조직 공학 : 계층화 된 세포 시트의 전달을위한 다세포 3D 비계 건설

Bioengineering

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Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets. J. Vis. Exp. (92), e51044, doi:10.3791/51044 (2014).

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Abstract

이러한 성인의 마음으로 많은 조직은 적절하게 손상 후 재생 할 수 없습니다. 조직 공학에서 2,3 전략 복구 및 수리에 몸을 지원하기 위해 혁신을 제안한다. 예를 들어, TE 방식은 심근 경색 (MI) 후 심장 리모델링을 약화 가능성이 거의 정상 사전 MI 수준으로 전체 심장 기능을 향상시킬 수 있습니다. 4, 심장 조직을 성공적으로 재생이의 적절한 전달이 포함 기능적 조직과 마찬가지로 이식 된 세포 / 조직 이식의 통합과 생존에 유리한 환경 단서 여러 세포 유형. 배달 차량, 세포 생존에 미치는 영향, 재료 강도 및 세포 간 조직의 조직의 촉진으로 평가 용해 신호, 세포 간 상호 작용 및 매트릭스 재료 : 엔지니어링 조직은 다음과 같은 여러 매개 변수를 해결해야합니다. 그래프트 세포의 직접 분사 만이 필수 요소를 무시를 이용하는 연구. 2,5,6이 성분을 결합 조직 설계는 아직 개발되어야한다. 여기서, 우리는 "조직"에서 새로운 혈관의 형성을 향상시키기위한 표적 장기 세포 유형 및 내피 세포를 포함하는 생물학적 유래 물질의 두 가지 유형의 패턴 화 된 세포 시트의 레이어를 이용하여 통합 된 디자인의 예를 제시한다. 이러한 연구는 심장과 같은 조직의 생성에 집중하더라도,이 조직 설계는 최소한의 디자인 및 재질 변경 심장 이외의 여러 장기에 적용 할 수 있고, 회생 치료를위한 상용 제품이 될 것을 의미한다. 이 프로토콜은 다섯 자세한 단계가 포함되어 있습니다. 온도에 민감한 폴리 (N의 -isopropylacrylamide) (pNIPAAM은) 코트 조직 문화 요리에 사용됩니다. 이어서, 조직 특이 세포는 강한 횡 유착 세포 시트를 형성하기 위해 코팅 된 플레이트 / 미세 패턴 표면의 표면 상에 배양한다. 셋째, 기본 매트릭스는 신생 혈관 permissi 다공성 매트릭스와 결합하여 조직을 위해 생성 된하이드로 겔과 내피 세포를했습니다. 마지막으로, 세포 시트 pNIPAAM 코팅 접시로부터 해제되어 완전한 구조를 만드는 기본 요소로 전송.

Protocol

pNIPAAM 코팅 된 플레이트의 1 창조

  1. 60 % 톨루엔 / 40 % 헥산 용액 2 ㎖에 pNIPAAM의 2.6 g을 녹인다.
  2. pNIPAAM이 용해 될 때까지 교반 10 분 동안 60 ° C로 가열하여 혼합합니다.
  3. 뷰 흐너 깔때기에 60mm 직경의 원과 장소 종이에 종이 필터를 잘라.
  4. 미리 칭량 유리 비이커 흐너 깔때기를 통해 용액 (헥산 플라스틱을 용융하는 바와 같이, 플라스틱을 사용하지 않음) 필터.
  5. 벨 진공 (24 PSI) O / N (16 시간)로 비커와 내용을 놓습니다. 참고 : 잔류 이소 프로필과 반응 할 때까지 그렇게는 산소와 접촉하지 않는지 확인 산화됩니다.
  6. pNIPAAM의 무게를 설정하는 비커의 무게를 측정.
  7. 솔루션 w / w 50 대 50을 만들어 pNIPAAM에 이소 프로필 알코올을 추가합니다.
  8. UV 빛 아래 5 분의 조직 배양 판의 표면에 솔루션 및 코트 2 ㎖를 놓습니다.
  9. 두 번 따뜻한 PBS의 2 ㎖의 접시를 씻으세포 배양에 사용하기 전에.

세포 시트의 2 창조

주 : 표적 장기에 대한 일차 세포의 세포 시트를 서로 다른 방법들을 사용하여 생성 될 수 있고, 또는 여기에서 설명한 바와 같이 열 응답 성 폴리머로 조직 배양 표면을 코팅하여. 사전 코팅 온도에 민감한 판은 공급 업체들에 의해 제공됩니다.

참고 :이 프로토콜은 35mm 접시를 사용하여 문화입니다. 간단히, 세포는 제 1 인접 셀 사이의 수평 연결을 설정할 수 합류에 24 시간의 최소 37 ° C에서 배양된다. 세포 시트를 해제하려면 판은 32 ° C 이하의 온도로 실시한다. 세포 시트는 후 혈관 내피 세포와 혈관 신생 허용 하이드로 겔을 포함하는 강염기 섬유상 매트릭스에 전송된다.

  1. 세포 집단을 분리합니다. 주 :이 방법은 개개의 도출 과정과 세포 유형에 의존한다. 쥐 대동맥 부드러운 무scle 세포 (RASMC)이 예에서 사용됩니다. 이들은 쥐의 복부 대동맥으로부터 분리 일차 평활근 세포이다.
  2. 따뜻한 PBS의 2 ㎖의 세포를 씻으십시오.
  3. 5 분 동안 세포에 트립신 (또는 다른 클 리빙 / 연결 해제 용액) 3 ㎖를 추가합니다.
  4. 10 % 태아 소 혈청 (FBS)을 함유하는 배지, 또는 인산 완충 용액 (PBS) 3 ㎖을 첨가함으로써 트립신을 억제한다.
  5. 원뿔 튜브에 세포를 수집하고 나누어지는 계산합니다.
  6. 5 분 동안 1,000 rpm으로 (228 XG)에서 세포를 스핀.
  7. 뜨는을 기음과 성장 배지에서 세포를 재현 탁 (SmGM2 플러스 총알 키트 배양액 RASMC에 사용됩니다).
  8. 백퍼센트 합류를 달성하기위한 농도 pNIPAAM 코팅 플레이트 - 35mm의 온도에 민감한 접시에 세포를 포함하는 미디어를 넣습니다. 주 : RASMCs 들어 그 숫자 / cm 2 100,000 세포로 측정되었다. 그 버지니아의 그러나, 통과하는 동안 세포의 손실, 120 % 루이 사용됩니다.
  9. 37 ° CO / N에서 인큐베이터에 놓습니다. 참고 : 접시에 세포 부착을 유지하기 위해 37 ° C에서 세포를 유지하는 것이 중요합니다.

파운데이션 매트릭스의 3 준비

참고 : 다양한 3D 섬유 행렬이 섬세한 세포 시트 사이에 강한 섬유 매트릭스를 레이어 할 수 있습니다. 예를 들면 다음과 같습니다 : gelfoam을, 바이오 글라스, 자연 acellularized 소재 26 또는 nanospun 재료 (27, 28)을이 연구에 사용 된 돼지 방광 매트릭스 (UBM)가 관대하게 우리의 협력자, 박사 Badylak에서 제공 한 29.

  1. decellularized 행렬이 사용되는 경우, 셀룰러 함량의 부족을 포함 매트릭스의 특성을 결정 27,28 특정 세포 생존 능력, 및 보이드 공간을 사용하기 전에. 22
  2. 원하는 크기와 형상으로 예비 살균 행렬을 잘라. 주 : 여기에서, 홀 펀치 4mm 직경의 원을 절단하는 데 사용된다.
ve_title "> 4. 신생 혈관 허용 히드로 겔로 시드 내피 세포

주 : 내피 줄기 세포 또는 전구 세포로부터 분화 포함한 다양한 소스로부터 획득 될 수있다. 여기에, HUVECs를 사용한다.

  1. 가교 시간만큼 긴 허용 하이드로 겔 (피브린, 콜라겐 젤)를 사용하면 세포가 가능한 머물 수 있도록 충분히 짧다. 주 : 여기에서, 히알루 론산 (HA)을 기반 겔 디설파이드 브릿지가 사용으로 가교.
  2. 회사 프로토콜에 따라 HA 하이드로 젤을 준비한다.
  3. 내피 세포를 수집하고 1X 트립신을 사용하여 단일 세포로 분산 용액. 참고 : Accutase 또는 세포 분열 버퍼는 단일 세포 분산에 사용될 수 있습니다.
  4. 또는 PBS에 10 % FBS 용액 / 15 ㎖ 중에 세포 원추형 튜브를 수집 (이것은 세포가 혈청과 접촉하지 않는 것이 중요한 경우) 대두 트립신 억제제의 동등한 양을 사용하여 트립신 효소를 비활성화.
  5. C세포 ount과 패치 사이즈에 필요한 양을 계산한다 (이전 정량화). 참고 : 4mm 패치, 여기 2,000,000 내피 세포가 사용된다.
  6. 2,000,000 세포를 추출, 새로운 15 ML 원뿔 튜브에 배치합니다.
  7. 5 분 (228 XG)에 스핀.
  8. 원뿔 튜브에서 펠릿으로 세포를 떠나, 뜨는을 대기음.
  9. 한 배급 : 1의 HA 및 젤라틴 액체 재료를 섞는다. 이어서 펠렛을 함유하는 원뿔형 튜브에 전체 부피의 80 %를 추가한다.
  10. 한 HA / 젤라틴 혼합물 : 1의 내피 세포를 재현 탁
  11. 2 단계에서 기본 섬유 매트릭스로 HA / 젤라틴 혼합물에서 일시 중단 된 세포를 놓습니다.
  12. 가교제의 원하는 총 부피 1/5 (20 %)를 추가
  13. 37 ° C에서 1 시간 동안 품어.

세포 시트의 5 분리

  1. 세포 배양 후드에서의 인큐베이터 및 장소에서 세포를 함유하는 35mm pNIPAAM 처리 판을 제거RT.
  2. 신속하게 세포에서 미디어를 대기음, 37 ° C로 가열 된 6 % 정상 젤라틴 2 ㎖를 추가합니다.
  3. 젤라틴이 남아있는 동안, 일반 젤라틴 (동영상 1)의 표면 아래에 침수, 젤라틴으로 금속 격자를 배치합니다.
  4. 젤라틴은 강화 할 수 있도록 5-7 분 동안 얼음에 전체 판을 놓습니다.
  5. 7 분 후, 조심스럽게 플레이트 측으로부터 젤라틴 에지를 분리하는 주걱을 사용하고 플레이트 주부터 금속 격자 리프트 집게를 사용 : 6 % 젤라틴, 및 세포 시트는 격자 리프트한다.
  6. 접시에 세포 시트를 이동하고 조심스럽게 구조의 상단에있는 격자를 설정, 기본 섬유 매트릭스 하이드로 겔 조합의 상단에 배치합니다. 참고 : 셀 시트의 꼭대기 쪽은 여전히​​ 최고 위치에있을 것입니다.
  7. 따뜻한 미디어 (37 ° C) 2 ㎖를 추가합니다.
  8. O / N은 ​​하이드로 겔 표면에 부착하기 위해 세포 시트를 허용 부화.
  9. t 제거용액 (약 1 시간), 또는 그 다음날 따뜻해 후 그는 금속 격자.

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Representative Results

흐름도 (도 1)는 다층 패치를 제조하는 전체적인 방법을 도시한다. 세포 시트를 32 ° C 이하의 온도를 떨어 뜨려 pNIPAAM 처리 플레이트에서 분리된다. 이어서 세포 시트는 기본 섬유 매트릭스 (도 1)로 파종 혈관 내피 세포를 포함하는 가교 된 하이드로 겔의 상단에 배치된다. 전처리 감열 플레이트는 또한 세포 시트를 만드는 데 사용할 수있다. 특별 위상 표면은 특별히 패턴 셀 (30) (즉, 정렬)하는 데 사용됩니다.

베이스 섬유상 매트릭스는 네이티브 조직 매트릭스 또는 전기 방사를 decellularizing로부터 생성 될 수있다. 여기서, 섬유 재료 시트는베이스 패치 (도 2A)에 대한 4mm 직경으로 절단 하였다. 이 물질의 특성은 공극 공간을 채우기 위해 사용될 수있는 하이드로 겔의 양을 결정하는 것이 중요하다. 여기에서 사용 된 행렬은 만일 이전되었습니다교활한 특징 및 발표했다. 22

내피 세포를 함유하는 하이드로 겔은 가교 결합 된 섬유질 매트릭스 HA 하이드로 겔 액체 성분의 도포 후이다. 형광 / 전송 현미경 가교 하이드로 겔에 캡처 된 칼 세인 AM (그림 2B)로 염색하여 살아있는 세포 보여줍니다.

세포 시트를 만드는 과정은 공급 업체로부터 구입 자체 pNIPAAM 코팅 플레이트 및 프리 코팅 플레이트 사이의 비교를 포함하여, (도 3)에 묘화된다. RASMC는 37 ° C에서 최소 16 시간 동안 pNIPAAM 처리 된 표면에 도금되어있다. 이 최소 시간은 세포가 이웃 세포 ​​(그림 3A)이 자신의 측면 보더 유착을 설정 할 수 있습니다. 참고 : 세포는 이러한 측면 경계선을 설정하는 데 합류해야합니다. 적어도 16 시간 동안 배양 한 후, 세포의 판은 32 ° C 이하로 떨어질 및 얼음 F를 사용하는 RT로 이동해야합니다또는 5-8 분의 냉각 공정 (도 3b)을 가속화. 온도 강하 세포 시트는 플레이트의 리프트 오프 할 수 있도록 코팅 재료의 구조적 접촉각을 변경한다.도 3c는 플레이트로부터의 세포 시트를 해제를 보여준다.

실험실에서 코팅 된 플레이트를 생성하고 세포 시트를 이동, 일부 최적화 후, 잘했다. 4D는 전송하기 전에 RASMC의 합류 단층을 보여줍니다. 세포가 들어 허용되었을 때, 시트는 사내에서 생성 pNIPAAM에 세포 시트를 조작 접어 사실. 자체 (그림 3E)에 집착하는 경향 또는 구입 한 사람들은 어려웠다 자주 (그림 시트 찢어 결과 3 층). 따라서, 시트를 이송하기위한 솔루션이 개발되었다. 세포가 인큐베이터에서 제거하고 시원한에 시작되면, 6 % 젤라틴은 추가 금속 리터로 세포를 커버하는 데 사용되었다attice 겔 (도 3G) 내에 내장. 냉각 판으로 세포를 해제하고, 경화 젤라틴. 집게를 사용하여, 격자 gelatin- 세포 시트를 배양 접시에서 함께 제거 될 수있다; 모두 같은 시간 (그림 3H)에서. 그러면이 세 성분은 기반 구조 (도 3I)의 상단에 배치된다. 여기서, 세포 시트 (핑크)는 하부 기본 매트릭스 (핑크 세포 시트 아래에 두꺼운 흰색 매트릭스)보다 훨씬 크다. 세포 시트를 쉽게 크기로 트림 될 수있다.

마지막 셀 패치 (그림 4)는 패치 기본 및 허용 하이드로 겔의 예비 성형 복잡한에 세포 시트를 적층되어 생성됩니다. 아래에서 위로, 패치는 히알루 론산 하이드로 젤은 내피 세포를 함유하고 세포 시트는이 매트릭스의 상부에 적층 시드 섬유상 매트릭스로 구성된다. 조기 젤라틴 / 격자 appar 사용하지 않고 세포 시트를 조작하려고atus는 (그림 4A-D는 위에서 본). 그림 4a는 mitotracker 빨간색을 결합 초기 패치 디자인 합성 사진을 나타냅니다 종종 접 히고 찢겨 아주 작은 세포 시트 결과 염색 RASMC (그림 4B), 칼 세인의 AM 녹색 형광을 HUVEC (그림 4C), 및 투과광 화상 (도 4d). 가까운 배 이미지 세포 시트에 제공되고, HA / 하이드로 겔 매트릭스 (도 4E-H)없이.도 4E는 mitotraker 빨강 (도 4F)의 복합체이며, 칼 세인 AM 녹색 된 HUVEC (도 4G)과 투과광 ( 그림 4H). (기본 매트릭스, HA / HUVEC), 각 구성 요소의 세포 시트 이미지 아래에서보기도 4I-L의 표시이다. 합성 이미지 그림 4J-L에 표시되는 개별 부품으로, 그림 4I이며, 그림 4J 쉬세포 시트 (적색), 내피 세포 (녹색),도 4K에있는 투과 이미지 (도 4L) OWS 합성 화상 (도 4M)은 행렬의 전체 영역을 덮는 균일 한 세포 시트 패치를 도시 모든 접거나 찢어.없이 4M-P 행렬에 올려 바닥에서 또한들이다. 그림 4N은 중립 레드를 포함하는, 세포 시트입니다. 시트는 매트릭스의 에지에 바로 인접하여 해당 장소에 접하기 때문에 다시 두꺼운 붉은 스트립 매트릭스 주위에 나타난다. 투과광 촬상 (도 4O)는 세포의 형태학, 및 매트릭스의 구조를 나타낸다. 마지막으로 (도 4P)는, 행렬은 DAPI와 같은 파장에서 형광의 특별한 품질을 갖는다. 따라서, 행렬의 자외선 여기가 명확하게 세포 시트 (밝은 빨강)에서 분리보기로 사용됩니다. 패치의 가장자리에 트리밍 될 수있다행렬의 가장자리에 걸려있는 시트의 가장자리를 제거합니다.

그림 1
조직 조립. 세포 시트의 그림 1 플로우 차트는 합류에 도달 이웃 세포에 측면 연결을 설정하는 셀에 대한 충분한 시간을 thermoresponsive pNIPAAM 코팅 된 플레이트에 세포를 파종하고, 수에 의해 만들어집니다. 세포 시트는 온도 (노란색 디스크)을 감소시킴으로써 해제된다. 동시에, 내피 세포는 빈 공간의 강한베이스 섬유 매트릭스의 공간, 화학적 가교 (흰색 디스크)에 주입, 신생 혈관 허용 HA 하이드로 젤에 포함됩니다. 세포 시트 (노란색 디스크) 내피 매트릭스 조합 (흰색)와 다음 계층이며, 필요에 따라. 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전을 확인합니다.

그림이
자료 매트릭스와 내피 캡슐화의 2 이미지 그림. (A) 강한베이스 섬유 매트릭스는 둥근 모양으로 펀칭. 여기에 직경 4mm가 생체 내 동물 모델을 기반으로 사용됩니다. 기본 매트릭스 (10 배)의 표면에 HA 하이드로 겔에 현탁 mitotracker 녹색 (칼 세인 AM)로 염색 (B) 된 HUVEC. 큰 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 버전입니다.

그림 3
세포 시트의 3 창조 그림. (A)의 C RASMC시중에서 구입 한에서 해제 세포 시트의 가장자리 ultured가에 16 시간 (10 배)에 35mm - 요리를 pNIPAAM 처리. (B) RASMC 5-7 분 동안 얼음에 접시를 배치 한 후 해제합니다. (C) 이미지 thermoresponsive 세포 배양 접시 (10 배). (DF) 이미지는 사내에서 생성 pNIPAAM 코팅 요리에서 세포 시트의 생성을위한 유사한 결과를 묘사한다. (D) 플루 RASMC는 35mm 표준 조직 배양 판 (4X)에 성장합니다. (E를 ) 냉각 후), 세포 시트가 수축 그들이 분리로 (4X 접혀. (F)으로 인해 단일 세포 시트의 취약성으로, 세포 시트는 종종) 4X (리프팅 또는 다른 조작 중에 손상된다. (G)에서 세포 시트의 천공을 완화하기 위하여는, 금속 스크린은 세포 시트의 이송을 돕기 위해 물리적 지지체로서 사용 하였다. RASMC 6 % 젤라틴 및 다공성 금속 화면 지원, 덮여 중립 레드로 염색했다차 강화하는 것을 허용했다. (H) 화면 지원을 통해 세포 시트 피해를 최소화 (4 배)로 전송됩니다. (I) 큰 RASMC 세포 시트 층 (핑크 색상)이 다음 강한베이스 섬유 패치 하이드로 겔 조합 (화살표)의 상단에 배치했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
계층화 된 셀룰러 패치. 셀도 4는 이미지 pNIPPAM 코팅 표면에 배양 한 후 섬유 매트릭스의 표면 시트로 옮겼다. 젤라틴 / 금속 격자가 함께 전송되지 않았습니다 초기 임상 시험은 작은 너덜 패치 (AD)였다. (BD)의 (A) 합성 이미지,(B) Mitotracker 빨간색과 녹색으로 염색 (C) HUVECs를하고, 전송 된 빛 (D). (E) 강한베이스 섬유 매트릭스 하이드로 겔 조합을 포함하는 결합 된 세포 시트의 합성 이미지로 염색이 장에서 RASMCs Calceing 오전 하이드로 겔에서 일시 중단. 강한베이스 섬유 매트릭스 하이드로 겔 조합의 (H) 전송 이미지 HUVECs를 (녹색) 및 (F) Mitotracker 레드 RASMCs. (G) 녹색 형광 HUVECs를 스테인드. (I) 복합 이미지에서 찾고 위쪽으로 강한 염기 섬유상 매트릭스 (염색되지 않음)베이스 섬유상 매트릭스 - 통해 본, HA가 된 HUVEC (녹색), 및 RASMCs의 세포 시트 (적색)였다. (J) 적색 형광 RASMCs 시트를 함유 통한 패치의 하단 하이드로 겔 조합. (K) 녹색 형광을 HUVEC. (L) 패치 구조의 전송 이미지.(M)베이스 섬유 매트릭스 하이드로 겔 조합 (autofluorescent 블루)를 통해 세포 시트 (적색)의 합성 사진입니다. 시트 커버 (N) 셀 가장자리에서베이스 섬유 매트릭스 하이드로 겔 조합 쇼 증가 형광에 의한 것입니다 세포의 뭉침. 구조의 (O) 전송 된 이미지입니다. (P) 천연 섬유 기재 행렬은 DAPI (청색 파장)에 autofluorescent된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

영화 1 . 세포 시트를 전사 프로세스 문서와 함께 제출 보충 영화에서 강조된다. 영화 프로그램, 단계별 공정에있어서, 배양기에서 세포의 제거; 6 % 젤라틴, 일의 삽입으로 용지 교체즉, 금속 스크린, 얼음에 세포의 저온, 다른 접시, 셀 전송시의 화상, 마지막 시트에서 화면의 제거 pNIPAAM 코팅 접시에서 세포의 전사.

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Discussion

프로토콜의 중요한 단계는 다음과 같습니다 thermoresponsive 폴리머 플레이트 표면을 코팅하고 판을 냉각 한 후 세포 시트를 조작. 상이한 셀들이 서로 다른 물리적 특성을 보일 수 있기 때문에, 점착성 같이, 승강 시간은 서로 다른 세포 유형에 대해 최적화되어야한다. 이 프로토콜의 제 2 및 가장 현저 도전 성분은, 세포 시트, 티슈 조립 방법의 중요한 양태의 조작을 중심. 세포 시트의 단일 셀 층은 매우 취약하고 집게를 조작하면 쉽게 찢어 수 있습니다. 세포 시트 위치에 고정되지 않은 경우 또한, 그들은 계약을 체결하는 경향이 쉽게 접을 수 있습니다. 지지 스크린을 사용하여 제안 된 세포 시트 전송 깨지기 세포 시트의 조작을 돕는다.

이 논문에 제시된 설계 방법은 조직 공학 어플리의 다양한 세포 시트를 작성하여 매우 저가의 방법을 제공한다양이온. 또한, 대학 연​​구소 내 pNIPAAM 코팅 플레이트를 만드는 것은 여러 세포 유형, 및 표면을 수용하기 위해 만들어 질 수있다 프로토콜이 방법 및 변형으로 표준화 할 수있다. 세포 시트보다는 조직화 단일 세포의 사용은, 조직 조립체 에이즈, 또한 이식 조직 생존과의 통합의 가능성을 증가시킬 수있다. 그러나, 이러한 구조의 (되지이 프로토콜에서 언급) 생체 내 전달 방법은 각각의 조직 유형에 대해 최적화 될 필요가있을 것이다. 미래의 응용 프로그램을 탐험하고 특정 기관 시스템에 대한 조직을 생성하기위한 최적의 방법을 포함한다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Calcein-AM Invitrogen C3099 Cell tracker / live dye
Lysotracker Red Invitrogen L7528 Cell tracker
Neutral Red Sigma N7005 Visible Cell dye
pNIPAAM Sigma Aldrich 412780250 Poly(N-isopropylacrylamide)
Toluene Sigma Aldrich 244511-1L
Hexane Sigma Aldrich 296090-1L
RAOSMC Lonza R-ASM-580 Rat Aortic Smooth Muscle Cells
SmGM2 Lonza CC-4149 Smooth Muscle Media
HUVEC Invitrogen C-003-5C Human Venous Endothelial Cells
HyStem Glycosan/Biotime
Isopropyl alcohol VWR International BDH1133-4LP
Trypsin Corning Cellgro 25-053-C1
PBS Gibco 14287-072
FBS Gibco 16140-071
Specific Equipment
Filter paper Ahlstrom  6310-0900 
Buchner Funnel  Sigma Aldrich  Z247308 
UpCell Plates  Nunc  2014-11 
UV light Jelight Company  UVO Cleaner Model No.42

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References

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