Beurteilung Myogenic Antwort und Vasoaktivität In Resistance Mesenterialarterien Mit Druck Myographie

1Section of Gastroenterology and Hepatology, Georgia Regents University, 2Division of Gastroenterology and Hepatology, University of Pittsburgh School of Medicine, 3Vascular Biology Center, Georgia Regents University
Published 7/06/2015
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Medicine

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Summary

Druck Myographie wird verwendet, um Vasoaktivität der kleinen Arterien, die anhaltende Verengung zu entwickeln, wenn unter Druck zu bewerten. Diese Handschrift ein detailliertes Protokoll, um in isolierten Segmenten der kleinen Mesenterialarterien von Ratten, Vasoaktivität und die Wirkung der intraluminale Druck auf die Gefäßdurchmesser zu bewerten.

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Jadeja, R. N., Rachakonda, V., Bagi, Z., Khurana, S. Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography. J. Vis. Exp. (101), e50997, doi:10.3791/50997 (2015).

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Abstract

Geringen Widerstand Arterien verengen und zu dilatieren bzw. in Reaktion auf erhöhte oder verringerte intraluminale Druck; Dieses Phänomen, das als myogene Reaktion bekannt ist ein Schlüsselregulator der lokalen Durchblutung. In isobar kleinen Widerstand Arterien anhaltend in Verengung als myogene Tonus (MT), die eine wichtige Determinante für den systemischen Gefäßwiderstand (SVR) ist bekannt. Daher ex vivo unter Druck stehende Präparate von kleinen Widerstand Arterien sind wichtige Werkzeuge, um mikrovaskulären Funktion in nahezu physiologische Zustände zu studieren. Um dies zu erreichen, wird eine frisch isolierte intakte Segment eines kleinen Widerstandsader (Durchmesser ~ 260 & mgr; m) auf beiden Glas Kanülen und unter Druck gelagert ist. Diese Arterienpräparate behalten die meisten in vivo Eigenschaften und Genehmigung Beurteilung der Gefäßtonus in Echtzeit. Hier bieten wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für die Beurteilung Vasoaktivität in Druck kleiner Widerstand Mesenterialarterien von Ratten; diese Arterien entwickelnpermanente Vasokonstriktion - etwa 25% des maximalen Durchmessers - wenn sie bei 70 mm Hg Druck. Diese arterielle Zubereitungen können verwendet werden, um die Wirkung der Verbindungen auf die experimentellen Verhältnis zwischen intra-arteriellen Blutdruck und Vasoaktivität untersuchen und zu bestimmen, Änderungen der mikrovaskulären Funktion in Tiermodellen von verschiedenen Krankheiten.

Introduction

Kleinen Widerstand Arterien sind entscheidend für SVR und spielen eine wichtige Rolle in der Pathophysiologie von vielen Krankheiten 1,2. Erkrankungen wie Diabetes 3, Schwangerschaft 4, Ischämie-Reperfusion 5, Fettleibigkeit und Bluthochdruck 6,7 werden häufig mit veränderten Mikrogefäßfunktion. Vascular Myographie können nicht nur wichtige Erkenntnisse über Änderungen der mikrovaskulären Funktion bei verschiedenen Krankheiten, sondern auch dazu beitragen, therapeutische Ziele und bewerten die Wirksamkeit von vasoaktiven Verbindungen. Kreislauf-Funktion wurde unter Verwendung von isolierten kleinen Arterien unter isometrischen oder isobaren Bedingungen Gefäß 8 untersucht. Detaillierte Beschreibung der isometrischen Myographie anderswo 9 vorgesehen. Jedoch gibt es Unterschiede in den Daten aus isometrischen gegen isobaren Präparationen 10-12 erhalten. Da unter Druck Arterienpräparate erlauben die Untersuchung der mikrovaskulären Funktion in nahezu physiologischen Bedingungen, diegewonnenen Erkenntnisse können besser mit In-vivo-Verhalten der Gefäßbett 8,13 korrelieren.

Im Jahr 1902 die Wirkung von transmuralen Druck zuerst beschrieben Bayliss auf Gefäßdurchmesser 14. Er beobachtete, in kleinen Widerstand Arterien von verschiedenen vaskulären Betten von Kaninchen, Katzen und Hunden, die eine Abnahme des Drucks wurde durch Vasodilatation gefolgt, und eine Zunahme der Druck wurde durch Vasokonstriktion gefolgt. Dieses Phänomen ist als myogenen Reaktion bekannt. Bayliss und nachfolgende Forscher festgestellt, dass in isobaren Bedingungen geringen Widerstand Arterien entwickeln nachhaltige Verengung als MT 15,16 bekannt. Sowohl myogenen Antwort und MT kann durch Verwendung von Druck Myographie (PM) -Verfahren bewertet. PM wird in erster Linie verwendet, um Vasoaktivität der kleinen Arterien, Venen und anderen Fahrzeugen zu bestimmen. Neben der Beurteilung der Wirkung von vasoaktiven Verbindungen auf Gefäßdurchmesser, PM - wie der Name sagt - wird verwendet, um intravaskuläre Druck-vermittelte ch bewertenanges auf Gefäßdurchmesser. In den letzten Jahrzehnten Fortschritte in der Computer-Software, die eine verbesserte Videomikroskopie und Glaspipette Ziehen, haben PM leichter durchzuführen hat. Jedoch bleibt Dissektion von lebensfähigem intaktem Segmente kleiner Blutgefäße mühsam und manchmal schwierig. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur myogenen Reaktion in kleinen mesenterialen Widerstandsarterien von Ratten isoliert studieren.

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Protocol

Die hier gezeigten Beispiele sind aus Experimenten von IACUC in Georgia Regents Universität zugelassen - Protokoll Nr: # 2011-0408

1. Vorbereitung der Reagenzien

  1. Bereiten Sezieren Lösung Lager: Für 500 ml Stammlösung Dissektion (5x), lösen sich 21,18 g NaCl, 0,875 g KCl, 0,739 g MgSO 4, 1,049 g MOPS und 0,019 g EDTA in 450 ml Milli-Q-Wasser. PH-Wert auf 7,3 bis 7,4 unter Verwendung von 1 N NaOH. Stellen Sie die Lautstärke auf 500 ml mit Milli-Q-Wasser. Stammlösung kann bis zu 7-10 Tage gelagert werden. Siehe Tabelle 1 für eine Liste von Chemikalien und deren Anbieter. Siehe Tabelle 2 Konzentration in mM.
  2. Bereiten Sie Arbeits Dissektion Lösung: Bereiten Sie frische Arbeits Dissektion Lösung jeden Tag. Für 100 ml Arbeitslösung, aufzulösen 0,091 g Glucose, 0,016 g NaH 2 PO 4 und 0,022 g Natriumpyruvat in 79,8 ml Milli-Q-Wasser. 0,2 ml 1 M CaCl 2 und 20 ml Präparation Lösung Lager auf volu bringenmich zu 100 ml.
  3. Vorbereitung physiologische Salzlösung (PSS): Zu 1000 ml PSS herzustellen, löse 0,365 g KCl, 6.545 g NaCl, 0,296 g MgSO 4, 0,163 g KH 2 PO 4, 2,072 g Glucose, 2,184 g NaHCO 3 und 2,383 g in 950 ml HEPES Milli-Q-Wasser. PH-Wert auf 7,3 bis 7,4 unter Verwendung von 1 N NaOH. Stellen Sie die Lautstärke auf 1000 ml mit Milli-Q-Wasser. Entfernen 2 ml Lösung und ersetzen Sie sie mit 2 ml 1 M CaCl 2. (Frische PSS muss täglich hergestellt werden)
  4. Bereiten Calcium (Ca 2+) kostenlos PSS: Für 100 ml PSS ohne Ca 2+, lösen sich 0,036 g KCl, 0,654 g NaCl, 0,029 g MgSO 4, 0,016 g KH 2 PO 4, 0,207 g Glucose, 0,218 g NaHCO 3, 0,238 g HEPES, 0,015 g EGTA und 0,0026 g Natriumnitroprussid (SNP) in 95 ml Milli-Q-Wasser. PH-Wert auf 7,3 bis 7,4 unter Verwendung von 1 N NaOH. Stellen Sie die Lautstärke auf 100 ml mit Milli-Q-Wasser.

2. Herstellung von Glas Kanülen

  1. Ziehen Glaspipettenum die 100-150 um gekippt Kanülen mit einer Pipette Abzieher nach Herstellerrichtlinien zu erzeugen.
  2. Bevel die Glaskanüle Spitzen mit einem Mikroelektrodenschweißkantenformer, Feuer polieren sie und biegen Sie die Glaskanüle Tipps von ~ 45 ° unter Verwendung eines Hitzesonde.
  3. Laden Sie die Kanülen in die Mikropipette Halter und befestigen Sie die Mikropipette Halter an der Perfusionskammer.

3. Herstellung der Perfusionskammer

  1. Rinse Perfusionskammer mit Milli-Q-Wasser, gefolgt von Sezieren Lösung für jede 5 min. Laden Sie die Kammer mit 2 ml Lösung Dissektion.
  2. Saug-Dissektion Lösung durch die Kanüle mit 10 ml Spritze und füllen Sie sorgfältig die gesamte Kanüle und den beigefügten Schlauch blasenfrei. Absaugen vorsichtig, um die Erzeugung von Blasen zu verhindern.
  3. Bereiten Sie zwei Nähte mit einem halben Knoten jeweils mit stumpfen Pinzette. Da ophthalmische Monofilament Nylonnaht (10-0, 0,2 metrische) verwendet werden, um die Knoten, die nur vorzubereiten1-2 mm im Durchmesser, kann Dissektionsmikroskop benötigt.
  4. Visualisierung unter Dissektionsmikroskop Verwenden Dissektion Zange beide Kanülen mit teilweise geschlossenen Naht Knoten ein wenig weg von der Spitze zu laden. Später wurden diese Knoten wird vorsichtig auf die arterielle Durchbohrte Enden geschoben werden kann und vollständig geschlossen ist.

4. Sammlung von Mesenterialarterie Arcade von Sprague-Dawley Ratten

  1. Suchen Genehmigung der örtlichen Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) vor der Durchführung dieser Experimente. Haus Tiere in der Tierhaltung mit kontrollierter Temperatur und Beleuchtung und ermöglicht freien Zugang zu Wasser und einer kommerziellen Nagerfutter.
  2. Ratten anästhesiert durch intraperitoneale Injektion von Ketamin (80 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg). Bestätigen tiefer Narkose durch Zehen Prise und bei Bedarf weitere Anästhetika verabreichen.
  3. Nach der Bestätigung der chirurgischen Anästhesie, einschläfern das Tier durch Enthauptung. Folgen Sie AAALAC Richtlinien für utiLizing geeignete Methoden für die Tier Euthanasie.
  4. Verwenden Sie eine Dissektion Schere und eine Zange, eine Mittellinie Laparotomie vom Becken bis Brustbein durchzuführen. Dies wird in zwei Schritten: Zuerst die Haut einzuschneiden und zweiten, einzuschneiden die zugrunde liegende Muskelschicht. Es ist darauf zu achten, dass die intra-abdominalen Organe verletzen werden.
  5. Schneiden Sie das proximale Ende des Darms in der Nähe des Pylorus und das distale Ende in der Nähe des ileo-cecal Kreuzung. Binden Sie beide Enden getrennt des Lecks der Chymus und Kot wodurch Kontamination der extrazellulären Badlösung zu verhindern. Einzuschneiden Mesenterium an seiner Basis in der Nähe des Futtergefäß dh A. mesenterica superior und überweisen Sie den gesamten Dünndarm-mesenterica Bett in ein 50 ml Becherglas mit eiskaltem Sezieren Lösung.
  6. Erlauben gewonnene Gewebe in eiskaltes Dissektion Lösung für 5 Minuten bleiben und spülen Sie mit frischem Dissektion Lösung loswerden Blut zu bekommen.

5. Isolierung und Kanülierung von 4 th

  1. Festzunageln das proximale Ende des Darms auf der rechten Seite in einem Sylgard-beschichtete Schale. Verlängern Sie die verbleibenden Darm in einer gegen den Uhrzeigersinn Weg, Pinning das Segment unten, um die Mesenterium verteilt und das Aussetzen der Blutgefäße (Abbildung 1). Beachten Sie: Sie isolieren arterielle Segmente bei Raumtemperatur. Ansonsten legen wir mesenterica Arcade-Schüssel auf Eis enthält. Einige Labors, einschließlich derjenigen, an unserer Hochschule, verwenden Kühleinheiten zu Arterien bei 4 ° C zu sezieren.
  2. Unter einem Stereo-Zoom-Mikroskop sezieren 3. und 4. Ordnung kleinen Mesenterialarterien (~ 260 & mgr; m), die parallel zu den Dünndarm mit einer kleinen Schere. Erste sezieren entfernt all die Abdeckung Fett. Dann sezieren die Vene und zu isolieren, die Arterie mit V-förmigen Verzweigungspunkt. Achten Sie darauf, um das ausgewählte Segment zu punktieren. Starten Sie sezieren das Fett in der Nähe eines 2. Ordnung Zweig und finden Sie den Weg zu 3. oder 4. order Gefäße.
    1. Hinweis: Arterien und Venen können auf der Grundlage ihrer Wandstärke unterscheiden - Arterienwand dicker als die Vene. Außerdem, wenn angrenzende Bindegewebe sanft senkrecht zur Gefäße, Venen Zusammenbruch leicht, während Arterien nicht gezogen. Seit Arterien mit Lumendurchmesser <400 & mgr; m großen Standorten der systemischen Gefäßwiderstand, für dieses Protokoll verwendeten wir 4. Ordnung Ratte Mesenterialarterien (Lumendurchmesser <300 & mgr; m).
  3. Isolieren einer 4-5 mm Schnitt der Arterie parallel an den Dünndarm. Visualisieren Sie alle 5. Ordnung Branchen Einbettung in Dünndarm und schneiden Sie sie leicht von der Herkunft der Filialen und einen Teil zu bewahren. Diese erhaltenen Teile der Äste dienen als Haltestellen (mit Dissektion Zange) für die Übertragung von arteriellen Segmenten zu einer Perfusionskammer und anschließend führen ihre Kanülierung.
  4. Dann schneiden Sie die arterielle Segmente, indem sie 2 Einschnitte distal5. Um Zweige auf jeder Seite der Arterie und überträgt es auf der Perfusionskammer (siehe Abbildung 1C und Legende).
  5. Kanülieren einem Ende der Gefäße auf einem Glas-Mikropipette (Durchmesser: 100 bis 150 & mgr; m) mit einer Pinzette Dissektion, indem die Spitzen der Arteriensegment mit Dissektion Pinzette. Schieben Sie den zuvor geladenen teilweise geschlossene Naht auf den kanülierten Ende und sichern. Hinweis: Das proximale Ende der Arterie kann auf die Glaskanüle, die servo-gesteuerten Druckregeleinrichtung verbunden ist, um in situ-Umgebung nachahmen kanüliert werden.
  6. Anhängen einer Präparierlösung geladen 10 ml Spritze mit dem Sperrhahn in diese Kanüle, so daß Präparierlösung im Schlauch verbindet die Kanüle und Hahn übergeht, daß in der Spritze verbunden ist. Erhöhen Sie vorsichtig die Spritze. Die Gravitationskraft auf die Lösung, die intra vaskulären Blut von dem offenen Ende des Behälters zu entfernen. Nach dem Entfernen der intraarterieller BlutSchließen Sie den Wasserhahn.
    Hinweis: Alternativ legen Sie den Wasserhahn, um den Druckregler, einschalten und vorsichtig erhöhen den Druck auf 5-10 mm Hg, um das gleiche Ergebnis zu erzielen.
  7. Binden das distale Ende der Gefäße auf eine zweite Glaskanüle durch vorsichtiges Bringen des anderen Kanüle so dicht wie möglich an der ungebundene Ende des Arteriensegment. Schieben Sie den zuvor geladenen teilweise geschlossene Naht auf den kanülierten Ende und sichern. Es muss darauf geachtet nicht zu zerren oder zu ziehen auf den arteriellen Segmenten werden. Stellen Sie sicher, dass Hähne auf beide Kanülen angebracht sind geschlossen.
  8. Übertragen Perfusionskammer auf der Stufe der inversen Mikroskop mit Live-Videoaufzeichnungsgeräte.
  9. Schließen Sie den Absperrhahn der Kanüle mit dem proximalen Ende der arteriellen Segment zu einem servogesteuerten Druckregelgerät gebunden und stellen Sie sicher, dass Hahn in die andere Kanüle befestigt bleibt geschlossen, um eine stabile intraluminale Druck aufrecht zu erhalten.
  10. Als nächstes befestigen Sie den Vakuumschlauch, um die Ansaugöffnung einnd der Infusionsschlauch an die Perfusionsöffnung der Kammer.
    Hinweis: abgeschrägte Nadel-Port wird für Saug- und stumpfen Nadel-Port für die Perfusion verwendet.
  11. Beginnen Perfusion Gefäß mit warmem PSS durch Einreihen-Lösung Heizer (37 ° C, wobei Gasgemisch äquilibriert: 5% CO 2, 5% O 2 und 90% N auf einen neutralen pH und eine angemessene Sauerstoffversorgung 17 zu erhalten) bei 2 ml / min unter Verwendung von eine peristaltische Pumpe. Drehen Sie das Vakuum auf auch. Legen Sie einen Thermistor in der Kammer auf Temperatur kontinuierlich zu überwachen.
  12. Als die Temperatur der PSS in der Kammer nähert ~ 37 ° C (in der Regel innerhalb von 5 min), langsam steigern intraluminale Druck von 20 bis 100 mmHg und überprüfen Schiffe auf Dichtheit. Dies wird mit Hilfe der automatischen Druckeinstellung des Druckreglers erfolgen. Entsorgen Sie Gefäße mit Leck und Ersetzen mit einem anderen Segment. Die Schiffe mit Leckagen nicht in der Lage, um den Druck zu halten.
  13. Beurteilen Sie die arterielle Segment biegt, während der Druck bei 100 mmHg beibehalten.Mit der Schraube-Hebel, bewegen Sie die Kanüle, um den arteriellen Segment zu begradigen. Nicht zu strecken die arterielle Segmente; das Ziel ist, in vivo arteriellen Segmentlänge zu imitieren.
  14. Reduzieren Sie den Druck auf 70 mmHg (in vivo Druck im mesenterialen arcade 18 imitieren) und lassen Sie den arteriellen Segment zu stabilisieren und zu entwickeln myogenic Ton. Arterien variabel (40-70 mmHg) nach Versuchsstrategie und Gefäßbett unter Druck gesetzt werden. Ein zuvor veröffentlichten Aufsatz gibt einen hervorragenden Überblick über die Variabilität in MT in arterielle Segmente aus verschiedenen Gefäßbetten 8.

6. Messung der Arteriendurchmesser

  1. Ansicht Arterien 10X-Objektiv auf einem Mikroskop mit einem Schwarzweiß-Videoladungsgekoppelte Einrichtung Kamera ausgestattet. Messen Lumendurchmesser mit Hilfe von Video-Framegrabber und Echtzeit-Rand-Erkennungssystem. Eine Liste von Geräten verwendet wird, die in Tabelle 3 vorgesehen.
  2. Überwachung und Aufzeichnung Gefäß diameter kontinuierlich.
  3. Beachten Sie für die Entwicklung von MT. Hinweis: Es wird festgestellt, dass bei Ratten mesenterischen Arterien Widerstand bei 70 mmHg, Entwicklung von MT wird von ~ 20% Abnahme des Durchmessers gekennzeichnet. MT variiert je nach Gefäßbett und Tierarten.
  4. Bestätigen Gefäß Lebensfähigkeit durch die Beurteilung Vasokonstriktor und gefäßerweiternde Reaktionen auf 1 uM Phenylephrin (Phe) und 1 & mgr; M Acetylcholin (ACh).
  5. Am Ende jedes Experiments bestimmen passive Durchmesser (PD) durch Inkubation von Arterien in Ca 2+ -freiem PSS für 20 min.

7. Myogenic Antwort

  1. Reduzieren Sie den Druck auf 20 mm Hg und damit der Durchmesser zu stabilisieren. Erhöhen Sie die intraluminale Druck in kleinen Schritten (20, 40, 60, 80 und 100) und bei jeder Druckstufe ermöglichen Arterien, um eine stabile Durchmesser (in der Regel innerhalb von 5 Minuten) zu erreichen.
  2. Reduzieren Sie die intraluminale Druck auf 20 mmHg und Inkubation des arteriellen Segment in Ca 2+ -freien PSS enthält 0,39 mMEGTA und 0,1 mM SNP. Ermöglichen die arterielle Durchmesser zu stabilisieren (normalerweise 15 min).
  3. Wiederholen Sie den Drucksprungantwort in Ca 2+ -freien PSS enthält 0,39 mM EGTA und 0,1 mM SNP.

8. Interpretation der Ergebnisse und Berechnung von Daten

  1. Berechnen Sie die MT als die prozentuale Differenz der für Ca 2+ beobachtet Durchmesser enthaltenden gegen Ca 2+ -freien PSS bei jedem Druck nach folgender Berechnung:
    Gleichung 1
  2. Für Arterien unterziehen Gefäßbewegung des Durchmessers kann durch Mittelung der Plateauphase 1 min berechnet werden. Exprimieren die gesammelten Daten als Prozent der maximalen Erholung (% PD) gemäß der Beziehung:% PD = 100 x [& Delta; D / PD]; & Delta; D die Differenz zwischen dem Durchmesser vor und nach der Zugabe von jedem Untersuchungswirkstoff (z Phe); PD ist passive Durchmesser (auch diemaximaler Durchmesser).

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Representative Results

Schematische Darstellung eines typischen Druck Myographions Aufbau ist in Abbildung 1 dargestellt. Die beiden Enden des Schiffes sind mit einer Glasmikropipette kanüliert und mit Nähten auf beiden Seiten gesichert. Über eine Rohrleitung und einer offenen Absperrhahn wird eine Kanüle in eine servogesteuerte Druckregler verbunden ist; die andere Kanüle in einen geschlossenen Absperrhahn verbunden. Die Kammer ist mit PSS und Gefäßdurchmesser Änderungen werden durch ein umgekehrtes Mikroskop, um eine CCD-Kamera verbunden ist beobachtet perfundiert.

Die arterielle Segment bei 70 mmHg Druck in frisch hergestellten warmen PSS, die durch die arterielle Kammer bei 2-4 ml / min fließt und abgesaugt inkubiert. Arterielle Durchmesser wird überwacht und aufgezeichnet mit Videomikroskopie und Kantenerkennungssoftware. Nach ~ 40 min, verengen Arteriensegmente spontan von 20-40% ihrer Ausgangsdurchmesser (2A). In unseren Händen verengen kleine Ratte Widerstand Arterien um 25-30% (Durchschnitts varies gemäß den Einstellungen, Operator und arteriellen Bett). Dann wird Funktionsfähigkeit von gefäßerweiternden und vasokonstriktorische Reaktion auf ACh (1 uM) und Phe (1 uM), bzw. (2A) bestimmt. Während andere Vasodilatoren verwendet werden, ACh induziert endothelabhängige Vasodilatation und somit sind nützlich, um sowohl endotheliale als auch die glatte Gefäßmuskulatur Lebensfähigkeit. Anschließend wird der arterielle Segment in PSS wieder inkubiert und einmal der Durchmesser stabilisiert, bereit für Experiment ist es. Am Ende jedes Experiments sind arterielle Segmente in Ca 2+ frei PSS inkubiert PD (2B) zu messen. Die in 2A und 2B aufgezeichnet Durchmesser werden in 2C tabelliert. Absolute MT ist die Differenz zwischen PD und stabile Durchmesser bei einer spontanen Vasokonstriktion bei 70 mmHg erreicht. Daher ist die von der gezeigten Verfolgungs beobachtet MT 33% PD. Wie hier zu sehen ist, als Reaktion auf ACh (1 & mgr; M) ist ge nerally ähnlich dem für freie Ca 2+ PSS beobachtet. Man beachte, daß in Versuchen die Beurteilung Vasodilatation vor Zugabe eines Vasokonstriktors erforderlich sein.

Zu myogenen Antwort zu bestimmen, werden Ratten- mesenterialen arteriellen Segmente zur Erhöhung intraluminale Druck Stufen zwischen 20 und 100 mmHg unterworfen. Ein Beispiel ist in 3A gezeigt. Die Arterien sind erlaubt, um einen stabilen Durchmessers nach jedem Schritt (~ 5 min; gestrichelte Linien) zu erzielen. Anschließend wurde dieselbe arterielle Segment mit Druckantwort in Ca 2+ mit 0,39 mM EGTA und 0,1 mM SNP (3A) unterworfen -freien PSS. Die am Ende jeder Druckstufe erreicht Durchmesser kann als ein Liniendiagramm (3B) dargestellt werden. MT berechnet als die prozentuale Differenz im Durchmesser für Ca 2+ -enthaltenden vs. Ca 2+ -freien PSS bei jedem Druck kann als Linien- oder Balkendiagramm (3C) angezeigt.

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Abbildung 1: Eine Abbildung der Druck Myographions Aufbau (A) Die wichtigsten Komponenten werden angezeigt.. Siehe Tabelle 3 für eine Liste aller Geräte. (B) Die geernteten mesenterica Bett auf einem Sylgard-beschichtete Schale festgesteckt wird angezeigt. (C) Eine Karikatur mesenterialen arteriellen Arkade gezeigt. Schwarze Punkte stellen Stiftpositionen. Die gestrichelten Abschnitt stellt eine arterielle Segment zu seziert werden. Kleine grüne Balken zeigen die Schnittstellen auf der Arterie. Klicken Sie hier, um größere Abbildung zu sehen .

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Abbildung 2: (A) Wie in der Ablaufverfolgung angezeigt, Durchmesser kleiner mesenterischen Arterien von Ratten, wenn sie bei 70 mm Hg Druck, nimmt spontan. Zugabe von ACh (1 uM) erhöhten Durchmessers (bis nahen Ausgangsdurchmesser). Zugabe von Phe (1 uM), um Gewebebad abnimmt Arteriendurchmessers. (B) Inkubation in Ca 2+ -freien PSS erhöht arteriellen Durchmessers. (C) Der Durchmesser eines einzelnen druckbeaufschlagten Arteriensegment in verschiedenen in A gezeigt perfusates und B aufgeführt.

Figur 3
Figur 3: (A) Arterielle Durchmesser kontinuierlich gleichzeitiger Erhöhung der intraluminale Druck inkrementell in Gegenwart von PSS und Ca 2+ -freiem zeichnetenPSS. (B) Kurve der arteriellen Durchmesser an der jeder Druckstufe erreicht. (C) Bar Graph der MT erreicht bei jeder Druckstufe. Klicken Sie hier, um größere Abbildung zu sehen .

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Discussion

Kritischen Schritte, Fehlersuche und Änderungen

In einem typischen isobaren Gefäß Vorbereitung wird die Arterie bei 70 mmHg zwischen zwei Glas Kanülen mit warmem (37 ° C) PSS perfundiert Druck gesetzt. Nach 30-45 min, Arterien entwickeln MT, gekennzeichnet durch spontane Abnahme des Durchmessers, die in 20-30 Minuten stabilisiert. Die Widerstandsarterien aus verschiedenen Gefäßbetten entwickeln variablen MT. Zum Beispiel Ratte Widerstand Mesenterialarterien entwickeln MT ~ 25% der PD, während cremastric Arterien MT ~ 40% der PD zu erreichen. Arterien, die MT nicht entwickeln innerhalb von 60 min zu verwerfen; diese Dauer kann je nach Gefäßbett und Arten variieren. Arterien mit unzureichendem Ansprechen auf Phe und ACh auch verworfen werden.

pH-Wert und Temperatur des PSS haben einen signifikanten Einfluss auf die Entwicklung der MT. pH-Wert der PSS, die über lange Zeiträume ohne Belüftung sitzt, kann sich erhöhen. Zusätzlich bei Raumtemperatur Arterien unwahrscheinlich develop MT. Daher der PSS sollte so schnell wie möglich unter Verwendung der im Protokollabschnitt und der Temperatur der Perfusionskammer angegebenen Gasgemisch ständig zu überwachen und bei ~ 37 ° C unter Verwendung eines Durchlauferhitzers aufrechterhalten werden belüftet werden.

Da diese Experimente sind 3-5 Stunden Dauer werden Perfusionskammern und die damit verbundenen Schlauch an PSS für längere Zeit ausgesetzt ist; Salz-Ausscheidungen können sowohl in der Kammer und Schläuche, die mit nachfolgenden Experimenten stören können zu bauen. Daher ist es wichtig, die Perfusionskammer gründlich waschen und spülen Sie den Schlauch mit entionisiertem Wasser nach jedem Experiment. Ebenso ist darauf zu gut säubern Sylgard-beschichtete Schale für die Präparation mit entionisiertem Wasser nach jeder Präparation verwendet werden.

Begrenztheit

Trotz ihrer Bedeutung hat PM verschiedenen Einschränkungen. Erstens, die kollektiven Kosten zu beschaffen PM Ausrüstung ist hoch (~ 22.000 $) und kann unerschwinglich für bestimmte la seinbs; Eine detaillierte Aufstellung der Geräte sind in Tabelle 3 dargestellt Zweitens werden neue Schiffe für die meisten Experimente nötig. somit ein neues Tier wird für jedes Experiment euthanasiert, was zu den Gesamtkosten. Drittens Dissektion der kleinen Mesenterialarterien ist mühsam und erfordert andere Instrumente wie Dissektionsmikroskop und Mikrodissektion Werkzeuge, die anfällig für Schäden sind. Viertens gibt es eine Lernkurve; Gewinnung Expertise in und Gründung PM in einem Labor erfordert engagiertes Personal, Zeit und Mühe.

Signifikanz in Bezug auf andere Verfahren und zukünftige Anwendungen

Isobar und isometrische experimentelle Protokolle sind zwei wichtige Ansätze verwendet werden, um vaskuläre Reaktivität zu bestimmen. Im Gegensatz zu den Isobaren Vorbereitungen wird Vasoaktivität in isometrische Vorbereitungen durch Messung der glatten Gefäßmuskelspannung mit einer Draht Myographions System bestimmt. Neben den Unterschieden in der Ausrüstung für diese zwei experimentellen Protokollen erforderlich, Agonist-induced Kontraktion unterscheidet sich unter diesen experimentellen Ansätzen in Bezug auf Größe, Zeitverlauf und die Richtung der Gefäßwandspannung 11,19. Aufgrund technischer Komfort und Grenzen, beide Präparate dienen eine wichtige Rolle. Zum Beispiel, weil es einfacher ist, mikroskopische Schwerpunkt isometrische Zubereitungen zu erhalten, werden sie häufig zur gleichzeitigen Messung der vaskulären Reaktivität und Veränderungen in der vaskulären glatten Muskulatur Ca 2+ eingesetzt. Andererseits wird myogene Aktivität am besten in Druckpräparate, die als in vivo physiologischen Zustand genau imitieren beurteilt. Eine detaillierte Übersicht über Unterschiede zwischen diesen Vorbereitungen wird zuvor 19 zur Verfügung gestellt.

Zusammenfassend ist Druck Myographie eine zuverlässige Technik zur myogenen Antwort in geringen Widerstandsgefäße bei nahezu physiologischen Bedingungen zu studieren. Trotz der Einschränkungen, hat PM bedeutende Beiträge zum Verständnis der Veränderungen in der vorgesehenenKreislauf-Funktion in normalen und pathologischen Bedingungen 3-7,20-23. Regulierung der systemischen Gefäßtonus ist sehr komplex und beinhaltet lokale und neuro-hormonelle Faktoren daher zu isolieren die Rolle der spezifischen Mechanismen der Ton der Gefäßbetten in vivo ist schwierig. In dieser Hinsicht ex vivo unter Druck arteriellen Präparate dienen als ausgezeichnete Surrogate. Wer sich für die Übertragungsmechanismen von MT und myogene Reaktion sind bisher veröffentlichten exzellenten Kritiken 15,19 bezeichnet. In der Zukunft können wir Fortschritte in der Ausrüstung, die Beurteilung der myogenen Reaktion und Veränderungen in der nachgeschalteten Botenstoffe, wie beispielsweise Ca 2+ zu integrieren, obwohl es sehr unwahrscheinlich ist, dass wir eine Reduzierung der Anlagenkosten zu sehen. Da diese Technik wird von Wissenschaftlern mit abwechslungsreichen Hintergrund angenommen, werden wir wahrscheinlich sehen ihre Anwendung auf Änderungen in der mikrovaskulären Funktion in Krankheiten außer Bluthochdruck, Diabetes und Schock wie Leberzirrhose, de bewertenDemenz usw.

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Disclosures

Autoren haben keine finanziellen Konflikte.

Acknowledgements

Sandeep Khurana wird durch NIH (K08DKO81479) unterstützt. Vikrant Rachakonda durch (T32DK067872) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemical
Acetylcholine Sigma Aldrich A6625
Calcium chloride (CaCl2) Sigma Aldrich 223506
D-(+)-Glucose Sigma Aldrich G5767
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetra acetic acid (EGTA) Sigma Aldrich E3889
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) Sigma Aldrich E9884
HEPES Sigma Aldrich H3784
Magnesium sulfate (MgSO4) Sigma Aldrich M7506
MOPS Sigma Aldrich M5162
Phenylephrine Sigma Aldrich P6126
Potassium chloride (KCl) Sigma Aldrich P3911
Potassium phosphate (KH2PO4) Sigma Aldrich P5655
Sodium bicarbonate (NaHCO3 ) Sigma Aldrich S6014
Sodium chloride (NaCl) Sigma Aldrich S7653
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma Aldrich S5881
Sodium nitroprusside Sigma Aldrich 13451
Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4) Sigma Aldrich S9638
Sodium pyruvate Sigma Aldrich P8574
Table 1.
Physiological salt solution (1,000 ml) mM
KCl 4.9 0.365 g
NaCl 112 6.545 g
MgSO4.7H2O 1.2 0.296 g
KH2PO4 1.2 0.163 g
Glucose 11.5 2.072 g
NaHCO3 26 2.184 g
HEPES 10 2.383 g
CaCl2 2 2 ml (1M stock)
De-ionized water 998 ml
Ca2+ free physiological salt solution (100 ml) mM
KCl 4.9 0.036 g
NaCl 112 0.645 g
MgSO4.7H2O 1.2 0.029 g
KH2PO4 1.2 0.016 g
Glucose 11.5 0.207 g
NaHCO3 26 0.218 g
HEPES 10 0.238 g
EGTA 0.39 0.015 g
Sodium nitroprusside 0.1 0.0026 g
De-ionized water 100 ml
Dissection solution, stock (500 ml) mM
NaCl 145 21.18 g
KCl 4.7 0.875 g
MgSO4 1.2 0.739 g
MOPS 2 1.049 g
EDTA 0.02 0.019 g
De-ionized water 500 ml
Working dissection solution (100 ml) mM
Dissection solution stock 20 ml
Glucose 1.2 0.091 g
NaH2PO4 5 0.016 g
Sodium pyruvate 2 0.022 g
CaCl2 2 0.2 ml (1M stock)
De-ionized water 79.8 ml
Table 2. Composition of Experimetnal solutions
Equipment
CCD Monochrome Camera The imaging Source DMK 21AU04
Single inline solution heater Warner Instruments 64-0102
Thermistor Warner Instruments 64-0108
Dual automatic temperature controller Warner Instruments TC-344B
Flaming/Brown micropipette puller Sutter Instruments P-97
Fluorescence System Interface IonOptix model FSI-700
Forceps and scissors World Precision Instruments
Ion Wizard-Core and Analysis IonOptix Ion Wizard 6.0
Laboratory tubing Silastic 508-005
Male Sprague Dawley rat Harlan Laboratories
Master flex console drive Cole-parmer
Milli-Q Plus Ultrapure Water System Millipore ZD5211584
Ophthalmic monofilament nylon suture Ethicon 9007G
Photometry and Dimensioning Microscope Motic AE31
Pressure Servo Controller with peristaltic pump and pressure transducer Living Systems Instrumentation PS-200
Stereomicroscope Nikon Instruments Inc SMZ660
Vessel Chamber Living Systems Instrumentation CH-1
Dissection dish Living Systems Instrumentation DD-90-S
Thin Wall Glass Capillaries World Precision Instruments TW120-6
Microforge Stoelting 51550
Table 3.

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References

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