Порядок Имплантация с организованной Массивы Микропровода с одноместным-единицы Recordings в Пробудитесь, Ведя Животные

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Имплантация организованных массивов микропроводков для использования в одно-единицы электрофизиологических записей представляет ряд технических проблем. Методы проведения эту технику и оборудование, необходимое описаны. Кроме того, полезно использование организованных массивов микропровода для записи с различных нейронных субрегионов с высоким пространственным селективности обсуждается.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Barker, D. J., Root, D. H., Coffey, K. R., Ma, S., West, M. O. A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals. J. Vis. Exp. (84), e51004, doi:10.3791/51004 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

В естественных условиях электрофизиологических записей в активном, ведет себя животное обеспечивают мощный метод для понимания нейронной сигнализации на уровне одноклеточного. Методика позволяет экспериментаторы изучить во времени и на региональном уровне определенные шаблоны огневые того, чтобы соотнести записанные потенциалы действия с постоянной поведения. Кроме того, одного блока записи могут быть объединены с множеством других методов с целью получения комплексных объяснения нервной функции. В этой статье мы опишем анестезии и подготовку к микропроводов имплантации. Впоследствии мы перечислим необходимое оборудование и хирургические меры, чтобы точно вставить микропроволоки массив в целевой структуры. Наконец, мы кратко опишем оборудования, используемого для записи с каждого отдельного электрода в массиве. Фиксированные массивы MICROWIRE описанные хорошо подходит для хронической имплантации и позволяют продольных записи нейронных данных в почти любых поведенческих готона. Мы обсуждаем трассировки электродов песни в триангуляции MICROWIRE должности, а также способы комбинирования микропровода имплантации с иммуногистохимических методов с целью повышения анатомическую специфику записанных результатов.

Introduction

Электрофизиологические записи позволит ученым изучить электрические свойства биологических клеток. В центральной нервной системе, в которой электрические импульсы служить в качестве механизма передачи сигналов, эти записи имеют особое значение для понимания нейронной функции 1-2. Во время одного блока записей в себя животных, микроэлектрод, который был вставлен в мозг способен записывать изменения в поколение нейрона потенциалов действия во времени.

Хотя многие методы позволяют записывать активность мозга, один блок-электрофизиология является одним из наиболее точных методов, позволяя разрешение на одном уровне нейронов. Когда высокая степень пространственной специфичности желательно, микропровода могут быть использованы для целевой дискретные суб-ядер или ансамбли клеток в brain3. Одно-блок записи также извлечь выгоду из высоким временным разрешением, как записи точны на уровне микросекунд. И, в естественных условияхуслуга записи позволяют нетронутыми взаимодействия схемы, с естественной среде афферентных и эфферентных проекций, системного химических и гормональных влияний и физиологических параметров. Нервные сигналы получены от сенсорной информации, моторных поведения, когнитивной обработки, нейрохимии / фармакологии, или некоторой комбинации. Соответственно, разделение сенсорных, моторных, когнитивных и химическим воздействиям, требует хорошо продуманных экспериментов с эффективными обстоятельств и управления, которые могут позволить для оценки каждого из вышеупомянутых влияний. В целом, записи в себя животных позволяют экспериментаторы наблюдать интеграцию различных источников информации в рамках функционирующей цепи и для получения более полной модели функции схемы.

Одно-блок записи также страдают от ряда недостатков которой любой экспериментатор должен быть в курсе. В первую очередь, записи могут быть трудно провести. Действительно, свойства гое headstage усилители и имплантированные Микропровода, которые позволяют пространственной и временной специфичности в этих записей также делает записи подвержены влиянию посторонних электрических сигналов (т.е. электрический «шум»). Соответственно, способность устранять проблемы в электрофизиологических системы требует хорошо развитой технического понимания электрофизиологических принципов и аппарата. Важно также отметить, что при определенных обстоятельствах, записанные электрические сигналы в внеклеточных записи может представлять суммирование нескольких нейронных сигналов. Кроме того, Обобщаемость одной единицы активности на активность населения в пределах области-мишени часто может быть ограничена степенью неоднородности в сотовой области-мишени (но см. Cardin 4). Например, электроды могут быть смещены в сторону записи выходных нейронов высокой амплитуды вместо других клеток. Интерпретируемость одной единицы записи увеличиваетсяпутем объединения записи с другими методами, включая, но не ограничиваясь ими, электрические (ортодромном или Антидромная), химические (например, электрофореза или дизайнер рецептор) или optogenetic стимуляция 4, временные нервные inactivations, сенсомоторных осмотры 5, процедуры разъединения или иммуногистохимия 3.

В протоколе, который следует мы перечислим материалы и шаги, необходимые для имплантации организованной массив микропровода у крыс (хотя протокол может быть адаптирован для использования в других видах). Порядок и стиль основных массивов, используемых в нашей лаборатории доказали свою надежность для продольных записей и может выдержать записи одного и того же нейрона для течением времени один месяц 6-8. Это делает эту процедуру идеально подходит для изучения фазовые ответов на экспериментальных стимулов, пластиковые изменений в нервных реакций, или механизмов обучения и мотивации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Постоянное внимание должны быть приняты для поддержания асептических условий (как описано в руководстве по по проблемам помощи и использованию лабораторных животных 9) во время подготовки и проведения следующей процедуры. Следующий протокол является в соответствии с Руководство по уходу и использованию лабораторных животных и был одобрен на уходу и использованию животных комитета институциональной, Rutgers University по. Считается, что последующие процедуры потребует 3-6 ч, чтобы закончить.

Имплантация массива MICROWIRE:

  1. Место животные под наркозом с использованием 50 мг / кг пентобарбитала натрия (IP) и управляют 10 мг / кг атропина метилового нитрата (IP; Гликопирролат может быть замещена) и 0,25 мг пенициллина (300 000 ЕД / мл внутримышечно) для поддержания функции внешнего дыхания и предотвращения инфекции , соответственно.
    Примечание: При длине 3-6 ч этого имплантации хирургии, фенобарбиталом натрия используется, потому что это является экономически эффективным и ограничивает воздействия на человекаанестетики (как может произойти при длительном использовании газовых анестетиков) в то же время обеспечивая длительный наркоз. Замена других анестезирующих средств является приемлемым.
  2. Убедитесь, что анестезия вступило в силу, используя тест хвост щепотку перед переходом.
  3. При необходимости дать переменного инъекции кетамина гидрохлорида (60 мг / кг внутрибрюшинно) и пентобарбиталом натрия (5-10 мг / кг IP) для поддержания анестезии всей операции.
  4. Бритье головы с использованием # 22 лезвие скальпеля.
  5. Лечить бритая скальп с повидон-йод.
  6. Дайте подкожные инъекции бупивакаина (~ 1 мг / кг SC расположены на 4 местах инъекций), чтобы локально обезболить кожу головы. Разрешить 5-10 мин для местного анестетика вступили в силу.
  7. Наведите глазной смазки над глазами, чтобы сохранить влагу во время анестезии.
  8. Закрепите животное в ухо баров и носа зажима стереотаксической аппарата.
  9. Используйте визуальные ориентиры (например, горизонтальная полоса на стерeotaxic рамка) примерно уровне головы животного. Этот шаг предназначен только для примерно уровне черепа.
  10. Сделайте надрез вдоль средней линии головы с помощью # 11 лезвие скальпеля, установленный на держателе скальпеля. Разрез должен проходить от просто за ушами к задней части носовой кости.
  11. Использование рассечение шпатель, очистить череп всех остальных ткани, пока обе боковые черепа хребты и задняя череп хребет не были достигнуты.
  12. Потяните кожу вокруг разреза, используя ряд Hemostats (6x).
  13. Очистите череп любого крови и дайте ему высохнуть. Если все оставшиеся кровотечение происходит, прекратить остаточную кровотечение с небольшой инструмент прижигание. Обеспечение того, чтобы череп остается чистой и сухой позволяет стоматологическая акриловая используется на последующих стадиях, чтобы связать к черепу на постоянной основе.
  14. Марк брегма и лямбда (рис. 2D) путем интерполяции пересечение черепа швов. Рассекает микрофонroscope необходимо точно отметить эти позиции.
  15. Прикрепите небольшой острый предмет (например, контактный или зубной сверло) для стереотаксической руку и опустите его, чтобы определить спинной / вентральной (DV) координата брегмы и лямбда.
  16. Регулировка нос зажим, пока не DV координаты темени и лямбда находятся в пределах 100 мкм (0,1 мм) друг от друга.
  17. После того, как выравнивается, записывать передней / задней (AP), медиальной / боковой (ML) и DV координаты брегмы вместе с положением носа зажима. Тщательно проверьте координаты для точности, как остальная часть операции зависит от точности этих координатах.
  18. Используйте измеренные координаты для расчета с ОД и А.П. координаты четырех углов «окна череп" по отношению к темени (т.е. краниотомии; рис. 1). Окно череп точно позиционируется прямоугольник, через который будет проходить массив микропровод.
  19. Используйте расчетные координаты, чтобы отметитьокна череп координаты на черепе с помощью остроконечного привязанность стереотаксической и авторучка чернила. Чтобы получить точные оценки, применяются только небольшое количество чернил на кончике инструмента маркировки с помощью ватного аппликатором.
  20. Дрель в окно черепа, удалив кости в серии небольших слоев.
    1. Начните с бурения отмеченные углов окна, когда знаки были помещены.
    2. Затем подключите углы и наметить окно.
    3. Наконец, ясно, из области в контур вниз на глубину твердой мозговой оболочки. Отверстие должно быть шире (например, скошенный) ниже поверхностных слоев черепа, чтобы гарантировать, что окно сохраняет соответствующую ширину от верха до низа.
  21. Используйте microforceps тщательно удалить все оставшиеся костной стружки, мусора или твердую мозговую оболочку в окне черепа. Этот шаг является чрезвычайно важным, так как эти биты материала может нарушить целостность массива при опускании. После очистки, надо иметь тыс.е окно влажная с бактериостатическим физиологического раствора в течение оставшейся части операции.
  22. Наведите маркировку на черепе в течение 5 черепа винтов и 1 провод заземления (рис. 1). Эти позиции будут различаться в зависимости от целевой области мозга. Headstage будет наиболее безопасным, если один винт ставится на каждой из костей 5 черепа. Положите обе черепа винты и провод заземления в местах, которые не будут мешать размещению микропровод массива.
  23. Сверлить отверстия для винтов черепа и закрепите винты на месте. Винты не должны быть снижены до всего 3-4 темы отображаются (или, если использовать другие, чем те, которые рекомендованы винты, достаточно глубоко, чтобы пройти толщину черепа для содействия стабильности массива, но не слишком глубоко для того, чтобы повредить кору). Очистите резьбу винтов после размещения.
  24. Просверлите отверстие для провода заземления. Медленно опустите провод (более 1-2 мин) в целевой DV координат и зафиксировать провод на месте с помощью зубной акрил.
  25. Добавить акрил вокруг нитейвинтов череп. Перед акриловых высохнет, удалите излишки цемента, которая течет от провода заземления или черепа винтами. Разрешить 15 минут для стоматологической акрила для просушки / твердеют.
  26. Прикрепите массив в стереотаксической руку. Уровень массив и ориентировать его так, что он будет прямо проходить через рамки окна черепа.
  27. Поместите физиологический раствор в окне черепа так, что она находится на уровне черепа. Опустить массив, пока он не создает впадину в физиологическом растворе. Это координат используется как уровень черепа для массива. Используйте это значение для расчета финале Д.В. координата массива.
  28. Опустите массив медленно, пока не достигнет его окончательная Д.В. координат. Стоп каждый 1 мм опускания и ждать в течение нескольких минут для того, чтобы позволить ткани мозга для восстановления рябь и распустить нижнюю часть полиэтиленгликоль (ПЭГ) в массиве (PEG используется для временного закрепления проводов в свою конформацию при одновременном снижении и растворяется медленно в физиологическом растворе).
  29. Когда массив 1ммот цели, опустите его медленнее, пока конечная цель не будет достигнута. Понижение в 0,1-0,2 мм за один раз, прежде чем разрешить ткань отдохнуть в течение 5 мин предназначен для сохранения ткани в сайте-мишени, а также проксимальных синаптических соединений. Если оборудование доступно, точность опускания массива может быть оказана помощь с использованием моторизованных манипулятор.
  30. Растворите оставшийся ПЭГ и использовать зубной акрил заделать микропроводов на месте. Добавить несколько слоев цемента, чтобы обеспечить, что провода находятся в безопасности, а затем позволить 15-20 мин для цемента, чтобы укрепиться, прежде чем продолжить. Это гарантирует, что провода не будет толкать от их окончательного размещения.
  31. Постройте остаток headstage животного с помощью зубной акрил. Используйте акрил, чтобы упаковать черепа винты, заземляющий провод и разъем для микропроводков. Разрешить акрил шляпа, чтобы укрепиться достаточно перед началом работы.
  32. Шовный кожу головы разрез с помощью рассасывающиеся нити и администрировать 2 мл ое бактериостатическое физиологический раствор (подкожно) для восстановления гидратации после операции.
  33. Снимите животное от уха баров и поместить предмет в экологически чистом районе. Соблюдайте животное часто в течение послеоперационного восстановления, пока терморегуляции и передвижения не восстановились. После выхода из наркоза, переместите животное в одном-жилья на оставшуюся часть послеоперационного восстановления.
  34. Дайте животным ежедневно в послеоперационном периоде мониторинг и уход в первые дни после процедуры. Восстановление после этой процедуры является оптимальным, когда семь или более дней допускается.
  35. Дайте животным инъекции Carprofen (5mg/kg) и энрофлоксацина (5-10 мг / кг) или их эквиваленты во время восстановления в расписании рекомендованной лечащим ветеринаром.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Перечень оборудования, используемого в данной лаборатории для записи электрофизиологических сигналов можно найти в таблице 3. После восстановления после операции, одиночные-единицы записываются, подключив единичным усилением headstage в имплантированного разъема. Это headstage подключен через кабель к коммутатору, который способен свободного вращения без перерывов в электрофизиологические записи с использованием электрических колец скольжения. Коммутатор позволяет субъекты свободно перемещаться во время записи во время поведения, который является одним из основных преимуществ этого препарата. Сигналы затем подают через предварительный усилитель (10x усиление), который используется для дифференциально усиления сигнала на каждом электроде против окружающего шума на электроде выбранной, поскольку он не обладает единичный сигнал. Дифференциальные записи используются для усиления мгновенную разницу между двумя напряжения. Потому что оба провода записывать окружающий шум примерно одинаково, их оппозициитэ полярности эффективно включить вычитание окружающего шума от нейронных записей (рис. 2). Наконец, сигналы полосовой фильтрации (450 Гц до 10 кГц; скатываются -1.5 дБ / октаву на частоте 1 кГц и -6 дБ / октаву на 11 кГц) и усиленного 700x, прежде чем оцифрованы с помощью компьютера с А / Ц карты (50 кГц частота дискретизации / провод) и храниться в течение автономного анализа.

В программном обеспечении, сигналы часто пробовали, используя метод порог обнаружения. Таким образом, сигналы, которые проходят определенный порог напряжения оцифровываются и сохраняются. Тем не менее, существует внутреннее уровень ложных срабатываний, в котором электрические артефакты проходят через порог, фильтрации и дифференциального усиления, и отбираются. Эти не нейронные сигналы вычитаются после специальной помощью шип-сортировочный программное обеспечение, позволяющее в выборку разряды должны быть отсортированы на основе их параметров (например, напряжений амплитуда, пиком и долины, и т.д..), А затем позволяет ликвидации эльectrical "шум" и выбор нейронной сигнала (рис. 3). Осциллограмм включены для анализа, если 1) осциллограмм присутствующие с каноническими моделей нейронной активности в том числе четко определенной потенциала действия и после гиперполяризации (рис. 3; правая панель); 2) амплитуда предполагаемых нервных экспонатов формы волны по крайней мере, сигнальных 2:01 : шум (то есть явно отделить от шума полосы канала; амплитуда шума полосе = около .. 50 мкВ); 3) Параметры остаются стабильными в течение всего сеанса и 4) интервал межспайковые (ISI) гистограмма показывает, что не возникло разряды в процессе естественного рефрактерного периода нейрона (т.е. ~ +2 мс; Рисунок 3 левой панели).

Нервные разряды затем можно соотнести с поведенческими событий (например рычаг ответивших), которые записаны временные метки с помощью использования цифровой вход-выход (I / O) карты. Это время-штампы могут быть использованы для создания временных пригородных событие гистограммы (PETHs; Рисунок 4а), которые используются для отображения нейронные разряды, возникающие в заданном диапазоне времени вокруг конкретного поведенческого акта. Наша лаборатория обычно рассматривается нейронной стрельбы порядка часа (Tonic 10), минуты (Замедленное фазовых 11) и секундах / миллисекундах (Rapid-Фазовые 12). Тоник стрельбы, как правило, используется, чтобы исследовать самые глобальные события в сессии. Например, мы часто используем это для сравнения огневые темпы нейронов, когда животные самоуправляющиеся наркотиков, т.е. predrug против теплотехнической на-препарата. Медленные анализы фазовые часто используются для изучения стрельбу во время замедленного меняющихся событий, как фармакологического распада препарата в течение минут. Наконец, быстрые анализы фазовые используются для более мгновенных событий, как в оперантного ответ или начала экспериментального кия.

4 показана гистограмма тонической обжигасо счетчиком разрядов в 30 секунд бункеров по всей всего сеанса записи во время кокаина самоуправления. Пример клеток показано чувствителен к изменениям в уровнях тела кокаина и становится тормозится (рис. 4А), как уровень тела животного кокаина увеличивается (рис. 4, б), но возвращается в исходное скорострельность как уровень кокаина падает после само- Условные администрации закончились. В зависимости от целевой области, нейроны могут быть чувствительны к фармакологическим эффектам, или любое количество поведенческих событий, включая вознаграждение ассоциированных сигналов 6, сенсомоторной ввода 13 или мотивированного подхода 3.

Под правильными условиях, можно записать один и тот же нейрон для многих сессий. В полосатом теле, нейроны равномерно распределены (80% проводов дают только один блок и клетки не слоистой или плотно сгруппированных) и производят относительно небольшие сигналы, которые быстро распад ÖVEг расстояние. В этих условиях, наша лаборатория смогла записать один и тот же нейрон в стриатуме для нескольких недель. Важно отметить, что не все нейроны могут быть проверены во время сеанса и не все нейроны поддерживается в течение долгого времени. Определение свою способность получить эти типы продольных записей требует тщательного тестирования электрофизиологического системы. Например, можно оценить расстояние записи микропровода с помощью приводимых электродов. Если рассматривать наряду физических свойств проводов, регионального анатомии и параметров формы сигнала нейрона через сессий, можно определить с достаточной уверенностью, что форма сигнала была сохранена между сеансами 7,8,13.

Рисунок 1
Рисунок 1. Предстив размещения для "черепа окна» (т.е. краниотомии), череп винтов, и заземляющим проводом. А) Вид спинной черепа, показывающий размещение черепа винта на каждой пластине черепа (красный), окна черепа (квадрат), и противоположной отверстием для провода заземления (зеленый). При планировании окно черепа, координаты должны быть определены путем определения В) передней и C) задней медиальной и латеральной координаты области-мишени (например, дорсолатеральный полосатое тело). D) Эти координаты можно использовать, чтобы определить размещение окна на спинной поверхности черепа. Обратите внимание, что окно черепа соответствует медиальной и латеральной целевых задач, намеченных в В и С, а также охватывает указанный диапазон в передне-заднем плоскости между В и С. Эти координаты будут специфичны для каждой отдельной области-мишени. Представитель распоций микропроводов в массиве 2 х 8 показаны с помощью маленьких точек в окне черепа, показанном на D. Окончательный дорсовентральный координата проводов будет зависеть от глубины, на которую они пониженной. Цифры модифицированные от Paxinos & Watson 14. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 2
Рисунок 2. Иллюстрации процесса дифференциального усиления. Самый верхний панель представляет собой нейронную сигнал предварительное к дифференциальным усиление (сигнал + шум). После дифференциального усиления, посторонние электрические сигналы, которые находятся на всех каналах (Noise; средняя панель) может быть эффективно вычитается из записи шразрешением посредством использования заданного перепада электрода в целях улучшения изоляции нервной сигнала (сигнала; нижняя панель).

Рисунок 3
Рисунок 3. Пример нейронной сигнала (справа) записал с одного провода массива микропроводов. Гистограмма (слева) показывает количество потенциалов действия в миллисекундах предыдущих друг наблюдается нейронной разряда в сессии. Каждый бункер представляет собой период 1 миллисекунду. Гистограмма показывает, что нет потенциалы действия не произошло естественного рефрактерного периода нейрона (2 мс).

Рисунок 4
Фигура4. Пример нейрона, который монотонно тормозится во кокаина самоуправления.) Скорострельность (Spikes/30 сек) нейрона через кокаина самоуправления сессии долгосрочной доступа в 30 секунд бункеров. Б) Соответствующая расчетный уровень препарат по тому же сессии. В сочетании, увеличение уровня наркотиков коррелируют с депрессией в нейронной стрельбы. Соответственно, когда сессия заканчивается в ~ 425 мин, нейронная стрельбы восстанавливает как содержанием в организме кокаина падения.

Рисунок 5
Рисунок 5. Гистологические срезы из двух животных со микропровода имплантатов. А) Нисслю окрашенных разделе использованием нейтрального красного в сочетании с желтой кровяной соли счетчика пятно выявления поврежденного советы Микропровод (синие).Микропровод можно проследить от коры вниз до кончиков проволоки (синий), следуя провода дорожек в ткани. Дорожки можно проследить в одном срезе или серии смежных ломтиками. B) срез окрашивали для вещества Р, который показывает брюшной спирохета, в сочетании с желтой кровяной соли счетчика пятно. Использование иммуногистологического методы, отдельные микро-провода могут быть локализованы в определенных областях мозга, или даже в конкретных субрегионов конкретного ядра. Рисунок показывает чаевые микропровода (синий) локализованное в брюшной спирохета помощью Вещество Р пятно.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Внеклеточные записи представляют собой мощный экспериментальную технику, которые могут быть включены в почти любой экспериментальной подготовки в области неврологии. Провода, которые были имплантированы в организованных массивов можно отслеживать как их валы проходят через мозг и в их целевом регионе (рис. 5, а). Когда маленький, после опыта поражения создается в неизолированного кончика микропроводов создать небольшой депозит железа из нержавеющей стальной проволоки, можно точно отметить расположение неизолированного кончика микропровода (где один-блок был записан) с использованием раствора 5%-ферроцианида калия и 10% HCl (фиг.5А и 5В, синий точками). Таким образом, можно легко использовать серию последующих срезах мозга, чтобы воссоздать положение всего массива в головном мозге. Наконец, указанные выше методы могут быть легко объединены с иммуногистохимии с целью повышения пространственной специфичности записи, с темпроверить целевые места размещения, и даже в целях изучения субрегиональных различия в пределах одного ядра-мишени 3 (рис. 5б).

Для достижения желаемого пространственную специфику, MICROWIRE массивы должны быть разработаны и имплантировали с осторожностью. В первую очередь, расстояние между рядами и колоннами внутри массива должны быть разработаны специально для интересующей нас области. Массивы, которые слишком долго или в ширину для цели может уменьшить точность или производить большое количество проводов, которые попадают на границе между двумя соседними ядрами. В то же время, микропровода расположены слишком близко друг к другу может запретить отдельный разграничение каждого электрода. Во-вторых, MICROWIRE массивы должны быть обработаны с осторожностью с целью сохранения целостности массива. Холост электродные решетки изготавливаются с использованием тонких, похожие на волосы провода, которые могут быть легко повреждены или толкали от их конфигурации при контакте. Качества этих проводов идеально подходят для уменьшения повреждения то ткани на пути подхода к своей цели, а также позволит провода переложить в концерт с небольшими движениями мозга. Таким образом, это, как правило рекомендуется хранить массивы в безопасном месте и избегать не удаляя массивы из защитных футляров, пока только до имплантации. Кроме того, необходимо соблюдать осторожность при стерилизации MICROWIRE массивы. В некоторых случаях в автоклаве из электродов может быть приемлемым. Тем не менее, окись этилена или УФ-санитарной обработки может быть предпочтительным, чтобы защитить хрупкие массивов. Наконец, металлический электрод и изоляция, диаметр каждого из них, должны быть внимательно рассмотрены. Например, только электроды, содержащие железо (например, нержавеющая сталь) смогут производить берлинской лазури реакции для индивидуального демаркации каждого микропроволоки в массиве.

В отдельных случаях, Микропровода в массиве будет отклоняться от их конфигурации при опускании из-за незамеченных препятствий (например, фрагменты черепа в окне черепа) или бедных гаndling. В этих случаях, таких микропровод часто еще отслеживаться, чтобы его кончик (хотя скорее всего он будет за пределами целевой области). Если экземпляр возникают, где любой пронумерованы микропровод в массиве не может быть проверена, важно для целостности эксперимента, что это животное быть удалены из набора данных. Неверная интерпретация позиции отдельного MICROWIRE может позволить своим нервные сигналы, чтобы усложнить или поврежден интерпретация данных.

Во время имплантации, точность окна черепа и выравнивания массива также имеют важное значение целевой точности. Череп окна должны быть достаточно широкими, чтобы массив пройти не сгибаясь или повреждение провода. С другой стороны, окно также используется, чтобы точно направить массив в требуемую позицию и поэтому должны быть пробурены с точностью в каждом измерении. Когда все будет готово для имплантации, нужно также быть уверенным, что массив отвес с окном черепа во всех измерениях. То есть,Небольшой наклон массива в любой размерности может привести массив к частично или полностью пропустить ядро-мишень. Наконец, особое внимание следует уделить при опускании первый 1-3 мм. Именно во время начальной снижение, что обломки, которые прошли незамеченными в окне черепа может нарушить целостность массива и нарушить путь микропроводков. Если путь из микропроводков затруднен, пока они медленно опустил, можно увидеть Микропровода сгибания и лук под небольшим увеличением до массив несет никакого ущерба (например, с помощью увеличительного стекла). На данный момент, Микропровода может быть втянута и мусора может быть очищен от окна, прежде чем продолжить с имплантацией.

Не в последнюю очередь, успешное насаждение микропровода массивов требует особого внимания для поддержания асептическую операционную и обеспечение тщательного послеоперационного ухода. В сочетании с указанными выше меры предосторожности, жизнеспособные записи могут быть получены изрегионы, представляющие интерес для свыше одного месяца; мы убедились записи до 40 дней после операции 6. Возможно, самое главное, долговечность этих записей предоставляет возможность изучать дискретные функциональные схемы в сложной среде электрического, химического и гормональных влияний и ответить на жизненно важные вопросы о роли этих схем в процессе обучения и мотивации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют конкурирующие финансовые интересы раскрывать.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано Национальным институтом по злоупотреблению наркотиками предоставляет Д.А. 006886 (MOW) и Д.А. 032270 (DJB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Table 1. List of Surgical Materials.
Gauze Fisher (MooreBrand) 19-898-144
Cotton Swabs Fisher (Puritan) S304659
Nembutal (Pentobarbital) Sigma Aldrich P3761
Atropine Methyl Nitrate Sigma Aldrich A0382
Baytril (Enrofloxacin) Butler Shein (Bayer) 1040007
Ketamine Hydrochloride Butler Shein SKU# 023061
Betadine (Povidone-Iodine) Fisher (Perdue) 19-066452
Stereotax Kopf Model 900
Cauterizing Tool Stoelting 59017
Dissecting Microscope Nikon SMZ445
Dental Drill Buffalo 37800
Bacteriostatic Saline Bulter Schein 8973
Jewlers Screws Stoelting 51457
Microwire Array Microprobes Custom (Flexible)
Ground Wire Omnetics Custom Plug
Dental Acrylic Fisher (BAS) 50-854-402
Absorbable Sutures Fisher (Ethicon) NC0258473
Puralube (Opthalamic Ointment/Lubricant) Fisher (Henry Schein) 008897
Table 2. List of Surgical Instruments.
2x Microforceps George Tiemann Co. #160-57 Multi-use (e.g. clearing debris in skull window)
2x Forceps George Tiemann Co. #160-93 Multi-use (e.g. tying sutures)
6x Hemostats George Tiemann Co. #105-1125 Clamp and open incision
1x Small scissors George Tiemann Co. #105-411 Cut sutures after tying
1x Tissue forceps George Tiemann Co. #105-222 Holding tissue while suturing
1x Needle holder George Tiemann Co. #105-1259 Holding suture needle
1x Scalpel holder (with #11 blade) George Tiemann Co. #105-80 (w/ #105-71 blade) Making skull incision
1x #22 Scalpel blade George Tiemann Co. #160-381 Shaving scalp
1x Surgical Spatula George Tiemann Co. #160-718 Scraping skull to clear tissue on skull
Machine/Jewelers Screws Various N/A 0/80 x 1/8”
Table 3. List of Equipment for Recording Electrophysiological Signals.
Microwire Array & Connector Micro Probe, Inc. (Gaithersburg, MD) N/A (Part No. based on array characteristics) Cranially implanted in target recording region. Arrays are customized based on desired wire spacing, length, etc.
Unity-Gain Harness/Headstage M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ) Proj 1200 Initial amplification of neural signal; allows for propagation of small neural signals.
Commutator (and Optional Fluid Swivel) Plastics One, Inc. (Roanoke, VA) SL18C Allows animals to freely rotate while propagating electrical signal to preamp
Pre-amplifier M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ) Proj 1198 Differentially amplifies neural signals against a reference electrode.
Filter and Amplifier M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ) Proj 1199 Band-pass filters and further amplifies the differentially amplified signal.
Acquisition Computer EnGen (Phoenix, AZ) N/A (Custom Build) Runs software and hardware for behavioral and neural data acquisition.
A/D Card  Data Translation (Marlboro, MA) DT-3010 Digitizes neural signals for computer sampling.
Digital I/O Card Measurement Computing (Norton, MA) PCI CTR-05 Acquires behavioral inputs and outputs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carter, M., Shieh, J. C. Electrophysiology In: Guide to research techniques in neuroscience. Academic Press. (2009).
  2. Aston-Jones, G., Siggins, G. R. Electrophysiology. In: Psychopharmacology: The Fourth Generation of Progress. Kupfer, D., Bloom, F. E. Raven Press. (1995).
  3. Root, D. H., et al. Differential roles of ventral pallidum subregions during cocaine self-administration behaviors. J. Comp. Neurol. 521, (3), 558-588 (2013).
  4. Cardin, J. A. Dissecting local circuits in vivo: integrated optogenetic and electrophysiology approaches for exploring inhibitory regulation of cortical activity. (3-4), 106-103 (2012).
  5. Ma, S., et al. Amphetamine's dose-dependent effects on dorsolateral striatum sensorimotor neuron firing. Behav. Brain Res. (2013).
  6. Ghitza, U. E., et al. Persistent cue-evoked activity of accumbens neurons after prolonged abstinence from self-administered cocaine. J. Neurosci. 23, (19), 7239-7245 (2003).
  7. Tang, C., et al. Changes in activity of the striatum during formation of a motor habit. Eur. J. Neurosci. 25, (4), 1212-1227 (2007).
  8. Tang, C., et al. Dose and rate-dependent effects of cocaine on striatal firing related to licking. J. Pharmacol. Exp. Ther. 324, (2), 701-713 (2008).
  9. National Research Council. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals: Eighth Edition. The National Academies Press. Washington, DC. (2011).
  10. Fabbricatore, A. T., et al. Electrophysiological evidence of mediolateral functional dichotomy in the rat accumbens during cocaine self-administration: tonic firing patterns. Eur. J. Neurosci. 30, (12), 2387-2400 (2009).
  11. Root, D. H., et al. Slow phasic and tonic activity of ventral pallidal neurons during cocaine self-administration. Synapse. 66, (2), 106-127 (2012).
  12. Root, D. H., et al. Rapid-phasic activity of ventral pallidal neurons during cocaine self-administration. Synapse. 64, (9), 704-713 (2010).
  13. Tang, C. C., et al. Decreased firing of striatal neurons related to licking during acquisition and overtraining of a licking task. J. Neurosci. 29, (44), 12952-12961 Forthcoming.
  14. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. Academic Press/Elsevier. (1997).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics