Vurdere myogenic Response og vasoactivity I Resistance tarmens arterier Bruke Trykk Myography

1Section of Gastroenterology and Hepatology, Georgia Regents University, 2Division of Gastroenterology and Hepatology, University of Pittsburgh School of Medicine, 3Vascular Biology Center, Georgia Regents University
Published 7/06/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Trykk myography brukes til å vurdere vasoactivity av små arterier som utvikler vedvarende innsnevring når trykk. Dette manuskriptet gir en detaljert protokoll for å vurdere i isolerte segmenter av små mesenteriske arterier fra rotte, vasoactivity og effekten av intraluminal press på vaskulær diameter.

Cite this Article

Copy Citation

Jadeja, R. N., Rachakonda, V., Bagi, Z., Khurana, S. Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography. J. Vis. Exp. (101), e50997, doi:10.3791/50997 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Liten motstand arterier seg sammen og utvider seg henholdsvis i respons til økt eller redusert intraluminale trykk; Dette fenomen kjent som myogenisk reaksjon er en viktig regulator for lokal blodstrøm. I isobariske betingelser liten motstand arterier utvikler vedvarende innsnevring kjent som myogenisk tone (MT), som er en viktig determinant for systemisk vaskulær resistens (SVR). Derfor ex vivo trykk preparater av små motstandsarterier er viktige verktøy for å studere mikrovaskulær funksjon i nær-fysiologiske tilstander. For å oppnå dette, er en nylig isolert intakt segment av en liten motstand arterie (diameter ~ 260 mikrometer) som er montert på to små glass kanyler og trykk. Disse arterielle forberedelser beholde mest in vivo egenskaper og tillatelse vurdering av vaskulær tone i sanntid. Her gir vi en detaljert protokoll for vurdering vasoactivity i trykk små motstand tarmens arterier fra rotter; disse arteriene utviklervedvarende vasokonstriksjon - ca 25% av maksimal diameter - når trykksatt til 70 mmHg. Disse arterielle preparater kan anvendes for å studere effekten av investigational forbindelser på forholdet mellom intra-arterielt trykk og vasoactivity og bestemme endringer i mikrovaskulær funksjon i dyremodeller av ulike sykdommer.

Introduction

Liten motstand arterier er viktige determinanter av SVR og spiller en viktig rolle i patofysiologien av mange sykdommer 1,2. Tilstander som diabetes 3, graviditet 4, ischemi-reperfusjon 5, fedme og høyt blodtrykk 6,7 er ofte assosiert med endret mikrovaskulær funksjon. Vaskulær myography kan ikke bare gi viktig innsikt i endringer i mikrovaskulær funksjon i ulike sykdommer, men også bidra til å identifisere terapeutiske mål og evaluere effekten av vasoaktive forbindelser. Vaskulær funksjon har blitt undersøkt ved hjelp av isolerte små arterier henhold isometriske eller isobariske fartøyet forhold åtte. Detaljert beskrivelse av isometrisk myography er gitt andre steder ni. Men det er forskjeller i data innhentet fra isometrisk versus isobariske forberedelser 10-12. Siden trykk arterielle preparater tillater studiet av mikrovaskulær funksjon i nær fysiologiske forhold,innhentet funn kan korrelere bedre med in vivo oppførselen til karseng 8,13.

I 1902 Bayliss først beskrevet effekten av transmural press på vaskulær diameter 14. Han observerte i liten motstand arterier fra forskjellige vaskulære sjikt av kaniner, katter og hunder som en reduksjon i trykk ble etterfulgt av vasodilatasjon, og en økning i trykket ble etterfulgt av vasokonstriksjon. Dette fenomenet er kjent som myogenic respons. Bayliss og påfølgende etterforskere observert at i isobariske forholdene liten motstand arterier utvikle vedvarende innsnevring kjent som MT 15,16. Både myogenisk respons og MT kan vurderes ved hjelp av trykk myography (PM) teknikk. PM er først og fremst brukes til å bestemme vasoactivity av små arterier, vener og andre fartøy. I tillegg til å vurdere effekten av vasoaktive forbindelser på vaskulær diameter, PM - som navnet indikerer - brukes for å vurdere intravaskulære trykk-mediert changes på vaskulær diameter. I løpet av de siste tiårene fremskritt innen programvare, som forbedret videomikroskopi og glass pipette trekke, har gjort PM lettere å utføre. Men disseksjon av levedyktige intakte segmenter av små blodkar forblir kjedelig og noen ganger utfordrende. Her vil vi skissere en detaljert protokoll for å studere myogenic respons i små mesenteriske motstand arterier isolert fra rotter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Eksemplene vist her er fra eksperimenter godkjent av IACUC ved Georgia Regents University - protokoll: # 2011-0408

1. Utarbeidelse av reagenser

  1. Forbered disseksjon løsning lager: For 500 ml lager disseksjon løsning (5x), oppløse 21,18 g NaCl, 0,875 g KCl, 0,739 g MgSO4, 1,049 g MOPS og 0,019 g EDTA i 450 ml Milli-Q vann. Juster pH til 7,3 til 7,4 ved anvendelse av 1 N NaOH. Gjør opp volumet til 500 ml med Milli-Q vann. Stamløsning kan lagres opp til 7-10 dager. Se tabell 1 for en liste over kjemikalier og deres leverandører. Se tabell 2 for konsentrasjonen i mM.
  2. Forbered arbeider disseksjon løsning: Forbered fersk arbeids disseksjon løsning hver dag. For 100 ml arbeidsoppløsning, oppløse 0,091 g glukose, 0,016 g NaH 2PO 4 og 0,022 g natrium-pyruvat i 79,8 ml av Milli-Q-vann. Legg 0,2 ml 1M CaCl 2 og 20 ml disseksjon løsning lager for å bringe volumeg til 100 ml.
  3. Forbered fysiologisk saltløsning (PSS): For å forberede 1000 ml PSS, oppløse 0,365 g KCl, 6,545 g NaCl, 0,296 g MgSO4, 0,163 g KH 2 PO 4, 2,072 g glukose, 2,184 g NaHCO3 og 2,383 g HEPES i 950 ml av Milli-Q vann. Juster pH til 7,3 til 7,4 ved anvendelse av 1 N NaOH. Gjør opp volumet til 1000 ml med Milli-Q vann. Fjern 2 ml oppløsning og erstatte den med 2 ml 1 M CaCl 2. (Frisk PSS må være forberedt daglig)
  4. Forbered kalsium (Ca 2+) gratis PSS: For 100 ml PSS uten Ca 2+, oppløse 0,036 g KCl, 0,654 g NaCl, 0,029 g MgSO4, 0,016 g KH 2 PO 4, 0,207 g glukose, 0,218 g NaHCO3, 0,238 g HEPES, 0,015 g EGTA og 0,0026 g Natriumnitroprussid (SNP) i 95 ml av Milli-Q-vann. Juster pH til 7,3 til 7,4 ved anvendelse av 1 N NaOH. Gjør opp volumet til 100 ml med Milli-Q vann.

2. Utarbeidelse av Glass kanyler

  1. Trekk glass pipetterå generere 100-150 mikrometer tippet kanyler ved hjelp av en pipette puller som per produsentens retningslinjer.
  2. Bevel glass kanyle tips ved hjelp av en microelectrode beveller, brann polere dem og bøye glass kanyle tips av ~ 45 ° ved hjelp av en varmekilde probe.
  3. Laste kanyler inn mikropipette holderen og fest mikropipette holder på å perfusjon kammeret.

3. Utarbeidelse av Perfusjons Chamber

  1. Skyll perfusjon kammer med Milli-Q-vann, etterfulgt av disseksjon oppløsningen i 5 minutter hver. Laste kammer med 2 ml disseksjon løsning.
  2. Suge disseksjon løsning gjennom kanylen ved bruk av 10 ml sprøyte og fyll forsiktig hele kanylen og den vedlagte slangen uten bobler. Påfør sug forsiktig for å hindre dannelse av bobler.
  3. Forbered to sting på halv knute hver med butte pinsett. Siden oftalmiske monofilament nylon suturer (10-0, 0,2 metrisk) blir brukt for å fremstille de knuter som bare1-2 mm i diameter, kan disseksjon mikroskop være nødvendig.
  4. Visual etter disseksjon mikroskop, bruker disseksjon pinsett til å laste begge kanyler med delvis lukkede sutur knop litt vekk fra spissen. Senere disse knop vil skyves forsiktig inn de kanylert arterielle endene og lukkes helt.

4. Innsamling av arteria mesenterica Arcade fra Sprague-Dawley Rats

  1. Søke godkjenning av den lokale Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) før du utfører disse eksperimentene. Huset dyrene i dyre anlegg med kontrollert temperatur og belysning og tillate fri tilgang til vann og en kommersiell gnagerfor.
  2. Bedøve rotter ved intraperitoneal injeksjon av ketamin (80 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg). Bekreft dyp anestesi ved tå-pinch og om nødvendig Administrer ekstra bedøvelse.
  3. Etter å ha bekreftet kirurgisk anestesi, avlive dyret ved halshogging. Følg AAALAC retningslinjer for UVIlizing egnede metoder for dyr dødshjelp.
  4. Bruk en disseksjon saks og en pinsett til å utføre en midtlinje laparotomi fra bekkenet til brystbenet. Dette gjøres i to trinn: for det første, langsgående snitt i huden og andre, langsgående snitt i underliggende muskellaget. Hensyn må tas for ikke å skade de intra-abdominal organer.
  5. Skjær den proksimale enden av tarmen nær pylorus og den distale ende nær den ileo-cecal veikryss. Knyt begge ender separat for å forhindre lekkasje av chyme og avføring og dermed unngår forurensing av ekstracellulært bading løsning. Incise mesenteriet ved basen nær forings vaskulaturen dvs. store mesenteriske arterie og overføre hele tynntarm mesenteriske seng til et 50 ml begerglass inneholdende iskald løsning disseksjon.
  6. Tillat slakte vev å bo i iskald disseksjon løsning for 5 min og skyll med frisk disseksjon løsning for å bli kvitt blod.

5. Isolering og kanylering av 4 th

  1. Peke ut den proksimale enden av tarmen på høyre side i en Sylgard-belagte fatet. Forlenge den gjenværende tarmen i en retning mot urviseren bane, låsing segmentet nedover for å spre mesenteriet og eksponere blodkarene (figur 1). Merk: Vi isolerer arterielle segmenter ved romtemperatur. Ellers legger vi det mesenteriske arcade inneholder tallerken på isen. Noen laboratorier, inkludert de på vår institusjon, bruker chiller å dissekere arterier ved 4 ° C.
  2. Under en stereo zoom mikroskop dissekere ut 3. og 4. ordens små tarmens arterier (~ 260 mikrometer) parallell til tynntarmen ved hjelp av små saks. Først dissekere bort alt dekker fett. Deretter dissekere ut venen og isolere arterie med V-formet forgreningspunkt. Vær forsiktig med å punktere valgte segmentet. Begynn dissekere fettet i nærheten av en 2 nd for gren og finne veien til 3. eller 4. ordeh fartøy.
    1. Note: Arterier og vener kan skilles basert på deres veggtykkelse - arterieveggen er tykkere enn vein tallet. Dessuten, når tilstøtende bindevev trekkes forsiktig vinkelrett på fartøy, vener kollaps lett mens arteriene ikke gjør det. Siden arterier med lumen diameter <400 mikrometer er store områder av systemisk vaskulær motstand, for denne protokollen vi brukte 4 th for rotte tarmens arterier (lumen diameter <300 mm).
  3. Isoler et 4-5 mm seksjon av arterien parallelt til tynntarmen. Visualisere alle de 5 th ordre grener embedding i tynntarmen og skjær dem litt vekk fra opprinnelsen av filialer og bevare en del. Disse bevarte deler av filialer tjene som holder sider (med disseksjon tang) for overføring av arterielle segmenter til en perfusjon kammer og senere lede deres kanylering.
  4. Deretter skar de arterielle segmenter ved å lage to snitt distaltde 5 th ordre grener på hver side av arterien og overføre den til perfusjon kammeret (se figur 1C og legende).
  5. Cannulate ene enden av skipene på en av glass mikropipette (diameter: 100-150 nm) ved hjelp av disseksjon tang ved å holde tuppene av arteriell segment med disseksjon tang. Skyv tidligere lastet delvis stengt sutur på kannulert slutten og sikre den. Merk: proksimale enden av arterien kan kanylert på glass kanylen som er koblet til servostyrt trykkregulerende anordning for å etterligne in situ miljø.
  6. Fest en disseksjon løsning lastet 10 ml sprøyte til stengeventilen som er koblet til denne kanylen slik at disseksjon løsning i røret som forbinder kanylen og stoppekranen fusjonerer med det i sprøyten. Forsiktig heve sprøyten. Gravitasjonskraften på løsningen for å fjerne den intra vaskulære blod fra den åpne ende av karet. Etter fjerning av intra-arterielt blodSteng stoppekranen.
    Merk: Du kan også feste stoppekranen til trykket kontrolleren, slå den på og forsiktig øke presset til 5-10 mm Hg for å oppnå samme resultat.
  7. Bind den distale enden av fartøyene på en andre glass kanyle ved forsiktig å bringe den andre kanylen så nær som mulig til den ubundne ende av arterielle segmentet. Skyv tidligere lastet delvis stengt sutur på kannulert slutten og sikre den. Hensyn må tas ikke napp eller dra på den arterielle segmenter. Sørg for at stoppekraner knyttet til begge kanyler er stengt.
  8. Overfør perfusjon kammer på scenen av invertert mikroskop utstyrt med live video-opptak.
  9. Koble stoppekranen av kanylen knyttet til den proksimale enden av arteriell segmentet til en servostyrt trykkregulerende enhet, og sørg for at stoppekran festet til den andre kanylen fortsatt lukket for å opprettholde stabil intraluminal press.
  10. Deretter fester du vakuumslangen til sugeporten ennd Perfusjonsslangen til perfusjon port av kammeret.
    Merk: Skrå nål porten brukes for sug og butt nål port for perfusjon.
  11. Begynn perfusjon av fartøyet med varm PSS gjennom single inline løsning eren (37 ° C, bragt til likevekt med gassblanding: 5% CO2, 5% O2 og 90% N for å opprettholde nøytral pH-verdi og tilstrekkelig oksygene 17) ved 2 ml / min ved hjelp en peristaltisk pumpe. Snu vakuum på også. Plasser en termistor i kammeret for å overvåke temperaturen fortløpende.
  12. Når temperaturen i PSS i kammeret nærmer ~ 37 ° C (vanligvis i løpet av 5 min), langsomt øke intraluminal trykket 20-100 mmHg vist fartøy for lekkasjer. Dette gjøres ved hjelp av automatisk trykk innstilling av trykkregulator. Kast fartøy med lekkasje og erstatte med et annet segment. Fartøyene med lekkasjer vil ikke være i stand til å holde trykket.
  13. Vurdere arterielle segmentet svinger under opprettholdelse av trykket ved 100 mm Hg.Bruk av skruespaken, sett kanylen å rette den arterielle segmentet. Ikke over strekke arterielle segmenter; målet er å etterligne in vivo arteriell segment lengde.
  14. Redusere trykket til 70 mm Hg (for å etterligne in vivo trykket i den mesenteriske hall 18) og la det arterielle segmentet for å stabilisere og utvikle myogenisk tone. Arterier kan være under trykk variabelt (40-70 mmHg) i henhold til forsøks strategi og karseng. En tidligere utgitt gjennomgang gir en utmerket gjennomgang av variasjon i MT i arterielle segmenter fra ulike vaskulære senger åtte.

6. Måling av arteriell Diameter

  1. Se arterier på 10X objektiv på et mikroskop utstyrt med en monokrom video CCD kamera. Mål luminal diameter bruke video ramme grabben og real-time kant-deteksjon system. En liste over utstyr som brukes er gitt i tabell 3.
  2. Monitor og registrere fartøy diameter kontinuerlig.
  3. Observere for utvikling av MT. Merk: Det ble observert at i rotte mesenteriske arterier motstands, 70 mmHg, utvikling av MT er karakterisert ved ~ 20% reduksjon i diameter. MT varierer vaskulære seng og dyrearter.
  4. Bekreft vaskulær levedyktighet ved å vurdere vasokonstriksjonseffekter og vasodilaterende svar på 1fiM fenylefrin (Phe) og 1fiM acetylkolin (ACH).
  5. Ved slutten av hvert forsøk, bestemme passiv diameter (PD) ved å inkubere blodårene i Ca2 + -fri PSS i 20 min.

7. myogenic Response

  1. Redusere trykket til 20 mm Hg og la diameter for å stabilisere seg. Øk intraluminal trykket i inkrementelle trinn (20, 40, 60, 80 og 100), og ved hver trykktrinn tillate arterier for å oppnå en stabil diameter (vanligvis i løpet av 5 min).
  2. Reduser intraluminal trykket til 20 mmHg og inkuber arteriell segmentet i Ca 2+ -fri PSS inneholder 0,39 mMEGTA og 0,1 mM SNP. Tillat diameteren arteriell å stabil (vanligvis 15 min).
  3. Gjenta trykk trinn respons i Ca 2+ -fri PSS inneholder 0,39 mM EGTA og 0,1 mM SNP.

8. Tolkning av resultater og beregning av data

  1. Beregn MT som prosent forskjell i diameter observert for Ca 2+ -inneholdende versus Ca 2+ -fri PSS ved hvert trykk i henhold til følgende regnestykke:
    Ligning 1
  2. For arterier gjennomgår vasomotion diameter kan beregnes ved å ta gjennomsnittet av platåfasen i 1 min. Uttrykk de innsamlede data som prosent av maksimal avslapning (% Pd) i henhold til forholdet:% Pd = 100 x [AD / PD]; AD er forskjellen mellom diameteren før og etter tilsetning av en hvilken som helst utprøvings forbindelse (f.eks Phe); PD er passiv diameter (ogsåmaksimal diameter).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Skjematisk representasjon av et typisk trykk myograph oppsett er vist i figur 1. De to ender av beholderen er kanylert med et glass mikropipette og festes med sting på begge sider. Via slangen og en åpen stoppekran, er en kanyle koblet til en servostyrt trykkregulator; den andre kanyle er forbundet med en lukket stoppekran. Kammeret er perfunderes med PSS og vaskulær diametre blir observert av et invertert mikroskop koblet til et CCD-kamera.

Den arterielle segment trykksatt ved 70 mmHg inkuberes i nylaget varm PSS, som strømmer gjennom den arterielle kammeret på 2-4 ml / min, og suges ut. Arteriell diameter blir overvåket og registrert bruker videomicroscopy og kantdeteksjon programvare. Etter ~ 40 minutter, arterielle segmenter innsnevre spontant med 20-40% av sin utgangs diameter (figur 2A). I våre hender liten rotte motstand arterier constrict med 25-30% (gjennomsnittlig varies i henhold til innstillingene, operatøren og arteriell seng). Deretter blir funksjonell levedyktighet bedømmes ved vasodilaterende og vasokonstriktor responser på ACh (1 uM) og Phe (1 uM), henholdsvis (figur 2A). Mens andre vasodilatorer kan anvendes, induserer ACh endotel-avhengig vasodilatasjon og er således nyttig for å vurdere både endotelial så vel som vaskulær glatt muskulatur levedyktighet. Deretter ble den arterielle segmentet gjen inkuberes i PSS og når diameteren stabiliserer seg, er den klar for eksperimentet. Ved slutten av hvert forsøk, er arterielle segmenter inkuberes i Ca2 + fri PSS å måle PD (figur 2B). Diameterne innspilt i figur 2A og 2B er tabulert i figur 2C. Absolute MT er forskjellen mellom PD og stabil diameter oppnås ved spontan vasokonstriksjon 70 mmHg. Derfor er MT observert fra oppsporingen viste 33% av PD. Som sett her, er respons på ACH (1 mm) ge nerally lik den som ble observert for Ca 2+ gratis PSS. Legg merke til at i forsøk vurderer vasodilatasjon, kan før tilsetning av en vasokonstriktor være nødvendig.

For å bestemme myogenic svar, er rotte mesenteriske arterielle segmenter utsatt for økende intraluminale trykk trinn mellom 20 og 100 mmHg. Et eksempel er vist i Figur 3A. Arteriene får lov til å oppnå en stabil diameter etter hvert trinn (~ 5 min, stiplede linjer). Deretter blir den samme arteriell segment utsatt for trykk-respons i Ca2 + -fri PSS med 0,39 mM EGTA og 0,1 mM SNP (figur 3A). Diameteren oppnådd ved slutten av hvert trykktrinn kan vises som et linjediagram (figur 3B). MT beregnet som den prosentvise forskjell i diameter for Ca2 + -holdig vs. Ca 2+ -fri PSS ved hvert trykk kan bli vist som linje eller søylediagram (Figur 3C).

nt "fo: keep-together.within-side =" always "> Figur 1
Figur 1: En illustrasjon av trykk myograph konfigurering av (A) Den sentrale komponenter er indikert.. Se tabell 3 for en liste over alt utstyr. (B) Slaktet mesenteriske seng festet på en Sylgard belagt parabolen er vist. (C) En tegneserie av mesenteriske arteriell arcade vises. Svarte prikker representerer pin posisjoner. Den stiplede del representerer en arteriell segmentet som skal dissekert. Små grønne linjene viser snittet nettstedene på arterien. Klikk her for å se større figur .

/ftp_upload/50997/50997fig2.jpg "/>
Figur 2: (a) som angitt ved tracing, diameteren av små mesenteriske arterier fra rotte, når trykksatt til 70 mmHg, avtar spontant. Tilsetning av ACh (1 uM) økte diameteren (til nær utgangs diameter). Tilsetting av Phe (1 mm) til vevsbadet avtar arteriell diameter. (B) Inkubasjon i Ca 2+ -fri PSS øker arteriell diameter. (C) Diameteren av en enkelt trykk arteriell segment i forskjellige perfusates vist i A og B er ordnet.

Figur 3
Figur 3: (A) Arterial diameter ble målt kontinuerlig og samtidig øke intraluminal trykket trinnvis i nærvær av PSS og Ca2 + -friPSS. (B) kurve av arterielt diameter oppnådd ved hvert trykktrinn. (C) Bar graf av MT oppnådd ved hvert trykk trinn. Klikk her for å se større figur .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritisk trinn, feilsøking og modifikasjoner

I et typisk fartøy isobar preparatet, blir arterien under trykk ved 70 mm Hg mellom to glass kanyler perfundert med varm (37 ° C) PSS. Etter 30-45 min, arterier utvikle MT, karakterisert ved spontan reduksjon i diameter som stabiliserer i 20-30 min. Motstands arterier fra ulike vaskulære senger utvikle variabel MT. For eksempel rotte motstand tarmens arterier utvikle MT ~ 25% av PD, mens cremastric arterier kan oppnå MT ~ 40% av PD. Arterier som ikke utvikler MT løpet av 60 min bør kastes; denne varigheten kan variere avhengig av vaskulær seng og arter. Arterier med utilstrekkelig respons på Phe og ACH bør også kastes.

pH og temperatur i PSS har en betydelig innvirkning på utviklingen av MT. pH av PSS, som sitter i lange perioder uten lufting, kan øke. I tillegg, ved romtemperatur arterier er neppe develop MT. Derav PSS skal luftes så raskt som mulig ved hjelp av gassblandingen som er angitt i protokollen delen og temperaturen i kammeret perfusjon bør overvåkes kontinuerlig og holdt ved ~ 37 ° C ved hjelp av en strømningsvarmer.

Siden disse eksperimentene er 3-5 timer i varighet, er perfusjon kammer og tilhørende rør utsettes for PSS i lengre perioder; salt-utfellinger kan bygge opp i både kammeret og rør som kan interferere med etterfølgende eksperimenter. Derfor er det viktig å grundig vask perfusjon kammeret og skylle røret med de-ionisert vann etter hvert eksperiment. Likeledes må man sørge for å rengjøre Sylgard belagt fatet brukes for disseksjon med de-ionisert vann etter hver disseksjon.

Begrensninger

Til tross for sin betydning, har PM ulike begrensninger. Først, for å skaffe den samlede kostnaden PM utstyr er høy (~ $ 22 000) og kan være prohibitive for visse labs; en detaljert liste over utstyr er vist i tabell 3 andre er ferske fartøyene nødvendig for de fleste forsøkene.; følgelig et nytt dyr avlives for hvert eksperiment, og legger til den totale kostnaden. Tredje, disseksjon av små tarmens arterier er kjedelig og krever andre instrumenter som disseksjon mikroskop og mikrodisseksjon verktøy som er utsatt for skader. Fjerde, det er en læringskurve; få kompetanse i og etablere PM i en lab krever dedikert personale, tid og krefter.

Betydning med hensyn til andre metoder og fremtidige applikasjoner

Isobariske og isometriske eksperimentelle protokoller er to viktige tilnærminger brukes til å bestemme vaskulær reaktivitet. I motsetning til isobariske preparater, er vasoactivity i isometrisk preparater bestemmes ved måling av vaskulær glatt muskelspenning ved hjelp av en ledning myograph system. I tillegg til forskjeller i utstyr som kreves for disse to eksperimentelle protokoller, agonist-induced sammentrekning er annerledes blant disse eksperimentelle tilnærminger i forhold til omfang, tid-kurs og retning av vaskulær vegg spenning 11,19. På grunn av tekniske bekvemmeligheter og begrensninger, både forberedelser tjene viktige roller. For eksempel, fordi det er lettere å opprettholde fokus på mikroskopisk isometriske preparater, de er ofte brukt for samtidig måling av vaskulær reaktivitet og forandringer i vaskulær glatt muskulatur Ca 2+. På den annen side er myogenic aktivitet vurderes best i trykksatte preparater som anses å etterligne in vivo fysiologisk tilstand tett. En detaljert gjennomgang av forskjellene mellom disse preparatene er gitt tidligere 19.

I konklusjonen, er trykket myography en pålitelig teknikk for å studere myogenic respons i små motstandskarene på nær-fysiologiske forhold. Til tross for sine begrensninger, har PM gitt betydelige bidrag til forståelsen av endringer ivaskulær funksjon i normale og patologiske tilstander 3-7,20-23. Regulering av systemisk vaskulær tone er meget komplisert og medfører lokale og nevrohormonelle faktorer derav isolere rollen til spesifikke mekanismer som regulerer tone av vaskulære senger in vivo er vanskelig. I denne forbindelse, ex vivo trykk arterielle forberedelser tjene som gode surrogater. De som er interessert i transduksjon mekanismer for MT og myogenic svar er referert til tidligere publiserte gode anmeldelser 15,19. I fremtiden kan vi se fremskritt i utstyr som integrerer vurdering av myogenic respons og endringer i nedstrøms budbringere som Ca 2+ om det er svært lite sannsynlig at vi vil se en reduksjon i utstyrskostnader. Men som denne teknikken er tatt i bruk av forskere med variert bakgrunn, vil vi sannsynligvis se sin søknad for å vurdere endringer i mikrovaskulær funksjon ved sykdommer andre enn høyt blodtrykk, diabetes og sjokk som skrumplever, dementia etc.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen økonomiske konflikter.

Acknowledgements

Sandeep Khurana er støttet av NIH (K08DKO81479). Vikrant Rachakonda er støttet av (T32DK067872).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemical
Acetylcholine Sigma Aldrich A6625
Calcium chloride (CaCl2) Sigma Aldrich 223506
D-(+)-Glucose Sigma Aldrich G5767
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetra acetic acid (EGTA) Sigma Aldrich E3889
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) Sigma Aldrich E9884
HEPES Sigma Aldrich H3784
Magnesium sulfate (MgSO4) Sigma Aldrich M7506
MOPS Sigma Aldrich M5162
Phenylephrine Sigma Aldrich P6126
Potassium chloride (KCl) Sigma Aldrich P3911
Potassium phosphate (KH2PO4) Sigma Aldrich P5655
Sodium bicarbonate (NaHCO3 ) Sigma Aldrich S6014
Sodium chloride (NaCl) Sigma Aldrich S7653
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma Aldrich S5881
Sodium nitroprusside Sigma Aldrich 13451
Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4) Sigma Aldrich S9638
Sodium pyruvate Sigma Aldrich P8574
Table 1.
Physiological salt solution (1,000 ml) mM
KCl 4.9 0.365 g
NaCl 112 6.545 g
MgSO4.7H2O 1.2 0.296 g
KH2PO4 1.2 0.163 g
Glucose 11.5 2.072 g
NaHCO3 26 2.184 g
HEPES 10 2.383 g
CaCl2 2 2 ml (1M stock)
De-ionized water 998 ml
Ca2+ free physiological salt solution (100 ml) mM
KCl 4.9 0.036 g
NaCl 112 0.645 g
MgSO4.7H2O 1.2 0.029 g
KH2PO4 1.2 0.016 g
Glucose 11.5 0.207 g
NaHCO3 26 0.218 g
HEPES 10 0.238 g
EGTA 0.39 0.015 g
Sodium nitroprusside 0.1 0.0026 g
De-ionized water 100 ml
Dissection solution, stock (500 ml) mM
NaCl 145 21.18 g
KCl 4.7 0.875 g
MgSO4 1.2 0.739 g
MOPS 2 1.049 g
EDTA 0.02 0.019 g
De-ionized water 500 ml
Working dissection solution (100 ml) mM
Dissection solution stock 20 ml
Glucose 1.2 0.091 g
NaH2PO4 5 0.016 g
Sodium pyruvate 2 0.022 g
CaCl2 2 0.2 ml (1M stock)
De-ionized water 79.8 ml
Table 2. Composition of Experimetnal solutions
Equipment
CCD Monochrome Camera The imaging Source DMK 21AU04
Single inline solution heater Warner Instruments 64-0102
Thermistor Warner Instruments 64-0108
Dual automatic temperature controller Warner Instruments TC-344B
Flaming/Brown micropipette puller Sutter Instruments P-97
Fluorescence System Interface IonOptix model FSI-700
Forceps and scissors World Precision Instruments
Ion Wizard-Core and Analysis IonOptix Ion Wizard 6.0
Laboratory tubing Silastic 508-005
Male Sprague Dawley rat Harlan Laboratories
Master flex console drive Cole-parmer
Milli-Q Plus Ultrapure Water System Millipore ZD5211584
Ophthalmic monofilament nylon suture Ethicon 9007G
Photometry and Dimensioning Microscope Motic AE31
Pressure Servo Controller with peristaltic pump and pressure transducer Living Systems Instrumentation PS-200
Stereomicroscope Nikon Instruments Inc SMZ660
Vessel Chamber Living Systems Instrumentation CH-1
Dissection dish Living Systems Instrumentation DD-90-S
Thin Wall Glass Capillaries World Precision Instruments TW120-6
Microforge Stoelting 51550
Table 3.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Christensen, K. L., Mulvany, M. J. Location of resistance arteries. J Vasc Res. 38, 1-12 (2001).
  2. Rietzschel, E. R. Oxidized low-density lipoprotein cholesterol is associated with decreases in cardiac function independent of vascular alterations. Hypertension. 52, 535-541 (2008).
  3. Hill, M. A., Ege, E. A. Active and passive mechanical properties of isolated arterioles from STZ-induced diabetic rats. Effect of aminoguanidine treatment. Diabetes. 43, 1450-1456 (1994).
  4. Osol, G., Cipolla, M. Interaction of myogenic and adrenergic mechanisms in isolated, pressurized uterine radial arteries from late-pregnant and nonpregnant rats. Am J Obstet Gynecol. 168, 697-705 (1993).
  5. Cipolla, M. J., McCall, A. L., Lessov, N., Porter, J. M. Reperfusion decreases myogenic reactivity and alters middle cerebral artery function after focal cerebral ischemia in rats. Stroke. 28, 176-180 (1997).
  6. Ren, Y., et al. Enhanced myogenic response in the afferent arteriole of spontaneously hypertensive rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298, H1769-H1775 (2010).
  7. Hayashi, K., Epstein, M., Saruta, T. Altered myogenic responsiveness of the renal microvasculature in experimental hypertension. J Hypertens. 14, 1387-1401 (1996).
  8. Schubert, R., Mulvany, M. J. The myogenic response: established facts and attractive hypotheses. Clin Sci (Lond). 96, 313-326 (1999).
  9. Bridges, L. E., Williams, C. L., Pointer, M. A., Awumey, E. M. Mesenteric artery contraction and relaxation studies using automated wire myography. J Vis Exp. (2011).
  10. Buus, N. H., Vanbavel, E., Mulvany, M. J. Differences in Sensitivity of Rat Mesenteric Small Arteries to Agonists When Studied as Ring Preparations or as Cannulated Preparations. British Journal of Pharmacology. 112, 579-587 (1994).
  11. Falloon, B. J., Stephens, N., Tulip, J. R., Heagerty, A. M. Comparison of small artery sensitivity and morphology in pressurized and wire-mounted preparations. Am J Physiol. 268, H670-H678 (1995).
  12. Schubert, R., Wesselman, J. P. M., Nilsson, H., Mulvany, M. J. Noradrenaline-induced depolarization is smaller in isobaric compared to isometric preparations of rat mesenteric small arteries. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 431, 794-796 (1996).
  13. Khurana, S., Raina, H., Pappas, V., Raufman, J. P., Pallone, T. L. Effects of deoxycholylglycine, a conjugated secondary bile acid, on myogenic tone and agonist-induced contraction in rat resistance arteries. PLoS One. 7, e32006 (2012).
  14. Bayliss, W. M. On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure. J Physiol. 28, 220-231 (1902).
  15. Hughes, J. M., Bund, S. J. Arterial myogenic properties of the spontaneously hypertensive rat. Exp Physiol. 87, 527-534 (2002).
  16. Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260, 617-619 (1976).
  17. Raina, H., Zacharia, J., Li, M., Wier, W. G. Activation by Ca2+/calmodulin of an exogenous myosin light chain kinase in mouse arteries. J Physiol. 587, 2599-2612 (2009).
  18. Fenger-Gron, J., Mulvany, M. J., Christensen, K. L. Mesenteric blood pressure profile of conscious, freely moving rats. J Physiol. 488, (Pt 3), 753-760 (1995).
  19. Davis, M. J., Hill, M. A. Signaling mechanisms underlying the vascular myogenic response). Physiol Rev. 79, 387-423 (1999).
  20. Osmond, J. M., Mintz, J. D., Dalton, B., Stepp, D. W. Obesity increases blood pressure, cerebral vascular remodeling, and severity of stroke in the Zucker rat. Hypertension. 53, 381-386 (2009).
  21. Ge, Y., et al. Endogenously produced 20-HETE modulates myogenic and TGF response in microperfused afferent arterioles. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 102-103, 42-48 (2013).
  22. Ryan, M. J., et al. Placental ischemia impairs middle cerebral artery myogenic responses in the pregnant rat. Hypertension. 58, 1126-1131 (2011).
  23. Bagi, Z., et al. Type 2 diabetic mice have increased arteriolar tone and blood pressure: enhanced release of COX-2-derived constrictor prostaglandins. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25, 1610-1616 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats