هندسة الأنسجة: بناء ومتعددة الخلايا 3D سقالة لتسليم الطبقات صفائح خلية

1School of Engineering, University of California, Merced
Published 10/03/2014
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets. J. Vis. Exp. (92), e51044, doi:10.3791/51044 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

العديد من الأنسجة، مثل قلوب البشر البالغين، غير قادرين على تجديد كاف بعد الضرر. 2،3 استراتيجيات في هندسة الأنسجة تقترح الابتكارات لمساعدة الجسم على الشفاء والإصلاح. على سبيل المثال، قد يكون النهج TE قادرة على تخفيف إعادة القلب بعد احتشاء عضلة القلب (MI)، وربما زيادة إجمالي وظائف القلب إلى القريب العادي قبل MI مستوى 4 كما هو الحال مع أي نوع من الأنسجة وظيفية، وتجديد أنسجة القلب الناجح ينطوي على تسليم السليم لل أنواع الخلايا متعددة مع العظة البيئية لصالح التكامل وبقاء الكسب غير المشروع زرع خلية / الأنسجة. يجب أن تعالج الأنسجة المهندسة معلمات متعددة بما في ذلك: الإشارات القابلة للذوبان، خلية الى خلية التفاعلات، والمواد مصفوفة تقييم وسائل إيصالها، آثارها على بقاء الخلية، والقوة المادية، وتسهيل وتنظيم الخلايا إلى الأنسجة. الدراسات باستخدام الحقن المباشر للخلايا الكسب غير المشروع فقط تجاهل هذه العناصر الأساسية. 2،5،6لم يتم بعد إعداد تصميم النسيج الجمع بين هذه المكونات. هنا، نقدم مثالا لتصاميم متكاملة باستخدام طبقات من ألواح الخلايا منقوشة مع نوعين متميزين من المواد البيولوجية المشتقة من نوع من الخلايا التي تحتوي على الجهاز المستهدف والخلايا البطانية لتعزيز تكوين الأوعية جديد في "نسيج". على الرغم من أن هذه الدراسات تركز على توليد أنسجة تشبه القلب، وهذا التصميم الأنسجة يمكن تطبيقها على العديد من الأجهزة الأخرى من القلب مع تصميم المواد والحد الأدنى من التغييرات، ومن المفترض أن يكون المنتج قبالة الجاهزة للاستخدام للعلاجات التجدد. بروتوكول يتضمن خمس خطوات مفصلة. ويستخدم البولي درجة الحرارة حساسة (N -isopropylacrylamide) (pNIPAAM) لأطباق زراعة الأنسجة معطف. ثم، وخلايا أنسجة محددة يتم تربيتها على سطح لوحات مغلفة / أسطح micropattern لتشكيل خلية ورقة مع التصاقات جانبية قوية. ثالثا، يتم إنشاء مصفوفة قاعدة للأنسجة عن طريق الجمع بين مسامية مصفوفة مع permissi التوعية المستحدثةلقد الهلاميات المائية والخلايا البطانية. وأخيرا، يتم رفع الأوراق خلية من الأطباق pNIPAAM المغلفة ونقل إلى قاعدة عنصر، مما يجعل بناء كاملة.

Protocol

1. إنشاء لوحات pNIPAAM المغلفة

  1. حل 2.6 غرام من pNIPAAM في 2 مل من / 40٪ محلول الهكسان 60٪ التولوين.
  2. حرارة الخليط إلى 60 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة أثار، حتى يتم حل pNIPAAM.
  3. قطع ورق الترشيح في دائرة قطرها 60 ملم ورقة مكان في قمع بوخنر.
  4. تصفية حل من خلال بوخنر القمع في وزنه قبل دورق زجاجي (لا تستخدم البلاستيك، والهكسان سوف تذوب البلاستيك).
  5. ضع الكأس ومحتوياتها في فراغ جرس (24 رطل) O / N (16 ساعة). ملاحظة: حتى يتفاعل مع بقايا الآيزوبروبيل سيكون أكسدة لذلك تأكد من أنها لا تأتي في اتصال مع الأوكسجين.
  6. تزن الكأس لتحديد وزن pNIPAAM.
  7. إضافة ايزوبروبيل إلى pNIPAAM، وخلق 50/50 ث / ث الحل.
  8. ضع 2 مل من محلول على سطح لوحة زراعة الأنسجة، ومعطف لمدة 5 دقائق تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية.
  9. غسل لوحة مع 2 مل من برنامج تلفزيوني الدافئ مرتينقبل استخدام لثقافة الخلية.

2. إنشاء خلية صفائح

ملاحظة: يمكن إنشاء أوراق خلية من الخلايا الأولية للجهاز الهدف باستخدام عدد من الأساليب المختلفة، أو طلاء الأسطح زراعة الأنسجة مع الحرارية استجابة البوليمر كما هو موضح هنا. وتقدم لوحات الحرارية الحساسة قبل المغلفة أيضا عدد من البائعين.

ملاحظة: هذا البروتوكول هو لثقافة استخدام طبق 35 ملم. باختصار، يتم تحضين الخلايا أولا عند 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 24 ساعة عند التقاء لتأسيس اتصالات جانبية بين الخلايا المجاورة. للافراج عن صحائف خلية، يتعرض لوحات لدرجات حرارة أقل من 32 درجة مئوية. ثم يتم نقل ورقة الخلية إلى قاعدة مصفوفة ليفية قوية تحتوي على هيدروجيل متساهل التوعية المستحدثة مع الخلايا البطانية في الأوعية الدموية.

  1. عزل السكان الخلية. ملاحظة: هذه الطريقة تعتمد على إجراءات اشتقاق الفردية ونوع من الخلايا. الفئران مو سلس الأبهروتستخدم خلايا scle (RASMC) في هذا المثال. هذه هي خلايا العضلات الملساء معزولة الأولية من الشريان الأورطي البطني من الفئران.
  2. غسل الخلايا مع 2 مل من PBS الدافئ.
  3. إضافة 3 مل من التربسين (أو الشق الآخر / حل يفصل) إلى الخلايا لمدة 5 دقائق.
  4. تمنع التربسين بإضافة 3 مل من وسائل الإعلام والثقافة، أو حل العازلة الفوسفات (PBS) التي تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS).
  5. جمع الخلايا في أنبوب مخروطي الشكل والاعتماد قسامة.
  6. تدور الخلايا في 1،000 دورة في الدقيقة (228 x ج) لمدة 5 دقائق.
  7. نضح وطاف resuspend الخلايا في وسائل الإعلام نموها (يتم استخدام SmGM2 بالإضافة إلى عدة رصاصة مستنبت للRASMC).
  8. وضع وسائل الإعلام التي تحتوي على الخلايا على 35 ملم الحرارية الحساسة وحة - pNIPAAM لوحة المغلفة بتركيز التي من شأنها تحقيق 100٪ التقاء. ملاحظة: للحصول RASMCs تم تحديد هذا العدد ليكون 100،000 خلية / سم 2. ولكن نظرا لفقدان الخلايا أثناء وفاة، و 120٪ من ذلك فا يستخدم LUE.
  9. وضع في حاضنة عند 37 درجة CO / N. ملاحظة: من المهم للحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية للحفاظ على التصاق الخلية إلى لوحة.

3. إعداد مصفوفة التأسيسية

ملاحظة: مختلف المصفوفات ليفية 3D يمكن استخدامها لطبقة مصفوفة ليفية قوية بين الأوراق الخلايا الحساسة. وتشمل بعض الأمثلة: جلفوم، bioglass والمواد الطبيعية acellularized 26 أو nanospun المواد 27،28 وقدمت المثانة البولية الخنزير مصفوفة (UBM) المستخدمة في هذه الدراسات بسخاء من وجهة نظرنا متعاون، الدكتور Badylak 29.

  1. قبل استخدامها، وتحديد خصائص المصفوفة بما في ذلك عدم وجود محتوى الخلوي إذا تم استخدام مصفوفة decellularized، 27،28 بقاء الخلية المحددة، والفضاء باطل 22
  2. قطع مصفوفة تعقيمها قبل إلى الحجم المطلوب والشكل. ملاحظة: وهنا، يستخدم حفرة لكمة لقطع دائرة قطرها 4 مم.
ve_title "> 4. الخلايا البطانية لحصد في حديث التوعي متساهل هيدروجيل

ملاحظة: يمكن الحصول على الخلايا البطانية من مجموعة متنوعة من المصادر، بما في ذلك التمييز من الخلايا الجذعية أو السلف. هنا، وتستخدم HuVECs.

  1. استخدام أي هيدروجيل متساهل (الليفين، والمواد الهلامية الكولاجين) لفترة طويلة كما المرة عبر ربط قصيرة بما يكفي للسماح للخلايا تبقى قابلة للحياة. ملاحظة: هنا، هلام لHyaluronan (HA) على ربط عبر مع يستخدم جسر ثاني كبريتيد.
  2. إعداد هيدروجيل HA وفقا لبروتوكول الشركة.
  3. جمع الخلايا البطانية وتفريق في حل وحيد الخلية باستخدام 1X التربسين. ملاحظة: يمكن أيضا Accutase أو خلية التفكك العازلة استخدامها لتشتت خلية واحدة.
  4. تنشيط انزيم التربسين باستخدام مبلغ مساو من مثبط التربسين فول الصويا (إذا كان من المهم أن الخلايا لا تتلامس مع المصل) أو 10٪ FBS في برنامج تلفزيوني، وجمع الحل / الخلايا في أنبوب مخروطي 15 مل.
  5. Count الخلايا، وحساب حجم الحاجة للأبعاد التصحيح (كميا سابقا). ملاحظة: للحصول على 4 ملم التصحيح، وتستخدم هنا من 2 مليون الخلايا البطانية.
  6. استخراج خلايا من 2 مليون، والمكان الى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد.
  7. تدور في (228 x ج) لمدة 5 دقائق.
  8. نضح طاف، وترك الخلايا كما بيليه في أنبوب مخروطي.
  9. مزيج من المواد السائلة HA والجيلاتين في 1: الحصة 1. ثم إضافة 80٪ من حجم التداول الكلي في أنبوب مخروطي يحتوي على بيليه.
  10. resuspend الخلايا البطانية في 1: 1 HA / خليط الجيلاتين
  11. وضع خلايا معلقة في خليط HA / الجيلاتين في قاعدة مصفوفة ليفية من الخطوة 2.
  12. إضافة 1/5 (20٪) من حجم التداول الكلي المطلوب للرابط عبر
  13. احتضان لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية.

5. عزل صفائح خلية

  1. إزالة لوحات 35 ملم pNIPAAM المعاملة التي تحتوي على خلايا من الحاضنة ومكان في غطاء ثقافة الخلية فيRT.
  2. نضح بسرعة وسائل الإعلام من الخلايا، وإضافة 2 مل من 6٪ الجيلاتين العادية الذي تم تسخينه إلى 37 درجة مئوية.
  3. في حين أن الجيلاتين لا تزال دافئة، ضع شعرية معدنية في الجيلاتين، غمر تحت سطح الجيلاتين العادية (فيلم 1).
  4. وضع لوحة كاملة على الجليد لمدة 5 إلى 7 دقائق، والسماح للالجيلاتين لتتصلب.
  5. بعد 7 دقائق، واستخدام ملعقة لفصل بعناية حواف الجيلاتين من الجانب من لوحة، ومن ثم استخدام ملقط لرفع شعرية معدنية من لوحة ملاحظة: الجيلاتين 6٪، ورقة خلية يجب أن ترفع مع شعرية.
  6. نقل ورقة الخلية إلى الطبق ووضع على رأس قاعدة ليفية مصفوفة هيدروجيل الجمع، ووضع بعناية شعرية على أعلى بناء. ملاحظة: الجانب القمي من ورقة خلية ستبقى في هذا المنصب.
  7. إضافة 2 مل من وسائل الإعلام دافئ (37 درجة مئوية).
  8. احتضان O / N السماح للخلايا ورقة التمسك السطح هيدروجيل.
  9. إزالة رانه شعرية المعادن بعد حل ارتفاع درجة حرارة (حوالي 1 ساعة)، أو في اليوم التالي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

مخطط التدفق (الشكل 1) يبين طريقة الكلي لجعل التصحيح متعدد الطبقات. يتم فصل الخلايا من ورقة لوحة تعامل pNIPAAM بإسقاط درجة حرارة أقل من 32 درجة مئوية. ثم يتم وضع ورقة خلية على رأس هيدروجيل عبر ربط تحتوي على الخلايا البطانية المصنف في مصفوفة ليفية الأساسية (الشكل 1). ويمكن أيضا لوحات الحرارية الحساسة سابقة التجهيز أن تستخدم لخلق ورقة الخلية. وتستخدم أسطح الطوبوغرافية خاصة لنمط تحديدا (أي محاذاة) الخلايا 30.

يمكن إنشاء مصفوفة ليفية الأساس من decellularizing مصفوفة أنسجة الأم أو electrospun. هنا، تم قطع ورقة مادة ليفية لقطرها 4 مم للقاعدة التصحيح (الشكل 2A). توصيف هذه المواد مهم لتحديد مبلغ هيدروجيل التي يمكن استخدامها لملء المساحات الفارغة. مصفوفة المستخدمة هنا تم previouتتميز خبيث ونشرت 22

الهلاميات المائية التي تحتوي على الخلايا البطانية هي عبر ربط بعد تطبيق HA هيدروجيل مكونات السائل إلى مصفوفة ليفية. يظهر الفحص المجهري مضان / نقل خلايا ملطخة Calcein AM (الشكل 2B) التي تم التقاطها في هيدروجيل عبر ربط الحية.

تم تصوير عملية إنشاء ورقة الخلية (الشكل 3)، بما في ذلك المقارنة بين منطقتنا لوحات pNIPAAM والمغلفة لوحات ما قبل المغلفة شراؤها من بائع. ومطلي RASMC على سطح pNIPAAM المعالجة للا يقل عن 16 ساعة عند 37 درجة مئوية. هذه المرة الأدنى يسمح للخلايا لإنشاء التصاقات الحدود الجانبية مع الخلايا المجاورة (الشكل 3A). ملاحظة: يجب أن تكون الخلايا في التقاء لإقامة هذه الحدود الجانبية. بعد زراعة لمدة 16 ساعة على الأقل، يجب أن يتم نقل لوحة من الخلايا لRT لانخفاض أقل من 32 درجة مئوية، واستخدام الثلج وأو 5-8 دقيقة يسرع عملية التبريد (الشكل 3B). انخفاض درجات الحرارة يغير زاوية الاتصال متعلق بتكوين للطلاء المادي يسمح للخلية ورقة لرفع الخروج من لوحة. يبين الشكل 3C رفع ورقة خلية من لوحة.

لوحات مغلفة في المختبر عملت بشكل جيد، وبعد بعض الأمثل، لخلق وتحريك صفائح خلية الشكل 4D معارض أحادي الطبقة متموجة من RASMC قبل نقلها. عندما سمح للخلايا لرفع، تميل الأوراق إلى أضعاف والعصا إلى نفسه (الشكل 3E). في الواقع، والتلاعب في الأوراق خلية في المنزل خلق pNIPAAM أو تلك التي تم شراؤها من الصعب وأدت في كثير من الأحيان في تمزيق الأوراق (الشكل 3F). ولذلك، تم تطوير حل لنقل الأوراق. مرة واحدة تتم إزالة الخلايا من الحاضنة والبدء في باردة، تم استخدام 6٪ الجيلاتين لتغطية الخلايا مع معدن لتر إضافيattice جزءا لا يتجزأ من داخل هلام (الشكل 3G). مع انحسار لوحة، الخلايا رفعت، ويصلب الجيلاتين. باستخدام ملقط، شعرية وخلية ورقة gelatin- يمكن إزالتها معا من لوحة الثقافة. جميع في نفس الوقت (الشكل 3H). ثم توضع هذه العناصر الثلاثة على رأس القائمة على بناء (الشكل 3I). هنا، ورقة الخلية (الوردي) هو أكبر بكثير من المصفوفة قاعدة الأساسية (مصفوفة بيضاء سميكة تحت خلية ورقة الوردي). يمكن بسهولة قلص ورقة الخلية إلى حجم.

يتم إنشاء خلية التصحيح النهائي (الشكل 4) من خلال طبقات الخلايا على ورقة المجمع بريفورميد قاعدة التصحيح وهيدروجيل متساهل. من أسفل إلى أعلى، ويتكون التصحيح مصفوفة ليفية المصنف مع hyaluronan هيدروجيل تحتوي على الخلايا البطانية، ومن ثم يتم الطبقات ورقة على رأس خلية من هذه المصفوفة. في وقت مبكر محاولات للتلاعب في أوراق الخلية دون استخدام الجيلاتين / شعرية apparأدى atus في أوراق زنزانة صغيرة جدا التي غالبا مطوية وتمزقت (الشكل 4A-D ينظر اليها من فوق). الشكل 4A يمثل التصحيح في وقت مبكر تصميم صورة مركبة تجمع بين الأحمر mitotracker مصبوغ RASMC (الشكل 4B)، calcein AM HuVECs الفلورية الخضراء (الشكل 4C)، وصورة ضوئية تنتقل (الشكل 4D). يتم توفير توثيق 10X الصور للخلية ورقة HA / هيدروجيل دون مصفوفة (الشكل 4E-H). الشكل 4E هو مركب من mitotraker الأحمر (الشكل 4F)، وCalcein AM الأخضر HuVECs (الشكل 4G) والضوء المرسل ( الرقم 4H). وجهة نظر من تحت (مصفوفة قاعدة، HA / HUVEC)، والصور ورقة خلية من كل عنصر تظهر في أرقام 4I-L. الصور المركبة هي الشكل 4I، مع الأجزاء الفردية ممثلة في الشكل 4J-L، الشكل 4J SHالدودة الحلزونية ورقة الخلية (اللون الأحمر)، والخلايا البطانية (الخضراء) هي في الشكل 4K، ونقل صورة (الشكل 4L) الصورة المركبة (الشكل 4M) معارض التصحيح مع ورقة خلية موحدة تغطي المنطقة بأكملها من المصفوفة دون أي لطي أو تمزق. أرقام 4M-P هي أيضا من أسفل يبحث حتى في مصفوفة. 4N الشكل هو خلية ورقة، تحتوي محايد الأحمر. مرة أخرى، تظهر شرائط حمراء سميكة حول مصفوفة لأن طيات ورقة في هذه المناطق المتاخمة مباشرة إلى حافة المصفوفة. التصوير ضوء انتقال (الشكل 4O) يظهر مورفولوجيا الخلايا، وهيكل المصفوفة. أخيرا (الشكل 4P)، ومصفوفة لديها نوعية خاصة من الاستشعاع في نفس الطول الموجي ودابي. لذلك، يتم استخدام الإثارة فوق البنفسجية من المصفوفة لمشاهدته بوضوح منفصلة عن ورقة الخلية (أحمر فاتح). حواف التصحيح يمكن خفض لإزالة أي حواف الورقة التي تخيم على حواف المصفوفة.

الشكل 1
يتم إنشاء الشكل البياني 1. تدفق الأنسجة الجمعية. اوراق خلية من خلايا البذر على لوحات thermoresponsive pNIPAAM المغلفة، ويتيح وقتا كافيا للخلايا للوصول إلى نقطة التقاء وتأسيس اتصالات جانبية على الخلايا المجاورة. يتم تحرير ورقة الخلية عن طريق خفض درجة حرارة (القرص الأصفر). وفي الوقت نفسه، هي جزء لا يتجزأ الخلايا البطانية في التوعية المستحدثة متساهل HA هيدروجيل، حقن الفراغات الفضاء من قاعدة أقوى مصفوفة ليفية، وcrosslinked كيميائيا (القرص الأبيض). ورقة الخلية (القرص الأصفر) هي الطبقات ثم مع مزيج البطانية مصفوفة (أبيض)، حسب الحاجة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الرقم 2. صور مصفوفة قاعدة وتغليف غشائي. واللكم (A) قاعدة أقوى مصفوفة ليفية في شكل دائري. هنا يتم استخدام 4 مم في القطر بناء على نموذج حيواني في الجسم الحي. (B) HuVECs ملطخة mitotracker الأخضر (Calcein AM) معلقة في الهلاميات المائية HA على سطح مصفوفة قاعدة (10X). الرجاء انقر هنا لعرض أكبر نسخة من هذا الرقم.

الرقم 3
الرقم 3. إنشاء صفائح الخلية. (A) ج RASMCultured على pNIPAAM المعاملة 35 مم أطباق لمدة 16 ساعة (10X). (B) رفع RASMC بعد وضع لوحة على الجليد لمدة 5-7 دقيقة. (C) صورة من حافة ورقة الافراج عن خلية من شراؤها تجاريا thermoresponsive صحن الثقافة الخلية (10X). (DF) الصور تصور نتائج مماثلة لتوليد صحائف خلية من الأطباق في المنزل خلق pNIPAAM المغلفة. (D) مندمج RASMC نمت على 35 ملم لوحات زراعة الأنسجة القياسية (4X). (E ) بعد التبريد، تعاقدت الخلية وأوراق مطوية لأنها منفصلة (4X). (F) ونظرا لهشاشة ورقة وحيدة الخلية، وغالبا ما تلف أوراق خلية خلال رفع أو معالجات أخرى (4X). (G) و أجل تخفيف الثقوب في ورقة خلية، تم استخدام شاشة معدنية كدعم مادي للمساعدة في نقل الأوراق الخلية. كانت ملطخة RASMC مع محايد الأحمر، مع تغطية 6٪ الجيلاتين ودعم الشاشة المعدنية التي يسهل اختراقها، والثاني سمح لتتصلب. (H) مع دعم الشاشة، يتم نقل صفائح خلية بأقل ضرر (4X). (I) و أكبر RASMC طبقة ورقة الخلية (اللون الوردي) ثم وضع على رأس ليفي مزيج التصحيح هيدروجيل قاعدة أقوى (السهم). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
كانت شخصية 4. صور الطبقات الخلوية التصحيح. الخلايا المستزرعة على سطح pNIPPAM المغلفة ثم انتقلت بمثابة ورقة على سطح مصفوفة ليفية. أسفرت التجارب المبكرة التي لم نقلها مع شعرية الجيلاتين / المعادن في بقع صغيرة ممزقة (AD). (A) صورة مركبة من (BD)،(B) RASMCs في ورقتين ملطخة Mitotracker الأحمر، و (C) HuVECs ملطخة الأخضر، و (D) في ضوء المنقولة. (E) صورة مركبة من خلية ورقة جنبا إلى جنب مع قاعدة أقوى ليفي مزيج مصفوفة تحتوي على هيدروجيل Calceing AM الملون HuVECs (الأخضر)، و (F) Mitotracker الأحمر RASMCs. (G) HuVECs الفلورية الخضراء معلقة في هيدروجيل. (H) نقل الصور من قاعدة أقوى ليفي مزيج مصفوفة هيدروجيل. (I) صورة مركب تبحث عن السفلي من التصحيح الصعودي خلال قاعدة أقوى مصفوفة ليفية (وليس الملون)، HA يحتوي HuVECs (الأخضر)، ورقة خلية من RASMCs (الأحمر)، على التوالي. (J) الحمراء RASMCs الفلورسنت ورقة، كما يتضح من خلال قاعدة المصفوفة ليفي هيدروجيل الجمع. (K) HuVECs الفلورية الخضراء (L) صورة إحالة بناء التصحيح.(M) صورة مركبة من الخلايا اوراق (الحمراء) على قاعدة ليفية مزيج مصفوفة هيدروجيل (-autofluorescent الأزرق). (N) الخلايا في ورقة الغلاف هو قاعدة ليفية مصفوفة هيدروجيل المعرض مزيج زيادة مضان على حواف بسبب bunching من الخلايا. (O) نقل صورة للبناء. (P) وautofluorescent الطبيعية الليفية قاعدة المصفوفة في دابي (الطول الموجي الأزرق). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيلم 1 . يتم تمييز عملية نقل الأوراق من الخلايا في الفيلم التكميلي المقدمة مع الوثيقة. يظهر الفيلم، في عملية تدريجية، وإزالة الخلايا من الحاضنة. استبدال وسائل الإعلام مع 6٪ الجيلاتين، وإدخال عشرالبريد الشاشة المعدنية، تقشعر لها الأبدان من الخلايا على الجليد، ونقل الخلايا من الطبق pNIPAAM المغلفة لطبق آخر، صورة من الخلايا أثناء النقل، وأخيرا إزالة الشاشة من الورقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الخطوات الحاسمة في البروتوكول ما يلي: طلاء أسطح لوحة مع البوليمر thermoresponsive والتلاعب في أوراق الخلية بعد التبريد لوحات. لأن خلايا مختلفة تظهر الخصائص الفيزيائية المختلفة، مثل adhesivity، يجب أن يكون الأمثل الوقت لرفع كل نوع من الخلايا المختلفة. العنصر الثاني، والأكثر تحديا بكثير من هذا البروتوكول، ومراكز على التلاعب في خلية ورقة، جانبا مهما من أساليب لتجميع الأنسجة. طبقة وحيدة الخلية في خلية ورقة هشة للغاية ويمكن أن تمزق بسهولة إذا التلاعب بالملقط. وعلاوة على ذلك، عندما لا يتم عقد صحائف خلية في مكان، فإنها تميل إلى التعاقد ويمكن طيها بسهولة. نقل ورقة خلية المقترحة باستخدام شاشة داعمة الإيدز التلاعب في خلية ورقة هشة.

منهجية تصميم الواردة في هذا المخطوط يوفر نهج منخفض التكلفة إلى حد ما في خلق خلية ورقة لمجموعة متنوعة من تطبيق صحيفة هندسة الأنسجةالكاتيونات. وعلاوة على ذلك، وخلق لوحات pNIPAAM المغلفة داخل مختبر الجامعة يمكن أن تكون موحدة مع هذا الأسلوب والتعديلات على بروتوكول يمكن إدخالها على استيعاب أنواع خلايا متعددة، والسطوح. استخدام صفائح الخلايا، بدلا من الخلايا واحد غير المنظمة، والإيدز التجمع الأنسجة، ويمكن أيضا أن يزيد من احتمال البقاء على قيد الحياة وتكامل الأنسجة المزروعة. ومع ذلك، فإن في الجسم الحي طريقة التسليم (لم يرد ذكرها في هذا البروتوكول) من هذه التركيبات يجب أن يكون الأمثل لكل نوع من أنواع الأنسجة. وتشمل التطبيقات المستقبلية الاستكشافات والمنهجيات الأمثل لتوليد الأنسجة للأجهزة الجسم محددة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Calcein-AM Invitrogen C3099 Cell tracker / live dye
Lysotracker Red Invitrogen L7528 Cell tracker
Neutral Red Sigma N7005 Visible Cell dye
pNIPAAM Sigma Aldrich 412780250 Poly(N-isopropylacrylamide)
Toluene Sigma Aldrich 244511-1L
Hexane Sigma Aldrich 296090-1L
RAOSMC Lonza R-ASM-580 Rat Aortic Smooth Muscle Cells
SmGM2 Lonza CC-4149 Smooth Muscle Media
HUVEC Invitrogen C-003-5C Human Venous Endothelial Cells
HyStem Glycosan/Biotime
Isopropyl alcohol VWR International BDH1133-4LP
Trypsin Corning Cellgro 25-053-C1
PBS Gibco 14287-072
FBS Gibco 16140-071
Specific Equipment
Filter paper Ahlstrom  6310-0900 
Buchner Funnel  Sigma Aldrich  Z247308 
UpCell Plates  Nunc  2014-11 
UV light Jelight Company  UVO Cleaner Model No.42

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ohashi, K., Okano, T. Functional tissue engineering of the liver and islets. Anat Rec (Hoboken). 297, 73-82 (2014).
  2. Chen, Q. Z., Harding, S. E., Ali, N. N., Lyon, A. R., Boccaccini, A. R. Biomaterials in cardiac tissue engineering: Ten years of research survey. Mat Sci Eng R. 59, 1-37 (2008).
  3. Jakob, P., Landmesser, U. Current status of cell-based therapy for heart failure. Curr Heart Fail Rep. 10, 165-176 (2013).
  4. Tongers, J., Losordo, D. W., Landmesser, U. Stem and progenitor cell-based therapy in ischaemic heart disease: promise, uncertainties, and challenges. Eur Heart J. 32, 1197-1206 (2011).
  5. Etzion, S., et al. Influence of embryonic cardiomyocyte transplantation on the progression of heart failure in a rat model of extensive myocardial infarction. J Mol Cell Cardiol. 33, 1321-1330 (2001).
  6. Masuda, S., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T. Cell sheet engineering for heart tissue repair. Adv Drug Deliv Rev. 60, 277-285 (2008).
  7. Koh, G. Y., Soonpaa, M. H., Klug, M. G., Field, L. J. Strategies for myocardial repair. J Interv Cardiol. 8, 387-393 (1995).
  8. Li, R. K., et al. Construction of a bioengineered cardiac graft. J Thorac Cardiovasc Surg. 119, 368-375 (2000).
  9. Muller-Ehmsen, J., et al. Rebuilding a damaged heart: long-term survival of transplanted neonatal rat cardiomyocytes after myocardial infarction and effect on cardiac function. Circulation. 105-1720 (2002).
  10. Reinecke, H., Zhang, M., Bartosek, T., Murry, C. E. Survival, integration, and differentiation of cardiomyocyte grafts: a study in normal and injured rat hearts. Circulation. 100-193 (1999).
  11. Roell, W., et al. Cellular cardiomyoplasty improves survival after myocardial injury. Circulation. 105, 2435-2441 (2002).
  12. Soonpaa, M. H., et al. Potential approaches for myocardial regeneration. Ann N Y Acad Sci. 752, 446-454 (1995).
  13. Akins, R. E. Can tissue engineering mend broken hearts. Circ Res. 90, 120-122 (2002).
  14. Goodell, M. A., et al. Stem cell plasticity in muscle and bone marrow. Ann N Y Acad Sci. 938, 208-218 (2001).
  15. Menasche, P., et al. Myoblast transplantation for heart failure. Lancet. 357, 279-280 (2001).
  16. Murry, C. E., Wiseman, R. W., Schwartz, S. M., Hauschka, S. D. Skeletal myoblast transplantation for repair of myocardial necrosis. J Clin Invest. 98, 2512-2523 (1172).
  17. Orlic, D., et al. Transplanted adult bone marrow cells repair myocardial infarcts in mice. Ann N Y Acad Sci. 938, 221-229 (2001).
  18. Elia, R., et al. Silk-hyaluronan-based composite hydrogels: a novel, securable vehicle for drug delivery. J Biomater Appl. 27, 749-762 (2013).
  19. Kai, D., et al. Stem cell-loaded nanofibrous patch promotes the regeneration of infarcted myocardium with functional improvement in rat model. Acta Biomater. (2014).
  20. Hong, H. J., et al. Tracheal reconstruction using chondrocytes seeded on a poly(l-lactic-co-glycolic acid)-fibrin/hyaluronan. J Biomed Mater Res A. (2014).
  21. Serpooshan, V., et al. The effect of bioengineered acellular collagen patch on cardiac remodeling and ventricular function post myocardial infarction. Biomaterials. 34, 9048-9055 (2013).
  22. Turner, W. S., et al. Cardiac tissue development for delivery of embryonic stem cell-derived endothelial and cardiac cells in natural matrices. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 100, 2060-2072 (2012).
  23. Sato, M., Yamato, M., Hamahashi, K., Okano, T., Mochida, J. Articular cartilage regeneration using cell sheet technology. Anat Rec (Hoboken). 297, 36-43 (2014).
  24. Sawa, Y., Miyagawa, S. Present and future perspectives on cell sheet-based myocardial regeneration therapy. Biomed Res Int. 2013, 583912 (2013).
  25. Demirbag, B., Huri, P. Y., Kose, G. T., Buyuksungur, A., Hasirci, V. Advanced cell therapies with and without scaffolds. Biotechnol J. 6, 1437-1453 (2011).
  26. Song, J. J., Ott, H. C. Organ engineering based on decellularized matrix scaffolds. Trends Mol Med. 17, 424-432 (2011).
  27. Badylak, S. F., et al. The use of extracellular matrix as an inductive scaffold for the partial replacement of functional myocardium. Cell Transplant. 15, Suppl 1. S29-S40 (2006).
  28. Wang, Y., et al. Lineage restriction of human hepatic stem cells to mature fates is made efficient by tissue-specific biomatrix scaffolds. Hepatology. 53, 293-305 (2011).
  29. Gilbert, T. W., et al. Collagen fiber alignment and biaxial mechanical behavior of porcine urinary bladder derived extracellular matrix. Biomaterials. 29, 4775-4782 (2008).
  30. Luna, J. I., et al. Multiscale biomimetic topography for the alignment of neonatal and embryonic stem cell-derived heart cells. Tissue Eng Part C Methods. 17, 579-588 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats