PSS med 0,39 mM EGTA och 0,1 mM SNP (figur 3A). Diametern uppnås vid slutet av varje trycksteg kan visas som ett linjediagram (figur 3B). MT beräknat som skillnaden procent i diameter för Ca2 + -innehållande vs. Ca2 + -fri PSS vid varje tryck kan visas som linje eller stapeldiagram (Figur 3C).

nt "fo: keep-together.within-page =" always "> Figur 1
Figur 1: En illustration av tryck myograph set-up (A) De viktigaste komponenterna anges.. Se tabell 3 för en lista över all utrustning. (B) Skördade mesenteriska säng nålas på en sylgard belagd maträtt visas. (C) En tecknad film av mesenteriala artärhall visas. Svarta punkter representerar stiftpositioner. Den streckade sektion representerar en arteriell segment som skall dissekeras. Små gröna staplar visar snittet platser på artären. Klicka här för att visa en större bild .

/ftp_upload/50997/50997fig2.jpg "/>
Figur 2: (A) Som framgår av spårning, diameter små mesenteriska artärer från råttor, när tryck på 70 mmHg minskar spontant. Tillsats av ACh (1 pM) ökade diametern (till nära-utgångsdiametern). Tillsats av Phe (1 | iM) till vävnadsbadet minskar artärdiameter. (B) Inkubation i Ca2 + -fri PSS ökar arteriell diameter. (C) Diametern av en enda tryck arteriell segment i olika perfusat som visas i A och B tabell.

Figur 3
Figur 3: (A) Arteriell diameter registreras kontinuerligt och samtidigt öka intraluminala trycket stegvis i närvaro av PSS och Ca2 + -friPSS. (B) kurvan av arteriell diameter uppnås vid varje trycksteg. (C) stapeldiagram över MT uppnås på varje trycksteg. Klicka här för att visa en större bild .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritiska steg, felsökning och modifieringar

I en typisk isobar kärl beredning, artären under tryck vid 70 mm Hg mellan två glas kanyler perfunderade med varmt (37 ° C) PSS. Efter 30-45 minuter, artärer utveckla MT, som kännetecknas av spontan minskning i diameter som stabiliserar i 20-30 min. Motstånds artärer från olika kärlbäddar utveckla rörlig MT. Till exempel råtta motstånd mesenteriska artärer utveckla MT ~ 25% av PD, medan cremastric artärer kan uppnå MT ~ 40% av PD. Artärer som inte utvecklar MT inom 60 minuter ska kasseras; denna varaktighet kan variera beroende på kärlbädden och arter. Artärer med otillräckligt svar till Phe och ACh bör också kasseras.

pH och temperatur PSS har en betydande inverkan på utvecklingen av MT. pH hos PSS, som sitter under långa perioder utan luftning, kan öka. Dessutom, på rummet är osannolikt att d temperatur artärerevelop MT. Därav PSS bör luftas så snart som möjligt genom att använda gasblandningen anges i protokollenheten och temperaturen hos perfusionskammaren bör övervakas kontinuerligt och hölls vid ~ 37 ° C med användning av en flödesvärmare.

Eftersom dessa experiment är 3-5 timmar i längd, är perfusionskammare och tillhörande slangar som utsätts för PSS under långa perioder; salt fällningar kan bygga upp både i kammaren och slang som kan störa efterföljande experiment. Därför är det viktigt att tvätta perfusionskammaren och rensa slangen med avjoniserat vatten efter varje experiment. På samma sätt måste man noggrant rengöra sylgard belagda skålen används för dissekering med avjoniserat vatten efter varje dissekering.

Begränsningar

Trots sin betydelse har PM olika begränsningar. För det första att den sammantagna kostnaden upphandla PM utrustning är hög (~ $ 22.000) och kan vara oöverkomliga för vissa laB; en detaljerad lista över utrustning visas i tabell 3 andra är färska fartyg som behövs för de flesta experiment. varför en ny djur avlivas för varje experiment, att lägga till den totala kostnaden. Tredje, dissektion av små mesenteriska artärer är jobbigt och kräver andra instrument såsom dissektion mikroskop och microdissection verktyg, som är benägna att skada. För det fjärde, det finns en inlärningskurva; få kompetens inom och inrättande av PM i ett labb kräver engagerad personal, tid och ansträngning.

Betydelse med hänsyn till andra metoder och framtida tillämpningar

Isobariska och isometriska experimentella protokoll finns två huvudsakliga metoder som används för att bestämma kärl reaktivitet. I motsats till isobariska beredningar är vasoaktivitet i isometriska preparat bestäms genom att mäta vaskulär glatt muskelspänningar med hjälp av en tråd myograph system. Förutom skillnader i utrustning som krävs för dessa två experimentella protokoll, agonist-induced kontraktion är annorlunda bland dessa experimentella metoder i fråga om att storleken, tidsförloppet och riktning kärlväggen spänning 11,19. På grund av tekniska bekvämligheter och begränsningar, båda preparaten fyller viktiga roller. Till exempel, eftersom det är lättare att underhålla mikroskopisk fokus på isometriska beredningar, de används ofta för samtidig mätning av vaskulär reaktivitet och förändringar i vaskulär glatt muskulatur Ca2 +. Å andra sidan, är myogena aktiviteten bedöms bäst i trycksatta preparat som anses efterlikna in vivo fysiologiska tillstånd noga. En detaljerad genomgång av skillnaderna mellan dessa preparat är tidigare 19 tillhandahålls.

Sammanfattningsvis är tryck myography en pålitlig teknik för att studera myogenic svar i små resistenskärl vid nära fysiologiska betingelser. Trots sina begränsningar, har PM gett betydande bidrag till förståelsen av förändringar ikärlfunktionen under normala och patologiska tillstånd 3-7,20-23. Reglering av systemisk vaskulär tonen är mycket komplicerat och involverar lokala och neuro hormonella faktorer därmed isolera betydelsen av specifika mekanismer som reglerar tonen i kärlbäddar in vivo är svårt. I detta avseende, ex vivo trycksatta artärpreparat tjänar som utmärkta surrogat. De som är intresserade i överföringsmekanismer för MT och myogenic svar hänvisas till tidigare publicerade utmärkta recensioner 15,19. I framtiden kan vi se framsteg i utrustning som integrerar bedömning av myogenic svar och förändringar i efterföljande budbärare såsom Ca2 + men det är högst osannolikt att vi skulle få se en minskning av kostnaderna för utrustning. Men eftersom denna teknik har antagits av forskare med varierande bakgrund, kommer vi sannolikt att se sin ansökan att bedöma förändringar i mikrovaskulära funktion vid sjukdomar andra än högt blodtryck, diabetes och chock, såsom cirros, dementia etc.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författare har inga finansiella konflikter.

Acknowledgements

Sandeep Khurana stöds av NIH (K08DKO81479). Vikrant Rachakonda stöds av (T32DK067872).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemical
Acetylcholine Sigma Aldrich A6625
Calcium chloride (CaCl2) Sigma Aldrich 223506
D-(+)-Glucose Sigma Aldrich G5767
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetra acetic acid (EGTA) Sigma Aldrich E3889
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) Sigma Aldrich E9884
HEPES Sigma Aldrich H3784
Magnesium sulfate (MgSO4) Sigma Aldrich M7506
MOPS Sigma Aldrich M5162
Phenylephrine Sigma Aldrich P6126
Potassium chloride (KCl) Sigma Aldrich P3911
Potassium phosphate (KH2PO4) Sigma Aldrich P5655
Sodium bicarbonate (NaHCO3 ) Sigma Aldrich S6014
Sodium chloride (NaCl) Sigma Aldrich S7653
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma Aldrich S5881
Sodium nitroprusside Sigma Aldrich 13451
Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4) Sigma Aldrich S9638
Sodium pyruvate Sigma Aldrich P8574
Table 1.
Physiological salt solution (1,000 ml) mM
KCl 4.9 0.365 g
NaCl 112 6.545 g
MgSO4.7H2O 1.2 0.296 g
KH2PO4 1.2 0.163 g
Glucose 11.5 2.072 g
NaHCO3 26 2.184 g
HEPES 10 2.383 g
CaCl2 2 2 ml (1M stock)
De-ionized water 998 ml
Ca2+ free physiological salt solution (100 ml) mM
KCl 4.9 0.036 g
NaCl 112 0.645 g
MgSO4.7H2O 1.2 0.029 g
KH2PO4 1.2 0.016 g
Glucose 11.5 0.207 g
NaHCO3 26 0.218 g
HEPES 10 0.238 g
EGTA 0.39 0.015 g
Sodium nitroprusside 0.1 0.0026 g
De-ionized water 100 ml
Dissection solution, stock (500 ml) mM
NaCl 145 21.18 g
KCl 4.7 0.875 g
MgSO4 1.2 0.739 g
MOPS 2 1.049 g
EDTA 0.02 0.019 g
De-ionized water 500 ml
Working dissection solution (100 ml) mM
Dissection solution stock 20 ml
Glucose 1.2 0.091 g
NaH2PO4 5 0.016 g
Sodium pyruvate 2 0.022 g
CaCl2 2 0.2 ml (1M stock)
De-ionized water 79.8 ml
Table 2. Composition of Experimetnal solutions
Equipment
CCD Monochrome Camera The imaging Source DMK 21AU04
Single inline solution heater Warner Instruments 64-0102
Thermistor Warner Instruments 64-0108
Dual automatic temperature controller Warner Instruments TC-344B
Flaming/Brown micropipette puller Sutter Instruments P-97
Fluorescence System Interface IonOptix model FSI-700
Forceps and scissors World Precision Instruments
Ion Wizard-Core and Analysis IonOptix Ion Wizard 6.0
Laboratory tubing Silastic 508-005
Male Sprague Dawley rat Harlan Laboratories
Master flex console drive Cole-parmer
Milli-Q Plus Ultrapure Water System Millipore ZD5211584
Ophthalmic monofilament nylon suture Ethicon 9007G
Photometry and Dimensioning Microscope Motic AE31
Pressure Servo Controller with peristaltic pump and pressure transducer Living Systems Instrumentation PS-200
Stereomicroscope Nikon Instruments Inc SMZ660
Vessel Chamber Living Systems Instrumentation CH-1
Dissection dish Living Systems Instrumentation DD-90-S
Thin Wall Glass Capillaries World Precision Instruments TW120-6
Microforge Stoelting 51550
Table 3.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Christensen, K. L., Mulvany, M. J. Location of resistance arteries. J Vasc Res. 38, 1-12 (2001).
  2. Rietzschel, E. R. Oxidized low-density lipoprotein cholesterol is associated with decreases in cardiac function independent of vascular alterations. Hypertension. 52, 535-541 (2008).
  3. Hill, M. A., Ege, E. A. Active and passive mechanical properties of isolated arterioles from STZ-induced diabetic rats. Effect of aminoguanidine treatment. Diabetes. 43, 1450-1456 (1994).
  4. Osol, G., Cipolla, M. Interaction of myogenic and adrenergic mechanisms in isolated, pressurized uterine radial arteries from late-pregnant and nonpregnant rats. Am J Obstet Gynecol. 168, 697-705 (1993).
  5. Cipolla, M. J., McCall, A. L., Lessov, N., Porter, J. M. Reperfusion decreases myogenic reactivity and alters middle cerebral artery function after focal cerebral ischemia in rats. Stroke. 28, 176-180 (1997).
  6. Ren, Y., et al. Enhanced myogenic response in the afferent arteriole of spontaneously hypertensive rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298, H1769-H1775 (2010).
  7. Hayashi, K., Epstein, M., Saruta, T. Altered myogenic responsiveness of the renal microvasculature in experimental hypertension. J Hypertens. 14, 1387-1401 (1996).
  8. Schubert, R., Mulvany, M. J. The myogenic response: established facts and attractive hypotheses. Clin Sci (Lond). 96, 313-326 (1999).
  9. Bridges, L. E., Williams, C. L., Pointer, M. A., Awumey, E. M. Mesenteric artery contraction and relaxation studies using automated wire myography. J Vis Exp. (2011).
  10. Buus, N. H., Vanbavel, E., Mulvany, M. J. Differences in Sensitivity of Rat Mesenteric Small Arteries to Agonists When Studied as Ring Preparations or as Cannulated Preparations. British Journal of Pharmacology. 112, 579-587 (1994).
  11. Falloon, B. J., Stephens, N., Tulip, J. R., Heagerty, A. M. Comparison of small artery sensitivity and morphology in pressurized and wire-mounted preparations. Am J Physiol. 268, H670-H678 (1995).
  12. Schubert, R., Wesselman, J. P. M., Nilsson, H., Mulvany, M. J. Noradrenaline-induced depolarization is smaller in isobaric compared to isometric preparations of rat mesenteric small arteries. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 431, 794-796 (1996).
  13. Khurana, S., Raina, H., Pappas, V., Raufman, J. P., Pallone, T. L. Effects of deoxycholylglycine, a conjugated secondary bile acid, on myogenic tone and agonist-induced contraction in rat resistance arteries. PLoS One. 7, e32006 (2012).
  14. Bayliss, W. M. On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure. J Physiol. 28, 220-231 (1902).
  15. Hughes, J. M., Bund, S. J. Arterial myogenic properties of the spontaneously hypertensive rat. Exp Physiol. 87, 527-534 (2002).
  16. Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260, 617-619 (1976).
  17. Raina, H., Zacharia, J., Li, M., Wier, W. G. Activation by Ca2+/calmodulin of an exogenous myosin light chain kinase in mouse arteries. J Physiol. 587, 2599-2612 (2009).
  18. Fenger-Gron, J., Mulvany, M. J., Christensen, K. L. Mesenteric blood pressure profile of conscious, freely moving rats. J Physiol. 488, (Pt 3), 753-760 (1995).
  19. Davis, M. J., Hill, M. A. Signaling mechanisms underlying the vascular myogenic response). Physiol Rev. 79, 387-423 (1999).
  20. Osmond, J. M., Mintz, J. D., Dalton, B., Stepp, D. W. Obesity increases blood pressure, cerebral vascular remodeling, and severity of stroke in the Zucker rat. Hypertension. 53, 381-386 (2009).
  21. Ge, Y., et al. Endogenously produced 20-HETE modulates myogenic and TGF response in microperfused afferent arterioles. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 102-103, 42-48 (2013).
  22. Ryan, M. J., et al. Placental ischemia impairs middle cerebral artery myogenic responses in the pregnant rat. Hypertension. 58, 1126-1131 (2011).
  23. Bagi, Z., et al. Type 2 diabetic mice have increased arteriolar tone and blood pressure: enhanced release of COX-2-derived constrictor prostaglandins. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25, 1610-1616 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats