Mechanotransduction cues के प्रभाव Decoupling के लिए hydroxy-पाम Hydrogels की तैयारी

Bioengineering

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Summary

हम कम से कम लागत या विशेषज्ञता के साथ ईसीएम प्रोटीन का एक सीधा बंधन की अनुमति देता है कि hydroxy-पाम नामक एक नया polyacrylamide हाइड्रोजेल, प्रस्तुत करते हैं. microcontact मुद्रण सेलुलर mechanostransduction के अध्ययन के लिए प्राकृतिक सेल microenvironment के कई संकेत के स्वतंत्र नियंत्रण की सुविधा के साथ hydroxy-पाम के संयोजन हाइड्रोजेल.

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Grevesse, T., Versaevel, M., Gabriele, S. Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues. J. Vis. Exp. (90), e51010, doi:10.3791/51010 (2014).

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Abstract

अब यह अच्छी तरह से कई सेलुलर कार्यों उनके बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) पर्यावरण के भौतिक और यांत्रिक संकेतों के साथ कोशिकाओं की बातचीत द्वारा विनियमित रहे हैं कि स्थापित है. यूकेरियोटिक कोशिकाओं लगातार जैव रासायनिक संकेतों में ईसीएम के शारीरिक परिवर्तन transduce को सतह mechanosensors के माध्यम से उनके स्थानीय microenvironment भावना है, और जीन अभिव्यक्ति में विशिष्ट परिवर्तन को प्राप्त करने के लिए इन संकेतों को एकीकृत. दिलचस्प है, एक दूसरे के साथ ईसीएम कर सकते दंपति की भौतिक और यांत्रिक मापदंडों सेल भाग्य को विनियमित करने के लिए. इसलिए, mechanotransduction को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण सेलुलर कार्यों पर ईसीएम संकेत के सापेक्ष योगदान दसगुणा है.

यहाँ हम तेजी से और आसानी से इन विट्रो में mechanotransduction संकेतों से स्वतंत्र ट्यूनिंग के लिए जैविक रूप से प्रासंगिक हाइड्रोजेल उत्पन्न करने के लिए एक विस्तृत प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. हम रासायनिक संशोधित polyacrylamide हाइड्रोजेल (पाम) अपने आंतरिक रूप से गैर adhes बढ़नाpolymerization के दौरान हाइड्रॉक्सिल-functionalized acrylamide monomers शामिल करके गुण ive. हम ईसीएम प्रोटीन के किसी भी वांछित प्रकृति का स्थिरीकरण परमिट जो hydroxy-पाम नामक उपन्यास पाम हाइड्रोजेल,, प्राप्त की. microcontact मुद्रण स्वतंत्र रूप से एकल कक्षों की आकृति विज्ञान, मैट्रिक्स कठोरता, प्रकृति और ईसीएम प्रोटीन के घनत्व को नियंत्रित करने के लिए अनुमति देता है के साथ hydroxy-पाम के संयोजन हाइड्रोजेल. हम इन विट्रो सेल mechanotransduction प्रक्रियाओं में अध्ययन करने के लिए हर जीव विज्ञान प्रयोगशाला में स्थापित किया जा सकता है कि एक सरल और तेजी से विधि प्रदान करते हैं. हम ईसीएम कठोरता और नाभिक के बीच एक यांत्रिक युग्मन दिखाना है कि endothelial कोशिकाओं पर प्रयोगों का आयोजन करके इस उपन्यास दो आयामी मंच मान्य.

Introduction

स्थानीय सेलुलर microenvironment के कई पहलुओं (जैसे, कठोरता, ताकना आकार, प्रोटीन की प्रकृति, या सेल ligand घनत्व) एक ऐसी गतिशीलता, सेल प्रसार, भेदभाव, और जीन अभिव्यक्ति के रूप में सेलुलर प्रक्रियाओं को नियंत्रित कि नियामक संकेतों के सेट समन्वय प्रदान करते हैं. बाह्य वातावरण के भौतिक गुणों का संशोधन कोशिकाओं द्वारा कथित और सेलुलर ध्रुवीकरण, प्रवास, और भेदभाव के विकार सहित विभिन्न शारीरिक परिणाम, कारण हो सकता है. यह कोशिकाओं सेलुलर जैव रासायनिक संकेतों में ईसीएम संशोधनों अनुवाद कैसे, हालांकि, अस्पष्ट बनी हुई है. इसलिए यह बड़े महत्व का mechanotransduction रास्ते के अध्ययन के लिए कोशिकाओं और उनके microenvironment के बीच बातचीत को पुन: पेश कर सकते हैं कि इन विट्रो microenvironments में नियंत्रित करने के लिए इंजीनियर है. इस समस्या का समाधान करने के लिए, हमने हाल ही में आसानी से दो पैसा भी उत्पन्न करने के लिए, hydroxy-पाम हाइड्रोजेल नामक एक उपन्यास विधि 1, शुरू की हैnsional मुलायम स्वतंत्र रूप से महत्वपूर्ण mechanotransduction संकेतों को नियंत्रित करने की अनुमति है कि matrices: मैट्रिक्स कठोरता, सेल ज्यामिति और प्रसूति, प्रोटीन और सेल ligand घनत्व की प्रकृति.

ईसीएम morphogens में ढ़ाल के माध्यम से सेलुलर प्रक्रियाओं (कीमोटैक्सिस), चिपकने वाला प्रोटीन (haptotaxis), और कठोरता (durotaxis) का निर्देशन. पिछले कुछ दशकों में, इन विट्रो प्लेटफार्मों में विकसित कोशिकाओं शारीरिक प्रक्रियाओं 2-5 में जैव रासायनिक और biophysical सुविधाओं का अनुवाद करने में सक्षम हैं कैसे बाहर तंग करने के क्रम में इन बाह्य संकेतों को अलग करने के लिए विकसित किया गया है. इलेक्ट्रॉन बीम 6, photolithography 7, प्रकाश रासायनिक स्थिरीकरण 8, या प्लाज्मा की सहायता की तकनीक 9 micropatterned substrates पर जीवित कोशिकाओं के विकास को निर्देशित करने के लिए विकसित किया गया है. इन तकनीकों के महत्वपूर्ण परिणाम सामने आए हैं, उनमें से ज्यादातर सेल व्यवहार पर विभिन्न संकेतों के व्यक्तिगत प्रभाव के बीच भेदभाव की अनुमति नहीं देतेऔर वे कुछ प्रयोगशालाओं बर्दाश्त कर सकते हैं कि तकनीकी सुविधाओं की आवश्यकता होती है. इन तकनीकों के अलावा, microcontact मुद्रण (μCP), सेल चिपकने वाला सूक्ष्म द्वीपों 10 बनाने के लिए एक मजबूत और सुलभ तरीके के रूप में उभरा है. अभी हाल ही में व्यापक प्रयासों 11-14 जीवित ऊतकों में मनाया कठोर की व्यापक रेंज को पुन: पेश करने के लिए आदेश में ट्यून करने योग्य कठोर साथ हाइड्रोजेल पर μCP विकसित करने के लिए बनाया गया है. इन कार्यों के अलावा, polyacrylamide (पाम) 15 लोकप्रिय बन गया है और पहले से ही सेल बायोमैकेनिक्स assays के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया बहुलक आधारित matrices में से एक है.

पाम सतहों सामान्यतः एन sulfosuccinimidyl-6 [4'-azido 2'- nitrophenylamido] (sulfo-SANPAH) और ईसीएम प्रोटीन sulfo-SANPAH nitrophenyl की यूवी सक्रियण द्वारा सतह से जुड़े होते हैं heterobifunctional पार linker साथ functionalized रहे हैं azide समूह 16. एक और तकनीक गंभीर रूप से ऑक्सीकरण किया गया है कि प्रोटीन के लिए युग्मन hydrazine में होते हैंperiodate 17 के साथ. Hynd और सहकर्मियों एक acroyl-streptavidin मोनोमर 18 की उपस्थिति में photopolymerization की आवश्यकता है कि प्रोटीन और पेप्टाइड साथ biomimetic हाइड्रोजेल सतहों patterning के लिए एक तकनीक की शुरुआत की. हाल ही में, Tseng एट अल. 1-एथिल-3 [3 dimethylaminopropyl] carbodiimide हाइड्रोक्लोराइड के साथ सक्रिय पीए जैल सेते करने की आवश्यकता है कि एक ऑप्टिकल क्वार्ट्ज मुखौटा के माध्यम से पाम की गहरी यूवी जोखिम के आधार पर एक नई micropatterning विधि 19 (ईडीसी) को सूचित किया है और एन hydroxysuccinimide (एनएचएस) पानी समाधान पूर्व प्रोटीन जोड़ने के लिए. लंबे संश्लेषण प्रक्रियाओं (जैसे, डायलिसिस, lyophilization, आदि), महंगी रासायनिक यौगिकों (जैसे, Hyaluronic एसिड, sulfo-SANPAH) या गहरी यूवी: सजातीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटीन micropatterns बनाने के लिए इन तकनीकों की क्षमता होने के बावजूद उनमें से ज्यादातर प्रमुख सीमाओं पीड़ित विकिरण. इसके अलावा, इन तकनीकों सब्सट्रेट कठोरता, micropattern की स्वतंत्र मॉडुलन की अनुमति नहीं देतेज्यामिति, ईसीएम प्रोटीन प्रकृति, और सेल ligand घनत्व.

खाते में इन सीमाओं ले रहा है, हम नरम हाइड्रोजेल पर प्रोटीन और biomolecules की एक किस्म के स्थिरीकरण की अनुमति देता है और सेलुलर कार्यों पर उनकी भूमिका को समझने के क्रम में mechanotransduction संकेतों से स्वतंत्र ट्यूनिंग कि परमिट एक उपन्यास और सरल acrylamide आधारित दृष्टिकोण विकसित किया है. इसके बजाय कठोर रासायनिक यौगिकों के साथ पाम हाइड्रोजेल इलाज की, हम पाम polymerization के दौरान हाइड्रॉक्सिल समूहों के साथ एक वाणिज्यिक acrylamide monomer परिचय. यह सरल ऑपरेशन किसी भी अन्य तकनीकी आवश्यकताओं के बिना पाम हाइड्रोजेल की आंतरिक विरोधी चिपकने वाला संपत्ति पर काबू पा.

हाइड्रॉक्सिल समूहों की उपस्थिति हाइड्रोजन संबंध बातचीत है कि फार्म प्रोटीन और biomolecules के लिए hydroxy-पाम हाइड्रोजेल का एक उच्च आत्मीयता की ओर जाता है. ΜCP साथ संयोजन में, hydroxy-पाम हाइड्रोजेल एक स्वतंत्र नियंत्रण के साथ दो आयामी संस्कृति मंच की एक तेजी से पीढ़ी सक्षमmechanotransduction के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली मंच कल्पना कर रहे हैं जो मैट्रिक्स कठोरता, ईसीएम प्रोटीन के प्रकार, सेल ligand घनत्व और सीमित चिपचिपाहट, पर.

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य आसानी से सामग्री विज्ञान में किसी भी विशेषज्ञता के बिना hydroxy-पाम हाइड्रोजेल बनाने के लिए आवश्यक जानकारी प्रदान करना है. शोधकर्ताओं pathophysiological तंत्र में शामिल mechanotransduction रास्ते में से एक बेहतर समझ पैदा हो सकती है कि सेलुलर और ऊतक स्तरों पर physiologically प्रासंगिक सवाल पूछने के लिए अंतिम लक्ष्य एक साधन प्रदान करना है.

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Protocol

1 कांच coverslips की सतह को सक्रिय

  1. एक पेट्री डिश और धब्बा (अनुशंसित रासायनिक धूआं हुड) 5 मिनट के लिए उस पर 0.1 एम NaOH समाधान में जगह कांच परिपत्र coverslips (25 मिमी व्यास).
  2. NaOH समाधान निकालें और धीरे से एक बाँझ संस्कृति हुड में एक कमाल की थाली पर कमाल की है, जबकि पूरी तरह से 20 मिनट के लिए बाँझ DDH 2 हे के साथ coverslips विसर्जित कर दिया.
  3. बाँझ DDH 2 हे नाली और कदम 1.2 दोहराएँ.
  4. बाँझ चिमटी के साथ coverslips निकालें और सक्रिय चेहरे के साथ एक नया पेट्री डिश में उन्हें जगह है.
  5. उच्च शुद्धता नाइट्रोजन गैस की एक सतत प्रवाह के नीचे सूखी coverslips.
  6. एक बाँझ संस्कृति हुड में, 1 घंटे के लिए coverslip के सक्रिय ओर 3 (trimethoxysilyl) propyl acrylate (92%) की एक पतली परत धब्बा.
  7. बड़े पैमाने पर बाँझ DDH 2 ओ की 3 washes के साथ कांच coverslips धोने और एक नया पेट्री डिश में बाँझ DDH 2 ओ में उन्हें विसर्जित कर दिया.
  8. पेट्री डिश ठोकरऔर parafilm के साथ 10 मिनट के लिए कोमल आंदोलन के तहत एक घुमाव थाली पर जगह है.
  9. ठीक सुझावों के साथ बाँझ चिमटी के साथ DDH 2 ओ से coverslips निकालें और सक्रिय चेहरे के साथ एक नया पेट्री डिश में उन्हें जगह है.
  10. Coverslips से चिपके से धूल से बचने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ एक सूखी जगह में आरटी पर स्टोर.

Hydroxy-पाम hydrogels के 2. तैयारी

  1. एक 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में एन hydroxyethyl acrylamide (HEA) की 65 मिलीग्राम की एक वजन तैयार करें. यह एक ताजा HEA समाधान तैयार करने के लिए महत्वपूर्ण है.
  2. HEA 50 मिमी HEPES बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें और पूरा HEA विघटन तक एक vortexer का उपयोग कर मिश्रण.
  3. वांछित हाइड्रोजेल कठोरता तक पहुँचने के लिए w ​​/ HEPES में acrylamide समाधान और / HEPES बीआईएस acrylamide समाधान में डब्ल्यू (1 टेबल देखें) डब्ल्यू 2% की मात्रा डब्ल्यू 40% की 400 μl जोड़ें. 5 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा को 50 मिमी HEPES के साथ समायोजित करें.
  4. एक vortexer और देगास यह प्रयोग कर समाधान मिक्सhydroxy-पाम polymerization रोकता है जो समाधान के भीतर ऑक्सीजन एकाग्रता कम करने के लिए 20 मिनट के लिए एक निर्वात चैम्बर में.
  5. एक बाँझ हुड के तहत, यह बाँझ के क्रम में एक 0.2 माइक्रोन ताकना आकार फिल्टर के साथ degased समाधान फ़िल्टर.
  6. 7 मिनट के दौरान एक यूवी / ओजोन क्लीनर में परिपत्र कांच coverslips (22 मिमी व्यास) को सक्रिय करें.
  7. 10% अमोनियम persulfate (ए पी) समाधान के 100 μl तैयार करें, कि 100 μl DDH 2 ओ में 10 मिलीग्राम ए पी है यह एक ताजा ए पी समाधान तैयार करने के लिए महत्वपूर्ण है.
  8. Polymerization आरंभ करने के लिए tetramethylenediamine के 2.5 μl (TEMED) और निष्फल hydroxy-पाम समाधान (2.5 कदम) के लिए ए पी समाधान के 25 μl जोड़ें. बाँझ परिस्थितियों में, बुलबुले की शुरूआत के बिना 3 लगातार pipettings द्वारा समाधान मिश्रण.
  9. एक बाँझ हुड के तहत, एक 22 मिमी जीएल जगह तुरंत (कदम 1.9 से उपलब्ध है) और एक 25 मिमी coverslip पर hydroxy-पाम समाधान के 25 μl बूंद जगहछोटी बूंद के शीर्ष पर गधा coverslip (2.5 कदम पर तैयार) hydroxy-पाम समाधान निचोड़. बाँझ चिमटी के साथ 22 मिमी कांच coverslip केंद्र और किसी भी बुलबुले बाहर चिकनी.
  10. Hydroxy-पाम हाइड्रोजेल 15 मिनट के लिए आरटी पर भाजन करने की अनुमति दें. Polymerization की प्रक्रिया के पूरा होने का पालन करने के लिए Eppendorf ट्यूब में मैन्युअल शेष hydroxy-पाम समाधान पलटना.
  11. पूरी तरह से बाँझ DDH 2 हे के साथ coverslips विसर्जित और ध्यान से 22 मिमी कांच coverslips और hydroxy-पाम हाइड्रोजेल परत के बीच एक धार के किनारे शुरू करने से 22 मिमी कांच coverslips अलग.
  12. बाँझ पीबीएस के साथ hydroxy-पाम हाइड्रोजेल वाश (पीबीएस के 3 एक्सचेंजों) और पूरी तरह से जलयोजन बनाए रखने के लिए बाँझ पीबीएस में डूबे जैल करते हैं.
  13. ऊपर से 3 दिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ पीबीएस में hydroxy-पाम हाइड्रोजेल स्टोर.

3 polydimethylsiloxane (PDMS) Microstamp निर्माण

नोट: एक सिलिकॉन मास्टर का निर्माण स्टेशन से पहले आवश्यक हैPDMS microstamp निर्माण RT. एक सिलिकॉन मास्टर की यह microfabrication विशेष उपकरण और प्रशिक्षण की आवश्यकता है जो lithographic तकनीकों, के द्वारा किया जा सकता है. एक nanofabrication सुविधा के साथ सहयोग सिलिकॉन गुरु बनाना करने के लिए प्रोत्साहित कर रहे हैं. वैकल्पिक रूप से, मांग पर कस्टम बनाया microstructured सिलिकॉन स्वामी fabricates कि एक कंपनी से संपर्क करें. यह सिलिकॉन मास्टर के निर्माण की जरूरत है केवल एक बार किया जाना है कि नोट करना महत्वपूर्ण है. दरअसल, microstructured सिलिकॉन स्वामी elastomeric टिकटों का उत्पादन करने के लिए अनिश्चित काल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

  1. मिक्स PDMS और एक 10 में इलाज एजेंट: एक प्लास्टिक बीकर में 1 अनुपात और 10 मिनट के लिए एक पिपेट का उपयोग अच्छी तरह से मिश्रण.
  2. 3.1 कदम दौरान गठन किया गया है कि हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए वैक्यूम के अंतर्गत PDMS मिश्रण देगास.
  3. एक पेट्री डिश में microstructured सिलिकॉन मास्टर प्लेस और बुलबुले के गठन के बिना इस पर degassed PDMS मिश्रण की एक 10 मिमी मोटी परत डाली.
  4. एक में 60 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए PDMS इलाज देनाओवन.
  5. एक स्केलपेल के साथ एक धूल मुक्त वातावरण में, छील बंद PDMS परत और उत्पाद शुल्क 1 सेमी 2 microstamps.
  6. संदंश का प्रयोग, जगह PDMS एक पेट्री डिश में पैटर्न अप microstamps.

4 Micropatterning hydroxy-पाम Hydrogels

  1. 15 मिनट के लिए एक इथेनॉल / पानी में रखें PDMS microstamps (50/50) समाधान और Sonicate.
  2. नाइट्रोजन प्रवाह की एक धारा के साथ टिकटों सूखी और उन्हें 7 मिनट के लिए एक यूवी / ओजोन क्लीनर (λ <200 एनएम) में पैटर्न ऊपर रखें.
  3. एक बाँझ हुड के तहत, एक 1 सेमी 2 PDMS स्टांप की microstructured सतह पर एक वांछित प्रोटीन समाधान (जैसे, 100 माइक्रोग्राम / एमएल laminin पीबीएस में या 25 माइक्रोग्राम / एमएल फ़ाइब्रोनेक्टिन पीबीएस में) के 150 μl बूंद जगह है.
  4. वैकल्पिक: सेल ligand घनत्व मिलाना प्रोटीन समाधान की एकाग्रता को संशोधित करें.
  5. के प्रत्येक कोने की ओर एक पिपेट की एक बाँझ टिप के साथ यह ले जाकर स्टाम्प सतह भर में प्रोटीन समाधान बिखरास्टाम्प.
  6. एक बाँझ हुड के नीचे 60 मिनट के लिए PDMS स्टांप पर सोखना के लिए प्रोटीन समाधान के लिए छोड़ दें. प्रोटीन की क्षति से बचने के लिए लैंप बंद करें.
  7. एक बाँझ हुड के तहत, एक पेट्री डिश में (चरण 2.13 से उपलब्ध) hydroxy-पाम लेपित coverslips हस्तांतरण.
  8. बाँझ परिस्थितियों में एक कम नाइट्रोजन धारा के साथ hydroxy-पाम substrates की सतह से अतिरिक्त पीबीएस निकालें. जैसे ही जेल सतह पर पानी खड़ा के कोई सबूत नहीं मनाया जाता है के रूप में प्रक्रिया बंद करो. जेल इस स्तर पर अच्छी तरह से सूख नहीं किया जाना चाहिए.
  9. सूखी ध्यान से PDMS की संरचित सतह उच्च शुद्धता नाइट्रोजन गैस की एक सतत प्रवाह के साथ टिकट.
  10. ड्रेसिंग ऊतक संदंश के साथ प्रोटीन में लिपटे स्टाम्प समझ और सूखे हाइड्रोजेल सतह के साथ संपर्क में संरचित सतह जगह है. स्टाम्प microfeatures और हाइड्रोजेल सतह के बीच एक अच्छा संपर्क सुनिश्चित करने के लिए PDMS स्टांप के शीर्ष पर चिमटी की नोक के साथ संक्षिप्त दबाव अंक को लागू करें.
  11. वें पर PDMS स्टांप छोड़ दोआरटी पर 1 घंटे के लिए ई हाइड्रोजेल सतह.
  12. धीरे ड्रेसिंग ऊतक संदंश के साथ hydroxy-पाम हाइड्रोजेल से PDMS टिकटों को हटाने और स्टांप साफ करने के लिए कदम 4.1 का पालन करें.
  13. विनिमय प्रति 10 मिनट के लिए बाँझ परिस्थितियों में पीबीएस के 3 एक्सचेंजों (पीएच = 7.4) द्वारा बड़े पैमाने पर मुहर लगी hydroxy-पाम हाइड्रोजेल धो लें.
  14. वैकल्पिक: अन्य ईसीएम प्रोटीन की अतिरिक्त micropatterns कदम 4.5-4.11 का पालन करके hydroxy-पाम सतह को जोड़ा जा सकता है.
  15. एक कमाल की थाली पर एक कोमल आंदोलन के तहत 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रात के दौरान पीबीएस में 5 मिलीग्राम / एमएल पर बीएसए के एक बाँझ समाधान के साथ passivate गैर मुद्रित क्षेत्र.
  16. विनिमय प्रति 10 मिनट के लिए बाँझ परिस्थितियों में पीबीएस के 3 एक्सचेंजों (पीएच = 7.4) द्वारा बड़े पैमाने पर धो लें. इस स्तर पर, मुहर लगी hydroxy-पाम हाइड्रोजेल एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.

Micropatterned hydroxy-पाम Hydrogels पर 5 सेल बयान

  1. पूर्व चढ़ाना सी को 30-45 मिनट के लिए सेल मीडिया में coverslips सेतेएल्स.
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ पीबीएस के साथ एक 75 सेमी 2 संस्कृति फ्लास्क में सुसंस्कृत पक्षपाती कोशिकाओं को धो लें और 10 मिनट के लिए 3 trypsin-EDTA के मिलीलीटर या Accutase साथ यह अलग.
  3. जी अलग कोशिकाओं से युक्त कुप्पी में अपने सेल लाइन के लिए पूर्व गर्म पूरा मध्यम विकास उचित के वांछित राशि हस्तांतरण और एक्स 650 में 3 मिनट के लिए सेल निलंबन अपकेंद्रित्र.
  4. एक micropipette के साथ सतह पर तैरनेवाला निकालें और 15-20,000 कोशिकाओं / एमएल पर पूरा मध्यम संस्कृति में कोशिकाओं resuspend.
  5. 1-2 घंटे के लिए नमी (5.1 कदम से प्राप्त) एक micropatterned coverslip के लिए सेल के समाधान के 4 मिलीलीटर जोड़ें और जगह सेल से ढके coverslip एक संस्कृति इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस और 5%.
  6. महाप्राण धीरे स्वाधीन कोशिकाओं और संस्कृति के माध्यम से बदलें. इनक्यूबेटर से जुड़ी कोशिकाओं लौटें और उन्हें (सेल प्रकार के आधार पर, 3-6 घंटा) पूरी तरह से फैला दें.

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Representative Results

चित्रा 1 ए के साथ acrylamide का सह polymerization (आम) और bisacrylamide (बीआईएस AAM) प्रस्तुत एन hydroxyethylacrylamide एम्बेडेड हाइड्रॉक्सिल समूहों के साथ यादृच्छिक कट्टरपंथी polymerization द्वारा polyacrylamide के एक हाइड्रोफिलिक नेटवर्क का गठन एक प्राथमिक हाइड्रॉक्सिल युक्त (HEA) monomers (hydroxy-पाम) . इस प्रोटोकॉल में, HEA का वजन 65 मिलीग्राम HEPES के 1 मिलीलीटर की मात्रा में पतला होना चाहिए. HEA का घनत्व एक के बराबर होता है, यह जानकर कि हम 1,065 μl (HEA + HEPES) की एक काम की मात्रा प्राप्त मान. तालिका 1 में प्रस्तुत के रूप में, आम की 400 μl और bisAAm के 50 μl के लिए 1,065 μl की कुल अलावा 1,515 μl की एक मात्रा की ओर जाता है. इसलिए HEPES की 3485 μl की मात्रा 5 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा का हल समायोजित करने की जरूरत है. कदम 2.6 में संकेत के रूप में, 22 मिमी कांच coverslip की सतह के कारण के बिना इसे दूर करने के क्रम में एक यूवी / ओजोन में 7 मिनट के दौरान सक्रिय होना चाहिएहाइड्रोजेल सतह के लिए किसी भी क्षति. दरअसल, कांच की सतह यूवी / ओजोन उपचार के बाद अधिक हाइड्रोफिलिक हो जाता है और इसलिए आसानी से पानी में पूरी व्यवस्था डुबो कर हटाया जा सकता है. इसके अलावा, यूवी / ओजोन उपचार हाइड्रोजेल सतह के साथ सीधे संपर्क में है जो 22 मिमी coverslip के रासायनिक संदूषण से बचाता है. इस तकनीक को परमिट एक गिलास coverslip के लिए बाध्य एक फ्लैट परिपत्र polyacrylamide सतह (व्यास में 22 मिमी) (व्यास में 25 मिमी) प्राप्त करने के लिए.

चित्रा 1 बी में प्रस्तुत के रूप में, प्रोटीन की micropatterns microcontact मुद्रण द्वारा hydroxy-पाम हाइड्रोजेल की सतह पर बनाया जा सकता है. इस प्रयोगात्मक प्रक्रिया में, यूवी / ओजोन जोखिम सतह पर silanol समूहों के गठन से अस्थायी रूप से PDMS टिकटों की आंतरिक hydrophobicity को कम करने की अनुमति है. 254 एनएम लाइन परमाणु ऑक्सीजन को ओजोन धर्मान्तरित, जबकि वास्तव में, 185 एनएम लाइन आणविक ऑक्सीजन से ओजोन पैदा करता है. इस प्रतिक्रियाशील प्रजातियों siloxane बीए हमलोंPDMS की ckbone ऑक्सीजन अमीर SiOx सिलिका की तरह परत और सी ओह सतह समूहों के रूप में. ऑक्सीकरण PDMS सतह के कारण सतह के लिए थोक चरण से कम आणविक भार uncrosslinked बहुलक श्रृंखला के प्रवास को हवा के संपर्क के बाद कुछ ही घंटों में अपने hydrophobicity ठीक करने के लिए जाना जाता है. इस रणनीति PDMS स्टांप की सतह पर प्रोटीन समाधान के प्रसार में मदद करता है.

इस विधि का मुख्य लाभ में से एक स्वतंत्र रूप से मैट्रिक्स कठोरता (2A चित्रा), micropattern ज्यामिति (चित्रा 2B), सेल ligand घनत्व (चित्रा -2), और प्रोटीन प्रकृति (आंकड़े 3 ए और 3 बी) व्यवस्थित करना है. चित्रा 2A में दिखाया गया है, hydroxy-पाम हाइड्रोजेल सेलुलर microenvironment की कठोरता के ठीक प्रजनन की अनुमति, कई दर्जन kPa को कुछ kPa से पार linker एकाग्रता पर लोचदार moduli की एक रेखीय निर्भरता दिखा. चित्रा 2B चित्रा -2 सेल पता चलता है कि -ligand घनत्व PDMS टिकटों सेते करने के लिए इस्तेमाल प्रोटीन समाधान की एकाग्रता अलग संग्राहक द्वारा किया जा सकता है. 3 अनुक्रमिक microcontact printings का उपयोग करके laminin और फ़ाइब्रोनेक्टिन लाइनों में मुहर लगी कोलेजन लाइनों की एक प्रतिदीप्ति छवि प्रस्तुत चित्रा.

पाठकों विभिन्न आकारों और micropatterns की आकृति, कुशलता की परवाह किए बिना हाइड्रोजेल कठोरता टिकट लगा दिया गया है कि नोट करने के लिए यह दिलचस्प है. हम कोई majo है कि वहाँ का प्रदर्शन सफलतापूर्वक तेज किनारों (जैसे, त्रिकोण और सितारों) और सीधे (जैसे, लाइनों), या घुमावदार (जैसे, हलकों) आकार के साथ प्रोटीन की microfeatures reproduced हैपैटर्न जटिलता को आर सीमा. एकल कक्ष प्रयोग के लिए, micropattern सतह क्षेत्र 400 और 2500 मीटर 2, एकल सेल व्यवहार्यता की सीमा को इसी कम मूल्य के बीच था. कई अन्य microprinting आधारित विधियों के रूप में प्रस्तुत किया विधि की मुख्य सीमा अपने स्थानिक संकल्प का सवाल है. "नरम" हाइड्रोजेल पर, संकल्प की सीमा आंशिक दौरान हो सकता है कि सतह विरूपण द्वारा निर्धारित हो जाता है, जबकि कठोर हाइड्रोजेल (ई> 10 किलो पास्कल) पर, स्थानिक संकल्प सुक्ष्ममापी के आसपास है और मुख्य रूप से टिकट के संकल्प द्वारा निर्धारित प्रोटीन हस्तांतरण.

hydroxy-पाम हाइड्रोजेल की विषाक्तता homogeneously लेपित पर संस्कृति में 1, 2, और 3 दिनों के लिए चढ़ाया प्राथमिक endothelial कोशिकाओं की व्यवहार्यता और microprinted मुलायम hydroxy-पाम हाइड्रोजेल (चित्रा -4 ए) बढ़ाता द्वारा जांच की गई. HUVECs के बारे में 80% बनाए रखा micropatterned मुलायम hydroxy-पाम हाइड्रोजेल पर चढ़ायाhydroxy-पाम के biocompatibility का प्रदर्शन तीन दिनों के लिए उनकी व्यवहार्यता, सेल संस्कृति के लिए हाइड्रोजेल. दिलचस्प है, इसी तरह की व्यवहार्यता प्राथमिक cortical न्यूरॉन कोशिकाओं के साथ हमारी प्रयोगशाला में प्राप्त हुई थी. इसके अलावा, प्राथमिक endothelial कोशिकाओं इस विधि कठोर की एक विस्तृत श्रृंखला में सेलुलर प्रसार के अध्ययन के लिए एक उपयुक्त microenvironment प्रदान करता है यह दर्शाता है कि, "नरम" (25 kPa) substrates (4B चित्रा) की तुलना में (500 kPa) "कठोर" पर अधिक संख्या में बढ़ना .

Mechanotransduction पर सब्सट्रेट कठोरता का प्रभाव और प्रसार क्षेत्र दसगुणा, प्राथमिक endothelial कोशिकाओं (HUVECs) आयताकार एफ एन लेपित micropatterns पर चढ़ाया गया तीन अलग stiffnesses (2.5, 8.5 से hydroxy-पाम हाइड्रोजेल पर जमा (1200 माइक्रोन 2 की लगातार क्षेत्र), और 25 किलो पास्कल). माँ के लिए इस्तेमाल के रूप में फिर, HUVECs, एक मानक immunocytochemistry प्रक्रिया का पालन करके एक्टिन तंतु, vinculin और डीएनए के लिए दाग रहे थेकांच substrates पर चढ़ाया Lian कोशिकाओं. Stiffer substrates पर, actin फाइबर straighter और मोटा और नाभिक विकृत (चित्रा 5) हैं जबकि softest substrates पर, HUVECs, कम actin फाइबर घनत्व और एक गोल नाभिक दिखा रहे हैं. निरंतर प्रसार क्षेत्र में सब्सट्रेट कठोरता में परिवर्तन नाभिक के पुनर्गठन में जो परिणाम actin तनाव फाइबर का तनाव और वितरण, मिलाना. इस अवलोकन मैट्रिक्स कठोरता, cytoskeleton, और नाभिक के बीच एक यांत्रिक युग्मन पता चलता है.

अंतिम AAM / bisAAm अनुपात AAM 40% (μl) HEA का वजन 1 मिलीलीटर HEPES (एमजी) में भंग करने के लिए भारतीय मानक ब्यूरो AAM (2%)
(Μl)
HEPES (μl) यंग मापांक
(10 3 पा)
0.2 / 50
0.5 / 50
1/50
2/50
3/50
400
400
400
400
400
65
65
65
65
65
50
125
250
500
750
3485
3410
3285
3035
2785
~ 1.4
~ 3.6
~ 8.7
~ 17.2
~ 25

Hydroxy-पाम की तालिका 1 तैयारी विभिन्न कठोर साथ हाइड्रोजेल. कार्य समाधान 1.4 से 25 किलो पास्कल को लेकर अंतिम कठोरता के साथ hydroxy-पाम हाइड्रोजेल तैयार करने के लिए.

चित्रा 1
चित्रा 1 (ए) Acrylamide (AAM, काले रंग में), एन, N'-methylenebisacrylamide (नीले रंग में बीआईएस आम,) और एन hydroxyethylacrylamide (HEA, लाल रंग में) hydroxy- के लिए फार्म एक साथ मिलाया गया पाम हाइड्रोजेल. (बी) hydroxy-पाम हाइड्रोजेल पर micropatterning प्रक्रिया के विभिन्न चरणों के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. प्रोटीन का एक समाधान पहले एक microstamp (# चरण 1) की संरचना चेहरे पर 1 घंटे के दौरान incubated है. हाइड्रोजेल सतह धीरे एक नाइट्रोजन प्रवाह (# चरण 2) के साथ सूख जाता है. microstamp तो 1 घंटा (# चरण 3) के दौरान hydroxy-पाम सतह के साथ औपचारिक संपर्क में रखा गया है. लगातार washes के बाद, microprinted सतह 4 डिग्री सेल्सियस (# चरण 5) गैर मुद्रित क्षेत्रों को ब्लॉक करने पर ओ / एन जमा एक बाँझ बीएसए समाधान के साथ passivated है. अंत में, microprinted hydroxy-पाम सतह बाँझ पीबीएस के साथ कई बार धोया और सेल बोने (# चरण 6). के लिए तैयार है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

1010 / 51010fig2highres.jpg "चौड़ाई =" 500 "/>
चित्रा 2 (ए) hydroxy-पाम हाइड्रोजेल की कठोरता के विकास रैखिक बीआईएस AAM पार linker (लाल रेखा के आर 2 = 0995 के साथ एक रेखीय प्रतिगमन है) की राशि के साथ जोड़ा जाता है. (बी) प्रतिदीप्ति छवियों की विभिन्न stiffnesses (ई = 2.5, 15, और 40 किलो पास्कल) की hydroxy-पाम हाइड्रोजेल पर मुहर लगी आयताकार laminin सूक्ष्म सुविधाओं. स्केल सलाखों (ए) 65 माइक्रोन, (बी) 80 माइक्रोन, और (सी) के अनुरूप 50 माइक्रोन. (सी) 15 माइक्रोन चौड़ाई फार्म एक 25 kPa hydroxy-पाम हाइड्रोजेल पर एक एलएम ढाल के समानांतर लाइनों, विकास ने संकेत दिया प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रोफाइल की. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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90 डिग्री पर पार कर धारियों (हरे रंग में) चित्रा 3 (ए) इम्यूनोफ्लोरेसेंस फ़ाइब्रोनेक्टिन की छवि (लाल रंग में) और laminin. (बी) (लाल रंग में) fibronectin, laminin (हरे रंग में) और पट्टियों (नीले रंग में) कोलेजन की Multilabeling microprinted बाद में एक 25 kPa हाइड्रोजेल पाम सब्सट्रेट पर. स्केल सलाखों 30 माइक्रोन के अनुरूप हैं. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
चित्रा 4 (ए) सेल व्यवहार्यता की मात्रा का ठहराव 24, 48 में उत्कृष्ट सेल अस्तित्व का प्रदर्शन किया, और पर चढ़ाया जा रहा है के बाद 72 घंटा homogeneously में लिपटे और hydroxy-पाम सतहों micropatterned. संख्या में संकेत दियाप्रत्येक बार के नीचे. व्यवहार्यता परख के लिए गिना कोशिकाओं की कुल संख्या से मेल खाती है 1 (सफेद सलाखों) के बाद 25 और 500 किलो पास्कल homogeneously लेपित substrates पर HUVECs प्रसार (बी) मात्रा और 7 (hashed सलाखों) संस्कृति का दिन. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
हरे रंग में चित्रा 5 फ्लोरोसेंट 2.5 kPa, 8.5 kPa के hydroxy-पाम हाइड्रोजेल पर जमा थे, जो आयताकार एफ एन लेपित micropatterns, पर सुसंस्कृत immunostained प्राथमिक endothelial कोशिकाओं की छवियों, और 25 (बाएं से दाएं) kPa. Actin तनाव फाइबर ( ) एलेक्सा Fluor 488 phalloidin, फोकल adhesions (लाल) में एक माउस polyclo साथ दाग रहे थे साथ दाग रहे थेएनएएल प्राथमिक एंटीबॉडी और एक लाल फ्लोरोसेंट आईजीजी माध्यमिक एंटीबॉडी और डीएनए के साथ लेबल DAPI के साथ नीले रंग में सना हुआ था. स्केल सलाखों 17 माइक्रोन के अनुरूप हैं. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

आधुनिक कोशिका जीव विज्ञान में इन विट्रो टिप्पणियों में कई बार ईसीएम प्रोटीन या RGD अनुक्रम युक्त सिंथेटिक पेप्टाइड्स की एक पतली परत के साथ लेपित कठोर कांच coverslips, पर प्रदर्शन किया गया है. हालांकि, इस तरह के बुनियादी संस्कृति substrates सेलुलर mechanotransduction प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक सटीक मॉडल प्रदान नहीं करते हैं, इस प्रकार ईसीएम की सारी भौतिक जटिलता पुनरावृत्ति और नहीं है. इस समस्या से निपटने के लिए, हम किसी भी वांछित राशि और ईसीएम प्रोटीन की प्रकृति के साथ दो आयामी हाइड्रोजेल functionalize करने के लिए एक सरल विकल्प का प्रस्ताव. इस विधि में इस तरह के मैट्रिक्स कठोरता, सेलुलर आकारिकी और कारावास या सेल ligand घनत्व के रूप में महत्वपूर्ण mechanotransduction संकेतों के स्वतंत्र नियंत्रण की अनुमति देता है. इसके अलावा, hydroxy-पाम हाइड्रोजेल स्थिर और एक से अधिक ईसीएम प्रोटीन के स्थानिक वितरण पर नियंत्रण पाना है जो वर्तमान functionalization तरीकों में से सबसे बड़ी सीमाओं में से एक से उबरने. कारण पनबिजली की उच्च आत्मीयता कोXY-पाम biomolecules के लिए, एक किसी भी अनुपूरक उपकरण की आवश्यकता नहीं है जो अनुक्रमिक microprintings, उपयोग करके एक ही सतह पर विभिन्न ईसीएम प्रोटीन के स्थानिक वितरण, चाहे मैट्रिक्स कठोरता, नियंत्रित कर सकते हैं हाइड्रोजेल.

हम लागत या विशेषज्ञता में न्यूनतम आवश्यकताओं के साथ अपने आंतरिक रूप से गैर चिपकने वाला गुण बढ़ना acrylamide हाइड्रोजेल भीतर हाइड्रॉक्सिल समूहों के समावेश पर आधारित एक उपन्यास प्रक्रिया का प्रस्ताव. हाइड्रोजेल पर प्रोटीन patterning के लिए मौजूदा तकनीक के साथ तुलना में, hydroxy-पाम विधि कठोर जहरीले रसायनों (जैसे, hydrazine हाइड्रेट), महंगा photoreactive crosslinkers (जैसे, sulfo-Sanpah) और यूवी लैंप शक्ति और स्थिति पर निर्भरता के प्रयोग से बचा जाता है मुलायम हाइड्रोजेल functionalize. Hydroxy-पाम हाइड्रोजेल, कई हफ्तों के लिए स्थिर और सक्रिय रहने के लिए बड़े पैमाने पर उत्पादन किया जा सकता है, आसानी से microprinted और biomolecules के लिए अपने उच्च आत्मीयता के synergistic प्रभाव की जांच करने के लिए अनुमति देता हैसेलुलर कार्यों पर संयुग्मित ईसीएम प्रोटीन. इसके अलावा, hydroxy-पाम हाइड्रोजेल मात्रात्मक उनके आसपास microenvironment पर कोशिकाओं द्वारा लगाए सिकुड़ा बलों की राशि की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. दरअसल, हम फ्लोरोसेंट मोती आसानी से विस्थापन क्षेत्र को मापने के लिए सेल कर्षण बल माइक्रोस्कोपी (TFM) का उपयोग करने के क्रम में, hydroxy-पाम हाइड्रोजेल में एम्बेड किया जा सकता है और कोशिकाओं द्वारा लगाए गए जिसके परिणामस्वरूप कर्षण मैदान पर चढ़ाया का अनुमान है कि पहले से 1,20 से पता चला है दो आयामी micropatterns.

जैसा कि कई अन्य microprinting आधारित विधियों, hydroxy-पाम हाइड्रोजेल का मुख्य सीमा प्रोटीन microfeatures के स्थानिक संकल्प का सवाल है. कड़ी हाइड्रोजेल (ई> 10 किलो पास्कल) पर, स्थानिक संकल्प एक माइक्रोमीटर के आसपास है और मुख्य रूप से सिलिकॉन मोल्ड बनाना इस्तेमाल लिथोग्राफी तकनीक के आधार पर टिकट के संकल्प, द्वारा निर्धारित की. नरम हाइड्रोजेल पर, स्थानिक संकल्प आंशिक वें द्वारा निर्धारित हो जाता हैसुक्ष्ममापी स्थानिक संकल्प तक पहुँचने के लिए प्रिंसिपल सीमा हो जाता है जो प्रोटीन हस्तांतरण के दौरान ई सतह विरूपण. यहाँ प्रस्तुत दृष्टिकोण वर्तमान में दो आयामी substrates तक सीमित है. हालांकि इस विधि उच्च स्केलेबल है और आगे के अध्ययन के लिए तीन आयामी संरचना करने के लिए इस विधि का विस्तार करने के लिए हमारी प्रयोगशाला में वर्तमान में चल रहे हैं.

हम hydroxy-पाम हाइड्रोजेल परिचित भ्रूण विकास, भड़काऊ प्रतिक्रियाओं, घाव भरने, neurite परिणाम, वयस्क ऊतक सहित सेल microenvironment 21,22 के भौतिक गुणों, से संबंधित हैं जो जटिल सेलुलर और ऊतक प्रक्रियाओं की कुंजी तंत्र को समझने में मदद मिल सकती है कि आशा समस्थिति, और इस तरह के फाइब्रोसिस और कैंसर जैसे रोगों के रोगजनन.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
UV/Ozone Photoreactor Ultra-Violet Products Model PR-100
Rocking plate IKAcWerke Model KS 130 Basic
Vortexer Scientific Industries Model Vortex Genie2
Vacuum degassing chamber Applied Vacuum Engineering DP- 8-KIT
Parafilm Sigma-Aldrich P7793-1EA
Stainless steel forceps with fine tip Sigma-Aldrich Z225304-1EA
Dressing tissue forceps Sigma-Aldrich F4392-1EA
Petri dishes in polystyrene Sigma-Aldrich P5731-500EA
Aluminium foil, thickness 0.5 mm Sigma-Aldrich 266574-3.4G
Isopore membrane filter (0.2 µm pore size) Millipore GTTP Filter code
Round glass coverslip (22 mm diameter) Neuvitro GG-22
Round glass coverslip (25 mm diameter) Neuvitro GG-25
Variable volume micropipette Sigma-Aldrich Z114820
Protein microcentrifuge tubes Sigma-Aldrich Z666505-100EA
Scalpel handles Sigma-Aldrich S2896-1EA
Scalpel blades Sigma-Aldrich S2771-100EA
Cell culture flasks (75 cm2) Sigma-Aldrich CLS430641
Ultrasonic bath tray, solid (stainless steel) Sigma-Aldrich Z613983-1EA
Polydimethylsiloxane  Dow Corning Sylgard 184 silicone elastomer kit
Acrylamide (powder) Sigma-Aldrich A3553
N,N’-Methylenebis(acrylamide) Sigma-Aldrich 146072
N-Hydroxyethylacrylamide Sigma-Aldrich 697931
N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine Sigma-Aldrich T9281
Amonium PerSulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678
3-(Trimetoxysilyl)propyle acrylate Sigma-Aldrich 1805
Human Plasma Fibronectin Millipore FC010
Laminin from EHS Sigma-Aldrich L2020
Sodium hydroxyde Sigma-Aldrich 221465-25G
Double-distilled water (ddH2O)
Endothelial cell growth medium Cells Applications 211K-500
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) Invitrogen C-003-5C
Accutase PAA laboratories L11-007
HEPES buffer solution 1 M in H2O Sigma-Aldrich 83264-500ML-F
Antibiotics-antimycotics PAA laboratories P11-002
Phosphate Buffer Saline solution PAA laboratories H15-002
Alexa Fluor 488 Phaloidin Molecular Probes A12379
Anti-vinculin antibody produced in mouse Sigma-Aldrich V9131
Goat anti-mouse antibody-tetramethylrhodamine Molecular Probes T-2762
Anti-Fibronectin (rabbit) Sigma-Aldrich F3648
Streptavidin  Sigma-Aldrich 41469
Anti-Laminin antibody (rabbit) Sigma-Aldrich L9393
Anti-rabbit IgG-FITC Sigma-Aldrich F7512
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T3924-100ML
Absolute ethanol Sigma-Aldrich 459844-2.5L

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References

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