Ett förfarande för Implantation Organized arrayer av Microwires för Single-enhet Inspelningar i Awake, uppför djur

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Implantation organiserade grupper av microwires för användning i singel-enhet elektrofysiologiska inspelningar presenterar en rad tekniska utmaningar. Metoder för utförande av denna teknik och den utrustning som krävs beskrivs. Dessutom är den nyttjanderätt till organiserade Microwire matriser för att spela in från olika neurala ekonomiska regioner med hög rumslig selektivitet diskuteras.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Barker, D. J., Root, D. H., Coffey, K. R., Ma, S., West, M. O. A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals. J. Vis. Exp. (84), e51004, doi:10.3791/51004 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

In vivo elektrofysiologiska inspelningar i vaken, beter djur ger en kraftfull metod för att förstå neural signalering vid encelliga nivå. Tekniken gör det möjligt för praktiker att tidsmässigt och regionalt granska särskilda bränning mönster för att korrelera inspelade aktionspotentialer med pågående beteende. Dessutom kan enstaka enhet inspelningar kombineras med en uppsjö av andra tekniker för att producera omfattande förklaringar av neural funktion. I den här artikeln beskriver vi anestesi och förberedelse för Micro implantation. Därefter räkna vi nödvändig utrustning och kirurgiska åtgärder för att exakt sätta in en Micro array i en målstruktur. Slutligen beskriver vi kortfattat den utrustning som används för att spela in från varje enskild elektrod i uppsättningen. De fasta Microwire arrayer beskrivs är väl lämpade för kronisk implantation och möjliggöra longitudinella inspelningar av neurala data i nästan alla beteende preparatividare. Vi diskuterar spåra elektrodspår att triangulera Microwire positioner samt sätt att kombinera Micro implantation med immunhistokemiska tekniker för att öka den anatomiska specificitet inspelade resultat.

Introduction

Elektrofysiologiska inspelningar tillåta forskare att undersöka de elektriska egenskaperna hos biologiska celler. I det centrala nervsystemet, där elektriska impulser fungera som en signalmekanism, dessa inspelningar är särskilt viktiga för att förstå neural funktion 1-2. Under enda enhet inspelningar i beter djur, är en mikroelektrod som har satts in i hjärnan kan registrera förändringar i en neuron generation av aktionspotentialer över tiden.

Medan många tekniker tillåter en att registrera hjärnans aktivitet, är enkel-enhet electrophysiology en av de mest precisa metoderna genom att tillåta upplösning på enda neuron nivå. När en hög grad av rumslig specificitet önskas kan microwires användas för att rikta diskreta sub-kärnor eller ensembler av celler inom brain3. Single-enhet inspelningar också dra nytta av hög tidsupplösning som inspelningar är korrekta på mikronivå. And, in vivo envakna inspelningar tillåter intakta krets interaktioner, med den naturliga miljön i afferenta och efferenta prognoser, systemisk kemiska och hormonella influenser, och fysiologiska parametrar. Neurala signaler kommer från sinnesintryck, motoriska beteenden, kognitiv behandling, neurokemi / farmakologi, eller en kombination. Således, separering av sensoriska, motoriska, kognitiva, och kemisk påverkan kräver genomtänkta experiment med effektiva oförutsedda händelser och kontroller som kan möjliggöra en bedömning av var och en av de ovan nämnda influenser. Allt som allt, inspelningar i beter djur tillåter praktiker att observera integration av flera informationskällor inom en fungerande krets och att härleda en mer omfattande modell av kretsfunktion.

Single-enhet inspelningar också lider av ett antal nackdelar som varje försöksledaren bör vara medveten om. Först och främst, kan inspelningar vara svårt att genomföra. Faktum egenskaper the huvudsteg förstärkare och de implanterade microwires som möjliggör rumsliga och tidsmässiga specificitet i dessa inspelningar gör också inspelningar mottagliga för påverkan av yttre elektriska signaler (dvs elektriskt "brus"). Således, förmågan att felsöka problem i en elektrofysiologisk systemet kräver en väl utvecklad teknisk förståelse av elektrofysiologiska principer och apparater. Det är också viktigt att notera att, under vissa omständigheter, kan inspelade elektriska signaler i extracellulära inspelningar utgör summan av flera neurala signaler. Vidare kan generalizabilityen av singel-enhet aktivitet att befolkningen aktivitet inom en målregion ofta begränsas av graden av cellulär heterogenitet inom målregionen (men se Cardin 4). Till exempel kan elektroderna vara partisk mot inspelning med hög amplitud utgångs nervceller i stället för andra celler. Den tolkningsbarhet av singel-enhet inspelningar ökargenom att kombinera inspelningar med andra tekniker innefattande, men inte begränsade till, elektriska (orthodromic eller antidromic), kemisk (t.ex. jontoforetisk eller designer receptor) eller optogenetic stimulering 4, temporära neurala inaktive, sensorimotor undersökningar 5, frånkopplingsförfaranden eller immunohistokemi 3.

I det protokoll som följer kommer vi att räkna upp de material och nödvändiga åtgärder för att implantera en organiserad Micro array i råtta (även om protokollet kan anpassas för användning i andra arter). Förfarandet och stil av fasta matriser som används i vårt laboratorium har visat sig vara tillförlitliga för longitudinella inspelningar och kan upprätthålla inspelningar av samma neuron i över en månads tid 6-8. Detta gör denna procedur idealisk för att pröva phasic svar på experimentella stimuli, plast förändringar i neurala svar, eller mekanismer för inlärning och motivation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Den största försiktighet måste vidtas för att upprätthålla aseptiska förhållanden (som beskrivs i handledningen för skötsel och användning av försöksdjur 9) samtidigt förbereda sig för och genomför följande procedur. Följande protokoll är i enlighet med handledningen för skötsel och användning av försöksdjur och har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén, Rutgers University. Det uppskattas att de efterföljande förfarandena kräver 3-6 timmar att slutföra.

Implantation av Micro Array:

  1. Place djuren under anestesi med användning av 50 mg / kg natriumpentobarbital (i.p.) och administrera 10 mg / kg av atropin metylnitrat (IP; Glykopyrrolat kan vara substituerad) och 0,25 mg penicillin (300.000 U / ml im) för att bibehålla andningsfunktionen och förhindra infektion , respektive.
    Notera: Med 3-6 tim längden på denna implantationskirurgi är natrium pentobarbital används eftersom det är kostnadseffektivt och begränsar människors exponering förbedövningsmedel (som kan uppstå vid långvarig användning av gas anestetika) samtidigt som det ger långvarig anestesi. Substitution av andra anestesimedel är acceptabelt.
  2. Kontrollera att bedövningen har tagit effekt med svansen nypa testet innan du fortsätter.
  3. Vid behov ge alternerande injektioner av ketamin-hydroklorid (60 mg / kg IP) och natriumpentobarbital (5 till 10 mg / kg IP) för att bibehålla anestesi under ingreppet.
  4. Raka hårbotten med användning av en # 22 skalpellblad.
  5. Desinficera rakades skalpen med povidonjod.
  6. Ge subkutana injektioner av bupivakain (~ 1 mg / kg SC fördelat på 4 injektionsställen) till lokalt söva hårbotten. Låt 5-10 minuter för lokalbedövning för att börja gälla.
  7. Placera en oftalmisk smörjmedel över ögonen för att behålla fukt under anestesi.
  8. Säkra djuret in i örat barer och näsa klämma av en stereotaktisk apparat.
  9. Använd visuella landmärken (t.ex. en horisontell bar på stereotaxic ram) till ungefär utjämna djurets huvud. Detta steg är endast avsedd att ungefär i nivå skallen.
  10. Gör ett snitt längs mittlinjen av hårbotten med hjälp av en # 11 skalpell blad monterat på en skalpell hållare. Snittet måste sträcka sig från strax bakom öronen till den bakre delen av det nasala benet.
  11. Med hjälp av en dissektion spatel, rensa skallen av alla kvarvarande vävnad tills båda sido åsar skallen och den bakre skallen åsen har uppnåtts.
  12. Dra tillbaka huden runt snittet med hjälp av ett antal peanger (6x).
  13. Rengör skallen av något blod och låt det torka. Om något kvar blödning uppstår, säga upp rest blödning med en liten etsande verktyg. Säkerställande av att skallen förblir ren och torr tillåter dentala akryl användes i efterföljande steg för att binda till skallen permanent.
  14. Mark bregma och lambda (Figur 2D) genom att interpolera skärningen mellan suturerna. En dissekera microscope är nödvändigt att noggrant markera dessa positioner.
  15. Bifoga ett litet spetsigt föremål (t.ex. ett stift eller tandläkarborr) till en stereotaktisk arm och sänka den för att bestämma den dorsala / ventrala (DV) koordinat bregma och lambda.
  16. Justera näsa klämman tills DV koordinater för bregma och lambda är inom 100 | im (0,1 mm) från varandra.
  17. När planat, spela in den främre / bakre (AP), mediala / laterala (ML) och DV-koordinater för bregma tillsammans med positionen för näsan klämman. Dubbla kontrollera koordinaterna för noggrannhet, eftersom återstoden av operation beror på precisionen i dessa koordinater.
  18. Använd de uppmätta koordinaterna för att beräkna ML och AP-koordinater för de fyra hörnen av "skallen fönstret" i förhållande till bregma (dvs. kraniotomi, Figur 1). Skallen fönstret är en exakt placerade rektangel genom vilken Micro array kommer att passera.
  19. Använd de beräknade koordinaterna för att markeraskallen fönstret samordnar på skallen med ett spetsigt stereotaktisk kvarstad och reservoarpenna bläck. För att få exakta märken, gäller endast en liten mängd bläck till toppen av märkningsverktyget med hjälp av en bomulls applikator.
  20. Borra skallen fönstret genom att ta bort benet i en serie av små lager.
    1. Börja med att borra de markerade hörnen av fönstret där varumärkena har placerats.
    2. Därefter ansluter hörnen och beskriver hur fönstret.
    3. Slutligen klar ut området inom konturen ned till djupet av dura mäter. Hålet måste vara bredare (dvs. avfasade) nedanför de ytliga skikten av skallen för att säkerställa att fönstret upprätthåller en lämplig bredd från topp till botten.
  21. Använd microforceps försiktigt bort återstående benbitar, skräp eller dura mater inuti skallen fönstret. Detta steg är ytterst viktigt, eftersom dessa bitar av material som kan äventyra integriteten i matrisen under sänkning. När rensas, måste man hålla the fönster fuktigt med bakteriostatisk saltlösning under återstoden av det kirurgiska ingreppet.
  22. Placera markeringarna på skallen för 5 skallen skruvar och 1 jordledning (Figur 1). Dessa positioner kommer att variera beroende på den målinriktade hjärnregion. Den huvudsteg kommer att vara mest säker om en skruv är placerad på vardera av de fem skallben. Placera både skallen skruvar och jordledningen på platser som inte kommer att störa Micro array placering.
  23. Borra hål för skallskruvar och dra åt skruvarna på plats. Skruvarna måste sänkas till bara 3-4 trådar visar (eller, om du använder andra än de som rekommenderas skruvar, tillräckligt djup för att korsa tjockleken på skallen för att främja array stabilitet men inte alltför djupt för att skada cortex). Rengör gängorna på skruvarna efter placering.
  24. Borra ett hål för jordledningen. Sänk tråden långsamt (under 1-2 minuter) till målet DV samordna och fixera kabeln på plats med hjälp av dentala akryl.
  25. Lägg akryl runt gängornai skallens skruvar. Innan akryl torkar, avlägsna överskottscement som flyter bort från marken tråd eller skallskruvar. Låt 15 minuter för dentala akryl torka / härda.
  26. Fäst array till stereotaxic armen. Nivå arrayen och rikta den så att det hållet kommer att passera genom gränserna för skallen fönstret.
  27. Placera saltlösning i skallen fönstret så att det är i nivå med skallen. Sänk arrayen tills det skapar en grop i saltlösning. Detta koordinatsystem används som skalle nivå för arrayen. Använd detta värde för att beräkna den slutliga DV koordinat i matrisen.
  28. Sänk arrayen långsamt tills den når sin slutliga DV koordinat. Stoppa varje 1mm av sänkning och vänta i flera minuter för att möjliggöra hjärnvävnad för att återhämta sig från gropar och att lösa upp den nedre delen av polyetylenglykol (PEG) på matrisen (PEG användes för att temporärt hålla trådarna i sin konformation och samtidigt sänka , och upplöses långsamt i saltlösning).
  29. När matrisen är 1mmbort från målet, sänk den långsamt tills slutmålet nås. Sänkning på 0,1-0,2 mm i taget innan man tillåter vävnaden att vila under en period av 5 minuter är att bevara vävnaden vid målplatsen samt proximala synapsförbindelser. Om utrustning finns tillgänglig, kan precisionen sänkning av arrayen bistås med hjälp av en motordriven manipulator.
  30. Lös resterande PEG och använda dentala akryl att cementera de microwires på plats. Lägg flera lager av cement för att se till att kablarna är säkra och låt 15-20 min för cementen att härda innan du fortsätter. Detta säkerställer att ledningarna inte kommer att knuffad från deras slutliga placering.
  31. Bygg upp resten av djurets huvudsteg med hjälp av dentala akryl. Använd akryl för att innesluta skallen skruvar, jordkabel och kontakt för microwires. Låt akryl hatten härda tillräckligt innan du fortsätter.
  32. Sutur hårbotten snitt med hjälp av absorberbara suturer och administrera 2 ml of bakteriostatisk saltlösning (sc) för att återställa vätsketillförsel från operation.
  33. Ta bort djuret från örat barer och placera motivet i ett rent område. Observera djuret ofta under den postoperativa återhämtningen tills termoreglering och locomotion har återhämtat sig. Efter återhämtning från anestesi, flytta djuret in single-höljet för återstoden av postoperativ återhämtning.
  34. Ge djuren dagliga postoperativ övervakning och vård i dagarna efter ingreppet. Återhämtning från detta förfarande är optimalt när sju eller fler dagar är tillåtna.
  35. Ge djuren injektioner av Karprofen (5mg/kg) och Enrofloxacin (5-10 mg / kg) eller deras motsvarigheter under återhämtning per schemat rekommenderas av behandlande veterinär.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En lista på utrustning som används av detta laboratorium för inspelning elektrofysiologiska signaler återfinns i tabell 3. Efter återhämtning från kirurgi, är enkelheter registreras genom att ansluta en enhet-gain huvudsteg i den implanterade kontakten. Denna huvudsteg är ansluten via en kabel till en kommutator, som är i stånd att rotera fritt utan avbrott i elektrofysiologiska inspelning genom användning av elektriska släpringar. Kommutatorn tillåter individer att fritt röra sig under inspelning under uppförande, som är en av de huvudsakliga fördelarna med detta preparat. Signalerna matas därefter genom en förförstärkare (10x förstärkning) som används för att differentiellt förstärka signalen på varje elektrod mot omgivningsbuller på en elektrod valts eftersom den inte uppvisar en enhetssignal. Differentiella inspelningar används för att amplifiera den momentana skillnaden mellan de två spänningarna. Eftersom båda trådarna spela in omgivande ljud ungefär lika, deras oppositionte polariteter faktiskt möjligt subtraktion av omgivande ljud från neurala inspelningar (Figur 2). Slutligen signaler är bandpass filtrerad (450 Hz till 10 kHz, roll off -1.5 dB / oktav vid 1 kHz och -6 dB / oktav vid 11 kHz) och förstärks 700x innan den digitaliseras med hjälp av en dator med en A / D-kort (50 kHz samplingsfrekvens / wire) och lagras för offline analys.

I programvara, är vågformer ofta samplas med hjälp av en tröskeldetekteringsmetod. Sålunda signaler, som passerar en given spänningströskel digitaliseras och lagras. Ändå finns det en inneboende hastighet av falskt positiva, i vilka elektriska artefakter passerar tröskeln, filtrering och differentiell förstärkning, och samplas. Dessa icke-neurala vågformer subtraheras post hoc använda spik-sortering programvara som gör utsläpp i urvalet ska sorteras utifrån deras parametrar (t.ex. amplitud, topp och dal spänningar osv.) Och därefter möjliggör eliminering av electrical "brus" och valet av den neuronala signalen (figur 3). Vågformerna är inkluderade för analys om 1) Vågformer närvarande med kanoniska mönster av neural aktivitet inklusive en klart definierad aktionspotential och efter hyperpolarisation (figur 3, högra panelen), 2) amplituden hos en förmodade neurala uppvisar vågformsdata åtminstone en signal 02:01 : brusförhållande (dvs. är klart skiljas från kanalens brusband, amplitud av buller band = ca .. 50 μV), 3) Parametrar förblir stabila under hela sessionen och 4) ett interspike intervall (ISI) histogram visar att inga utsläpp skett under neuron naturliga refraktärperioden (dvs. ~ 2 ms, fig 3 till vänster).

Neural utsläpp kan sedan korreleras med beteende händelser (t.ex. spaken svarar) som redovisas som tidsstämplar via användning av en digital input-output (I / O)-kort. Dessa tidsstämplar kan användas för att skapa peri-händelse tids histogram (PETHs; Figur 4A), som används för att visa neuronala urladdningar som inträffar i en specificerad tidsområde kring ett visst beteende-händelse. Vårt laboratorium har oftast undersökt neurala bränning i storleksordningen timmar (Tonic 10), minuter (långsam-phasic 11), och sekunder / millisekunder (Rapid-phasic 12). Tonic bränning används vanligtvis för att undersöka de mest globala händelser i en session. Till exempel använder vi ofta detta att jämföra bränning priser av nervceller, när djuren är själv administrera läkemedel, dvs predrug kontra på narkotika bränning priser. Långsam phasic analyser används ofta för att undersöka bränning under slow föränderliga händelser som den farmakologiska sönderfallet av en drog under några minuter. Slutligen är snabba phasic analyser används för mer momentana händelser som en operant respons eller uppkomsten av en experimentell kö.

Figur 4 visar ett histogram av tonic bränningmed en räkning av utsläpp på 30 andra papperskorgar i en hel inspelning under kokain självförvaltning. Exemplet visade cellen är känslig för förändringar i kroppens nivåer av kokain och blir hämmad (Figur 4A) som djurets kropp av kokain ökar (Figur 4B), men återgår till sin ursprungliga eldhastighet som nivån på kokain sjunker efter själv- administrationsutsedda har upphört. Beroende på målet regionen, kan neuroner vara känsliga för farmakologiska effekter, eller valfritt antal beteende evenemang inklusive belöning-associerad ledtrådar 6, sensorimotor ingång 13, eller motiverad strategi 3.

Under rätt förutsättningar är det möjligt att spela in samma neuron för många sessioner. I striatum är neuroner homogent fördelade (80% av trådar ger endast en enda enhet och cellerna inte är skiktad eller tätt grupperade) och producerar relativt små signaler som snabbt förfall over avstånd. Under dessa betingelser, har vårt laboratorium kunnat spela in samma neuron i striatum för flera veckor. Viktigt kan verifieras inte alla nervceller över sessioner och inte alla neuroner bibehålls över tid. Bestämma en förmåga att få dessa typer av longitudinella inspelningar kräver noggrann testning av den elektrofysiologiska systemet. Till exempel är det möjligt att uppskatta inspelningen avstånd microwires med hjälp körbara elektroder. När betraktas tillsammans med de fysikaliska egenskaperna hos de trådar, regional anatomi, och vågformen parametrarna hos neuron över arbetspass kan man bestämma med rimlig säkerhet om att en vågform som har upprätthållits över arbetspass 7,8,13.

Figur 1
Figur 1. Representative placeringar för "skallen fönstret" (dvs. kraniotomi), skallskruvarna och jordledning. A) en dorsal vy av skallen som visar placeringen av en skalle skruv på varje platta av skallen (röd), en skalle fönster (fyrkant) och ett kontralateralt hål för jordledningen (grön). Vid planering av skallen fönster bör koordinaterna definieras genom att bestämma B) främre och C) posteriora mediala och laterala koordinaterna för målregionen (t.ex. dorsolaterala striatum). D) Dessa koordinater kan sedan användas för att bestämma placeringen av fönstret på den dorsala ytan av skallen. Observera att skallen fönstret motsvarar de mediala och laterala mål som identifierats i B och C och sträcker sig över det angivna området i anteroposterior planet mellan B och C också. Dessa koordinater ska vara specifika för varje enskilt målområde. Representative locaningar av de microwires i en 2 x 8 matris visas med små prickar i skallen fönstret som visas i D. Den slutliga dorsoventral koordinaten av trådarna kommer att bero på det djup till vilket de är nedfällda. Siffrorna ändras från Paxinos och Watson 14. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 2
Figur 2. En illustration av förfarandet enligt differentiell amplifiering. Den översta panelen representerar en neural signal före differentiell förstärkning (signal + brus). Efter differentiell förstärkning, yttre elektriska signaler som finns på alla kanaler (Noise, mellersta panel) effektivt kan subtraheras från inspelningen wires via användningen av en bestämd differential elektrod för att förbättra isoleringen av den neurala vågform (Signal; nedre panelen).

Figur 3
Figur 3. Ett exempel neurala vågform (höger) inspelad från en tråd av en Micro array. Histogrammet (till vänster) visar antalet aktionspotentialer i millisekunder som föregår varje observerade neurala ansvarsfrihet sessionen. Varje fack representerar en 1 millisekunds period. Histogrammet visar att inga aktionspotentialer inträffade i neuron naturliga refraktärperiod (2 ms).

Figur 4
Figur4. Ett exempel på en neuron som tonically hämmas under kokain självförvaltning. A) eldhastighet (Spikes/30 sek) för en neuron över en lång tillgång kokain självadministrering session i 30 andra fack. B) Motsvarande beräknade läkemedelsnivå över samma session. I kombination är ökningar av läkemedelsnivå korrelerade med en fördjupning i neural bränning. Således, när sessionen slutar vid ~ 425 minuter, återhämtar neurala bränning som kroppens nivåer av kokain hösten.

Figur 5
Figur 5. Histologiska snitt från två djur med Microwire implantat. A) En Nissl färgade avsnitt med hjälp av neutralrött i kombination med en kaliumferrocyanid räknare fläck avslöjar skadade Microwire tips (blå).En Micro kan spåras från hjärnbarken ner till tråd tips (blå) genom att följa trådspåren i vävnaden. Spår kan spåras i en enda skiva eller en serie av intilliggande skivor. B) Ett avsnitt färgas för substans P, som avslöjar den ventrala pallidum, i kombination med en kaliumferrocyanid räknare fläcken. Använda immunohistologiska tekniker, kan enskilda mikrotrådar placeras inom specifika delar av hjärnan, eller till och med inom vissa delregioner av en viss kärna. Figuren visar en Micro spets (blå) lokaliserad inom den ventrala pallidum med hjälp av substans P fläcken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Cellulära inspelningar utgör en kraftfull experimentell teknik som kan integreras i nästan alla försöks beredning i neurovetenskap. Trådar som har implanterats i organiserade matriser kan spåras eftersom deras axlar passerar genom hjärnan och in i deras målområde (Figur 5A). När en liten, efter experimentell lesionen skapas vid oisolerade Micro spets för att skapa en liten järn insättning av tråd av rostfritt stål, kan en exakt markera platsen för den oisolerade Micro spetsen (där den enda enhet registrerades) under användning av en lösning av 5% kaliumferrocyanid och 10% HCl (fig. 5A och 5B; blå punkter). Sålunda kan en lätt använda en serie av följande hjärnan skivor för att återskapa positionen för hela antenn inom hjärnan. Slutligen kan de ovan nämnda tekniker med lätthet kombineras med immunhistokemi för att öka den rumsliga specificitet inspelningar, föratt kontrollera riktade placeringar och även i syfte att studera regionala skillnader inom ett enda mål kärna 3 (fig 5B).

För att uppnå önskad rumslig specificitet, Micro arrayer måste utformas och implanteras med omsorg. Först och främst måste det inbördes avståndet mellan de rader och kolumner i matrisen vara konstruerad speciellt för regionen av intresse. Matriser som är för långt eller brett för det önskade målet kan minska noggrannheten eller producera ett stort antal trådar som faller på gränsen mellan två närliggande kärnor. Samtidigt kan microwires åtskilda alltför nära varandra förbjuda en separat avgränsning av varje elektrod. För det andra måste Microwire arrayer hanteras varsamt för att bevara integriteten i arrayen. Enda elektrod arrayer produceras med hjälp av tunna hårliknande trådar som lätt kan skadas eller knuffad från deras konfiguration vid kontakt. Kvaliteter dessa trådar är idealiska för att minska skador to vävnad på väg förhållningssätt till sitt mål och även låta trådarna att skifta i samförstånd med små rörelser i hjärnan. Därför är det oftast lämpligt att lagra matriser på en säker plats och undvika att ta bort matriser från sina skyddsfodral förrän strax före implantation. Dessutom måste man vara försiktig när steriliseringsMicroWire arrayer. I vissa fall kan autoklavering av elektroder vara acceptabelt. Emellertid kan etylenoxid eller UV sanitization vara föredraget att skydda ömtåliga arrayer. Slutligen elektrodmetallen och isolering, och diametern för var och en, bör övervägas noga. Till exempel kommer endast elektroder som innehåller järn (t.ex. rostfritt stål) kunna framställa berlinerblått reaktioner för individuell avgränsning av varje Micro i arrayen.

Ibland kommer microwires i arrayen avvika från sin konfiguration under sänkning på grund obemärkt hinder (t.ex. skallfragment i skallen fönstret) eller dålig hektarndling. I dessa fall kan en sådan Microwire kan ofta fortfarande spåras till dess spets (även om det sannolikt kommer att vara utanför målregionen). Skulle en instans uppstå där kan inte verifieras någon numrerad Micro i matrisen, är det viktigt att integriteten av experimentet att djuret tas bort från datasetet. Felaktig tolkning av en enskild Micro ställning kan göra det möjligt för nervsignaler för att försvåra eller korrupta tolkning av data.

Under implantation, precisionen i skallen fönstret och array anpassning är också viktigt att rikta noggrannhet. Skull fönster måste göras tillräckligt bred för att tillåta arrayen att passera utan att böja eller skada kablarna. Å andra sidan är fönstret också användas för att noggrant vägleda arrayen till målpositionen och måste därför borras med precision i varje dimension. När redo för implantation, måste man också vara säker på att matrisen är lod med skallen fönster i alla dimensioner. Det vill säga,en liten lutning av uppsättningen i vilken dimension som helst kan förorsaka matrisen att antingen delvis eller helt missa målet kärnan. Slutligen bör särskild försiktighet iakttas vid sänkning de första 1-3 mm. Det är under den initiala sänkning att stycken av skräp som har gått obemärkt i skallen fönstret kan äventyra integriteten i arrayen och rubba den sträcka microwires. Om sökvägen till microwires hindras medan de långsamt sänks, kan man se microwires böja eller böja under lätt förstoring innan arrayen ådrar sig skador (t.ex. med hjälp av ett förstoringsglas). Vid denna punkt, kan microwires dras tillbaka och kan rensas skräp från fönstret innan det fortsätter med implantering.

Sist men inte minst, framgångsrik implantering av Microwire matriser kräver särskild uppmärksamhet på att upprätthålla en aseptisk operationssal och ge grundlig postoperativ vård. I kombination med de ovan nämnda försiktighetsåtgärder, kan livskraftiga inspelningar erhållas frånområden av intresse för drygt en månad, har vi verifierat inspelningar upp till 40 dagar efter operation 6. Kanske viktigast av allt, ger livslängden för dessa inspelningar möjlighet att studera diskreta funktionella kretsar inom den komplexa miljö av elektriska, kemiska och hormonella influenser och svara på viktiga frågor om vilken roll dessa kretsar i inlärning och motivation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen att lämna ut.

Acknowledgments

Denna studie stöddes av National Institute on Drug Abuse beviljar DA 006.886 (MOW) och DA 032.270 (DJB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Table 1. List of Surgical Materials.
Gauze Fisher (MooreBrand) 19-898-144
Cotton Swabs Fisher (Puritan) S304659
Nembutal (Pentobarbital) Sigma Aldrich P3761
Atropine Methyl Nitrate Sigma Aldrich A0382
Baytril (Enrofloxacin) Butler Shein (Bayer) 1040007
Ketamine Hydrochloride Butler Shein SKU# 023061
Betadine (Povidone-Iodine) Fisher (Perdue) 19-066452
Stereotax Kopf Model 900
Cauterizing Tool Stoelting 59017
Dissecting Microscope Nikon SMZ445
Dental Drill Buffalo 37800
Bacteriostatic Saline Bulter Schein 8973
Jewlers Screws Stoelting 51457
Microwire Array Microprobes Custom (Flexible)
Ground Wire Omnetics Custom Plug
Dental Acrylic Fisher (BAS) 50-854-402
Absorbable Sutures Fisher (Ethicon) NC0258473
Puralube (Opthalamic Ointment/Lubricant) Fisher (Henry Schein) 008897
Table 2. List of Surgical Instruments.
2x Microforceps George Tiemann Co. #160-57 Multi-use (e.g. clearing debris in skull window)
2x Forceps George Tiemann Co. #160-93 Multi-use (e.g. tying sutures)
6x Hemostats George Tiemann Co. #105-1125 Clamp and open incision
1x Small scissors George Tiemann Co. #105-411 Cut sutures after tying
1x Tissue forceps George Tiemann Co. #105-222 Holding tissue while suturing
1x Needle holder George Tiemann Co. #105-1259 Holding suture needle
1x Scalpel holder (with #11 blade) George Tiemann Co. #105-80 (w/ #105-71 blade) Making skull incision
1x #22 Scalpel blade George Tiemann Co. #160-381 Shaving scalp
1x Surgical Spatula George Tiemann Co. #160-718 Scraping skull to clear tissue on skull
Machine/Jewelers Screws Various N/A 0/80 x 1/8”
Table 3. List of Equipment for Recording Electrophysiological Signals.
Microwire Array & Connector Micro Probe, Inc. (Gaithersburg, MD) N/A (Part No. based on array characteristics) Cranially implanted in target recording region. Arrays are customized based on desired wire spacing, length, etc.
Unity-Gain Harness/Headstage M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ) Proj 1200 Initial amplification of neural signal; allows for propagation of small neural signals.
Commutator (and Optional Fluid Swivel) Plastics One, Inc. (Roanoke, VA) SL18C Allows animals to freely rotate while propagating electrical signal to preamp
Pre-amplifier M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ) Proj 1198 Differentially amplifies neural signals against a reference electrode.
Filter and Amplifier M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ) Proj 1199 Band-pass filters and further amplifies the differentially amplified signal.
Acquisition Computer EnGen (Phoenix, AZ) N/A (Custom Build) Runs software and hardware for behavioral and neural data acquisition.
A/D Card  Data Translation (Marlboro, MA) DT-3010 Digitizes neural signals for computer sampling.
Digital I/O Card Measurement Computing (Norton, MA) PCI CTR-05 Acquires behavioral inputs and outputs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carter, M., Shieh, J. C. Electrophysiology In: Guide to research techniques in neuroscience. Academic Press. (2009).
  2. Aston-Jones, G., Siggins, G. R. Electrophysiology. In: Psychopharmacology: The Fourth Generation of Progress. Kupfer, D., Bloom, F. E. Raven Press. (1995).
  3. Root, D. H., et al. Differential roles of ventral pallidum subregions during cocaine self-administration behaviors. J. Comp. Neurol. 521, (3), 558-588 (2013).
  4. Cardin, J. A. Dissecting local circuits in vivo: integrated optogenetic and electrophysiology approaches for exploring inhibitory regulation of cortical activity. (3-4), 106-103 (2012).
  5. Ma, S., et al. Amphetamine's dose-dependent effects on dorsolateral striatum sensorimotor neuron firing. Behav. Brain Res. (2013).
  6. Ghitza, U. E., et al. Persistent cue-evoked activity of accumbens neurons after prolonged abstinence from self-administered cocaine. J. Neurosci. 23, (19), 7239-7245 (2003).
  7. Tang, C., et al. Changes in activity of the striatum during formation of a motor habit. Eur. J. Neurosci. 25, (4), 1212-1227 (2007).
  8. Tang, C., et al. Dose and rate-dependent effects of cocaine on striatal firing related to licking. J. Pharmacol. Exp. Ther. 324, (2), 701-713 (2008).
  9. National Research Council. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals: Eighth Edition. The National Academies Press. Washington, DC. (2011).
  10. Fabbricatore, A. T., et al. Electrophysiological evidence of mediolateral functional dichotomy in the rat accumbens during cocaine self-administration: tonic firing patterns. Eur. J. Neurosci. 30, (12), 2387-2400 (2009).
  11. Root, D. H., et al. Slow phasic and tonic activity of ventral pallidal neurons during cocaine self-administration. Synapse. 66, (2), 106-127 (2012).
  12. Root, D. H., et al. Rapid-phasic activity of ventral pallidal neurons during cocaine self-administration. Synapse. 64, (9), 704-713 (2010).
  13. Tang, C. C., et al. Decreased firing of striatal neurons related to licking during acquisition and overtraining of a licking task. J. Neurosci. 29, (44), 12952-12961 Forthcoming.
  14. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. Academic Press/Elsevier. (1997).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics