Una procedura per l'impianto Array organizzata di microfili per Recordings singola unità di Awake, Comportarsi Animali

Neuroscience

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Summary

Impiantare array organizzate di microfili per l'uso in single-unit registrazioni elettrofisiologiche presenta una serie di sfide tecniche. Sono descritti metodi per eseguire questa tecnica e le attrezzature necessarie. Inoltre, i frutti di un array Microconduttori organizzati per registrare da sub-regioni neurali distinti con elevata selettività spaziale è discusso.

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Barker, D. J., Root, D. H., Coffey, K. R., Ma, S., West, M. O. A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals. J. Vis. Exp. (84), e51004, doi:10.3791/51004 (2014).

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Abstract

In vivo registrazioni elettrofisiologiche nella veglia, animali comportarsi forniscono un potente metodo per la comprensione segnalazione neurale a livello di singola cellula. La tecnica consente sperimentatori di esaminare temporalmente e regionale modelli di cottura specifici al fine di correlare i potenziali d'azione registrati con il comportamento in corso. Inoltre, le registrazioni singola unità possono essere combinati con una pletora di altre tecniche per produrre spiegazioni complete della funzione neurale. In questo articolo, descriviamo l'anestesia e la preparazione per Microwire impianto. Successivamente, annoveriamo l'attrezzatura necessaria e passaggi chirurgici per inserire con precisione una matrice microconduttori in una struttura di destinazione. Infine, descriviamo brevemente l'attrezzatura utilizzata per registrare da ciascun elettrodo nella matrice. Gli array Microconduttori fissi descritti sono particolarmente adatti per l'impianto cronica e consentono registrazioni longitudinali di dati neurali in quasi tutte le Preparati comportamentalion. Discutiamo rintracciamento brani elettrodi per triangolare posizioni Microconduttori nonché modi per combinare microconduttori impianto con tecniche di immunoistochimica per aumentare la specificità anatomica dei risultati registrati.

Introduction

Registrazioni elettrofisiologiche permettono agli scienziati di esaminare le proprietà elettriche delle cellule biologiche. Nel sistema nervoso centrale, in cui gli impulsi elettrici servono come meccanismo di segnalazione, queste registrazioni sono di particolare importanza per la comprensione funzione neurale 1-2. Durante le registrazioni singola unità a comportarsi animali, un microelettrodo che è stato inserito nel cervello è in grado di registrare i cambiamenti nella generazione di un neurone di potenziali d'azione nel corso del tempo.

Mentre molte tecniche permettono di registrare l'attività cerebrale, monoblocco elettrofisiologia è uno dei metodi più precisi consentendo risoluzione a livello di singolo neurone. Quando si desidera un alto grado di specificità spaziale, microfili possono essere utilizzati per indirizzare discreti sotto-nuclei o insiemi di cellule all'interno del brain3. Registrazioni singola unità beneficiano anche di alta risoluzione temporale registrazioni sono accurate a livello di microsecondo. E, in vivo unregistrazioni veglia consentono interazioni circuito intatto, con l'ambiente naturale della afferenti ed efferenti proiezioni, chimico sistemico e influenze ormonali e parametri fisiologici. Segnali neurali sono derivati ​​da input sensoriali, comportamenti motori, elaborazione cognitiva, neurochimica / farmacologia, o una combinazione. Di conseguenza, la segregazione di sensoriali, motorie, cognitive, e chimiche influenze richiede esperimenti ben concepiti, con rischi e controlli efficaci che possono consentire per la valutazione di ciascuna delle influenze di cui sopra. Tutto sommato, le registrazioni a comportarsi animali permettono sperimentatori di osservare l'integrazione di più fonti di informazioni all'interno di un circuito funzionante e per derivare un modello più completo della funzione del circuito.

Registrazioni singola unità soffrono anche di una serie di svantaggi, la cui sperimentatore deve essere consapevole. In primo luogo, le registrazioni possono essere difficili da condurre. Infatti, le proprietà di the amplificatori Headstage e le microfili impiantati che permettono specificità spaziale e temporale in queste registrazioni rende anche registrazioni suscettibile all'influenza di segnali elettrici estranei (cioè "disturbo" elettrico). Di conseguenza, la capacità di risolvere i problemi in un sistema elettrofisiologico richiede una comprensione tecnica ben sviluppata di principi e apparecchi elettrofisiologici. E 'anche importante notare che, in determinate circostanze, segnali elettrici registrati nelle registrazioni extracellulari possono rappresentare la somma di più segnali neurali. Inoltre, la generalizzazione dell'attività singola unità all'attività popolazione all'interno di una regione bersaglio può spesso essere limitata dal grado di eterogeneità cellulare all'interno della regione bersaglio (ma vedi Cardin 4). Ad esempio, gli elettrodi possono essere prevenuto verso registrazione neuroni di output elevata ampiezza in luogo di altre cellule. L'interpretabilità delle registrazioni singola unità è aumentatacombinando registrazioni con altre tecniche, tra cui, ma non limitatamente a, elettrici (ortodromica o antidromica), chimica (ad es iontoforetico o recettore designer) o optogenetic stimolazione 4, inattivazioni neurali temporanee, esami sensomotori 5, le procedure di disconnessione o immunoistochimica 3.

Nel protocollo che segue enumereremo i materiali e le fasi necessarie per impiantare una matrice microconduttori organizzata nel ratto (anche se il protocollo può essere adattato per l'uso in altre specie). Il procedimento e lo stile di array fissi utilizzati nel nostro laboratorio hanno dimostrato affidabile per registrazioni longitudinali e possono sostenere registrazioni della stessa neurone nel tempo per un mese 6-8. Ciò rende questa procedura ideale per l'esame delle risposte fasiche agli stimoli sperimentali, i cambiamenti plastici in risposte neurali, o meccanismi di apprendimento e motivazione.

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Protocol

La massima cura deve essere presa per mantenere condizioni di asetticità (come descritto nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio 9) durante la preparazione e lo svolgimento della seguente procedura. Il protocollo che segue è conforme alla Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio ed è stato approvato dalla cura degli animali ed uso Comitato Istituzionale, Rutgers University. Si stima che le procedure successive richiederanno 3-6 ore per completare.

Impiantare Array Microwire:

  1. Inserire animali sotto anestesia utilizzando 50 mg / kg sodio pentobarbital (ip) e amministrare 10 mg / kg di nitrato di atropina metile (IP; Glicopirrolato può essere sostituito) e 0,25 mg di penicillina (300.000 U / ml im) per mantenere la funzione respiratoria e prevenire l'infezione rispettivamente.
    Nota: Con la lunghezza di 3-6 ore di questa chirurgia impianto, pentobarbital di sodio viene usato perché è conveniente e limita l'esposizione umana alleanestetici (come potrebbe accadere con l'uso prolungato di anestetici a gas), pur fornendo anestesia di lunga durata. Sostituzione di altri anestetici è accettabile.
  2. Verificare che l'anestesia ha avuto effetto utilizzando il test tail pinch prima di procedere.
  3. Se necessario, invia alternando iniezioni di ketamina cloridrato (60 mg / kg ip) e sodio pentobarbital (5-10 mg / kg ip) per mantenere l'anestesia durante l'intervento chirurgico.
  4. Shave il cuoio capelluto con una lama da bisturi # 22.
  5. Disinfettare il cuoio capelluto rasato con povidone iodio.
  6. Dare iniezioni sottocutanee di bupivacaina (~ 1 mg / kg SC sviluppa su 4 siti di iniezione) per anestetizzare localmente il cuoio capelluto. Lasciare 5-10 min per l'anestetico locale per avere effetto.
  7. Inserire un lubrificante oftalmico sopra gli occhi per mantenere l'umidità durante l'anestesia.
  8. Fissare l'animale in bar orecchio e il naso morsetto di un apparato stereotassico.
  9. Utilizzare punti di riferimento visivi (ad esempio una barra orizzontale sul stertelaio eotaxic) per livellare approssimativamente la testa dell'animale. Questa fase ha il solo scopo approssimativamente a livello del cranio.
  10. Praticare un'incisione lungo la linea mediana del cuoio capelluto con una lama da bisturi # 11 montato su un supporto bisturi. L'incisione deve estendersi da appena dietro le orecchie alla porzione posteriore dell'osso nasale.
  11. Utilizzando una spatola dissezione, cancellare il cranio di tutto il tessuto rimanente fino sono stati raggiunti entrambi i crinali cranio laterali e la cresta cranio posteriore.
  12. Tirare indietro la pelle intorno l'incisione utilizzando un numero di hemostats (6x).
  13. Pulire il cranio di qualsiasi sangue e lasciarlo asciugare. Se si verifica un sanguinamento residuo, interrompere il sanguinamento residuo con un piccolo strumento cauterizzazione. Assicurare che il cranio rimane pulita e asciutta consente acrilico dentale usati nelle fasi successive di legarsi al cranio permanentemente.
  14. Mark bregma e lambda (Figura 2D) interpolando l'intersezione delle suture cranio. Un microfono dissezioneROSCOPE è necessario marcare con precisione queste posizioni.
  15. Attaccare un piccolo oggetto appuntito (ad esempio una spilla o dei denti punta) ad un braccio stereotassico e abbassarlo per determinare la dorsale / ventrale (DV) coordinata bregma e lambda.
  16. Regolare il morsetto naso fino coordinate DV per bregma e lambda sono entro 100 micron (0,1 mm) di ogni altro.
  17. Una volta livellato, registrare anteriore / posteriore (AP), mediale / laterale (ML) e DV coordinate di bregma con la posizione del morsetto naso. Controllare due volte le coordinate per la precisione, come il resto della chirurgia dipende dalla precisione di queste coordinate.
  18. Utilizzare le coordinate misurate per calcolare la ML e coordina AP per i quattro angoli della "finestra cranio" relativo al bregma (cioè craniotomia; la figura 1). La finestra cranio è un rettangolo posizionato proprio attraverso la quale la matrice microconduttori passerà.
  19. Utilizzare le coordinate calcolate per segnare ilCoordinate finestra teschio sul cranio con un allegato stereotassico punta e inchiostro della penna stilografica. Per ottenere segni precisi, applicare solo una piccola quantità di inchiostro alla punta dell'utensile marcatura con un applicatore di cotone.
  20. Perforare fuori dalla finestra cranio rimuovendo l'osso in una serie di piccoli strati.
    1. Inizia forando gli angoli marcati della finestra in cui sono stati collocati i segni.
    2. Quindi, collegare gli angoli e delineare la finestra.
    3. Infine, chiaro l'area all'interno della struttura fino alla profondità di dura madre. Il foro deve essere più ampio (cioè smussato) sotto gli strati superficiali del cranio per garantire che la finestra mantiene una larghezza appropriata dall'alto verso il basso.
  21. Utilizzare microforceps per rimuovere con attenzione i chip qualsiasi osso residuo, detriti, o dura madre all'interno della finestra del cranio. Questo passo è estremamente importante, in quanto questi bit di materiale possono compromettere l'integrità della matrice durante la discesa. Una volta eliminato, si deve tenere the finestra umido con soluzione salina batteriostatica per il resto della chirurgia.
  22. Posizionare le marcature sul cranio per 5 viti cranio e 1 filo di terra (Figura 1). Queste posizioni varieranno a seconda della regione del cervello mirata. Headstage sarà più sicuro se una vite è posto su ciascuna delle 5 ossa del cranio. Posizionare entrambe le viti del cranio e filo di terra in luoghi che non interferiscono con il posizionamento di matrice Microwire.
  23. Praticare i fori per le viti cranio e fissare le viti a posto. Le viti devono essere abbassati fino a solo 3-4 discussioni stanno mostrando (o, se si utilizzano viti diverse da quelle raccomandate, abbastanza profonda per attraversare lo spessore del cranio di promuovere la stabilità matrice, ma non troppo in profondità in modo da danneggiare la corteccia). Pulire i filetti delle viti dopo il posizionamento.
  24. Praticare un foro per il cavo di terra. Abbassare il filo lentamente (più di 1-2 minuti) per il DV obiettivo di coordinare e fissare il filo in posizione utilizzando acrilico dentale.
  25. Aggiungere acrilico intorno i filidelle viti cranio. Prima si asciuga acrilici, rimuovere eventuali eccessi di cemento che scorre lontano dal filo di terra o viti cranio. Lasciare 15 minuti per l'acrilico dentale ad asciugare / indurire.
  26. Fissare la matrice al braccio stereotassico. Livellare la matrice e orientarlo in modo che possa esattamente passare attraverso i confini della finestra cranio.
  27. Mettere salina nella finestra cranio in modo che sia a livello con il cranio. Abbassare la matrice finché si crea una fossetta nella soluzione salina. Questo coordinate serve come livello cranio per la matrice. Utilizzare questo valore per calcolare la coordinata DV finale della matrice.
  28. Abbassare la matrice lentamente fino a raggiungere la coordinata DV finale. Fermare ogni 1mm discesa ed attendere per alcuni minuti per consentire tessuto cerebrale riprendersi da fossette e per sciogliere la porzione inferiore del polietilenglicole (PEG) sulla matrice (PEG viene utilizzato per mantenere temporaneamente i fili nella loro conformazione riducendo , e si dissolve lentamente in soluzione salina).
  29. Quando la matrice è di 1 mmdistante dal target, abbassarlo più lentamente fino a raggiungere la destinazione finale. Abbassamento a 0,1-0,2 mm alla volta prima di consentire il tessuto a riposo per un periodo di 5 min mira a preservare il tessuto presso il sito di destinazione, nonché connessioni sinaptiche prossimali. Se l'apparecchiatura è disponibile, precisione abbassamento della matrice può essere assistita mediante un manipolatore motorizzato.
  30. Sciogliere il restante PEG e utilizzare acrilico dentale per cementare le microfili a posto. Aggiungere più strati di cemento per assicurare che i fili siano sicure e quindi consentire 15-20 min per il cemento per indurire prima di procedere. Questo assicura che i fili non saranno jostled dalla loro posizione finale.
  31. Costruisci il resto della headstage dell'animale utilizzando acrilico dentale. Utilizzare l'acrilico per incassare le viti cranio, filo di terra, e il connettore per le microfili. Lasciare che il cappello acrilico per indurire a sufficienza prima di procedere.
  32. Suturare l'incisione cuoio capelluto con suture assorbibili e somministrare 2 ml of salina batteriostatica (sc) per ripristinare l'idratazione da un intervento chirurgico.
  33. Rimuovere l'animale dalle barre orecchio e posizionare il soggetto in una zona pulita. Osservare l'animale frequentemente durante il recupero post-operatorio fino termoregolazione e di locomozione hanno recuperato. Dopo il recupero dall'anestesia, spostare l'animale in un solo alloggiamento per il resto del recupero post-chirurgico.
  34. Dare animali monitoraggio postoperatorio quotidiana e la cura nei giorni successivi alla procedura. Recupero da questa procedura è ottimale quando sono consentiti sette o più giorni.
  35. Dare animali iniezioni di Carprofene (5mg/kg) e Enrofloxacina (5-10 mg / kg) o loro equivalenti durante il recupero per il programma consigliato dal veterinario curante.

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Representative Results

Un elenco delle attrezzature utilizzate da questo laboratorio per la registrazione di segnali elettrofisiologici possono essere trovate nella tabella 3. Dopo il recupero da un intervento chirurgico,-singole unità sono registrati inserendo un guadagno unitario headstage nel connettore impiantato. Questo headstage è collegato tramite un cavo a un commutatore, che è capace di libera rotazione senza interruzioni nella registrazione elettrofisiologica attraverso l'uso di anelli collettori elettrici. Il commutatore permette ai soggetti di muoversi liberamente durante la registrazione durante il comportamento, che è uno dei vantaggi principali di questa preparazione. I segnali vengono poi alimentati attraverso un preamplificatore (10x guadagno) che viene utilizzato per amplificare in modo differenziale il segnale su ciascun elettrodo contro il rumore ambientale su un elettrodo selezionato perché non esporre un segnale all'unità. Registrazioni differenziali vengono utilizzati per amplificare la differenza istantanea tra le due tensioni. Poiché entrambi i fili di registrare il rumore ambientale di circa allo stesso modo, la loro opposizionete polarità consentono efficacemente la sottrazione del rumore ambientale dalle registrazioni neurali (Figura 2). Infine, i segnali sono filtrati passa-banda (450 Hz a 10 kHz; roll off -1.5 dB / ottava a 1 kHz e -6 dB / ottava a 11 kHz) e 700x amplificato prima di essere digitalizzato utilizzando un computer con una scheda A / D (50 kHz frequenza di campionamento / filo) e conservati per l'analisi offline.

Nel software, le forme d'onda campionate sono spesso utilizzando un metodo di rilevamento di soglia. Pertanto, i segnali che passano una certa soglia di tensione sono digitalizzate e memorizzate. Ancora, vi è un tasso intrinseco di falsi positivi, in cui artefatti elettrici passano attraverso la soglia, filtraggio ed amplificazione differenziale e vengono campionati. Queste forme d'onda non-neurali vengono sottratte post-hoc utilizzando il software di picco di smistamento che consente scarichi campionati per essere stati scelti in base ai loro parametri (ad esempio tensioni di ampiezza, di picco e di valle, ecc.) E, successivamente, consente per l'eliminazione di electrical "rumore" e la selezione del segnale neuronale (Figura 3). Le forme d'onda sono inclusi per analisi se 1) Forme d'onda presenti con modelli canonici di attività neurale tra cui un potenziale d'azione chiaramente definito e dopo iperpolarizzazione (Figura 3; pannello destro), 2) l'ampiezza di una forma d'onda putativi neurali presenta almeno un segnale 02:01 : rumore (cioè è chiaramente separabile dalla banda di rumore del canale, ampiezza di banda di rumore = ca .. 50 mV), 3) Parametri rimangono stabili per tutta la sessione e 4) un intervallo interspike (ISI) istogramma mostra che non si sono verificati gli scarichi durante il periodo refrattario naturale del neurone (cioè ~ 2 msec; Figura 3 a sinistra del pannello).

Scariche neurali possono essere correlati con eventi comportamentali (ad es leva risponde) che sono registrati come timestamp tramite l'uso di un ingresso-uscita digitale (I / O) card. Queste tempo-Stamp possono essere usati per creare istogrammi tempo peri-evento (PETHs; Figura 4A), che vengono utilizzati per visualizzare scariche neuronali che si verificano in un intervallo di tempo specificato intorno a un particolare evento comportamentale. Il nostro laboratorio è in genere esaminato cottura neurale dell'ordine di ore (Tonic 10), minuti (Lento-fasiche 11), e secondi / millisecondi (Rapid-fasico 12). Cottura Tonic è tipicamente usato per esaminare il maggior numero di eventi globali in una sessione. Ad esempio, spesso usiamo questo per confrontare i tassi di ricambio dei neuroni quando gli animali sono farmaci auto-somministrazione, cioè precedenti all'uso della droga contro i tassi di cottura on-droga. Analisi lento fasiche sono spesso utilizzati per esaminare cottura durante lento mutevoli eventi come il decadimento farmacologico di un farmaco per minuti. Infine, analisi fasiche rapidi sono utilizzati per più eventi istantanei come una risposta operante o l'insorgenza di un cue sperimentale.

La Figura 4 mostra un istogramma di tonico cotturacon un conteggio degli scarichi in 30 bidoni secondi in un intero sessione di registrazione durante la cocaina auto-somministrazione. La cella nell'esempio illustrato è sensibile ai cambiamenti nei livelli corporei di cocaina e diventa inibito (Figura 4A) come livello corporeo dell'animale di aumenti cocaina (Figura 4B), ma ritorna alla gittata originale come il livello di cocaina cade dopo l'auto- contingenze amministrative sono finite. A seconda della regione di destinazione, i neuroni possono essere sensibili agli effetti farmacologici o qualsiasi numero di eventi comportamentali, tra cui ricompensa associata spunti 6, ingresso sensitivo-13, o un approccio motivato 3.

In condizioni ottimali, è possibile registrare lo stesso neurone per molte sessioni. Nello striato, i neuroni sono omogeneamente distribuiti (80% di fili resa solo una singola unità e le cellule non sono a strati o strettamente raggruppati) e producono relativamente piccoli segnali che ove rapidamente decadimentodistanza r. In queste condizioni, il nostro laboratorio è stato in grado di registrare lo stesso neurone nello striato per più settimane. È importante sottolineare che non tutti i neuroni possono essere verificate attraverso le sessioni e non tutti i neuroni sono mantenuti nel tempo. Determinare la capacità di ottenere questi tipi di registrazioni longitudinali richiede un'attenta verifica del sistema elettrofisiologico. Ad esempio, è possibile stimare la distanza di registrazione di microfili utilizzando elettrodi pilotabili. Quando considerato accanto alle proprietà fisiche dei fili, anatomia regionale, ei parametri di forma d'onda del neurone tra le sessioni, si può determinare con ragionevole certezza che una forma d'onda è stata mantenuta tra le sessioni 7,8,13.

Figura 1
Figura 1. Representative posizionamenti per la "finestra skull" (cioè craniotomia), viti cranio e filo di terra. A) Una vista dorsale del cranio che mostra il posizionamento di una vite cranio su ciascuna piastra del cranio (rosso), una finestra cranio (quadrato), e un foro controlaterale per il filo di terra (verde). Quando si pianifica la finestra cranio, le coordinate devono essere definiti mediante la determinazione del B) anteriore e C) mediale posteriore e coordinate laterali per la regione bersaglio (ad es dorsolateral striato). D) Queste coordinate possono poi essere utilizzati per determinare la posizione della finestra sulla superficie dorsale del cranio. Notare che la finestra cranio corrisponde agli obiettivi mediale e laterale identificati in B e C e anche estende l'intervallo specificato nel piano antero-posteriore fra B e C. Queste coordinate saranno specifiche per ogni singola regione di destinazione. Loca Rappresentantezioni delle microfili in una matrice 2 x 8 sono mostrate usando piccoli punti all'interno della finestra cranio mostrato in D. Il dorsoventrale finale coordinate dei fili dipende dalla profondità a cui sono abbassati. Cifre modificati da Paxinos e Watson 14. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 2
Figura 2. Un'illustrazione del processo di amplificazione differenziale. Il pannello più in alto rappresenta un segnale neurale prima amplificazione differenziale (segnale + rumore). Dopo l'amplificazione differenziale, segnali elettrici estranei che si trovano su tutti i canali (rumore, pannello centrale) possono essere efficacemente sottratti dalla registrazione wires mediante l'uso di un elettrodo dato differenziale per migliorare l'isolamento della forma d'onda neurale (Signal; pannello inferiore).

Figura 3
Figura 3. Un esempio di forma d'onda neurale (a destra), registrato da un filo di una matrice microconduttori. L'istogramma (a sinistra) mostra il numero di potenziali d'azione nei millisecondi precedenti ogni osservata scarico neurale nella sessione. Ogni bin rappresenta un periodo di 1 millisecondo. L'istogramma dimostra che nessun potenziale d'azione si sono verificati in periodo refrattario naturale del neurone (2 msec).

Figura 4
Figura4. Un esempio di un neurone che è tonicamente inibita durante cocaina autosomministrazione. A) La frequenza di scarica (Spikes/30 sec) di un neurone attraverso una sessione cocaina auto-somministrazione a lungo accesso in 30 bidoni secondi. B) La corrispondente Livello di droga calcolata attraverso la stessa sessione. In combinazione, aumenti il ​​livello di droga sono correlati con una depressione in cottura neurale. Di conseguenza, quando la sessione termina a ~ 425 min, cottura neurale recupera i livelli corporei di cocaina caduta.

Figura 5
Figura 5. Sezioni istologiche dei due animali con impianti Microwire. A) Una sezione Nissl colorati con rosso neutro combinato con un contatore macchia ferrocianuro di potassio rivelando consigli Microconduttori lesionati (blu).Un microconduttori può essere fatta dalla corteccia fino alle punte filo (blu), seguendo le tracce di filo nel tessuto. Le tracce possono essere rintracciate in una sola fetta o una serie di sezioni adiacenti. B) Una sezione macchiato di sostanza P, che rivela la pallidum ventrale, accoppiato con un contatore macchia ferrocianuro di potassio. Utilizzando tecniche immunoistologici, singole micro-fili possono essere localizzate all'interno di regioni specifiche del cervello, o anche all'interno di specifiche sotto-regioni di un determinato nucleo. La figura mostra una punta microconduttori (blu) localizzata nel pallidum ventrale utilizzando il P macchia Sostanza.

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Discussion

Registrazioni extracellulari rappresentano una potente tecnica sperimentale che può essere incorporato in quasi ogni preparazione sperimentale nel campo delle neuroscienze. Fili che sono stati impiantati in array organizzati possono essere seguiti come i loro alberi passano attraverso il cervello e nella loro regione di destinazione (Figura 5A). Quando una piccola lesione post-sperimentale viene creato sulla punta microconduttori noninsulated per creare un piccolo deposito ferro dal filo di acciaio inossidabile, si può precisamente contrassegnare la posizione della punta microconduttori non isolata (dove è stato registrato il monoblocco) con una soluzione di ferrocianuro di potassio 5% e 10% HCl (Figure 5A e 5B; punti blu). Così, si può facilmente utilizzare una serie di successive sezioni di cervello di ricreare la posizione dell'intero array all'interno del cervello. Infine, le tecniche sopra menzionate possono essere facilmente combinati con immunoistochimica per aumentare la specificità spaziale delle registrazioni, al fineverificare posizionamenti bersaglio, e anche al fine di studiare le differenze subregionali all'interno di un singolo bersaglio nucleo 3 (Figura 5B).

Per raggiungere la specificità spaziale desiderata, matrici Microconduttori devono essere progettati e impiantato con cura. Innanzitutto, la spaziatura delle righe e delle colonne all'interno della matrice deve essere progettata specificamente per la regione di interesse. Array troppo lunga o larga per il target desiderato può ridurre la precisione o di produrre un gran numero di fili che cadono sul confine tra due nuclei adiacenti. Allo stesso tempo, microfili distanziati troppo stretto può impedire una demarcazione separata di ciascun elettrodo. In secondo luogo, gli array Microconduttori devono essere trattati con cura al fine di mantenere l'integrità della matrice. Schiere di elettrodi singole sono prodotte utilizzando, fili simili a capelli sottili che possono essere facilmente danneggiati o urtavano dalla loro configurazione quando contattato. Le qualità di questi cavi sono l'ideale per ridurre i danni to tessuto sul percorso di avvicinamento alla propria destinazione e anche che i fili di spostare in concerto con piccoli movimenti del cervello. Così, di solito è consigliabile memorizzare array in un luogo sicuro ed evitare di rimuovere le matrici dalle loro custodie protettive fino a poco prima dell'impianto. Inoltre, la cura deve essere presa quando sterilizzazione array Microwire. In alcuni casi, autoclave di elettrodi può essere accettabile. Tuttavia, ossido di etilene o UV sanificazione può essere preferibile per proteggere matrici fragili. Infine, il metallo elettrodo e l'isolante, e il diametro di ciascuna, deve essere attentamente valutata. Per esempio, solo elettrodi che contengono ferro (ad esempio acciaio inossidabile) saranno in grado di produrre reazioni di Prussia blu per demarcazione individuale di ogni microconduttori nella matrice.

A volte, microfili nella matrice si allontanerà dalla loro configurazione durante l'abbassamento a causa di ostacoli inosservato (ad esempio frammenti di cranio nella finestra cranio) o povero handling. In questi casi, un tale microconduttori spesso può ancora essere seguito della sua punta (anche se sarà probabilmente al di fuori della regione bersaglio). Qualora un'istanza verificarsi quando qualsiasi microconduttori numerato nella matrice non può essere verificata, è importante l'integrità dell'esperimento che questo animale essere rimosso dal set di dati. Errata interpretazione della posizione di un singolo microconduttori può attivare i suoi segnali neurali di complicare o all'interpretazione corrotto dei dati.

Durante l'impianto, la precisione della finestra cranio e allineamento matrice sono cruciali per la precisione bersaglio. Finestre Skull devono essere fatti sufficientemente ampia per consentire la matrice di passare senza piegare o danneggiare i cavi. D'altra parte, la finestra viene anche utilizzato per guidare con precisione la matrice alla posizione di destinazione e deve quindi essere forato con precisione in ogni dimensione. Quando si è pronti per l'impianto, bisogna anche essere certi che la matrice è a piombo con la finestra cranio in tutte le dimensioni. Cioè,una leggera inclinazione della matrice in qualsiasi dimensione può causare la matrice a parzialmente o totalmente mancare il nucleo bersaglio. Infine, particolare cura deve essere presa quando si abbassa il primo 1-3 mm. E 'durante l'abbassamento che pezzi di detriti che sono passati inosservati all'interno della finestra cranio possono compromettere l'integrità della matrice e sconvolto il percorso di microfili iniziale. Se il percorso dei microfili è ostruito mentre stanno lentamente abbassate, si può vedere microfili piegare o un arco con una leggera ingrandimento prima matrice comporta alcun danno (ad esempio utilizzando una lente di ingrandimento). A questo punto, microfili possono essere ripiegati e detriti possono essere cancellati dalla finestra prima di continuare con l'impianto.

Ultimo ma non meno importante, di successo impiantazione di array Microconduttori richiede una particolare attenzione al mantenimento di una sala operatoria asettica e fornendo completa assistenza post-operatoria. Quando combinato con le precauzioni di cui sopra, registrazioni vitali possono essere ottenuti daregioni di interesse per più di uno mese, abbiamo verificato le registrazioni fino a 40 giorni dopo l'intervento chirurgico 6. Forse la cosa più importante, la longevità di queste registrazioni offre l'opportunità di studiare i circuiti funzionali distinte all'interno del complesso ambiente di influenze ormonali elettrica, chimica, e e rispondere alle domande fondamentali sul ruolo di questi circuiti in apprendimento e motivazione.

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Disclosures

Gli autori non hanno concorrenti interessi finanziari da dichiarare.

Acknowledgments

Questo studio è stato sostenuto dal National Institute on Drug Abuse concede DA 006.886 (MOW) e DA 032.270 (DJB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Table 1. List of Surgical Materials.
Gauze Fisher (MooreBrand) 19-898-144
Cotton Swabs Fisher (Puritan) S304659
Nembutal (Pentobarbital) Sigma Aldrich P3761
Atropine Methyl Nitrate Sigma Aldrich A0382
Baytril (Enrofloxacin) Butler Shein (Bayer) 1040007
Ketamine Hydrochloride Butler Shein SKU# 023061
Betadine (Povidone-Iodine) Fisher (Perdue) 19-066452
Stereotax Kopf Model 900
Cauterizing Tool Stoelting 59017
Dissecting Microscope Nikon SMZ445
Dental Drill Buffalo 37800
Bacteriostatic Saline Bulter Schein 8973
Jewlers Screws Stoelting 51457
Microwire Array Microprobes Custom (Flexible)
Ground Wire Omnetics Custom Plug
Dental Acrylic Fisher (BAS) 50-854-402
Absorbable Sutures Fisher (Ethicon) NC0258473
Puralube (Opthalamic Ointment/Lubricant) Fisher (Henry Schein) 008897
Table 2. List of Surgical Instruments.
2x Microforceps George Tiemann Co. #160-57 Multi-use (e.g. clearing debris in skull window)
2x Forceps George Tiemann Co. #160-93 Multi-use (e.g. tying sutures)
6x Hemostats George Tiemann Co. #105-1125 Clamp and open incision
1x Small scissors George Tiemann Co. #105-411 Cut sutures after tying
1x Tissue forceps George Tiemann Co. #105-222 Holding tissue while suturing
1x Needle holder George Tiemann Co. #105-1259 Holding suture needle
1x Scalpel holder (with #11 blade) George Tiemann Co. #105-80 (w/ #105-71 blade) Making skull incision
1x #22 Scalpel blade George Tiemann Co. #160-381 Shaving scalp
1x Surgical Spatula George Tiemann Co. #160-718 Scraping skull to clear tissue on skull
Machine/Jewelers Screws Various N/A 0/80 x 1/8”
Table 3. List of Equipment for Recording Electrophysiological Signals.
Microwire Array & Connector Micro Probe, Inc. (Gaithersburg, MD) N/A (Part No. based on array characteristics) Cranially implanted in target recording region. Arrays are customized based on desired wire spacing, length, etc.
Unity-Gain Harness/Headstage M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ) Proj 1200 Initial amplification of neural signal; allows for propagation of small neural signals.
Commutator (and Optional Fluid Swivel) Plastics One, Inc. (Roanoke, VA) SL18C Allows animals to freely rotate while propagating electrical signal to preamp
Pre-amplifier M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ) Proj 1198 Differentially amplifies neural signals against a reference electrode.
Filter and Amplifier M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ) Proj 1199 Band-pass filters and further amplifies the differentially amplified signal.
Acquisition Computer EnGen (Phoenix, AZ) N/A (Custom Build) Runs software and hardware for behavioral and neural data acquisition.
A/D Card  Data Translation (Marlboro, MA) DT-3010 Digitizes neural signals for computer sampling.
Digital I/O Card Measurement Computing (Norton, MA) PCI CTR-05 Acquires behavioral inputs and outputs

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References

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