mechanotransduction의 큐의 영향 디커플링에 대한 히드 록시 PAAm 히드로 겔의 제조

Bioengineering

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Summary

우리는 최소한의 비용 또는 전문 지식을 갖춘 ECM 단백질의 직접적인 결합을 허용 히드 록시 PAAm라는 새로운 폴리 아크릴 아미드 하이드로 겔을 제시한다. 마이크로 콘택트 프린팅 휴대 mechanostransduction을 연구 천연 세포 미세 환경의 많은 큐들의 독립적 제어를 용이하게하여 히드 록시 PAAm의 조합은 하이드로 겔.

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Grevesse, T., Versaevel, M., Gabriele, S. Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues. J. Vis. Exp. (90), e51010, doi:10.3791/51010 (2014).

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Abstract

그것은 지금 잘 많은 세포 기능은 자신의 세포 외 기질 (ECM) 환경의 물리 화학적 및 기계적 신호와 세포의 상호 작용에 의해 조절되는 것으로 설정됩니다. 진핵 세포는 지속적으로 생화학 적 신호로 ECM의 물리적 변화를 형질 도입하기 위해 표면 mechanosensors 통해 로컬 미세 환경을 감지하고, 유전자 발현의 특정 변화를 달성하기 위해 이러한 신호를 통합. 흥미롭게도, 서로 ECM 캔 부부의 물리 화학적 및 기계적 매개 변수는 세포의 운명을 조절합니다. 따라서, mechanotransduction의를 이해하는 열쇠는 세포 기능에 ECM 큐의 상대적 기여도를 분리하는 것입니다.

여기에서 우리는 신속하고 쉽게 체외에서 mechanotransduction의 큐의 독립적 인 튜닝을위한 생물학적으로 관련 하이드로 겔을 생성하는 자세한 실험 프로토콜을 제시한다. 우리는 화학적으로 변성 폴리 아크릴 아마이드 하이드로 겔 (PAAm)는 자신의 본질적 비 ADHES을 극복하기중합시 히드 기능화 아크릴 모노머를 포함함으로써 속성 필자. 우리는 ECM 단백질의 원하는 성질의 고정화를 허용 록시-PAAm 불리는 신규 PAAm 하이드로 겔을시켰다. 마이크로 콘택트 프린팅은 독립적으로 단일 세포의 형태학, 매트릭스 강성 및 자연 ECM 단백질의 농도를 제어 할 수 있도록하여 하이드 록시 PAAm의 조합은 하이드로 겔. 우리는 시험 관내 세포 mechanotransduction의 과정에서 공부하는 모든 생물학 실험실에서 설정할 수있는 간단하고 빠른 방법을 제공한다. 우리는 ECM의 강성과 핵 사이의 기계적 커플 링을 보여 내피 세포에 대한 실험을 실시하여이 소설 두 차원 플랫폼을 검증합니다.

Introduction

지방 세포의 미세 환경의 많은 부분 (예를 들면, 강도, 기공 크기, 단백질의 성질, 또는 세포 리간드 밀도)가 이러한 운동성, 세포 증식, 분화 및 유전자 발현과 같은 세포 과정을 조절 규제 큐들의 좌표를 제공한다. 세포 외 환경의 물리 화학적 특성의 수정은 세포에 의해 감지 및 세포 편광, 마이그레이션 및 분화의 변형 등 다양한 생리 학적 결과를 야기 할 수 있습니다. 그것은 세포가 세포 생화학 적 신호로 ECM 수정을 번역하는 방법을, 그러나 확실하지 않다. 따라서 주요 중요성 mechanotransduction의 경로를 공부 셀과 미세 환경 사이의 상호 작용을 재현 할 수있는 시험 관내 미세 환경 제어 엔지니어이다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 최근에 쉽게 두 푼을 생성하기 위해, 히드 록시 PAAm 하이드로 겔이라는 새로운 방법 하나를 소개했다nsional 소프트 독립적으로 중요한 mechanotransduction의 단서를 제어 할 수 있도록 매트릭스 : 매트릭스 강성, 셀 형상과 감금, 단백질 및 세포 리간드 밀도의 자연입니다.

ECM은 morphogens에서 그라디언트를 통해 세포 과정 (화성), 접착 단백질 (haptotaxis), 강성 (durotaxis)을 지시합니다. 지난 몇 년 동안, 시험관 플랫폼에서 첨단 세포 생리 프로세스 2-5로 생화학 및 생물 물리학 적 기능을 변환 할 수있는 방법을 애타게하기 위해 이러한 세포 외 신호를 분리하기 위해 개발되었다. 전자빔 (6), (7), 포토 리소그래피, 광 화학적 고정화 8 또는 플라즈마 - 보조 기술도 9는 기판 상에 미세 패턴 살아있는 세포의 성장을 유도하기 위해 개발되었다. 이러한 기술이 중요한 결과를 산출하고 있지만, 이들 중 대부분은 세포 행동에 상이한 큐들의 개별적인 영향 사이의 차별을 허용하지그들은 몇 가지 실험실이 감당할 수있는 기술 설비를 필요로한다. 이러한 기술 중 미세 접촉 인쇄 (μCP)는 세포 접착 마이크로 섬 열을 만들 수있는 강력하고 접근 가능한 방법으로 떠오르고있다. 최근에, 광범위한 노력 11-14은 생체 조직에서 관찰 강성의 넓은 범위를 재현하기 위해 가변 강성과 하이드로 겔에 μCP을 개발되었습니다. 이들 작업 중, 폴리 아크릴 아미드 (PAAm)는 15 대중적 이미 세포 생체 역학 분석을 위해 가장 일반적으로 사용되는 중합 체계 매트릭스 중 하나입니다.

PAAm 표면은 일반적으로 N-sulfosuccinimidyl -6- [4'-아지도-2'-nitrophenylamido] (술포 SANPAH) 및 ECM 단백질 술포 SANPAH의 니트로의 UV 활성화함으로써 표면으로 연결되어 헤테로 가교제로 작용된다 아 지드 그룹 16. 또 다른 기술은 심한 산화 된 단백질에 결합 히드라진에 이루어져요오드 17. Hynd 및 동료 acroyl - 스트렙 타비 딘 단량체 (18)의 존재 광중합을 필요로 단백질과 펩타이드 생체 모방 하이드로 겔 표면을 패터닝하는 기술을 소개했다. 최근 챙은 외. 일 에틸 3 - [3 - 디메틸 아미노 프로필] 카르 보디이 미드 히드로 클로라이드로 활성화 된 PA 젤을 배양하는 데 필요한 광학 석영 마스크를 통해 PAAm 깊은 UV 노출에 기초한 새로운 미세 가공 방법 19 (EDC)를보고했다 및 N-히드 록시 숙신이 미드 (NHS) 수용액 전에 단백질을 추가한다. 긴 합성 과정 (예, 투석, 동결 건조, 등), 비싼 화학 물질 (예를 들면, 히알루 론산, 술포 SANPAH) 또는 깊은 UV : 균일하고 재현성 단백질 미세 패턴을 생성하기 위해 이러한 기술의 능력에도 불구하고, 대부분의 주요 한계 고통 조사. 또한, 이들 기술은 강성 기판, 미세 패턴의 독립적 인 변조를 허용하지 않는다기하학, ECM 단백질 자연, 그리고 세포 리간드 밀도.

계정에 이러한 한계를 가지고 가서, 우리는 부드러운 하이드로 겔의 단백질 및 생체 분자의 다양한 고정 수 및 세포 기능에 미치는 역할을 해독하기 위해 mechanotransduction의 큐의 독립적 인 튜닝을 허용하는 새롭고 간단한 아크릴 아미드 기반의 접근 방식을 개발했다. 대신에 강한 화학 화합물 PAAm 하이드로 겔을 치료, 우리 PAAm 중합 중에 수산기와 상업용 아크릴 모노머를 도입. 이 간단한 조작으로 다른 기술적 요구 사항없이 PAAm 하이드로 겔의 고유 안티 - 접착 성을 극복한다.

수산기의 존재는 수소 결합 상호 작용을 형성하는 단백질 및 생 분자를위한 히드 록시 PAAm 하이드로 겔의 높은 친화력으로 이끈다. μCP와 함께, 하이드 록시-PAAm 하이드로 겔은 독립 제어와 이차원 배양 플랫폼의 신속한 생성을 가능하게mechanotransduction의 연구를위한 강력한 플랫폼으로 구상하는 매트릭스 강성, ECM 단백질의 종류, 세포 리간드 밀도와 밀폐 된 접착에.

이 프로토콜의 목적은 쉽게 재료 과학에서 어떠한 지식없이 록시-PAAm 하이드로 겔을 제조하기위한 필요한 정보를 제공하는 것이다. 연구자 병태 생리 학적 기전에 관여 mechanotransduction의 경로를 더 잘 이해 될 수있는 세포 및 조직 수준에서 생리 관련 질문을위한 궁극적 목적은 수단을 제공하는 것이다.

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Protocol

1 유리 Coverslips는의 표면을 활성화

  1. 페트리 접시 스미어 (권장 화학 흄 후드) 5 분 정도에 0.1 M NaOH 용액에 넣어 유리 원형 커버 슬립 (25mm 직경).
  2. NaOH 용액을 제거하고 부드럽게 멸균 문화 후드에 흔들 접시에 락을하는 동안 완벽하게 20 분 동안 멸균 DDH 2 O로 된 커버를 체험.
  3. 멸균 DDH 2 O를 배출하고 단계 1.2를 반복합니다.
  4. 멸균 핀셋으로 된 커버를 제거하고 활성화 된 얼굴 위로 새로운 배양 접시에 배치합니다.
  5. 고순도 질소 가스의 지속적인 흐름하에 건조 된 커버.
  6. 멸균 배양 후드에서 1 시간 동안 커버 슬립의 활성화 측면에서 3 - (트리 메 톡시 실릴) 프로필 아크릴 레이트 (92 %)의 얇은 층을 얼룩.
  7. 광범위 살균 DDH 2 O 3 세척과 유리 된 커버를 세척하고 새로운 배양 접시에 무균 DDH 2 O에서 그들을 몰입.
  8. 페트리 접시를 누릅니다및 파라 필름으로 10 분 동안 교반과에서 로커 접시에 놓습니다.
  9. 좋은 팁을 멸균 핀셋 DDH 2 O의 커버 슬립을 제거하고 활성화 된 얼굴 위로 새로운 배양 접시에 배치합니다.
  10. 커버 슬립에 달라 붙는 먼지를 방지하기 위해 알루미늄 호일로 건조한 장소에서 실온에서 보관하십시오.

히드 록시 PAAm 히드로 겔의 2 준비

  1. 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 N-하이드 록시 에틸 아크릴 아미드 (HEA) 65 mg의 중량을 준비한다. 이는 신선한 HEA 용액을 제조하는 것이 중요하다.
  2. HEA에 50 mM의 HEPES 버퍼의 1 ML을 추가하고 전체 HEA 용해 할 때까지 vortexer를을 사용하여 혼합한다.
  3. 바람직한 하이드로 겔 강성에 도달 / w HEPES 아크릴 아미드 용액 및 / HEPES 비스 - 아크릴 아미드 용액에 w (표 1 참조) w 2 % w 필요한 부피 40 % 400 μl를 추가. 5 ML의 최종 볼륨에 50 mM의 HEPES로 조정합니다.
  4. vortexer를 탈기하고 그것을 사용 용액을 섞어하이드 록시 PAAm 중합을 방지 용액 내 산소 농도를 감소시키기 위해 20 분 동안 진공 챔버에서.
  5. 무균 후드 하에서, 소독하기 위해 0.2 μm의 세공 크기 필터를 탈기 용액을 필터.
  6. 7 분 동안 UV / 오존 클리너 원형 유리 커버 슬립 (22mm 직경) 활성화.
  7. 10 % 황산 암모늄 (APS) 용액 100 μl를 준비, 즉 100 μL의 DDH 2 O.에서 10 mg의 APS입니다 그것은 새로운 APS 용액을 제조하는 것이 중요하다.
  8. 중합을 개시 테트라 메틸렌 디아민의 2.5 μL (TEMED) 및 살균 히드 록시 PAAm 솔루션 (단계 2.5)에 APS 솔루션의 25 μl를 추가합니다. 멸균 조건 하에서, 거품의 도입없이 3 연속 pipettings 의해 용액을 혼합한다.
  9. 멸균 후드, 22mm의 GL을 배치 즉시 (단계 1.9에서 가능) 및 25mm coverslip에의 히드 록시 PAAm 솔루션의 25 μL 강하를 배치방울의 상단에 엉덩이를 커버 슬립 (단계 2.5에서 준비)는 히드 록시 PAAm 솔루션을 짜내합니다. 멸균 핀셋 22mm 유리 커버 슬립을 중앙에 모든 거품을 부드럽게.
  10. 하이드 록시 PAAm 하이드로 겔은 실온에서 15 분 동안 중합하도록 허용합니다. 중합 공정의 완료를 수행하는 에펜 도르프 튜브에서 직접 잔여 하이드 록시 PAAm 용액을 전환.
  11. 완전히 멸균 DDH 2 O로 커버 슬립을 담그고 신중 22mm 유리 커버 슬립 및 하이드 록시 PAAm 하이드로 겔 층 사이에 면도날의 에지를 도입하여 22mm 유리 커버 슬립을 분리.
  12. 멸균 PBS로 히드 록시 PAAm 하이드로 겔을 씻으 (PBS의 3 교류)와 완벽하게 수분을 유지하기 위해 멸균 PBS에 열중 젤을 할 수 있습니다.
  13. 최대 3 일 동안 4 ° C에서 멸균 PBS에서 히드 록시 PAAm 하이드로 겔을 저장합니다.

3 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) Microstamp 제작

NOTE : 실리콘 마스터의 제조는 STA에 앞서 필요PDMS에게 microstamp 제조를 실온. 실리콘 마스터의이 마이크로는 전문 장비와 훈련이 필요 리소그래피 기술에 의해 수행 할 수 있습니다. 나노 제조 시설과 협력은 실리콘 마스터를 제작하는 것이 좋습니다. 또한, 필요에 따라 맞춤형 미세 실리콘 마스터를 제조하고 회사에 문의하십시오. 이것은 실리콘 마스터의 제조에만 필요 한번 수행되어야한다는 것이 중요하다. 실제로, 미세 실리콘 주인은 탄성 중합체 스탬프를 생성하기 위해 무기한 사용할 수 있습니다.

  1. 믹스 및 PDMS (10) 경화제 : 플라스틱 비커 1 비율 10 분간 피펫을 사용하여 충분히 혼합한다.
  2. 3.1 공정 중에 형성된 기포를 제거하기 위해 진공 하에서 PDMS 혼합물을 탈기.
  3. 페트리 접시에서 미세 실리콘 마스터를 놓고 거품을 형성하지 않고 그 위에 가스가 제거 된 PDMS 혼합물의 10-mm 두께의 층을 캐스팅.
  4. 60 ° C에서 2 시간 동안 PDMS를 치료하자오븐.
  5. 메스와 먼지가없는 환경에서, 필 오프 PDMS 층과 소비세 1cm 2 microstamps.
  6. 집게를 사용하여, 장소 PDMS는 페트리 접시에 패턴 업을 microstamps.

(4) 미세 히드 록시 PAAm 히드로 겔

  1. 15 분 동안 에탄올 / 물에 장소 PDMS의 microstamps (50 분의 50) 솔루션 및 초음파 처리.
  2. 질소 기류의 흐름과 함께 우표를 건조하고 그들에게 7 분의 UV / 오존 청소기 (λ <200 nm의)의 패턴 업을 배치합니다.
  3. 멸균 후드에서 1 cm 2 PDMS 스탬프의 미세 표면에 원하는 단백질 용액 (예를 들어, 100 μg / ml의 라미닌 PBS 또는 25 μg / ml의 피브로넥틴 PBS에서)의 150 ㎕의 드롭을 배치합니다.
  4. 선택적 : 세포 리간드 밀도를 변조하는 단백질 용액의 농도를 수정한다.
  5. 각각의 모서리를 향해 멸균 피펫 팁으로 이동하여 도장면에 걸쳐 단백질 용액 확산스탬프입니다.
  6. 멸균 후드 아래에 60 분 동안 PDMS 스탬프에 흡착 단백질 용액을 둡니다. 단백질 손상을 방지하기 위해 램프를 끄고.
  7. 멸균 후드, 페트리 접시에 (단계 2.13에서 구입 가능) 히드 록시 PAAm 코팅 된 커버를 전송할 수 있습니다.
  8. 멸균 조건 하에서 낮은 질소 스트림과 하이드 록시 PAAm 기판의 표면으로부터 과량의 PBS를 제거한다. 즉시 겔 표면에 물을 서의 증거가 관찰되지로 절차를 중지. 겔이 단계에서 충분히 건조되어서는 안된다.
  9. 드라이 신중 PDMS의 구조화 된 표면은 고순도 질소 가스의 정상류와 스탬프.
  10. 드레싱 조직 겸자와 단백질 코팅 된 스탬프를 잡고 건조 된 하이드로 겔 표면과 접촉 구조화 된 표면을 배치합니다. 스탬프 마이크로 피처 및 하이드로 겔 표면 사이의 양호한 접촉을 보장하기 위해 PDMS 스탬프의 위에 핀셋의 끝 간단한 압력 점을 적용한다.
  11. 일에 PDMS 스탬프를 남겨실온에서 1 시간 동안 전자 하이드로 겔 표면.
  12. 부드럽게 드레싱 티슈 포셉 히드 록시 PAAm 하이드로 겔에서 PDMS 스탬프를 제거하고 스탬프를 청소하는 단계 4.1을 따릅니다.
  13. 환율 당 10 분 동안 멸균 조건에서 PBS의 3 교류 (산도 = 7.4)에 의해 광범위하게 각인 히드 록시 PAAm 하이드로 겔을 씻으십시오.
  14. 선택적 : 다른 ECM 단백질의 추가의 미세 패턴은 단계 4.5에서 4.11에 따라 하이드 록시 PAAm 표면에 첨가 될 수있다.
  15. 흔들 접시에 부드러운 교반하면서 4 ° C에서 하룻밤 동안 PBS에서 5 ㎎ / ㎖에서 BSA의 무균 용액으로 보호막을 비 인쇄 영역.
  16. 환율 당 10 분 동안 멸균 조건에서 PBS의 3 교류 (산도 = 7.4)에 의해 광범위하게 씻으십시오. 이 단계에서, 스탬프 히드 록시 PAAm 하이드로 겔은 일주까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다.

미세 패턴 히드 록시 PAAm 히드로 겔에 5 셀 증착

  1. 이전 도금 C에 30 ~ 45 분 동안 셀 미디어에 커버 슬립을 품어ELL 학생.
  2. 37 ° C에서 멸균 PBS와 75cm 문화 플라스크에서 배양 부착 세포를 세척하고 10 분 동안 3 트립신-EDTA의 ML 또는 accutase로 분리.
  3. g 떨어져있는 세포를 포함하는 플라스크로 세포주를 위해 미리 예열 완전 성장 배지에 적절한 원하는 금액을 전송 및 X 650에서 3 분 동안 세포 현탁액을 원심 분리.
  4. 마이크로 피펫으로 상층 액을 제거하고 15,000-20,000 세포 / ml에서 완전 배지에서 세포를 재현 탁.
  5. 1 ~ 2 시간 동안 습도를 (단계 5.1에서 얻은) 미세 패턴 커버 슬립에 셀 솔루션의 4 ML을 추가하고 배치 셀 덮인 커버 슬립을 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 5 %.
  6. 대기음 부드럽게 부착되지 않은 세포와 문화 매체를 교체합니다. 인큐베이터에 부착 된 세포를 반환하고가 (세포 유형에 따라 3-6 시간) 완전히 전파 할 수 있습니다.

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Representative Results

도 1a와 아크릴 아미드의 공중합 (AAM) 및 비스 아크릴 아미드 (비스 AAM)를 제시 N-hydroxyethylacrylamide 임베디드 히드록시기로 임의 라디칼 중합에 의해 폴리 아크릴 아미드의 친수성 네트워크를 형성 일차 수산기를 함유하는 (HEA) 모노머 (히드 록시 PAAm) . 이 프로토콜에서, HEA의 중량 65 ㎎을 HEPES 1 ㎖의 부피로 희석해야한다. HEA의 밀도가 한 대략 같다는 것을 알고, 우리는 우리가 1065 μL (HEA + HEPES)의 작업 볼륨을 얻을 수 있다고 가정합니다. 표 1에 제시된 바와 같이, AAM의 400 μL와 bisAAm의 50 μL로 1065 μL의 총 추가 1515 μL의 볼륨에 연결됩니다. 따라서 HEPES의 3485 μL의 부피는 5 ㎖의 최종 부피로 용액을 조정하는데 필요하다. 단계 2.6에서 나타낸 바와 같이, 22mm 유리 커버 슬립의 표면을 일으키지 않고이를 제거하기 위해 UV / 오존에서 7 분 동안 활성화해야하이드로 겔 표면에 모든 손해. 실제로, 유리 표면은 UV / 오존 처리 후에 더 친수성이되고, 따라서 용이하게 물에 시스템 전체를 침지에 의해 제거 할 수있다. 또한, UV / 오존 처리는 하이드로 겔의 표면과 직접 접촉 22mm의 커버 슬립의 화학적 오염을 방지한다. 이 방법은 허가 된 유리 커버 슬립에 결합 폴리 아크릴 아미드 평평한 원형 표면 (직경 22mm) (직경 25mm)을 얻었다.

그림 (b)에 제시된 바와 같이, 단백질의 미세 패턴은 미세 접촉 인쇄에 의해 히드 록시 PAAm 하이드로 겔의 표면에 생성 할 수 있습니다. 이 실험 절차에서, UV / 오존 노출은 표면에 실라 놀기를 형성함으로써 임시 PDMS 스탬프의 극한 소수성을 감소시키는 것을 허용. 254 nm의 라인은 원자 산소에 오존을 변환하는 동안 실제로, 185 nm의 라인은 분자 산소로부터 오존을 생성한다. 이 반응 종은 실록산 바 공격PDMS의 ckbone 산소 풍부 포스 SiOx 실리카 형 층 및 Si-OH 기의 표면을 형성한다. PDMS 표면 산화로 인해 표면 상으로부터 벌크 저분자 미가 교 중합체 사슬의 이주에 공기에 노출 후 단지 그 시간에 소수성을 회복하는 것으로 알려져있다. 이 전략은 PDMS 스탬프의 표면에 단백질 용액의 확산을 돕는다.

이 방법의 주요 이점 중 하나는 독립적으로 매트릭스 강성 (도 2A), 미세 패턴 형상 (도 2B), 세포 리간드 밀도 (도 2C), 단백질 특성 (도 3a 및도 3b)를 조절하는 것이다. 도 2a에 도시 된 바와 같이, 하이드 록시-PAAm 하이드로 겔은 세포 미세 환경의 강성 미세 복제를 허용 수십 kPa의 행부터 몇 kPa의 가교제 농도에 탄성률의 선형 의존도를 보여준다.도 2b를 선물도 2c는 셀 보여줍니다 리간드 밀도는 PDMS 스탬프를 배양하는 데 사용 된 단백질 용액의 농도를 변화시킴으로써 조절 될 수있다. 3 순차 마이크로 콘택트 장 복사를 사용하여 라미닌 및 피브로넥틴 행에 걸쳐 새겨 콜라겐 선 형광 영상을 제공 도표.

독자가 다양한 크기와 미세 패턴의 모양이 효율적에 관계없이 하이드로 겔 강성을 각인 한 점에 유의하는 것이 재미있다. 우리는 majo가 없음을 보여 성공적으로 날카로운 모서리 (예를 들어, 삼각형과 별)과 직선 (예를 들어, 선) 또는 곡선 (예를 들어, 원) 모양 단백질의 마이크로 피처를 재현패턴의 복잡성에 대한 연구 제한. 단일 세포 실험에서, 미세 패턴 표면적은 400 및 2500 μM이, 단일 세포 생존 능력의 한계에 대응하는 낮은 값 사이였다. 많은 다른 마이크로 인쇄 기반 방법으로, 제시된 방법의 주요 한계는 공간 분해능에 관한 것이다. "소프트"하이드로 겔에, 해상도의 한계가 부분적 동안 발생할 수있는 표면의 변형에 의해 결정된다 반면, 단단한 히드로 겔 (E> 10 kPa의)에서 공간 해상도는 마이크로 미터 주위에 주로 스탬프의 해상도에 의해 결정 단백질 전송.

히드 록시-PAAm 하이드로 겔의 독성에 균일하게 코팅 된 배양에서 1, 2, 3 일 동안 도금 차 내피 세포의 생존과 microprinted 소프트 록시-PAAm 하이드로 겔 (도 4a)를 정량화하여 조사 하였다. HUVECs를 약 80 %로 유지 미세 패턴 소프트 록시-PAAm 하이드로 겔에 도금하이드 록시 PAAm의 생체 적합성을 보여주는 3 일 동안 생존 능력은 세포 배양을 위해 하이드로 겔. 흥미롭게도, 유사한 생존은 기본 대뇌 피질의 신경 세포를 실험실에서 얻었다. 또한, 차 내피 세포는이 방법은 강성의 넓은 범위에 걸쳐 세포 증식을 연구 적절한 미세 환경을 제공한다는 것을 나타내는, "소프트"(25 kPa의) 기판들 (도 4b)에 비해 (500 kPa의) "딱딱한"에 더 증식 .

mechanotransduction의에 기판 강성의 효과와 확산 영역을 분리하려면 기본 내피 세포 (HUVEC 세포)가 직사각형 FN-코팅 된 미세 패턴에 도금 된 세 가지 다른 강성 (2.5, 8.5의 하이드 록시 PAAm 하이드로 겔에 증착 (1,200 μm의 2의 일정 영역), 25 kPa의). 맘마 사용 그런 다음, HUVEC를가 표준 면역 세포 화학 절차를 수행하여 액틴 필라멘트 vinculin 및 DNA를 위해 염색유리 기판 상에 도금 리안 세포. 단단한 기판에, 액틴 섬유가 똑바로 두꺼우 며 핵 변형 (그림 5) 반면 가장 부드러운 기판에서 HUVECs를가 낮은 액틴 섬유 밀도와 둥근 핵을 나타낸다. 일정한 확산 영역의 기판 강성의 변화는 핵의 리모델링 결과 굴지의 스트레스 섬유의 긴장과 유통을 조절. 이 관찰은 매트릭스 강성, 세포 골격과 핵 사이의 기계적 커플 링을 제안한다.

최종 AAM / bisAAm 비율 AAM 40 % (μL) HEA의 무게는 1 ml의 HEPES (MG)에 용해하기 비스 AAM (2 %)
(μL)
HEPES (μL) 영률
(10 PA)
0.2 / 50
0.5 / 50
50분의 1
50분의 2
50분의 3
400
400
400
400
400
65
65
65
65
65
50
125
250
500
750
3485
3410
3285
3035
2785
~ 1.4
~ 3.6
~ 8.7
~ 17.2
~ 25

하이드 록시 PAAm 표 1 준비는 다양한 경직성과 하이드로 겔. 작업 솔루션은 1.4에서 25 kPa의에 이르기까지 최종 강성 히드 록시 PAAm 하이드로 겔을 제조 하였다.

그림 1
도 1은 (A) 아크릴 아미드 (AAM, 블랙), N, N'-메틸렌 (비스 - 블루 AAM) 및 N-hydroxyethylacrylamide (HEA는 적색) 록시 형성하기 위해 함께 혼합 PAAm 하이드로 겔. (B) 히드 록시 PAAm 하이드로 겔의 미세 절차의 여러 단계의 도식 표현. 단백질 용액 제 microstamp (스텝 # 1)의 구조면에서 1 시간 동안 인큐베이션된다. 하이드로 겔의 표면을 부드럽게 질소 흐름 (스텝 # 2)에 의해 건조된다. microstamp이어서 1 시간 (단계 # 3) 중에 하이드 록시 PAAm 표면 공식적인 접촉하여 배치된다. 연속 세척 한 후, microprinted 표면은 4 ° C (5 단계)이 아닌 인쇄 된 부분을 차단에서 O / N 증착 된 멸균 BSA 용액으로 비활성화됩니다. 마지막으로, microprinted 히드 록시 PAAm 표면은 멸균 PBS로 여러 번 세척하고, 세포 시딩 (단계 # 6).에 대한 준비가 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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도 2 (A) 히드 록시-PAAm 하이드로 겔의 강성의 진화는 선형 비스 - AAM의 가교제 (적색 라인은 R 2 = 0995과 선형 회귀이다)의 양에 상관된다. (B) 형광 이미지 다른 강성 (E = 2.5, 15, 40 kPa의)의 히드 록시 PAAm 하이드로 겔에 찍혀 직사각형 라미닌 마이크로 기능을 제공합니다. 스케일 바는 (A) 65 μM, (B) 80 μM, 및 (C)에 대응하는 50 μM. (C) 15 μm의 폭 형태 25 kPa의 히드 록시-PAAm 하이드로 겔에 LM 그라데이션의 평행선, 진화로 나타내는 바와 같이 형광 강도 프로파일의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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90 °로 교차 줄무늬 (녹색) 그림 3 (A) 면역 형광의 피브로넥틴의 이미지 (빨간색)과 라미닌. (B) (빨간색) 피브로넥틴, 라미닌 (녹색)와 줄무늬 (파란색) 콜라겐의 Multilabeling microprinted 이후 25 kPa의 PAAm 하이드로 겔 기판 상. 스케일 바는 30 μm의에 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 (A) 세포 생존 능력의 정량화는 24, 48에서 우수한 세포 생존을 증명하고,에 도금 된 후 72 시간 균일하게 코팅 및 히드 록시 PAAm 표면을 마이크로 패턴. 숫자로 표시된각 바의 하단. 생존력 분석을 위해 카운트 세포의 총 수에 대응 한 (흰색 막대) 후 25 및 500 kPa의 균일 코팅 된 기판 상 된 HUVEC 증식 (B) 부량 7 (해시 바) 배양 일. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
녹색 그림 5 형광등 2.5 kPa의, 8.5 인민군 히드 록시 PAAm 하이드로 겔에 부착 된 직사각형 FN-코팅 된 미세 패턴에 배양 된 면역 염색 기본 내피 세포의 이미지, 25 (왼쪽에서 오른쪽으로) kPa의. 굴지 스트레스 섬유 ( )는 알렉사 플 루어 488 phalloidin 초점 유착 (빨간색) 마우스 polyclo로 염색과 염색NAL 차 항체와 붉은 형광의 IgG 이차 항체와 DNA 표지는 DAPI와 파란색으로 염색. 스케일 바는 17 μm의에 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

현대 세포 생물학 체외 관측 많은 종종 ECM 단백질 또는 RGD 서열을 함유하는 합성 펩티드의 얇은 층으로 코팅 된 경질 유리 커버 슬립 상에 수행되었다. 그러나, 이러한 기본 배양 기질 세포 mechanotransduction의 프로세스 연구를위한 정확한 모델을 제공하지 않는, 따라서 ECM의 전체 물리 복잡도 요점을 되풀이하지 않는다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 원하는 금액과 ECM 단백질의 자연과 두 차원 하이드로 젤을 기능화 할 수있는 간단한 대안을 제안한다. 이 방법은 매트릭스 강성, 세포 형태와 감금 또는 셀 - 리간드 밀도 중요한 mechanotransduction의 단서, 독립적으로 제어 할 수 있습니다. 또한, 하이드 록시-PAAm 하이드로 겔은 고정화 하나 이상의 ECM 단백질의 공간 분포를 제어 할 수 없다는 것이다 전류 기능화 방법의 가장 큰 제한 사항 중 하나를 극복. 때문에 수력의 친 화성이 높은XY-PAAm은 생체 분자에 대해, 하나는 어떠한 추가적인 장비를 필요로하지 않는 순차 microprintings를 이용하여 동일면에 다양 ECM 단백질의 공간적 분포에 관계없이 매트릭스 강성을 제어 할 수있는 하이드로 겔.

우리는 비용이나 전문 최소한의 요건들이 본질적으로 비 - 접착 성을 극복 아크릴 아미드 하이드로 겔 내의 수산기의 결합에 기초하여 신규 한 절차를 제안한다. 하이드로 겔에 단백질을 패터닝 기존 기술과 비교하여, 하이드 록시 PAAm 방식은 가혹한 독성 화학 물질 (예를 들면, 하이드라진 하이드레이트), 고가의 광 반응성 가교제 (예를 들면, 설포 Sanpah) 및 UV 램프 전력 및 위치에 의존하여 사용을 피한다 부드러운 하이드로 겔을 기능화. 히드 록시 PAAm 하이드로 겔은, 몇 주 동안 안정과 활성 상태로 유지하는 대량 생산 할 수 있습니다 쉽게 microprinted 및 생체 분자에 대한 높은 선호도의 상승 효과를 조사 할 수 있습니다세포 기능에 결합 된 ECM 단백질. 또한, 하이드 록시-PAAm 하이드로 겔 정량적 항상 주변 세포 미세 환경에 의해 가해지는 수축 힘의 양을 조사하기 위하여 사용될 수있다. 실제로, 우리는 형광 비드 쉽게 변위 필드를 측정하기 위해 세포 견인력 현미경 (TFM)를 사용하기 위해, 히드 록시-PAAm 하이드로 겔에 내장 될 수 있으며 진핵 세포에 의해 가해 얻어진 트랙션 필드에 도금 추정값 것을 이전 1,20 보여준다 이차원 미세 패턴.

많은 다른 마이크로 인쇄 기반 방법은, 히드​​ 록시 PAAm 하이드로 겔의 주요 제한은 단백질 마이크로 피처의 공간적 해상도에 관한 것이다. 뻣뻣한 하이드로 겔 (E> 10 kPa의)에서 공간 해상도는 마이크로 미터 주위에 주로 실리콘 몰드를 제조하는 데 사용되는 리소그래피 기술에 따라 스탬프의 해상도에 의해 결정. 연질 하이드로 겔에, 공간적 해상도가 부분적으로 결정된다 번째마이크로 미터의 공간 해상도를 달성하기 위해 주요한 제한이된다 단백질 전송 중에 전자 표면 변형. 여기에 제시된 방법은 현재 이차원 기판으로 제한된다. 그러나이 방법은 고도의 확장 성 및 추가 연구는 입체 구조에이 방법을 확장하는 우리의 실험실에서 현재 진행되고 있습니다.

우리는 히드 록시 PAAm 하이드로 겔이 밀접하게 배아 발달, 염증 반응, 상처 치유, 신경 돌기 생성, 성인 조직을 포함하는 세포 미세 환경 (21, 22)의 물리 화학적 특성, 관련된 복잡한 세포 및 조직 과정의 핵심 메커니즘을 해독하는 데 도움이 될 수 있기를 바랍니다 항상성, 그러한 섬유증 및 암과 같은 질환의 병인론.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
UV/Ozone Photoreactor Ultra-Violet Products Model PR-100
Rocking plate IKAcWerke Model KS 130 Basic
Vortexer Scientific Industries Model Vortex Genie2
Vacuum degassing chamber Applied Vacuum Engineering DP- 8-KIT
Parafilm Sigma-Aldrich P7793-1EA
Stainless steel forceps with fine tip Sigma-Aldrich Z225304-1EA
Dressing tissue forceps Sigma-Aldrich F4392-1EA
Petri dishes in polystyrene Sigma-Aldrich P5731-500EA
Aluminium foil, thickness 0.5 mm Sigma-Aldrich 266574-3.4G
Isopore membrane filter (0.2 µm pore size) Millipore GTTP Filter code
Round glass coverslip (22 mm diameter) Neuvitro GG-22
Round glass coverslip (25 mm diameter) Neuvitro GG-25
Variable volume micropipette Sigma-Aldrich Z114820
Protein microcentrifuge tubes Sigma-Aldrich Z666505-100EA
Scalpel handles Sigma-Aldrich S2896-1EA
Scalpel blades Sigma-Aldrich S2771-100EA
Cell culture flasks (75 cm2) Sigma-Aldrich CLS430641
Ultrasonic bath tray, solid (stainless steel) Sigma-Aldrich Z613983-1EA
Polydimethylsiloxane  Dow Corning Sylgard 184 silicone elastomer kit
Acrylamide (powder) Sigma-Aldrich A3553
N,N’-Methylenebis(acrylamide) Sigma-Aldrich 146072
N-Hydroxyethylacrylamide Sigma-Aldrich 697931
N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine Sigma-Aldrich T9281
Amonium PerSulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678
3-(Trimetoxysilyl)propyle acrylate Sigma-Aldrich 1805
Human Plasma Fibronectin Millipore FC010
Laminin from EHS Sigma-Aldrich L2020
Sodium hydroxyde Sigma-Aldrich 221465-25G
Double-distilled water (ddH2O)
Endothelial cell growth medium Cells Applications 211K-500
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) Invitrogen C-003-5C
Accutase PAA laboratories L11-007
HEPES buffer solution 1 M in H2O Sigma-Aldrich 83264-500ML-F
Antibiotics-antimycotics PAA laboratories P11-002
Phosphate Buffer Saline solution PAA laboratories H15-002
Alexa Fluor 488 Phaloidin Molecular Probes A12379
Anti-vinculin antibody produced in mouse Sigma-Aldrich V9131
Goat anti-mouse antibody-tetramethylrhodamine Molecular Probes T-2762
Anti-Fibronectin (rabbit) Sigma-Aldrich F3648
Streptavidin  Sigma-Aldrich 41469
Anti-Laminin antibody (rabbit) Sigma-Aldrich L9393
Anti-rabbit IgG-FITC Sigma-Aldrich F7512
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T3924-100ML
Absolute ethanol Sigma-Aldrich 459844-2.5L

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References

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