Een procedure voor het implanteren van georganiseerde Arrays van microwires voor Single-unit Opnamen in Awake, Gedragen Dieren

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Implanteren georganiseerde arrays van microwires voor gebruik in een enkele eenheid elektrofysiologische opnames presenteert een aantal technische uitdagingen. Methoden voor het uitvoeren van deze techniek en de apparatuur die nodig zijn beschreven. Ook is het nuttig gebruik van de georganiseerde Microwire arrays op te nemen van verschillende neurale subregio's met een hoge ruimtelijke selectiviteit besproken.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Barker, D. J., Root, D. H., Coffey, K. R., Ma, S., West, M. O. A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals. J. Vis. Exp. (84), e51004, doi:10.3791/51004 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

In vivo elektrofysiologische opnames in de wakkere, gedraagt ​​dier zorgen voor een krachtige methode voor het begrijpen van neurale signalering bij de single-cell niveau. De techniek maakt het mogelijk om onderzoekers tijdelijk en regionaal onderzoeken specifieke afvuren patronen om opgenomen actiepotentialen correleren met de lopende gedrag. Bovendien kan een enkele unit registraties worden gecombineerd met een overvloed aan andere technieken om uitgebreide uitleg van neurale functies te bewerkstelligen. In dit artikel beschrijven we de anesthesie en de voorbereiding voor Microwire implantatie. Vervolgens hebben we een opsomming van de benodigde apparatuur en chirurgische stappen om nauwkeurig plaats een Microwire array naar een doel structuur. Tot slot beschrijven we kort de voor de registratie van elke afzonderlijke elektrode in de array apparatuur. De vaste Microwire arrays beschreven zijn zeer geschikt voor chronische implantatie en zorgen voor longitudinale opnamen van neurale gegevens in vrijwel elke gedrags preparatiop. We bespreken tracing elektrode tracks naar Microwire posities evenals manieren om Microwire implantatie combineren met immunohistochemische technieken om de anatomische specificiteit van verkregen resultaten te verhogen driehoeksmeting.

Introduction

Elektrofysiologische registraties kunnen wetenschappers de elektrische eigenschappen van biologische cellen te onderzoeken. In het centrale zenuwstelsel, waarbij elektrische impulsen dienen als signaleringsmechanisme, deze opnamen van bijzonder belang voor het begrijpen van neurale functie 1-2. Tijdens de single-unit registraties in gedragen dieren, een micro-elektrode die in de hersenen is ingebracht is in staat om veranderingen op te nemen in de opwekking van een neuron van actiepotentialen in de tijd.

Terwijl veel technieken laten ons toe om de hersenactiviteit te registreren, single-unit elektrofysiologie is een van de meest precieze methoden doordat resolutie bij de enkel neuron niveau. Wanneer een hoge mate van ruimtelijke specificiteit gewenst is, kan microwires worden gebruikt om afzonderlijke sub-kernen of ensemble van cellen in de brain3 richten. Single-unit opnames ook profiteren van hoge tijdsresolutie wegens opnames zijn nauwkeurig op de microseconde niveau. En, in vivo eenkielzog opnames laten intact circuit interacties, met het natuurlijke milieu van afferente en efferente projecties, systemische chemische en hormonale invloeden, en fysiologische parameters. Neurale signalen worden afgeleid van zintuiglijke input, motorische gedrag, cognitieve verwerking, neurochemistry / farmacologie, of een combinatie. Dienovereenkomstig, de scheiding van sensorische, motorische, cognitieve, en chemische invloeden vereist doordachte experimenten met effectieve risico's en controles die kunnen toestaan ​​dat voor de beoordeling van elk van de bovengenoemde invloeden. Al met al, opnames in gedragen dieren mogelijk maken onderzoekers om de integratie van meerdere bronnen van informatie te observeren binnen een functionerende schakeling en een meer omvattend model van circuit functie afleiden.

Enkele eenheid opnamen ook kampen met een aantal nadelen, waarvan een experimentator moet zich bewust. Eerst en vooral, kunnen opnames moeilijk uit te voeren zijn. Inderdaad, eigenschappen van the headstage versterkers en de geïmplanteerde microwires waarmee ruimtelijke en temporele specificiteit in deze opnames maakt opnamen gevoelig voor de invloed van externe elektrische signalen (bijvoorbeeld elektrische "ruis"). Dienovereenkomstig, het vermogen om problemen op te lossen in een elektrofysiologische systeem vereist een goed ontwikkelde technische kennis van elektrofysiologische principes en apparaten. Het is ook belangrijk op te merken dat, onder bepaalde omstandigheden, opgenomen elektrische signalen in extracellulaire opnames kan de optelling van verschillende neurale signalen vertegenwoordigen. Bovendien kan gegeneraliseerd enkele eenheid activiteit populatie activiteit in een doelwit gebied vaak beperkt door de mate van cellulaire heterogeniteit binnen het doelgebied (maar zie Cardin 4). Bijvoorbeeld, zou elektroden de nadruk echter op het opnemen van hoge amplitude output vormen in plaats van andere cellen. De interpreteerbaarheid van single-unit registraties wordt verhoogddoor het combineren opnames met andere technieken, waaronder, maar niet beperkt tot, elektrische (orthodromic of antidromic), chemische (bijv. iontoforetische of ontwerper receptor) of optogenetic stimulatie 4, tijdelijke neurale inactivations, sensorimotorische onderzoeken 5, ontkoppelingsprocedure of immunohistochemie 3.

In het protocol dat volgt zullen wij de materialen en stappen die nodig sommen een georganiseerde Microwire array in ratten geïmplanteerd (hoewel het protocol kan worden aangepast voor gebruik in andere soorten). De procedure en de stijl van vaste arrays gebruikt in ons laboratorium hebben betrouwbare Longitudinale opnames bewezen en kan opnames van hetzelfde neuron houden voor meer dan een maand tijd 6-8. Dit maakt deze procedure ideaal voor de behandeling van driefase reacties op experimentele stimuli, plastische veranderingen in de neurale reacties, of mechanismen van leren en motivatie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De grootste zorg moeten worden genomen om aseptische omstandigheden te handhaven (zoals beschreven in de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren 9) tijdens de voorbereiding voor en het uitvoeren van de volgende procedure. Het volgende protocol is in overeenstemming met de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren en is goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite, Rutgers University goedgekeurd. Er wordt geschat dat de daaropvolgende procedures 3-6 uur zal nodig hebben om te voltooien.

Implantatie van de Microwire Array:

  1. Plaats dieren verdoofd met 50 mg / kg natriumpentobarbital (ip) en toedienen 10 mg / kg atropine methylnitraat (IP; Glycopyrrolaat gesubstitueerd kan zijn) en 0,25 mg penicilline (300.000 U / ml im) respiratoire functie te behouden en voorkomen van infectie respectievelijk.
    Opmerking: Bij de 3-6 uur lengte van deze implantatiechirurgie wordt natriumpentobarbital gebruikt omdat het kosteneffectief en beperkt de menselijke blootstelling aananesthetica (zoals kan optreden bij langdurig gebruik van gas anesthetica), terwijl het toch langdurige anesthesie. Substitutie van andere anesthetica aanvaardbaar.
  2. Controleer of de verdoving effect heeft gemaakt met de staartknijptest voordat u verder gaat.
  3. Indien nodig, geeft afwisselend injecties van ketamine hydrochloride (60 mg / kg IP) en natriumpentobarbital (5-10 mg / kg IP) anesthesie tijdens de operatie te handhaven.
  4. Scheer de hoofdhuid met behulp van een # 22 scalpel.
  5. Ontsmet de geschoren hoofdhuid met povidonjood.
  6. Geef subcutane injecties van bupivacaine (~ 1 mg / kg SC verdeeld over 4 injectieplaatsen) plaatselijk verdoven de hoofdhuid. Laat 5-10 minuten voor de plaatselijke verdoving door te voeren.
  7. Plaats een oogheelkundige smeermiddel over de ogen om vocht vast te houden tijdens de anesthesie.
  8. Beveilig het dier in het oor bars en neus klem van een stereotaxische apparaat.
  9. Gebruik visuele oriëntatiepunten (bijvoorbeeld een horizontale balk op de stereotaxic frame) tot ongeveer het niveau van hoofd van het dier. Deze stap is alleen bedoeld om ongeveer op het niveau van de schedel.
  10. Maak een insnijding langs de middellijn van de hoofdhuid met behulp van een # 11 scalpel gemonteerd op een scalpel houder. De incisie moet uitstrekken van net achter de oren om het achterste gedeelte van het neusbeen.
  11. Met behulp van een dissectie spatel, schakelt de schedel van alle resterende weefsel totdat beide laterale schedel kammen en de achterste schedel nok zijn bereikt.
  12. Trek de huid rond de incisie met behulp van een aantal hemostats (6x).
  13. Maak de schedel van een bloed en laat ze drogen. Als de resterende bloeden optreedt, beëindigen de resterende bloeden met een kleine cauterizing tool. Ervoor zorgen dat de schedel blijft schoon en droog maakt de tandheelkundige acryl gebruikt in de volgende stappen om permanent te binden aan de schedel.
  14. Mark bregma en lambda (figuur 2D) door interpolatie het snijpunt van de schedel hechtingen. Een ontleden microscope moeten deze posities nauwkeurig markeren.
  15. Bevestig een klein puntig voorwerp (bijvoorbeeld een pen of tandheelkundige boor) een stereotaxische arm en laat het aan de dorsale / ventrale (DV) bepalen coördinaat van bregma en lambda.
  16. Stel de neus klem totdat het DV-coördinaten van bregma en lambda zijn binnen 100 urn (0,1 mm) van elkaar.
  17. Eenmaal genivelleerd, noteer de anterior / posterior (AP), mediale / laterale (ML) en DV-coördinaten van bregma samen met de positie van de neus klem. Controleer de coördinaten van nauwkeurigheid, de rest van de operatie is afhankelijk van de nauwkeurigheid van deze coördinaten.
  18. Gebruik de gemeten coördinaten aan de ML-en AP-coördinaten van de vier hoeken van de "schedel venster" ten opzichte van bregma (dwz craniotomy; Figuur 1) te berekenen. Het venster schedel is een zeer precies te positioneren rechthoek waardoor de Microwire array zal passeren.
  19. Gebruik de berekende coördinaten ter gelegenheid van hetschedel venster coördineert op de schedel met een puntig stereotaxisch gehechtheid en vulpen inkt. Om precies te merken verkrijgen toepassing slechts een kleine hoeveelheid inkt naar de punt van de markeergereedschap met een katoenen applicator.
  20. Boor de schedel raam door het verwijderen van het bot in een reeks kleine lagen.
    1. Begin met het boren van de gemarkeerde hoeken van het venster wanneer de merken zijn geplaatst.
    2. Vervolgens sluit de hoeken en een overzicht van de raam.
    3. Ten slotte duidelijk uit het gebied binnen de omtrek tot in de diepte van de dura mater. Het gat moet breder (dwz schuine) in de oppervlakkige lagen van de schedel om ervoor te zorgen dat het raam onderhoudt een geschikte breedte van boven naar beneden.
  21. Gebruik microforceps om alle resterende botsplinters, puin, of dura mater verwijder voorzichtig in de schedel venster. Deze stap is zeer belangrijk, omdat deze stukjes materiaal de integriteit van de matrix kan beschadigen tijdens het dalen. Eenmaal gewist, moet men th houdene venster vochtig met bacteriostatische zoutoplossing voor de rest van de operatie.
  22. Plaats markeringen op de schedel voor 5 schedel schroeven en 1 begane draad (figuur 1). Deze posities zijn afhankelijk van de beoogde hersengebied. De headstage zullen de meeste veilig als een schroef op elk van de 5 schedelbeenderen wordt geplaatst. Plaats zowel de schedel schroeven en aardedraad op locaties die niet zal bemoeien met de Microwire reeks plaatsing.
  23. Boor gaten voor de schedel schroeven en zet de schroeven op zijn plaats. Schroeven moeten worden verlaagd tot slechts 3-4 draden vertonen (of, indien met andere dan de aanbevolen schroeven, diep genoeg om de dikte van de schedel array stabiliteit doorkruisen maar niet te diep om cortex beschadigen). Reinig de schroefdraad van de schroeven na plaatsing.
  24. Boor een gat voor de aardingskabel. Laat de draad langzaam (meer dan 1-2 min) naar het doel DV coördineren en bevestig de draad op zijn plaats met behulp van tandheelkundige acryl.
  25. Acryl voegen rond de dradenvan de schedel schroeven. Voordat de acryl droogt, verwijder eventueel overtollig cement dat uit de buurt van de grond draad of schedel schroeven stroomt. Laat 15 min voor de tandheelkundige acryl te drogen / uitharden.
  26. Bevestig de array om de stereotaxische arm. Zet de array en oriënteren zodat het vierkant zal door de grenzen van de schedel venster.
  27. Plaats zoutoplossing in de schedel venster zodat het niveau met de schedel. Verlaag de array totdat het creëert een kuiltje in de zoutoplossing. Deze coördinaat wordt gebruikt als schedel-niveau voor de array. Gebruik deze waarde voor de berekening van de uiteindelijke DV-coördinaat van de array.
  28. Verlaag de array langzaam totdat het bereikt zijn definitieve DV coördineren. Stop elke 1mm verlagen en wacht enkele minuten zodat hersenweefsel te herstellen van kuiltjes en het onderste gedeelte van de polyethyleenglycol (PEG) los op de array (PEG wordt gebruikt om de draden tijdelijk houden hun conformatie terwijl het verlagen en lost langzaam in zoutoplossing).
  29. Wanneer de array 1mmverwijderd van de doelstelling, zakken langzamer totdat de uiteindelijke doelstelling is bereikt. Verlaging van 0,1-0,2 mm in een tijd alvorens het weefsel rusten gedurende 5 minuten is bedoeld om het weefsel op de doelplaats en proximale synaptische verbindingen behouden. Als het materiaal beschikbaar is, kan de precisie verlaging van de array bijgestaan ​​met een gemotoriseerde manipulator.
  30. Los de resterende PEG en gebruiken tandheelkundige acryl om de microwires in plaats van cement. Voeg meerdere lagen van cement om ervoor te zorgen dat de draden goed vast en laat 15-20 minuten voor het cement uitharden voordat u verder gaat. Dit zorgt ervoor dat de kabels niet worden verdrongen uit hun definitieve plaatsing.
  31. Bouw de rest van headstage het dier met behulp van tandheelkundige acryl. Gebruik de acryl te omsluiten de schedel schroeven, aardedraad, en de aansluiting voor de microwires. Laat het acryl hoed voldoende uitharden voordat u verder gaat.
  32. Hecht de hoofdhuid incisie met behulp van absorbeerbare hechtingen en beheren 2 ml of bacteriostatische zoutoplossing (sc) om hydratatie te herstellen van een operatie.
  33. Verwijder het dier uit het oor bars en plaatsen het onderwerp in een schone omgeving. Observeer het dier vaak tijdens het postoperatieve herstel tot thermoregulatie en motoriek zijn hersteld. Na herstel van de anesthesie, verplaats het dier in single-behuizing voor de rest van de post-operatieve herstel.
  34. Geef dieren dagelijks postoperatieve bewaking en zorg in de dagen na de procedure. Herstel van deze procedure is optimaal wanneer zeven of meer dagen zijn niet toegestaan.
  35. Geef dieren injecties van Carprofen (5mg/kg) en Enrofloxacin (5-10 mg / kg) of equivalenten daarvan gedurende herstel volgens het schema aanbevolen door de behandelende dierenarts.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een lijst van de uitrusting die gebruikt wordt door dit laboratorium voor het opnemen van elektrofysiologische signalen zijn te vinden in tabel 3. Na herstel van een operatie, zijn single-eenheden geregistreerd door de stekker een unity-gain headstage in de geïmplanteerde connector. Deze headstage is via een kabel naar een commutator, dat in staat is vrije rotatie zonder onderbrekingen in de elektrofysiologische opname door het gebruik van elektrische sleepringen. De commutator kan onderwerpen vrij te bewegen tijdens het opnemen in gedrag, dat een van de belangrijkste voordelen van dit preparaat. De signalen worden vervolgens door een voorversterker (10x gain) die wordt gebruikt om het signaal differentieel amplificeren van elke elektrode tegen het omgevingsgeluid op een elektrode geselecteerd omdat het geen eenheid signaal vertonen. Differentiële opnamen worden gebruikt om het momentane verschil tussen de beide spanningen amplificeren. Omdat beide draden opnemen omgevingsgeluid ongeveer even, hun oppositiete polariteiten effectief mogelijk te maken aftrekken van het omgevingsgeluid uit neurale opnames (figuur 2). Tenslotte signalen zijn band-pass gefilterd (450 Hz tot 10 kHz; roll off -1,5 dB / octaaf bij 1 kHz en -6 dB / octaaf bij 11 kHz) en versterkt 700x voordat ze gedigitaliseerd met behulp van een computer met een A / D-kaart (50 kHz bemonsteringsfrequentie / draad) en opgeslagen voor offline analyse.

Bij software worden golfvormen vaak bemonsterd met behulp van een drempel detectiemethode. Zo signalen die een bepaald voltage drempel passeren worden gedigitaliseerd en opgeslagen. Toch is er een inherente percentage vals-positieven, waarbij elektrische artefacten pass drempel, filtering en differentiële amplificatie en bemonsterd. Deze niet-neurale golfvormen worden afgetrokken post-hoc gebruik-spike sorteren software waarmee bemonsterde lozingen te sorteren op basis van hun parameters (zoals amplitude, piek en dal spanningen, enz.) En vervolgens zorgt voor de eliminatie van electrical "ruis" en de selectie van de neuronale signaal (Figuur 3). Golfvormen worden opgenomen voor analyse indien 1) golfvormen aanwezig met canonieke patronen van neurale activiteit, waaronder een duidelijk omschreven actiepotentiaal en na hyperpolarisatie (figuur 3; rechter paneel), 2) de amplitude van een vermeende neurale golfvorm vertoont minstens een 2:1 signaal : ruisverhouding (dwz duidelijk worden gescheiden van lawaai band van het kanaal; amplitude lawaai band = ca. .. 50 mV); 3) Parameters stabiel blijven gedurende de hele sessie en 4) een interspike interval (ISI) histogram laat zien dat er geen lozing heeft plaatsgevonden tijdens natuurlijke refractaire periode het neuron (dwz ~ 2 msec; Figuur 3 linker paneel).

Neurale ontladingen kunnen vervolgens worden gecorreleerd met gedrags gebeurtenissen (bijv. hendel reageert) die zijn opgenomen als tijdstempels via het gebruik van een digitale input-output (I / O)-kaart. Deze tijd-Stempels worden gebruikt om peri-gebeurtenistijd histogrammen (PETHs; figuur 4A) maakt, die worden gebruikt om neuronale ontladingen die optreden in een bepaalde tijdspanne rond een bepaald gedrag gebeurtenis weer. Ons laboratorium heeft meestal onderzocht neurale vuren in de orde van uren (Tonic 10), minuten (Slow-Fasische 11) en seconden / milliseconden (Rapid-Fasische 12). Tonic afvuren wordt meestal gebruikt om de mondiale gebeurtenissen in een sessie te onderzoeken. Zo vaak gebruiken we deze om afvuren tarieven van neuronen vergelijken wanneer dieren zelfadministrerend drug, dwz predrug versus on-drug vuren tarieven. Slow fasisch analyses worden vaak gebruikt om vuren te onderzoeken tijdens langzame veranderende gebeurtenissen zoals de farmacologische verval van een geneesmiddel gedurende minuten. Ten slotte worden een snelle gefaseerde analyses gebruikt voor meer gebeurtenissen van het moment als een operante respons of het begin van een experimentele cue.

Figuur 4 toont een histogram van tonische afvurenmet een telling van de lozingen in 30 seconden bakken over een hele opname sessie tijdens cocaïne zelf toedienen. Het voorbeeld cel getoonde gevoelig voor veranderingen in het lichaam niveaus van cocaïne en wordt geremd (figuur 4A) als lichaamsniveau cocaïne toeneemt (figuur 4B) van het dier, terugkeert naar zijn oorspronkelijke vuursnelheid het niveau van cocaïne daalt na de zelf- administratie voorwaardelijke zijn beëindigd. Afhankelijk van het doelgebied, kunnen neuronen gevoelig voor farmacologische effecten, of een aantal gebeurtenissen waaronder gedrags-beloning geassocieerde signalen 6, sensorimotorische ingang 13 of gemotiveerd benadering 3 zijn.

Onder de juiste omstandigheden, is het mogelijk om hetzelfde neuron vele sessies opnemen. In het striatum neuronen worden homogeen verdeeld (80% draden afgeven van slechts een enkele eenheid en cellen niet gelaagd of strak gegroepeerde) en produceert relatief kleine signalen die snel verval over afstand. Onder deze omstandigheden heeft ons laboratorium kunnen hetzelfde neuron opgenomen in het striatum van meerdere weken. Belangrijk niet alle neuronen tussen sessies worden gecontroleerd en niet alle neuronen tijd gehandhaafd blijft. Het bepalen van iemands vermogen om dit soort longitudinale opnames te verkrijgen vereist een zorgvuldige toetsing van de elektrofysiologische systeem. Zo kan men schatten opname afstand microwires met aandrijfbare elektroden. Beschouwd naast de fysische eigenschappen van de draden, regionale anatomie en de golfvorm parameters van de neuron tussen sessies kan men met redelijke zekerheid bepalen dat een golfvorm is behouden tussen sessies 7,8,13.

Figuur 1
Figuur 1. Vertegenwooive plaatsingen voor de "skull venster" (dwz craniotomie), schedel schroeven, en aarde. A) Een dorsale mening van de schedel met de plaatsing van een schedel schroef op elke plaat van de schedel (rood), een schedel venster (vierkant), en een contralaterale gat voor de aardedraad (groen). Bij het ​​plannen van de schedel venster moet de coördinaten worden bepaald door bepaling van de B) voorste en C) posterior mediale en laterale coördinaten van het doelgebied (bijv. dorsolaterale striatum). D) Deze coördinaten kunnen dan worden gebruikt om de plaatsing van het venster bepalen op het dorsale oppervlak van de schedel. Merk op dat de schedel raam overeenkomt met de mediale en laterale doelstellingen die in B en C alsmede overspant het gespecificeerde bereik in de sagittale vlak tussen B en C. Deze coördinaten specifiek voor elke individuele doelwit regio. Representatieve locaties van de microwires in een 2 x 8 matrix worden weergegeven met kleine stipjes in de schedel venster getoond in D. De uiteindelijke dorsoventral coördinaat van de draden zal afhangen van de diepte waarop zij worden neergelaten. Cijfers gewijzigd van Paxinos en Watson 14. Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 2
Figuur 2. Een illustratie van de werkwijze van differentiële amplificatie. Het bovenste paneel is een neuraal signaal voorafgaand aan versterking differentiële (Signal + Noise). Na differentiële versterking, externe elektrische signalen die zijn gevonden op alle kanalen (Noise, middelste paneel) effectief kan worden afgetrokken van het opnemen wires via het gebruik van een bepaalde differentiële elektrode teneinde isolatie van de neurale golfvorm (signaal, onderste paneel) verbeteren.

Figuur 3
Figuur 3. Voorbeeld neurale golfvorm (rechts) opgenomen met een draad van een Microwire matrix. Het histogram (links) toont het aantal actiepotentialen in milliseconden vóór elke waargenomen neurale ontlading in de sessie. Elke bak is een 1 milliseconde periode. Het histogram laat zien dat er geen actiepotentialen zich in natuurlijke refractaire periode van de neuron (2 msec).

Figuur 4
Figuur4. Een voorbeeld van een neuron dat tonisch geremd tijdens cocaïne zelftoediening. A) de brandsnelheid (Spikes/30 seconde) van een neuron over een lange toegang cocaïne zelftoediening sessie 30 seconden bakken. B) De overeenkomstige berekend drug niveau in dezelfde sessie. In combinatie, zijn verhogingen van drug niveau gecorreleerd met een depressie in de neurale vuren. Dienovereenkomstig, wanneer de sessie eindigt bij ~ 425 min, neurale vuren herstelt als body niveaus van cocaïne vallen.

Figuur 5
Figuur 5. Histologische plakjes van twee dieren met Microwire implantaten. A) Een Nissl gekleurde coupe met neutrale rood gecombineerd met een kaliumferrocyanide teller vlek onthullen lesioned Microwire tips (blauw).Een Microwire kunnen worden getraceerd van de cortex tot op de draad tips (blauw) door het volgen van de draad tracks in het weefsel. Sporen kunnen worden getraceerd in een segment of een aantal aangrenzende segmenten. B) Een deel gekleurd Substantie P, die de ventrale pallidum blijkt, gekoppeld aan een kaliumferrocyanide teller vlek. Met behulp immunohistologische technieken kunnen individuele micro-aders worden gelokaliseerd binnen bepaalde gebieden van de hersenen, of zelfs binnen specifieke sub-regio's van een bepaalde kern. Figuur toont een Microwire tip (blauw) gelokaliseerd in het ventrale pallidum met behulp van de Substance P vlek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Extracellulaire registraties vormen een krachtige experimentele techniek die in vrijwel elke experimentele opstelling in de neurowetenschappen kunnen worden opgenomen. Draden die zijn geïmplanteerd in georganiseerde arrays kunnen worden gevolgd als hun assen passeren de hersenen en in hun doelgebied (figuur 5A). Wanneer een klein, post-experimentele laesie is gecreëerd op de niet-geïsoleerde Microwire tip om een ​​kleine ijzeren storting te maken van de roestvrij staaldraad, kan men nauwkeurig de locatie van de ongeïsoleerde Microwire tip (waar de single-eenheid werd opgenomen) te markeren met behulp van een oplossing van 5% kaliumferrocyanide en 10% HCl (figuren 5A en 5B, blauwe stippen). Zo kan men gemakkelijk gebruik maken van een reeks van opeenvolgende hersenenplakken de positie van de gehele matrix in de hersenen opnieuw. Tenslotte kunnen de hierboven genoemde technieken gemakkelijk worden gecombineerd met immunohistochemie om de specificiteit van ruimtelijke opnamen verhogen, teneindetot doel stages verifiëren en zelfs om subregionale verschillen bestuderen in een enkel doel kern 3 (figuur 5B).

Om de gewenste ruimtelijke specificiteit te bereiken, moeten Microwire arrays worden ontworpen en geïmplanteerd met zorg. Allereerst moet de afstand tussen de rijen en kolommen in de matrix speciaal ontworpen zijn voor het gebied van belang. Arrays die te lang of te breed is voor de gewenste doelgroep zijn kan de nauwkeurigheid verminderen of produceren een groot aantal draden die op de grens tussen twee aangrenzende kernen vallen. Tegelijkertijd kan microwires afstand te dicht op elkaar afzonderlijk afbakening van elke elektrode verbieden. Ten tweede moeten Microwire arrays zorgvuldig behandeld om de integriteit van de matrix behouden. Enkele elektrode arrays worden geproduceerd met behulp van dunne, haarachtige draden die gemakkelijk kunnen worden beschadigd of verdrongen van de configuratie bij contact. De eigenschappen van deze draden zijn ideaal voor het verminderen van schade to weefsel op de weg van aanpak iemands doelwit en laten ook de draden verschuiven overleg met kleine bewegingen van de hersenen. Zo is het meestal aan te raden om arrays te slaan op een veilige plaats en vermijd verwijderen arrays uit hun beschermhoesjes tot vlak vóór de implantatie. Ook moet erop worden gelet bij het steriliseren Microwire arrays. In sommige gevallen kan autoclaveren elektroden aanvaardbaar. Echter, ethyleenoxide of UV-ontsmetting voorkeur fragiele arrays te beschermen. Tenslotte, de elektrode metaal en isolatie, en de diameter van elk zorgvuldig worden overwogen. Zo alleen elektroden dat ijzer (bv. roestvrij staal) bevatten kunnen Pruisisch blauw reacties voor de individuele afbakening van elk Microwire in de array te produceren.

Bij gelegenheid zal microwires in de array afdwalen van hun configuratie tijdens het dalen vanwege ongemerkt obstakels (bv. schedel fragmenten in de schedel venster) of slechte handling. In deze gevallen dergelijke Microwire vaak nog worden gevolgd om de punt (hoewel het zal waarschijnlijk buiten het doelgebied). Indien een geval voordoen waarin genummerde Microwire in de array niet kan worden gecontroleerd, is het belangrijk om de integriteit van het experiment dat dit dier uit de dataset verwijderd. Verkeerde interpretatie van de positie van een individu Microwire kan haar neurale signalen in staat te bemoeilijken of corrupte interpretatie van de gegevens.

Tijdens implantatie De nauwkeurigheid van de schedel raam en matrix uitlijning ook kritisch nauwkeurigheid richten. Schedel ramen moeten breed genoeg om de array te passeren zonder te buigen of beschadigen draden worden gemaakt. Anderzijds, wordt het venster ook nauwkeurig geleiden de array de doelpositie en moet worden geboord nauwkeurig in elke dimensie. Als u klaar bent voor implantatie, moet men ook zeker van zijn dat de array is schietlood met de schedel raam in alle dimensies. Dat is,een lichte kanteling van de array in elke dimensie kan de array leiden tot gedeeltelijk of volledig missen het doel kern. Ten slotte moet speciale zorg worden genomen bij het verlagen van de eerste 1-3 mm. Het is tijdens de initiële verlaging van deze brokstukken die binnen de schedel venster onopgemerkt zijn gebleven de integriteit van de array kan binnendringen en verstoren de weg van microwires. Als het pad van de microwires wordt belemmerd, terwijl ze langzaam worden verlaagd, kan men microwires bocht zien of buigen onder lichte vergroting voordat de array lijdt schade (bijvoorbeeld met behulp van een vergrootglas). Op dit punt, kan microwires worden teruggetrokken en vuil kan uit het raam voordat u verder gaat met de implantatie worden gewist.

Last but not least, succesvolle inplanting van Microwire arrays vergt speciale aandacht aan het behoud van een aseptische operatiekamer en het verstrekken van gedegen post-operatieve zorg. In combinatie met de bovengenoemde voorzorgen, kan levensvatbare opnamen worden verkregenregio's van belang zijn voor ruim een maand, hebben we opnames gecontroleerd tot 40 dagen na de ingreep 6. Misschien wel het allerbelangrijkste, de levensduur van deze opnamen biedt de mogelijkheid om afzonderlijke functionele circuits te bestuderen binnen het complex milieu van elektrische, chemische en hormonale invloeden en beantwoorden belangrijke vragen over de rol van deze circuits in het leren en motivatie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen openbaar te maken.

Acknowledgments

Deze studie werd ondersteund door het National Institute on Drug Abuse kent DA 006886 (MOW) en DA 032270 (DJB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Table 1. List of Surgical Materials.
Gauze Fisher (MooreBrand) 19-898-144
Cotton Swabs Fisher (Puritan) S304659
Nembutal (Pentobarbital) Sigma Aldrich P3761
Atropine Methyl Nitrate Sigma Aldrich A0382
Baytril (Enrofloxacin) Butler Shein (Bayer) 1040007
Ketamine Hydrochloride Butler Shein SKU# 023061
Betadine (Povidone-Iodine) Fisher (Perdue) 19-066452
Stereotax Kopf Model 900
Cauterizing Tool Stoelting 59017
Dissecting Microscope Nikon SMZ445
Dental Drill Buffalo 37800
Bacteriostatic Saline Bulter Schein 8973
Jewlers Screws Stoelting 51457
Microwire Array Microprobes Custom (Flexible)
Ground Wire Omnetics Custom Plug
Dental Acrylic Fisher (BAS) 50-854-402
Absorbable Sutures Fisher (Ethicon) NC0258473
Puralube (Opthalamic Ointment/Lubricant) Fisher (Henry Schein) 008897
Table 2. List of Surgical Instruments.
2x Microforceps George Tiemann Co. #160-57 Multi-use (e.g. clearing debris in skull window)
2x Forceps George Tiemann Co. #160-93 Multi-use (e.g. tying sutures)
6x Hemostats George Tiemann Co. #105-1125 Clamp and open incision
1x Small scissors George Tiemann Co. #105-411 Cut sutures after tying
1x Tissue forceps George Tiemann Co. #105-222 Holding tissue while suturing
1x Needle holder George Tiemann Co. #105-1259 Holding suture needle
1x Scalpel holder (with #11 blade) George Tiemann Co. #105-80 (w/ #105-71 blade) Making skull incision
1x #22 Scalpel blade George Tiemann Co. #160-381 Shaving scalp
1x Surgical Spatula George Tiemann Co. #160-718 Scraping skull to clear tissue on skull
Machine/Jewelers Screws Various N/A 0/80 x 1/8”
Table 3. List of Equipment for Recording Electrophysiological Signals.
Microwire Array & Connector Micro Probe, Inc. (Gaithersburg, MD) N/A (Part No. based on array characteristics) Cranially implanted in target recording region. Arrays are customized based on desired wire spacing, length, etc.
Unity-Gain Harness/Headstage M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ) Proj 1200 Initial amplification of neural signal; allows for propagation of small neural signals.
Commutator (and Optional Fluid Swivel) Plastics One, Inc. (Roanoke, VA) SL18C Allows animals to freely rotate while propagating electrical signal to preamp
Pre-amplifier M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ) Proj 1198 Differentially amplifies neural signals against a reference electrode.
Filter and Amplifier M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ) Proj 1199 Band-pass filters and further amplifies the differentially amplified signal.
Acquisition Computer EnGen (Phoenix, AZ) N/A (Custom Build) Runs software and hardware for behavioral and neural data acquisition.
A/D Card  Data Translation (Marlboro, MA) DT-3010 Digitizes neural signals for computer sampling.
Digital I/O Card Measurement Computing (Norton, MA) PCI CTR-05 Acquires behavioral inputs and outputs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carter, M., Shieh, J. C. Electrophysiology In: Guide to research techniques in neuroscience. Academic Press. (2009).
  2. Aston-Jones, G., Siggins, G. R. Electrophysiology. In: Psychopharmacology: The Fourth Generation of Progress. Kupfer, D., Bloom, F. E. Raven Press. (1995).
  3. Root, D. H., et al. Differential roles of ventral pallidum subregions during cocaine self-administration behaviors. J. Comp. Neurol. 521, (3), 558-588 (2013).
  4. Cardin, J. A. Dissecting local circuits in vivo: integrated optogenetic and electrophysiology approaches for exploring inhibitory regulation of cortical activity. (3-4), 106-103 (2012).
  5. Ma, S., et al. Amphetamine's dose-dependent effects on dorsolateral striatum sensorimotor neuron firing. Behav. Brain Res. (2013).
  6. Ghitza, U. E., et al. Persistent cue-evoked activity of accumbens neurons after prolonged abstinence from self-administered cocaine. J. Neurosci. 23, (19), 7239-7245 (2003).
  7. Tang, C., et al. Changes in activity of the striatum during formation of a motor habit. Eur. J. Neurosci. 25, (4), 1212-1227 (2007).
  8. Tang, C., et al. Dose and rate-dependent effects of cocaine on striatal firing related to licking. J. Pharmacol. Exp. Ther. 324, (2), 701-713 (2008).
  9. National Research Council. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals: Eighth Edition. The National Academies Press. Washington, DC. (2011).
  10. Fabbricatore, A. T., et al. Electrophysiological evidence of mediolateral functional dichotomy in the rat accumbens during cocaine self-administration: tonic firing patterns. Eur. J. Neurosci. 30, (12), 2387-2400 (2009).
  11. Root, D. H., et al. Slow phasic and tonic activity of ventral pallidal neurons during cocaine self-administration. Synapse. 66, (2), 106-127 (2012).
  12. Root, D. H., et al. Rapid-phasic activity of ventral pallidal neurons during cocaine self-administration. Synapse. 64, (9), 704-713 (2010).
  13. Tang, C. C., et al. Decreased firing of striatal neurons related to licking during acquisition and overtraining of a licking task. J. Neurosci. 29, (44), 12952-12961 Forthcoming.
  14. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. Academic Press/Elsevier. (1997).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics