Erzeugung von Scherhaft Karte Mit SynVivo Synthetische mikrovaskuläre Networks

Bioengineering

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Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks. J. Vis. Exp. (87), e51025, doi:10.3791/51025 (2014).

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Abstract

Handy / Partikelhaftung Tests sind entscheidend für das Verständnis der biochemischen Interaktionen in Krankheit Pathophysiologie beteiligt und haben wichtige Anwendungen in der Suche nach der Entwicklung neuartiger Therapeutika. Tests mit statischen Bedingungen nicht um die Abhängigkeit der Haftung auf Scher erfassen, was ihre Korrelation mit in vivo-Umgebung. Parallelplattenflusskammern, die die Haftung unter physiologischen Fluidstrom zu quantifizieren müssen mehrere Experimente zur Erzeugung einer Scherhaft Karte. Darüber hinaus müssen sie nicht unbedingt die in vivo-Skala und Morphologie und erfordern große Volumina (~ ml) Reagenzien für die Experimente. In dieser Studie zeigen wir die Erzeugung von Scherhaftung Karte aus einem einzigen Experiment unter Verwendung einer mikrovaskulären Netzwerk basierend Mikrofluidikvorrichtung SynVivo-SMN. Das Gerät erstellt die komplexen in vivo Gefäßsystem einschließlich geometrischen Maßstab, morphologische Elemente, Strömungsmerkmale und zellulären Interaktionen in einIn-vitro-Format, wodurch eine biologisch realistische Umgebung für grundlegende und angewandte Forschung in Zellverhalten, Drug Delivery und Drug Discovery. Der Test wurde durch die Untersuchung der Wechselwirkung der 2 um Biotin-beschichteten Teilchen mit Avidin-beschichteten Oberflächen der Mikrochip gezeigt. Der gesamte Bereich der Scherung in der Mikrovaskulatur beobachtet in einem einzelnen Assay ermöglicht Adhäsion gegenüber der Scher Karte für die Partikel unter physiologischen Bedingungen erhalten wird.

Introduction

Aktuelle Assays auf Zell-Zell-und Zell-Teilchen-Wechselwirkungen untersuchen typischerweise statische Well-Plattenformat, in welchem ​​Teilchen oder Zellen auf Protein-Matrices oder adhärente Zellen inkubiert. Am Ende der angegebenen Inkubationszeit werden die Zahlen der anhaftenden Teilchen oder Zellen unter Verwendung von 1-Mikroskopie quantifiziert. Auch wenn diese Untersuchungen liefern wichtige Einblicke in die biochemischen Prozesse hinter dieser Wechselwirkungen ist eine wesentliche Einschränkung, der Mangel an physiologischen Flüssigkeitsstrom (typisch für die Mikrozirkulation) und ihre Auswirkungen auf die Partikelhaftung.

Um diese Einschränkung zu überwinden, wurden in-vitro-Strömungskammern in den letzten Jahren entwickelt worden. Ein gemeinsames Element dieser Strömungskammern ist ein transparentes Gerät bei niedrigen Reynolds-Zahlen an der Wand der Blutgefäße in vivo 2 beobachtet Scherraten entsprechen durchblutet. Die Behälterwand wird entweder durch Beschichtung von Biomolekülen oder das Wachstum von Zellen auf einer Oberfläche des Strömungs c modelliertHamber 3. Partikel oder Zellen 4-7 8-16 werden dann flossen bei gewünschten Durchsatzbereich, die Anzahl der anhaftenden Partikeln unter verschiedenen Scherraten zu quantifizieren.

Jedoch ist die Verwendung von parallelen Plattenströmungskammern zu studieren und zu validieren die biochemische Phänomene ziemlich teuer und zeitaufwendig. Dies ist vor allem aufgrund der Tatsache, dass mehrere Versuche benötigen, um zum Erzeugen einer Karte von der Fluidscher gegen die Anzahl der Partikel / Zellen haften geführt werden. Außerdem Platte Strömungskammern erfordern große Mengen von Reagenzien aufgrund ihrer Größe (Höhe> 250 um und einer Breite von> 1 mm). Schließlich sind diese Geräte nicht genau modellieren geometrische Merkmale (zB Bifurkationen) und Durchflussbedingungen (z. B. gegen konvergierenden divergierenden Ströme), die in vivo vorhanden sind.

Jüngste Fortschritte in der Lithographie Mikro 17-19 haben den Bereich der Lab-on-a-Chip beschleunigtGeräte 20-21. Diese Geräte waren maßgeblich an der Entwicklung eines miniaturisierten Version der Parallelplattenlaufkammer mit Abmessungen im Mikrometerbereich. Die Reduzierung der Dimension ergibt auch erhebliche Vorteile in Bezug auf die Mengen von Reagenzien, Zellen oder Partikel für die Experimente erforderlich. Eine wesentliche Einschränkung, die derzeit erhältlichen Vorrichtungen ist jedoch die Verwendung von linearen Kanälen Mikrogefäßen, die den in vivo beobachteten komplexen Mikrogefäß nicht zu imitieren ist modellieren.

Wir haben kürzlich ein neues Verfahren zur Wieder mikrovaskulärer Netzwerke auf Einweg-Kunststoffsubstraten, was zu synthetischen Darstellung der in vivo-Bedingungen entwickelt. Diese Geräte bezeichnet SynVivo-Synthetic mikrovaskuläre Networks (SMN) werden mit PDMS-basierte Soft-Lithographie-Prozess entwickelt. SynVivo SMN-Geräte können verwendet werden, um die Scherhaft Karte von Zell / Partikelhaftung 22 zu erhalten, Studien gezielten Wirkstofftransport und 23 have gegen in-vivo-Daten 24-25 validiert. In diesem Beitrag stellen wir ein Protokoll, dass die Erzeugung der Schubhaft Karte aus einem einzigen Experiment in Volumen so klein wie 1-5 ul was zu erheblichen Einsparungen von Ressourcen und Zeit ermöglicht.

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Protocol

1. Auffüllen der SynVivo-SMN Mikrofluidikvorrichtung

  1. Jeder Port (Einlass / Auslass) der Vorrichtung besteht aus zwei parallelen Ports umfaßt - eine für Oberflächenbeschichtungseinheiten fließt (Adhäsionsmoleküle, Wachstums Matrizen, etc.) und / oder Zellen zum Impfen und die andere für die Testdurchführung (1A ).
  2. Komplett Tauchen Sie das SynVivo-SMN Mikrofluidik-Vorrichtung (Abbildung 1B) in einer Petrischale sterilem deionisiertem (DI), das Wasser und die Schale in einen Vakuumtrockenschrank. Erlauben der Exsikkator ausgeführt, bis die gesamte Luft aus den Kanälen der Vorrichtung entfernt. Dies sollte etwa 15 Minuten dauern.
  3. Bevor Sie das Gerät aus dem Wasser, legen Tygon-Schlauch (OD von 0,06 "und ID von 0,02") mit Wasser vorbereitet in jedes Port des Gerätes mit feinen Punkt Pinzette. Der Schlauch sollte etwa 1 cm lang sein. Das Gerät kann nun aus dem Wasser entfernt werden. 1C zeigt Bild des DevicE mit dem Schlauch.

2. Beschichtung der mikrofluidischen Vorrichtung mit gewünschten Protein (z. B. Avidin)

  1. Mit einer Pipette einen Tropfen Wasser (etwa 100 ul), um die Basis des einen Einlaßanschlußschlauch. Den Schlauch mit dem Gerät verwendet prime vorsichtig entfernen. Der Wassertropfen wird Luft in das Gerät zu verhindern.
  2. Bereiten einer 1 ml Spritze mit Avidin beladen in einer Konzentration von 20 ug / ml. Schließen Sie die Spritze zu einer 24 G Nadel aus Edelstahl und Schläuche. Stecken Sie den Schlauch an einer der Einlassöffnungen des Gerätes. Klemmen Sie die Einlassöffnung nicht mit einem Backenschelle eingesetzt.
  3. Injizieren Avidin bei einer Flussrate von 1 &mgr; l / min für 10 Minuten, um eine vollständige Perfusion der Vorrichtung zu ermöglichen. Am Ende des Durchflusszeit, klemmen Sie den Schlauch mit dem Kieferklemme und stellen Sie das Gerät bei 4 ° C über Nacht.

3. Mitteln des biotinylierten Partikel Haftung für Experimente

  1. Lassen Sie das Gerät anauf Raumtemperatur kommen. Stellen Sie das Gerät auf einem inversen Fluoreszenzmikroskop mit einem motorisierten Bühne und einem Hochleistungs-Kamera ausgestattet.
  2. Eine Lösung von 2 um biotinylierten Partikel in einer Konzentration von 5 x 10 6 Partikeln / ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Laden der Teilchen in einer 1 ml-Spritze. Bereiten Sie eine zweite 1-ml-Spritze von nur PBS. Legen Sie jede Spritze auf eine Spritzenpumpe und eine Verbindung zu Nadel und Schläuche.
  3. Mit einer Pipette einen Tropfen Wasser (etwa 100 ul), um die Basis des Einlasses Schläuche. Den Schlauch zu beschichten das Gerät verwendet, vorsichtig entfernen. Der Wassertropfen wird Luft in das Gerät zu verhindern.
  4. Vorsichtig den Schlauch für biotinylierten Teilchen und PBS aus Schritt 3.2 in jede der Einlassöffnungen. 2A zeigt Bild von der Set-up.
  5. Einspritzen beginnen biotinylierten Partikel mit einer Durchflussrate von 2,5 ml / min. Überwachung der Einlaßöffnung auf dem Mikroskop. Beim ersten Anzeichenvon Partikeln, beginnen Sie den Timer und Fluss weiterhin für 3 min.
  6. Am Ende der 3 min, Auslaufen des biotinylierten Partikel, während gleichzeitig die Strömung des starren PBS bei einer Flussrate von 2,5 ml / min. Lassen PBS in der Einrichtung für 3 min fließen zu waschen ungebundene Partikel.

4. Erwerb von Bildern und Erstellen Area of ​​Interest (AOI) Messungen mit Imaging-Software (NIKON Elements)

  1. Mit der Funktion "Scan-große Bild" in der Imaging-Software, um das Bild der gesamten Einrichtung zu erwerben.
  2. Nacheinander die Anzahl Gabelungen im Gerät und eine kreisförmige AOI mit der doppelten Durchmesser der Kanäle. In diesem Fall den AOI Durchmesser bis 200 um, da die Kanaldurchmesser beträgt 100 um.
  3. Verwenden Sie die automatisierte Zählung Funktion in der Bildbearbeitungssoftware, um die Anzahl der Teilchen in jedem AOI in eine MS Excel-Tabelle exportieren.
  4. Ebenso nutzen die automatisierte Zählung-Funktion, um die Anzahl der Teilchen in der gesamten exportierenGerät.

5. Particle Flux Analyse mit Computational Fluid Dynamics (CFD) Modelle

  1. CFD-Simulationen werden mit kommerziell erhältlicher Software (CFD-ACE +, Inc. ESI) für den SynVivo-SMN Gerätetopologie laufen. Die Ergebnisse werden in einer Datenbank zur Analyse von experimentellen Beobachtungen gespeichert. Die Simulationsergebnisse speichern Informationen über Wandscherraten, Geschwindigkeit, Partikelfluss und Haftung im Gerät.
  2. Die Simulationsergebnisse werden verwendet, um die Anzahl der Partikel, die in jeder AOI basierend auf einem gegebenen Eintrittspartikelkonzentration zu bestimmen.

6. Genescherhaft Karte

  1. Berechnen% der Adhäsion durch Dividieren der anhaftenden Teilchen in der Gabelung von den in der Verzweigung, wie in Gleichung 6.1 gezeigt fließenden Teilchen.
    Gleichung 1
    wobei die Anzahl der Partikel haftet und den fließenden Teilchen aus p erhaltenrotocol Schritte 4.3 und 5.2 auf.
  2. Zeichnen Sie die Scherfestigkeit Karte mit der Scherrate bei jeder Gabelung der von der Datenbank in Schritt (5.1) erhalten Netze und die aus Gleichung 6.1% erhalten Haftwerte.

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Representative Results

1A zeigt eine schematische und eine helle Bildfeld SynVivo SMN-Gerät. 1B zeigt die SynVivo SMN-Gerät auf einem Glasträger montiert. 1C zeigt das Gerät mit folgenden Rohr im Vakuumtrockenschrank Grundierung mit Wasser.

2A zeigt ein Bild der Versuchs-Einrichtung. 2B zeigt eine typische Avidinbeschichtete SynVivo SMN-Gerät nach der Bindung von 2 um biotinylierten Partikel. Beachten Sie, dass Partikel bevorzugt in der Nähe der Gabelungen im Netz zu halten.

3A zeigt die nummerierten Gabelungen in der SynVivo SMN-Netzwerk. 3B zeigt Probe Wand durch die CFD-Modell des Geräts erzeugt Scher Karte. Die Schergeschwindigkeit variiert in der Vorrichtung im Bereich von 250 s -1 bis 15 s -1 in der Mikrovaskulatur in vivo beobachtet. Beachten Sie, dass diese unterschiedlichenScherraten können nicht gleichzeitig in linearer mikrofluidischen Kanälen erhalten werden, da sie eine konstante Scherrate für jede Fließgeschwindigkeit. Fig. 3C zeigt ein Diagramm der Werte der Schergeschwindigkeit an jeder der Verzweigungen des Netzwerks. Die Daten zeigen, dass die Scherrate Muster sind komplex und können nicht mit einer einfachen analytischen Beziehung im Gegensatz zu linearen Strömungskanäle erreicht werden. Außerdem mehrere Gabelungen (AOI) im Netz, die in der gleichen Scher bin fallen vorhanden sind, zusätzlich zu den statistischen Sicherheit der Daten.

4A zeigt Ergebnisse der Probe CFD-Analyse für die Partikelströme in dem Netzwerk, die verwendet werden, um die Partikelströme in den Zweigen und Gabelungen der experimentellen Netzwerk zu berechnen. 4B zeigt die Scherfestigkeit der Karte aus dem einzelnen SynVivo-SMN Experiment berechnet. Die Scherhaft Karten folgt die inverse Beziehung ab Scheradhäsion Karte beobachtet erteilenlinearen Kanal Experimenten. Im Gegensatz mit einem SynVivo Assay erlaubt jedoch einem einzigen Experiment Generation dieser Scher Karte Gegensatz mehrere Versuchsdurchläufe von den linearen Kanälen, was zu erheblichen Einsparungen an Zeit und Ressourcen erforderlich. Beachten Sie, dass Experimente sind in dreifacher Ausführung für maximale statistische Analysen laufen.

Figur 1
Fig. 1 ist. SynVivo SMN-Geräte. Linker Bereich (1A) zeigt eine schematische Darstellung der Vorrichtung. Hellfeld-Bild des Gerätes mit der rechten Panel (Abbildung 1A) zeigt. 1B zeigt die SynVivo SMN-Gerät auf Mikroskop-Objektträger montiert. 1C zeigt das Gerät mit Tygon ™ Schlauch an den Eingang / Ausgang-Ports nach dem Priming mit Wasser angebracht.


Abbildung 2. Typische Haft Assay in SynVivo-SMN. 2A zeigt ein Bild der Versuchs-Einrichtung. 2B zeigt biotinylierten Partikel nach der Bindung im Gerät. Beachten Sie, dass die Partikelhaftung gefunden wird, um in der Nähe von Bifurkation lokalisiert im Vergleich zu den Zweigen des Netzes werden.

Fig. 3
3. Scheranalyse SynVivo-SMN. 3A zeigt alle Verzweigungen im Netzwerk nummeriert und eine vergrößerte Ansicht der Verzweigungen von den Experimenten. 3B zeigt die qualitative Wandschub Karte in den Gabelungen in dem Netzwerk. Abbildung3C zeigt die quantitative Informationen über die Scherung in den Zweigen in dem Netzwerk. Beachten Sie, dass die Schermuster im Netzwerk sind komplex und umfassen die physiologischen Bereich von Scherraten (0-240 s -1) in vivo gefunden.

Fig. 4
4. Erzeugung von Scherhaftung Karte. Figur 4A zeigt die Trajektorien (in weiß dargestellt) in den von der CFD-Simulation erhalten Netzwerken. Diese Trajektorien nachbearbeitet, um die Partikelströme in den verschiedenen Branchen und den Verzweigungen zu erhalten sind. 4B zeigt die Scherfestigkeit Karte von einem einzigen SynVivo SMN-Experiment erhalten.

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Discussion

Parallelplattenflusskammer und bietet wesentliche Erkenntnisse über Zell-Zell-und Zell-Teilchen-Wechselwirkungen, leiden unter mehreren Einschränkungen wie hoher Verbrauch an Reagenzien und die Notwendigkeit für mehrere Versuchsdurchläufe, um eine Scherhaft Karte zu erzeugen. Die Verwendung von synthetischen Mikrovaskuläre SynVivo-Netzwerke (SynVivo-SMNS) ermöglicht die Erzeugung einer Scherhaft Karte aus einem einzigen Experiment unter Bedingungen in vivo-Bedingungen nachahmen. Zusätzlich wird deutliche Einsparungen (> 95%) in Reagenzien ebenfalls erhalten.

Der wichtigste Schritt im laufenden Partikelhaftung Experimente mit SynVivo-SMN ist es, blasenfreie Bedingungen in der Chip vor dem Experiment zu gewährleisten. Einführung von Blasen würde zu fließen Instabilität und mangelnde Zugang zu "Luft gesperrt" Bereiche des Chips. Daher muss sehr darauf, während Insertionen und Extraktionen der Schläuche von den Ports des Gerätes berücksichtigt werden. Im Falle einer Blase in th gefundene Vorrichtung während des Priming-Schritt kann man die Grundierungsschritt zu wiederholen, um die Blasen zu entfernen. Alternativ kann man in den Medien / Reagenzien bei einer niedrigen Durchflussraten (0,1 ml / min oder weniger) fließen kann, um blasenfreie Grundierung des Gerätes zu gewährleisten.

Die Hauptbeschränkung des Protokolls ist der Chip unbrauchbar nach dem Vorhandensein einer Blase, die nicht entfernt werden kann. Doch mit der Praxis eine sorgfältige Experimente mit in der Nähe von 100% Erfolg durchführen können. Auch die Erzeugung von Scherhaftung Karte erfordert Informationen von CFD-Modellen. Allerdings kann eine vorberechnete Datenbank von CFD-Ergebnisse für verschiedene Strömungsverhältnisse leicht zu überwinden die Notwendigkeit, die CFD-Simulationen durchzuführen.

Obwohl die hier vorgestellten Methode verwendet die Avidin-Biotin-System zur Vereinfachung der Demonstration, kann jeder Ligand-Rezeptor-Kombination auf Partikel oder Zellen verwendet werden, um Studie Partikeloberfläche oder Zell-Oberflächen-Wechselwirkungen in Echtzeit in der Vorrichtung sein. Weiterhin können Zellen, Cuin der Vorrichtung zur Partikel-Zell-und Zell-Zell-Interaktionen zu studieren ltured. Kultur von Zellen Beschichtung der Kanäle der Vorrichtung mit für gewünschte Zelltypen Matrix erfordern. Beispielsweise können Endothelzellen auf mit Fibronectin beschichteten Kanäle kultiviert werden. Nach Konfluenz können die Endothelzellen mit TNF-α oder anderer relevanter Zytokine aktiviert werden. Weiße Blutzellen (WBCs) eingespritzt werden kann und deren Interaktionen auf aktivierten Endothelzellen können in Echtzeit untersucht werden. Wie das Protokoll in dieser Studie gezeigt, kann eine Scherhaftung Karte von weißen Blutzellen leicht von einem einzigen Experiment erzeugt werden.

Die in diesem Dokument genannten Protokoll kann verwendet werden, um Auswirkungen von Netzwerkmorphologie auf Partikel / Zell-Adhäsion als ein Modell der in vivo-Bedingungen zu untersuchen. Darüber hinaus kann die Wirkung der Strömung auf Teilchen / Zell-Adhäsion und Zellverhalten zu modellieren physiologischen Bedingungen ebenfalls leicht ausgewertet werden. Schließlich kann das Protokoll unsed, um Medikamentenabgabe und Wirksamkeit für die gezielte Abgabe auf die gewünschte Zellpopulationen zu untersuchen.

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Disclosures

Veröffentlichungsgebühr für diesen Artikel von CFD Research Corporation gesponsert.

Acknowledgements

SynVivo Technologie wurde unter dem Förder # 2R44HL076034 vom NHLBI entwickelt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SynVivo-SMN CFD Research SMN-001 Exclusive at CFDRC
CFD-ACE+ ESI Inc. N/A
Avidin Invitrogen 43-4401 Any avidin source will work for this assay
Biotinylated Particles Polysciences 24173-1 Any source of biotinylated particles will work for the assay
Tygon Tubing VWR 63018-044 Size is typical for use with SynVivo-SMN
NIKON Elements NIKON Instruments N/A Any other imaging software can be used

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