Hayvanlar davranmak, Awake Tek-birim Recordings Microwires Organize Dizileri implantasyon için Usulü

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Tek ünite elektrofizyolojik kayıtlar kullanılmak üzere microwires organize dizileri implante teknik sorunlar bir dizi sunuyor. Bu teknik ve gerekli ekipman yerine getirilmesi için yöntemler tarif edilmiştir. Ayrıca, yüksek uzaysal seçicilik ile farklı nöral altbölgeler kayıt örgütlü mikrotel dizilerin faydalı kullanımı tartışılmıştır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Barker, D. J., Root, D. H., Coffey, K. R., Ma, S., West, M. O. A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals. J. Vis. Exp. (84), e51004, doi:10.3791/51004 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Uyanık in vivo elektrofizyolojik kayıtları olarak davranmak hayvan tek hücre düzeyinde sinir sinyal anlamak için güçlü bir yöntem sağlar. Teknik deneyci devam eden davranış ile kaydedilen aksiyon potansiyelleri ilişkilendirmek için zamansal ve bölgesel spesifik ateş desenleri incelemek için olanak sağlar. Ayrıca, tek ünite kayıtları sinir işlevinin kapsamlı açıklamalar üretmek için diğer tekniklerin bir bolluk ile birleştirilebilir. Bu yazıda, Mikro implantasyon için anestezi ve hazırlanmasını tarif etmektedir. Daha sonra, biz gerekli ekipman ve doğru bir hedef yapısı içine bir mikrotel dizi eklemek için cerrahi adımlar numaralandırmak. Son olarak, kısaca dizideki her bir elektrot kayıt için kullanılan ekipman tanımlamak. Açıklanan sabit mikrotel diziler kronik emplantasyon için çok uygundur ve hemen hemen herhangi bir davranış preparatl nöral veri kayıtları uzunlamasına kılabilmektedirüzerinde. Biz mikrotel konumları yanı sıra kaydedilen sonuçların anatomik özgüllüğünü arttırmak amacıyla immunohistokimyasal teknikler ile mikrotel implantasyonu birleştirmek için yollar üçgen elektrot izlerinin tartışacağız.

Introduction

Elektrofizyolojik kayıtlar bilim adamları, biyolojik hücrelerin elektriksel özelliklerini incelemek için izin verir. Elektriksel uyarılar bir sinyal mekanizması olarak hizmet merkezi sinir sistemi içinde, bu kayıtlar sinir fonksiyonu 1-2 anlaşılması için özel bir önem taşımaktadır. Hayvanlar davranıyor tek birim kayıtları sırasında, beynin içine yerleştirilen bir Mikroelektrot zamanla aksiyon potansiyelleri bir nöronun nesil değişiklikleri kayıt yapabiliyor.

Birçok teknik bir beyin aktivitesini kaydetmek için izin verirken, tek ünite elektrofizyoloji tek nöron düzeyinde çözünürlük sağlayarak en hassas yöntemlerden biridir. Mekansal yüksek bir spesifite derecesi isteniyorsa, microwires ayrık alt çekirdek ya da brain3 içinde hücre toplulukları hedeflemek için kullanılabilir. Kayıtları mikrosaniye düzeyinde doğru olarak tek birim kayıtları da yüksek temporal çözünürlük yarar. Ve, bir in vivowake kayıtları afferent ve efferent projeksiyonlar, sistemik kimyasal ve hormonal etkiler, ve fizyolojik parametrelerin doğal çevre ile bozulmamış devre etkileşimleri sağlar. Sinir sinyalleri duyusal girdi motor davranışları, bilişsel işleme, nörokimyasal / farmakoloji, ya da bazı kombinasyonundan türetilmiştir. Bu duruma göre, duyusal, motor, bilişsel ve kimyasal etkilere ve segregasyon belirtilen etkilerin her değerlendirilmesi için izin verebilir etkili yükümlülükler ve kontrolleri ile iyi tasarlanmış deneyler gerekli kılmaktadır. Sonuçta, hayvanlar davranıyor kayıtları denemecileri işleyen bir devre içinde birden çok bilgi kaynaklarının entegrasyonunu gözlemlemek ve devre fonksiyonu daha kapsamlı bir model elde etmek için izin verir.

Tek birimli kayıtlar aynı zamanda herhangi bir deneyi bilmelidir ki dezavantajları bir karşı karşıyadır. Birincisi ve en önemlisi, kayıtları yapmak zor olabilir. Gerçekten de, th özelliklerie headstage yükselticiler ve bu kayıtları mekansal ve zamansal özgüllük için izin implante microwires de gereksiz elektrik sinyalleri (yani elektrikli "gürültü") etkisiyle kayıtları duyarlı hale getirir. Buna göre, bir elektrofizyolojik sistemi sorunları giderme yeteneği elektrofizyolojik ilke ve aparatının iyi gelişmiş bir teknik anlayış gerektirir. Belli koşullar altında, hücre dışı kayıtlarında kaydedilen elektriksel sinyaller birden fazla nöral sinyallerin toplamını temsil edebilir, dikkat etmek de önemlidir. Ayrıca, bir hedef bölge içinde popülasyon aktivitesine tek birim aktivitesi genellenebilirlik genellikle, hedef bölge içinde hücresel heterojenlik derecesi ile sınırlı (fakat Cardin 4) olabilir. Örneğin, elektrot diğer hücrelerin yerine yüksek genlikte bir çıkış nöronlar kayıt karşı önyargılı olabilir. Tek ünite kayıtların klanmas artardahil olmak üzere, diğer teknikler ile kombine kayıtları, ancak bunlarla sınırlı değildir göre, elektrik (veya ortodromik antidromic), kimyasal (örneğin, iyontoforetik veya tasarımcı reseptör) veya stimülasyon optogenetic 4, geçici sinir inactivations, sensorimotor incelemeleri 5, kesme işlemleri, 3 ya da immünohistokimya.

(Protokol diğer türlerde kullanılmak üzere uyarlanabilir de) sıçanda organize bir mikrotel dizi implant edilmesi için gerekli olan malzeme ve adımlar numaralandırma aşağıdaki protokolde. Laboratuvarımızda kullanılan sabit diziler prosedür ve stil boyuna kayıtları için güvenilir kanıtlamış ve bir aylık süre 6-8 aşkın süredir aynı nöron kayıtları devam edebilir. Bu deneysel uyaranlara, sinirsel tepkiler plastik değişiklikler, ya da öğrenme ve motivasyon mekanizmaları fazik yanıtları incelemek için bu prosedür idealdir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Için hazırlanması ve aşağıdaki prosedürü yürütürken (9 Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nda açıklandığı gibi) son derece dikkatli aseptik koşullarda korumak için alınmalıdır. Aşağıdaki protokol Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu ile uyumlu olduğunu ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu, Rutgers Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Bu, daha sonraki işlemleri tamamlamak için 3-6 saat gerektirir tahmin edilmektedir.

Mikro Array implante:

  1. Yer anestezisi uygulanmış hayvanlar 50 mg / kg sodyum pentobarbital (ip) kullanılarak ve atropin metil nitrat, 10 mg / kg yönetmek (IP; Glikopirolat ikame edilebilir) ve 0.25 mg penisilin (300.000 U / ml im) solunum fonksiyonu korumak ve enfeksiyonu önlemek için sırasıyla.
    Not: Bu maliyet-etkin ve insan maruziyetini sınırlar, çünkü bu implantasyon cerrahisi 3-6 saat uzunluğu ile, sodyum pentobarbital kullanılıranestetikler (gaz anestezik uzun süreli kullanımı ile ortaya çıkabilecek gibi) yine uzun süreli anestezi sağlarken. Diğer anestezik yer değiştirmesi kabul edilebilir.
  2. Anestezi geçmeden önce kuyruk tutam testi kullanılarak etkisi almıştır doğrulayın.
  3. Gerekli olduğu gibi, ameliyat boyunca anesteziyi muhafaza etmek üzere ketamin hidroklorür (60 mg / kg IP) ve sodyum pentobarbital (5-10 mg / kg IP) enjeksiyon alternatif verir.
  4. Bir # 22 neşter bıçak kullanarak kafa derisi tıraş.
  5. Povidon iyot ile traş kafa derisi dezenfekte edin.
  6. Bupivakain deri altına enjeksiyon vermek (~ 4 enjeksiyon siteleri üzerinden 1 mg / kg SC spread) lokal olarak saç derisini uyutmak. Etkili olması için lokal anestezik için 5-10 dakika bekleyin.
  7. Anestezi sırasında nemi korumak için gözleri üzerinde bir göz yağlayıcı yerleştirin.
  8. Kulak çubukları ve bir stereotaksik tertibatının burun kelepçe içine hayvan edin.
  9. Ster görsel işaretlerini kullanın (örneğin, yatay bir çubukyaklaşık hayvanın kafasını seviyeye eotaxic kare). Bu adım sadece yaklaşık seviyeye kafatası içindir.
  10. Bir neşter tutucuya monte # 11 neşter bıçak kullanarak kafa derisi orta hat boyunca bir kesi yapmak. Kesi burun kemiğinin arka kısmına sadece kulakların arkasından genişletmek gerekir.
  11. Lateral kafa sırtlar ve posterior kafatası sırt hem ulaşıncaya kadar bir diseksiyon spatula kullanarak, kalan tüm doku kafatası temizleyin.
  12. Hemostatlarla bir dizi (6x) kullanarak kesi etrafındaki deriyi geri çekin.
  13. Herhangi bir kan kafatası temizleyin ve kurutun. Kalan kanama oluşursa, küçük bir dağlama aracı ile artık kanamayı sonlandırmak. Kafatası temiz ve kuru kalmasını sağlamak sonraki aşamalarda kullanılan dental akrilik sürekli kafatası bağlamak sağlar.
  14. Mark Bregma ve kafatası sütür kesişim interpolating lambda (Şekil 2B). A diseksiyon mikrofonroscope doğru bu konumları işaretlemek için gereklidir.
  15. Stereotaksik kol küçük sivri kalem (örneğin bir pim ya da diş matkap ucu) takın ve dorsal / ventral (DV) belirlemek için alt bregmaya ve lambda koordinatı.
  16. DV birbirinden 100 um (0.1 mm) içindedir bregma ve lambda için koordinatları kadar burun kelepçe ayarlayın.
  17. Bir kez tesviye, anterior / posterior (AP) kayıt lateral / medial (ML) ve DV burun kelepçe konumu ile birlikte bregmaya koordinatları. Cerrahi kalan bu koordinatların duyarlığına bağlıdır gibi, doğruluk için koordinatları kontrol çift.
  18. ML ve AP bregmaya "kafatası pencere" göreli (; Şekil 1 yani kraniotomi) dört köşe koordinatları hesaplamak için ölçülen koordinatları kullanın. Kafatası penceresi mikrotel dizi geçeceği kesin olarak konumlandırılmış dikdörtgen.
  19. Işaretlemek için hesaplanan koordinatları kullanınkafatası pencere sivri stereotaksik eki ve dolma kalem mürekkep kullanılarak kafatası koordinatları. Kesin işaretleri elde etmek için, pamuklu bir aplikatör ile işaretleme aracının ucuna kadar mürekkep sadece küçük bir miktar uygulanır.
  20. Küçük tabakaların bir dizi kemik kaldırılarak kafatası pencereden dışarı delin.
    1. Işaretleri yerleştirilmiş pencerenin işaretli köşeleri sondaj başlayın.
    2. Sonraki, köşeleri bağlamak ve pencere anahat.
    3. Son olarak, açık dura mater derinliğe kadar anahat içinde alanı dışında. Delik pencere yukarıdan aşağıya doğru uygun bir genişlik muhafaza sağlamak için kafatası yüzeysel katlarının altında (yani açılı) daha geniş olması gerekir.
  21. Dikkatli kafatası penceresinin içinde kalan kemik cips, enkaz veya dura mater kaldırmak için microforceps kullanın. Bu malzeme bit indirme sırasında dizisinin bütünlüğünü tehlikeye olarak bu aşama, son derece önemlidir. Bir kez temizlendi, bir th tutmalısınızAmeliyattan geri kalanı için bakteriyostatik tuzlu su ile nemli e pencere.
  22. 5 kafatası vida ve 1 zemin tel kafatası (Şekil 1) işaretlerini yerleştirin. Bu pozisyonlar, hedeflenen beyin bölgesi bağlı olarak değişecektir. Bir vida 5 kafatası kemiği her yer ise headstage en güvenli olacaktır. Mikrotel dizi yerleştirme ile engel olmaz yerlerde kafatası vidaları ve topraklama kablosunu hem yerleştirin.
  23. Kafatası vidalar için delikler delin ve yerinde vidaları ile sabitleyin. Vidalar sadece 3-4 ipler (korteksi zarar değil çok derin şekilde veya tavsiye edilenden başka vidaları kullanarak, eğer yeterince derin dizi istikrarı teşvik etmek kafatası kalınlığı kastetmek için ama) gösteren kadar indirilmesi gerekir. Yerleştirildikten sonra vidaların dişlerini temizleyin.
  24. Topraklama teli için bir delik delin. Hedef DV koordine ve diş akrilik kullanarak yerine tel düzeltmek için (1-2 dakika boyunca) yavaş yavaş tel indirin.
  25. Konuları etrafında akrilik eklekafatası vidalar. Akrilik kurumadan önce, uzak topraklama kablosu veya kafatası vida akar herhangi bir aşırı çimento kaldırın. / Sertleşmesine kurumaya diş akrilik için 15 dakika bekleyin.
  26. Stereotaksik koluna dizi takın. Dizi seviye ve dürüstçe kafatası penceresinin sınırları geçecek, böylece onu yönlendirin.
  27. Bu kafatası ile aynı seviyede olacak şekilde kafatası penceresinde tuzlu su koyun. Bu tuzlu su içinde bir çukur oluşturur kadar bir dizi aşağı indirin. Bu koordinat dizisi için kafatası seviyesi olarak da kullanılır. Nihai DV dizinin koordine hesaplamak için bu değeri kullanın.
  28. Onun nihai DV koordinat ulaşıncaya kadar yavaş yavaş dizi indirin. Düşürücü her 1 mm durdurun ve beyin dokusu (PEG düşürürken, geçici olarak bir şekle sahip olan teller tutmak için kullanılır dimpling kurtarmak ve dizisinde, polietilen glikol (PEG) alt kısmını çözmek için izin vermek amacıyla bir kaç dakika bekleyin ve benzeri) tuzlu su içinde yavaş yavaş çözülür.
  29. Dizi 1 mm olduğunda,Nihai hedef ulaşana kadar uzak hedeften daha yavaş indirin. Doku 5 dakikalık bir süre boyunca dinlenmeye izin vermeden önce bir anda 0,1-0,2 mm düşürülmesi hedef bölgede hem de yakın sinaptik bağlantıların da dokuyu korumak için tasarlanmıştır. Ekipman mevcut ise, dizinin düşürücü hassas motorlu bir manipülatör kullanılarak desteklenebilir.
  30. Kalan PEG çözülür ve yerine microwires çimento diş akrilik kullanın. Teller güvenli olmasını sağlamak ve daha sonra devam etmeden önce sertleşmesine çimento için 15-20 dk izin çimento çoklu katmanlar ekleyin. Bu teller, son yerleştirme jostled olmayacak sağlar.
  31. Diş akrilik kullanarak hayvanın headstage kalan oluşturun. Microwires için kafatası vidaları, topraklama kablosu ve konektörü örtmek için akrilik kullanın. Akrilik şapka geçmeden önce yeterince sertleşmesini bekleyiniz.
  32. Emilebilir sütürler kullanarak saçlı deri kesi dikin ve yönetmek 2 ml of ameliyat hidrasyon geri bakteriyostatik tuz (sc).
  33. Kulak çubukları hayvan çıkarın ve temiz bir alanda konuyu yerleştirin. Termoregülasyon ve hareket iyileşene kadar ameliyat sonrası iyileşme sırasında sık sık hayvan gözlemlemek. Anestezinin etkisinden kurtulana kadar sonra, ameliyat sonrası iyileşme kalan tek hayvan yuva içine hareket eder.
  34. Hayvanlar günlük postoperatif izleme vermek ve prosedürü izleyerek günlerde önemsiyorum. Yedi ya da daha fazla gün izin verildiğinde bu prosedüre Kurtarma uygunudur.
  35. Hayvanlara Carprofen (5mg/kg) ve Enrofloxacin katılan veteriner hekim tarafından önerilen program başına kurtarma sırasında (5-10 mg / kg) veya eşdeğer enjeksiyonu verin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Elektrofizyolojik sinyaller kayıt için bu laboratuvar tarafından kullanılan Ekipman listesi Tablo 3'te bulunabilir. Cerrahi işlemden sonra, tek üniteler implante konektörüne bir birlik-kazanç headstage takarak kaydedilir. Bu headstage elektrikli kayma halkaları kullanımı yoluyla elektrofizyolojik kayıt tatili olmadan ücretsiz dönme yeteneğine sahip bir komütatör, bir kablo ile bağlanır. Komütatör bu hazırlık ilkesinin avantajlarından biridir davranışı sırasında kayıt sırasında denekler serbestçe hareket etmesine olanak sağlar. Sinyaller daha sonra bir birim sinyal sergilemeyen için farklı olarak seçilen bir elektrot üzerinde ortam gürültüsü üzerinde her bir elektrot üzerindeki sinyal yükseltmek için kullanılan bir ön amplifikatöre (10x kazanç) aracılığıyla beslenir. Diferansiyel kayıtları iki gerilim arasındaki anlık farkı yükseltmek için kullanılır. Hem teller, yaklaşık eşit olarak muhalefet gürültüleri kayıt Çünküte kutupları etkili nöral kayıtları ortam gürültü çıkarma (Şekil 2) etkinleştirin. Son olarak, sinyalleri filtreden band geçiren vardır (450 Hz ile 10 kHz, 1 kHz ve -6 dB / oktav 11 kHz at -1.5 dB / oktav roll off) bir A / D kartı ile bir bilgisayar yardımıyla sayısallaştırılarak önce ve güçlendirilmiş 700X (50 kHz örnekleme frekansı / tel) ve çevrimdışı analiz için saklanır.

Yazılım olarak, dalga genellikle bir eşik saptama yöntemi ile örneklenir. Bu nedenle, belirli bir gerilim eşiği geçiş sinyalleri dijital ve depolanır. Yine de, elektrik eserler eşik, filtre edilir ve diferansiyel amplifikasyon geçmesine ve örneklenmiş olduğu yanlış pozitiflerin içsel bir oranı vardır. Bu non-nöral dalga (. Vb örneğin, genlik, pik ve vadi gerilimler,) örneklenmiş atıkların kendi parametrelerine göre sıralanır sağlar başak-sıralama yazılımı kullanarak post-hoc çıkarılır ve daha sonra el ortadan kaldırılması için olanak vardırectrical "gürültü" ve nöronal sinyal seçimi (Şekil 3). Waveforms için analize dahil olup olmadığını net olarak tanımlanmış bir eylem potansiyeli ve hiperpolarizasyonuna sonra (Şekil 3 de dahil olmak üzere nöral aktivitenin kanonik desenleri ile mevcut 1) Waveforms; sağ panel); azından bir sinyal 02:01 farazi bir sinir dalga sergileyen 2) genlik : gürültü oranı (yani açıkça kanalın gürültü bandından ayrılabilir değil, gürültü bant genlik = yakl .. 50 mV); histogram hiçbir boşalmalar meydana geldiğini göstermektedir 3) Parametreler bütün oturum boyunca sabit kalır ve 4) bir interspike aralığı (ISI) nöronun doğal refrakter dönem (yani ~ 2 msn; Şekil 3 panelini sola).

Nöral deşarjlar daha sonra bir dijital giriş-çıkış (I / O) kartı kullanımı yoluyla damgaları olarak kaydedilir davranışsal olayların (örn. kol yanıt) ile ilişkili olabilir. Bu zaman, Belirli bir davranış olay etrafında belirli bir zaman aralığında meydana nöronal deşarjları görüntülemek için kullanılır;-pullar peri-olay zaman histogramlarını (Şekil 4A PETHs) oluşturmak için kullanılabilir. Bizim laboratuvar genelde saat (Tonik 10), dakika (Slow-Fazik 11) sipariş üzerine sinir ateş incelenmiş ve saniye / milisaniye (Rapid-Fazik 12) oldu. Tonik ateşleme tipik bir oturumda en küresel olayları incelemek için kullanılır. Hayvanlar kendini yönetme ilaç, yani, ilaç öncesi karşı on-ilaç ateşleme oranları Örneğin, sık sık nöronların ateşleme oranlarını karşılaştırmak için kullanabilirsiniz. Yavaş faz analizleri genellikle dakika boyunca bir ilacın farmakolojik çürümesi gibi yavaş değişen olaylar sırasında ateş incelemek için kullanılır. Son olarak, hızlı faz analizleri bir operant yanıt veya deneysel işaret başlangıcından gibi daha anlık olaylar için kullanılır.

Şekil 4 tonik ateş bir histogram gösteriyorkokain öz-yönetim sırasında bütün bir kayıt oturumu genelinde 30 saniye kutularına deşarjları bir sayısı ile. Gösterilen örnekte, hücre kokain vücut seviyelerindeki değişimlere karşı hassastır ve kokain artar (Şekil 4B) ve hayvanın vücut seviyesi olarak (Şekil 4A) inhibe hale gelir, ancak kokain düzeyi olarak orijinal ateşleme hızı döner sonra düşer kendini yönetim şarta sona erdi. Hedef bölgeye bağlı olarak, nöronlar farmakolojik etkileri, ya da ödül-ilişkili ipuçlarının 6, algılayıcı girişi 13 veya motive yaklaşım 3 de dahil olmak üzere davranışsal olaylar herhangi bir sayıda duyarlı olabilir.

Doğru koşullar altında, bir çok oturumları için aynı nöron kaydetmek mümkündür. Striatum, nöronlar homojen dağıtılmış (tellerin% 80 tek bir birim verim ve hücreler katmanlı veya sıkıca gruplandırılmış değildir) ve bu hızla çürüme ove nispeten küçük sinyaller üretmekr mesafe. Bu şartlar altında, çok sayıda laboratuar hafta striatum içindeki aynı nöron kayıt mümkün olmuştur. Önemlisi, tüm nöronlar oturumlar boyunca kontrol edilebilir ve tüm nöronların zamanla tutulur. Uzunlamasına kayıtlar bu tür elde etmek için bir yeteneğini belirleyen elektrofizyolojik sisteminin dikkatli test gerektirir. Örneğin, sürülebilir elektrotlar kullanarak microwires kayıt mesafeyi tahmin etmek mümkündür. Teller, bölgesel anatomi ve oturumlar boyunca nöronun dalga parametrelerinin fiziksel özelliklerinin yanında bakıldığında, tek bir dalga seans 7,8,13 boyunca muhafaza edildiğini makul güven ile belirleyebilirsiniz.

Şekil 1
Şekil 1. Temsili"kafatası penceresi" (yani kraniotomi), kafatası vida ve zemin tel yerleşimleri ive. A) kafatası (kırmızı), bir kafatası pencerede (kare), ve topraklama kablosu (yeşil) için bir kontralateral deliğin her tabakta bir kafatası vida yerleşimini gösteren kafatası bir dorsal görünümü. Kafatası penceresi planlarken, koordinatlar) B belirlenerek tanımlanır anterior ve C) posterior medial ve hedef bölge için yanal koordinatları (örn. dorsolateral striatum). D) Bu koordinatlar daha sonra pencerenin yerleşimini belirlemek için kullanılabilir olmalıdır kafatasının dorsal yüzeyi üzerinde. Kafatası pencere B ve C olarak belirlenmiş ve medial yan hedeflere karşılık gelir ve aynı zamanda B ve C arasında ön-arka düzlemde belirtilen aralık yayılan unutmayın. Bu koordinatlar, her bir hedef bölgeye özgü olacaktır. Temsilci loca2 x 8 dizideki microwires tions D gösterilen kafatası pencere içinde küçük noktalar kullanarak gösterilmiştir. Nihai dorsoventral tellerin koordinatı da düşürülmüştür derinliğine bağlıdır. Paxinos & Watson 14 modifiye rakamlar. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Şekil 2,
Şekil 2,. Diferansiyel amplifikasyon işleminin bir örnek. Üstteki paneli amplifikasyon diferansiyel önce bir sinir sinyali (Sinyal + Gürültü) temsil eder. Aşağıdaki diferansiyel büyütme, tüm kanallarda bulunan gereksiz elektrik sinyalleri (Gürültü; orta panel) etkili kayıt wi çıkarılır edilebilirNöral dalga (; alt panel Sinyal) izolasyonunu geliştirmek amacıyla belirtilen bir diferansiyel elektrot kullanımı ile res.

Şekil 3,
Şekil 3. Bir mikrotel dizinin bir tel kaydedilen bir örnek nöral dalga (sağda). Histogram (solda) Her oturumda sinir deşarjı gözlenen önceki milisaniye aksiyon potansiyellerin sayısını gösterir. Her bin bir 1 milisaniye dönemi temsil eder. Histogram hiçbir aksiyon potansiyelleri nöronun doğal refrakter dönem (2 msn) meydana geldiğini göstermektedir.

Şekil 4,
Rakam4.. Tonik kokainin kendi kendine uygulanması sırasında inhibe edilir. Bir nöronun bir örneği, A) 30 saniye bidonları uzun erişim kendi kendine kokain alma oturumu boyunca bir nöronun ateşleme hızı (Spikes/30 sn). B) karşılık gelen Aynı oturumda genelinde hesaplanan ilaç düzeyi. Birlikte, ilaç düzeyde artışlar nöral ateş bir depresyon ile ilişkilidir. Oturum ~ 425 dk biter Buna göre, sinirsel ateşleme kokain düşme vücut seviyeleri olarak kurtarır.

Şekil 5,
Şekil 5. Mikrotel implantlar ile iki hayvanlardan histolojik dilimleri. A) lezyonlu mikrotel ipuçları (mavi) ortaya çıkaran bir potasyum ferrosiyanür karşı leke ile birlikte nötr kırmızı kullanılarak bir Nissl lekeli bölümü.Bir mikrotel dokusunda tel parçaları takip ederek tel uçları (mavi) aşağı korteks izlenebilmektedir. Tracks tek bir dilim veya bitişik dilim bir dizi. B) bir potasyum ferrosiyanür karşı leke ile birleştiğinde ventral pallidum ortaya Madde P için lekeli bir bölüm içinde izlenebilir. Immünohistolojik teknikleri kullanarak, ayrı ayrı mikro teller spesifik beyin bölgeleri içinde, ya da belirli bir çekirdeğinin belirli alt-bölgeler içinde lokalize edilmiş olabilir. Şekil Madde P leke kullanılarak ventral pallidum içinde lokalize bir mikrotel ucu (mavi) göstermektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ekstrasellüler kayıtları Nörobilimdeki neredeyse her deneysel hazırlık dahil edilebilir güçlü bir deney tekniği temsil eder. Kendi milleri (Şekil 5A) beyin aracılığıyla ve hedef bölgeye geçmek gibi organize dizilerde implante edilmiş teller izlenebilir. Küçük, post-deneysel lezyon paslanmaz çelik telden küçük bir demir depozito oluşturmak için noninsulated mikrotel ucunda oluşturulduğunda, biri tam bir çözüm kullanarak (tek ünite kaydedildi) yalıtılmamış mikrotel ucunun konumunu işaretleyebilirsiniz % 5 potasyum ferrosiyanür ve% 10 HCI (, mavi noktalar Şekil 5A ve 5B). Bu nedenle, hali hazırda, bir beyin içinde bütün dizinin konumunu yeniden oluşturmak için daha sonra beyin dilimleri bir dizi kullanılabilir. Son olarak, yukarıda belirtilen teknikler kolayca amacıyla, kayıtların uzamsal özgüllüğünü geliştirmek için immünohistokimya ile birleştirilebilirHedef yerleşimleri doğrulayın, ve hatta tek bir hedef çekirdeğe 3 (Şekil 5B) içinde alt bölgesel farklılıklarını incelemek için için.

Istenen uzamsal özgüllüğünü elde etmek için, mikrotel diziler tasarlanmış ve dikkatle implante edilmesi gerekir. Birincisi ve en önemlisi, dizi içindeki satır ve sütun aralığı ilgi bölge için özel olarak tasarlanmış olmalıdır. Istenilen hedef için çok uzun veya geniş Diziler doğruluğunu azaltmak veya iki komşu çekirdekleri arasındaki sınırda düşmek tellerin sayıda üretebilir. Aynı zamanda, birbirine çok yakın aralıklı microwires her bir elektrotun ayrı bir çizme yasaklayabilir. İkincisi, mikrotel diziler dizinin bütünlüğünü korumak için dikkatle ele alınması gerekir. Tek elektrot diziler temas ettiğinde kolayca hasar veya yapılandırmasından çekeceğiniz edilebilir ince, saç gibi teller kullanılarak üretilmektedir. Bu tellerin nitelikleri hasar t azaltmak için idealdiro da kişinin hedefe yaklaşma yolunda doku ve teller beynin küçük hareketlerle konser kaydırmaya izin verir. Böylece, güvenli bir yerde dizileri saklamak ve sadece implantasyon öncesinde kadar koruyucu durumlarda diziler kaldırarak önlemek için genellikle tavsiye edilir. Mikrotel diziler sterilizasyon yaparken de dikkat edilmelidir. Bazı durumlarda, elektrot otoklavlama kabul edilebilir. Bununla birlikte, etilen oksit ya da UV sanitization kırılgan diziler korumak tercih edilebilir. Son olarak, elektrot metal ve izolasyon ve her birinin çapı, dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır. Örneğin, demir (örneğin paslanmaz çelik) içeren sadece elektrotlar dizideki her Mikrotelin bireysel çizilmesi için Prusya mavisi reaksiyonlar üretmek mümkün olacak.

Vesileyle, dizideki microwires nedeniyle farkedilmeden engellerden düşürücü sırasında yapılandırma sokak (örn. kafatası kafatası penceresinde fragmanları) veya kötü handling. Bu durumlarda, böyle bir mikrotel çoğu hala (büyük olasılıkla hedef bölge dışında olsa da) onun ucuna izlenebilir. Dizisindeki herhangi sayılı mikrotel doğrulanmadı olamaz nerede bir örneği doğarsa, bu hayvan kümesi kaldırılır deney bütünlüğü önemlidir. Tek bir mikrotel pozisyonunun yanlış yorumlanması karmaşık veya veri bozuk yorumlanması onun sinir sinyalleri etkinleştirebilirsiniz.

Implantasyon sırasında, kafatası pencere ve dizi hizalama hassasiyeti de doğruluğunu hedef için kritik öneme sahiptir. Kafatası pencere yeterince geniş bir dizi bükme veya zarar telleri olmadan geçmesine izin vermek için yapılmalıdır. Öte yandan, pencere, aynı zamanda doğru hedef konuma dizi kılavuz için kullanılır ve bu nedenle, her boyutta hassas delinmelidir. Ne zaman implantasyon için hazır, bir de dizi tüm boyutlarıyla kafatası pencere ile çekül emin olmalısınız. Yani,herhangi bir boyutta dizinin hafif bir eğim ya da kısmen ya da tamamen hedef çekirdeği kaçırmak için dizi neden olabilir. İlk 1-3 mm düşürücü Son olarak, özel bakım alınmalıdır. Bu kafatası pencere içinde fark edilmeden gitti enkaz parçaları dizinin bütünlüğünü tehlikeye ve microwires yolunu üzgün olduğunu düşürücü ilk harflerinin sırasında. Yavaş yavaş indirilir iken microwires yolu tıkalıysa, bir microwires bend görebilirsiniz ya da dizi (bir büyüteç kullanarak örneğin) herhangi bir hasara maruz kalırsa önce hafif büyütme altında yay. Bu noktada, microwires katlanabilirler ve enkaz implantasyonu ile devam etmeden önce penceresinden silinebilir.

Son fakat en az değil, mikrotel dizilerin başarılı implantasyonu aseptik ameliyathane bakımı ve kapsamlı post-operatif bakım sağlamaya özel bir dikkat gerektirir. Yukarıda belirtilen önlemleri ile birlikte, uygun bir kayıt elde edilebilirbir ay yukarı ilgi bölgeleri; ameliyat 6 izleyen 40 gün kadar kayıtları doğruladıktan. Belki de en önemlisi, bu kayıtların uzun ömürlü elektrik, kimyasal ve hormonal etkilerin karmaşık ortam içinde ayrık fonksiyonel devreleri çalışma ve öğrenme ve motivasyon bu devrelerin rolü hakkında önemli soruları cevaplamak için fırsat sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa etmek hiçbir rakip mali çıkarları var.

Acknowledgments

Bu çalışma Uyuşturucu Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenen DA 006886 (MOW) ve DA 032270 (DJB) verir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Table 1. List of Surgical Materials.
Gauze Fisher (MooreBrand) 19-898-144
Cotton Swabs Fisher (Puritan) S304659
Nembutal (Pentobarbital) Sigma Aldrich P3761
Atropine Methyl Nitrate Sigma Aldrich A0382
Baytril (Enrofloxacin) Butler Shein (Bayer) 1040007
Ketamine Hydrochloride Butler Shein SKU# 023061
Betadine (Povidone-Iodine) Fisher (Perdue) 19-066452
Stereotax Kopf Model 900
Cauterizing Tool Stoelting 59017
Dissecting Microscope Nikon SMZ445
Dental Drill Buffalo 37800
Bacteriostatic Saline Bulter Schein 8973
Jewlers Screws Stoelting 51457
Microwire Array Microprobes Custom (Flexible)
Ground Wire Omnetics Custom Plug
Dental Acrylic Fisher (BAS) 50-854-402
Absorbable Sutures Fisher (Ethicon) NC0258473
Puralube (Opthalamic Ointment/Lubricant) Fisher (Henry Schein) 008897
Table 2. List of Surgical Instruments.
2x Microforceps George Tiemann Co. #160-57 Multi-use (e.g. clearing debris in skull window)
2x Forceps George Tiemann Co. #160-93 Multi-use (e.g. tying sutures)
6x Hemostats George Tiemann Co. #105-1125 Clamp and open incision
1x Small scissors George Tiemann Co. #105-411 Cut sutures after tying
1x Tissue forceps George Tiemann Co. #105-222 Holding tissue while suturing
1x Needle holder George Tiemann Co. #105-1259 Holding suture needle
1x Scalpel holder (with #11 blade) George Tiemann Co. #105-80 (w/ #105-71 blade) Making skull incision
1x #22 Scalpel blade George Tiemann Co. #160-381 Shaving scalp
1x Surgical Spatula George Tiemann Co. #160-718 Scraping skull to clear tissue on skull
Machine/Jewelers Screws Various N/A 0/80 x 1/8”
Table 3. List of Equipment for Recording Electrophysiological Signals.
Microwire Array & Connector Micro Probe, Inc. (Gaithersburg, MD) N/A (Part No. based on array characteristics) Cranially implanted in target recording region. Arrays are customized based on desired wire spacing, length, etc.
Unity-Gain Harness/Headstage M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ) Proj 1200 Initial amplification of neural signal; allows for propagation of small neural signals.
Commutator (and Optional Fluid Swivel) Plastics One, Inc. (Roanoke, VA) SL18C Allows animals to freely rotate while propagating electrical signal to preamp
Pre-amplifier M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ) Proj 1198 Differentially amplifies neural signals against a reference electrode.
Filter and Amplifier M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ) Proj 1199 Band-pass filters and further amplifies the differentially amplified signal.
Acquisition Computer EnGen (Phoenix, AZ) N/A (Custom Build) Runs software and hardware for behavioral and neural data acquisition.
A/D Card  Data Translation (Marlboro, MA) DT-3010 Digitizes neural signals for computer sampling.
Digital I/O Card Measurement Computing (Norton, MA) PCI CTR-05 Acquires behavioral inputs and outputs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carter, M., Shieh, J. C. Electrophysiology In: Guide to research techniques in neuroscience. Academic Press. (2009).
  2. Aston-Jones, G., Siggins, G. R. Electrophysiology. In: Psychopharmacology: The Fourth Generation of Progress. Kupfer, D., Bloom, F. E. Raven Press. (1995).
  3. Root, D. H., et al. Differential roles of ventral pallidum subregions during cocaine self-administration behaviors. J. Comp. Neurol. 521, (3), 558-588 (2013).
  4. Cardin, J. A. Dissecting local circuits in vivo: integrated optogenetic and electrophysiology approaches for exploring inhibitory regulation of cortical activity. (3-4), 106-103 (2012).
  5. Ma, S., et al. Amphetamine's dose-dependent effects on dorsolateral striatum sensorimotor neuron firing. Behav. Brain Res. (2013).
  6. Ghitza, U. E., et al. Persistent cue-evoked activity of accumbens neurons after prolonged abstinence from self-administered cocaine. J. Neurosci. 23, (19), 7239-7245 (2003).
  7. Tang, C., et al. Changes in activity of the striatum during formation of a motor habit. Eur. J. Neurosci. 25, (4), 1212-1227 (2007).
  8. Tang, C., et al. Dose and rate-dependent effects of cocaine on striatal firing related to licking. J. Pharmacol. Exp. Ther. 324, (2), 701-713 (2008).
  9. National Research Council. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals: Eighth Edition. The National Academies Press. Washington, DC. (2011).
  10. Fabbricatore, A. T., et al. Electrophysiological evidence of mediolateral functional dichotomy in the rat accumbens during cocaine self-administration: tonic firing patterns. Eur. J. Neurosci. 30, (12), 2387-2400 (2009).
  11. Root, D. H., et al. Slow phasic and tonic activity of ventral pallidal neurons during cocaine self-administration. Synapse. 66, (2), 106-127 (2012).
  12. Root, D. H., et al. Rapid-phasic activity of ventral pallidal neurons during cocaine self-administration. Synapse. 64, (9), 704-713 (2010).
  13. Tang, C. C., et al. Decreased firing of striatal neurons related to licking during acquisition and overtraining of a licking task. J. Neurosci. 29, (44), 12952-12961 Forthcoming.
  14. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. Academic Press/Elsevier. (1997).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics