Doku Mühendisliği: Katmanlı Hücre Sheets teslimi için bir Multisellüler 3D İskele İnşaatı

1School of Engineering, University of California, Merced
Published 10/03/2014
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets. J. Vis. Exp. (92), e51044, doi:10.3791/51044 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Böyle yetişkin insan kalpleri gibi birçok dokular, yeterince hasar sonra yeniden edemiyoruz. Doku mühendisliği 2,3 Stratejileri kurtarma ve tamir vücut yardımcı yenilikler öneriyoruz. Örneğin, TE yaklaşımlar miyokard infarktüsü (MI) sonrası kalp biçimlenme zayıflatır ve muhtemelen normale yakın ön-MI düzeyine toplam kalp fonksiyonunu artırmak mümkün olabilir. 4, kalp dokusu başarılı rejenerasyon doğru teslimini içeren herhangi bir fonksiyonel doku gibi implante hücre / doku greft entegrasyonu ve hayatta lehine çevre ipuçları ile birden fazla hücre tipleri. Verme araçları, hücre hayatta kalması üzerindeki etkileri, malzeme mukavemeti, ve hücre-doku organizasyon kolaylaştırılması olarak değerlendirildiğinde çözünür sinyalleri, hücre-hücre etkileşimleri ve matris malzemeleri: İşlenmiş dokular da dahil olmak üzere, birden çok parametre yönelik olmalıdır. Greft hücreleri doğrudan enjeksiyon sadece bu temel unsurlarını görmezden istihdam Çalışmaları. 2,5,6Bu malzemelerle birleştirerek bir doku tasarım henüz geliştirilecek gelmiştir. Burada, "doku" olarak yeni damar oluşumunun arttırılması için hedef organ, hücre tipi ve endotelial hücreleri içeren biyolojik şekilde türetilmemiş malzemelerden iki ayrı tip desenli hücre tabakaları perdelenmesini kullanarak entegre tasarımlarının bir örnek sunulmuştur. Bu çalışmalar kalp-benzeri doku nesil odaklanmış olsa da, bu doku tasarım, minimal tasarım ve malzeme değişiklikleri ile kalp daha başka birçok organ uygulanabilir ve rejeneratif tedaviler için bir off-the-raf ürünü olması gerekiyordu. Protokol beş ayrıntılı adımlar içermektedir. Bir ısıya duyarlı Poli (N -isopropylacrylamide) (pNIPAAM) kat doku kültür tabaklarına kullanılır. Daha sonra, doku spesifik hücreler, güçlü bir yan yapışıklığı hücre tabakaları meydana getirmek üzere kaplanmış plakalar / mikrodesenlerle yüzeylerin yüzeyi üzerinde kültürlenmiştir. Üçüncü olarak, bir taban matris neovasküler üreti gözenekli bir matris ile birleştirerek dokusu oluşturulurhidrojeller ve endotel hücreleri ettik. Son olarak, hücre tabakaları pNIPAAM kaplı kaplar kaldırılır ve komple yapı yapım taban elemanına transfer edilir.

Protocol

PNIPAAM kaplı Tabaklar 1. Yaratılış

  1. % 60 toluen /% 40 heksan solüsyonu 2 ml pNIPAAM arasında 2.6 g çözülür.
  2. PNIPAAM çözünene kadar karıştırılır, 10 dakika boyunca 60 ° C'ye kadar karışım ısıtılır.
  3. Büchner hunisi bir 60 mm çapında bir daire ve bir yerde kağıt içine filtre kağıdı kesin.
  4. Önceden tartılmış bir cam kabın içine Buchner hunisinden çözeltisi (heksan plastikleri eritmemesi gibi, plastik kullanmayın) filtre.
  5. Bir çan vakum (24 psi) O / N (16 saat) içine kabını ve içeriğini yerleştirin. Not: Artık madde isopropil reaksiyona girinceye kadar çok oksijen ile temas olmadığından emin olmak oksitlenir.
  6. PNIPAAM ağırlığını tespit etmek için bir beher tartılır.
  7. Çözeltisi bir a / a 50/50 oluşturarak, pNIPAAM izopropil alkol ekleyin.
  8. UV ışığı altında 5 dakika boyunca doku kültür plakasının yüzeyinde çözeltisi ve ceket 2 ml yerleştirin.
  9. Katı iki kez sıcak PBS ile 2 ml plakayı yıkayınHücre kültürü için kullanmadan önce.

Hücre Sheets 2. Yaratılış

Not: hedef organ birincil hücrelerin hücre katların farklı bir dizi yöntem kullanılarak oluşturulabilir, ya da burada tarif edildiği gibi termo-duyarlı polimer ile doku kültür yüzeylerin kaplanması ile. Ön kaplanmış ısıya duyarlı plakaları, aynı satıcıdan tarafından sunulmaktadır.

Not: Bu protokol, 35 mm tabak kullanarak kültür içindir. Kısaca açıklamak gerekirse hücreler önce, bitişik hücreler arasında yanal bağlantı kurmak için birleşme noktasında 24 saat arasında, en az 37 ° C'de inkübe edilir. Hücre tabakaları açmak için, plakalar, 32 ° C'nin altındaki bir sıcaklıkta tabi tutulur. Hücre tabaka daha sonra, vasküler endotel hücreleri ile bir neovasküler hidrojel içeren izin veren güçlü baz lifli matrise transfer edilir.

  1. Hücre popülasyonu izole. Not: Bu yöntem, bireysel türev usul ve hücre tipine bağlıdır. Sıçan aorta ait yumuşak uSistemik lupus hücreleri (RASMC) bu örnekte kullanılmıştır. Bunlar, bir sıçan karın aortundan izole edilen primer düz kas hücreleridir.
  2. Sıcak 2 ml PBS ile hücreleri yıkayın.
  3. 5 dakika boyunca, hücrelere tripsin (ya da diğer molekül ayrılması / ayrışarak çözelti) 3 ml ilave edilir.
  4. % 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) içeren kültür ortamı ya da fosfat tampon solüsyonu (PBS) 3 ml tripsin ilave edilmesi ile inhibe eder.
  5. Konik bir tüp içinde hücreleri toplamak ve bir kısım sayısı.
  6. 5 dakika boyunca 1000 rpm'de (228 xg) hücreleri dönerler.
  7. Süpernatantı aspire ve büyüme ortamı hücreleri tekrar süspansiyon (SmGM2 artı mermi kiti kültür ortamı RASMC için kullanılır).
  8. 100% izdiham elde edileceği bir konsantrasyonda pNIPAAM kaplı plaka - 35 mm bir ısıya-duyarlı levha üzerindeki hücreleri ihtiva eden ortam yerleştirin. Not: RASMCs için bu sayı / cm2 100,000 hücre olduğu belirlenmiştir. Bu va Bununla birlikte, bağlı geçen boyunca hücrelerin kaybı,% 120 Lue kullanılır.
  9. 37 ° CO / N bir kuvöz içine yerleştirin. Not: levhaya hücre yapışmasını sağlamak için, 37 ° C'de hücreleri korumak için önemlidir.

Foundational Matrix 3. hazırlanması

Not: Çeşitli 3D lifli matrisleri hassas hücre tabakaları arasında güçlü bir elyaflı matris tabaka için kullanılabilir. Bazı örnekler: gelfoam, biyo-cam, doğal asellülarize malzeme 26 ya da nanospun malzeme 27,28 Bu çalışmalarda kullanılan domuz mesane matrisi (UBM) cömertçe ortak çalışan Dr Badylak sağlandı 29.

  1. Hücresizleştirilmiş matris kullanıldığında, hücresel içeriği olmaması da dahil olmak üzere matris özelliklerini belirlemek 27,28, hücre spesifik canlılığı ve boş hacim, Kullanımdan önce. 22
  2. Arzu edilen bir boyut ve şekil, önceden sterilize edilmiş matris kesin. Not: Burada, bir delik yumruk 4 mm çaplı daire kesmek için kullanılır.
ve_title "> 4. bir Neovasküler Hoşgörülü Hidrojeli içine Tohumculuk Endotel Hücreleri

Not: Endotel hücreleri, kök veya projenitör hücrelerinin farklılaşma dahil olmak üzere çeşitli kaynaklardan elde edilen edilebilir. Burada, HuVECler kullanılır.

  1. Çapraz bağlama süresi olduğu sürece herhangi bir geçirgen hidrojel (fibrin, kolajen jeli) kullanarak canlı hücreler kalmak izin verecek kadar kısadır. Not: Burada, Hiyalüronan (HA) bazlı bir jel, bir disülfid köprüsü ile birlikte kullanılan çapraz bağlanmış olabilir.
  2. Işletme protokolüne uygun olarak HA hidrojel hazırlayın.
  3. Endotel hücrelerini toplamak ve 1x tripsin kullanılarak, tek bir hücre çözeltisi içine dağılırlar. Not: Accutase ya da hücre ayırma tamponu, aynı zamanda, tek bir hücre dağılımı için kullanılabilir.
  4. Ya da PBS içinde% 10 FBS çözelti / 15 ml konik bir tüp hücre toplanmasını içerir (bu hücrelerin serumu ile temas etmemesi çok önemlidir ise) soya fasulyesi tripsin inhibitörü eşit miktarda kullanılarak tripsin enzimi devre dışı bırakır.
  5. Chücreleri ount ve yama boyutları için gerekli hacmini hesaplamak (daha önce sayısal). Not: 4 mm yama için, buraya 2.000.000 endotel hücreleri kullanılır.
  6. 2 milyondan hücreleri Özü ve yeni bir 15 ml konik tüp içine yerleştirin.
  7. 5 dakika boyunca (228 xg) dönerler.
  8. Bir konik bir tüp içinde bir pelet gibi hücreleri bırakarak, süpernatan aspire.
  9. 1 oranından: 1, HA ve jelatin sıvı malzeme karıştırın. Daha sonra pelet içeren konik tüp içine, toplam hacmin% 80 ekleyin.
  10. 1, HA / Jelatin karışımı: 1 endotel hücrelerinin yeniden süspanse
  11. Kademe 2 de elde baz lifli matris içine HA / Jelatin karışımı içinde süspansiye edilmiş hücreler yerleştirin.
  12. Çapraz bağlayıcının istenen toplam hacminin 1/5 (yüzde 20) ilave
  13. 37 ° C'de 1 saat süreyle inkübe edin.

Hücre Sheets 5. İzolasyon

  1. Bir hücre kültür kaput bekletildi ve yerden hücreleri ihtiva eden 35 mm pNIPAAM-işlemden geçirilmiş olan levhalarda kaldırRT.
  2. Hızlı bir şekilde hücrelerden ortam havalandırın, ve 37 ° C'ye ısıtılmış olan% 6, normal jelatin 2 ml ekleyin.
  3. Jelatin hala sıcak iken, normal jelatin (Film 1) yüzeyinin altına daldırılması, jelatin içine metal kafes yerleştirin.
  4. Jelatin sertleşmesine izin 5-7 dakika boyunca buz üzerine tüm plaka koyun.
  5. 7 dakika sonra, dikkatli bir şekilde levhanın yan kenarları jelatin ayırmak için bir ıspatula kullanarak ve daha sonra plaka Not metal kafes kaldırmak için forseps kullanımı:% 6 jelatin ve hücre yapraklan çıtalı kaldırmalıdır.
  6. Çanak hücre tabakasını taşı ve dikkatli bir yapının üzerine kafes ayarı, baz lifli matris, hidrojel kombinasyonunun üzerine yerleştirin. Not: hücre tabakanın tepe tarafı hala en üst konumunda olacaktır.
  7. Sıcak ortamda (37 ° C) 2 ml ekleyin.
  8. O / N, hidrojel yüzeyine yapışma hücrelerinin Ön izin inkübe edin.
  9. T kaldırÇözelti (yaklaşık 1 saat), ya da bir sonraki gün ısındıktan sonra o, metal kafes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Akış diyagramıdır (Şekil 1) çok tabakalı yama yapılması için genel bir yöntem gösterir. Hücre levhalar 32 ° C'nin altında bırakarak pNIPAAM tedavi plaka ayrılmaktadır. Daha sonra hücre tabakası altta uzanan elyaflı matrisi (Şekil 1) içine ekildi endotel hücreleri içeren çapraz bağlanmış hidrojel üstüne yerleştirilir. Önceden işlem görmüş ısıya duyarlı Levhalar, aynı zamanda, hücre tabakaları oluşturmak için kullanılabilir. Özel topolojik yüzeyler, özellikle model 30 hücreleri (yani hizalamak) için kullanılır.

Baz, elyaflı matris doğal doku matris veya electrospun decellularizing oluşturulabilir. Burada elyaf malzemesi tabakası yama taban (Şekil 2A) için 4 mm çapında kesilmiştir. Bu malzemenin karakterizasyonu boşluk alanları doldurmak için kullanılabilir hidrojel miktarını belirlemek için de önemlidir. Burada kullanılan matris Previou edilmiştirsinsi karakterizedir ve yayınlandı. 22

Endotel hücrelerini içeren hidroj çapraz bağlanmış elyaflı matris HA hidrojel sıvı bileşenlerin uygulamadan sonra bulunmaktadır. Floresan / transmisyon mikroskopisi çapraz bağlanmış hidrojel içinde yakalanan kalsein AM (Şekil 2B) ile boyanmıştır canlı hücreler göstermektedir.

Hücre tabakasını oluşturma işlemi, bir satıcıdan satın alınan kendi pNIPAAM kaplı plaklara ve önceden kaplanmış levhalar arasında karşılaştırma dahil olmak üzere, (Şekil 3) görüntüsü alınır. RASMC 37 ° C'de en az 16 saat pNIPAAM işlemden geçirilmiş yüzey üzerinde plakalanır. Bu minimum sefer hücreler komşu hücrelere (Şekil 3A) ile yanal yatılı yapışıklıklar kurmanızı sağlar. Not: Hücreler, yanal, yatılı kurmak için birleştiği yerde olması gerekir. En az 16 saat kültür işleminden sonra, hücreler plaka, 32 ° C altında ve buz f kullanılarak, oda sıcaklığında taşınmalıdırveya 5-8 dk soğutma işlemi (Şekil 3B) hızlandırır. Sıcaklık düşüşü, hücre tabaka plakanın kaldırarak izin maddeden meydana gelen kaplamanın yapısal temas açısı değişir. Şekil 3C plakadan hücre tabakası kaldırma gösterilmektedir.

Laboratuarda kaplanan plakalar oluşturmak ve hücre tabakaları hareket ettirmek için, bir optimizasyon sonra çalıştı. 4D transfer edilmeden önce RASMC konfluent tek tabaka göstermektedir. Hücreleri kaldırmak için izin verince, yaprak içi oluşturulan pNIPAAM üzerinde hücre sayfaları manipüle, kat ve aslında. Kendisi (Şekil 3E) sopa eğiliminde veya satın alınan zordu ve genellikle (Şekil yaprak yırtılması sonuçlandı 3F). Bu nedenle, yaprak aktarmak için bir çözüm geliştirilmiştir. Hücreler, kuluçka makinesinden çıkarılır ve soğumaya başlar sonra,% 6 jelatin ek bir metal l hücreleri kapsayacak şekilde kullanılmıştırattice jel (Şekil 3G) içine yerleştirilmiştir. Plaka soğutulmuş olarak, hücreler kaldırdı ve jelatin sertleşir. Forseps kullanarak, kafes gelatin- ve hücre tabakası bir araya kültürü plakasının çıkarılabilir; Tüm aynı zamanda (Şekil 3H) değiştirilmiştir. Daha sonra bu üç bileşen temelli bir yapı (Şekil 3H) üzerine yerleştirilir. Burada, hücre tabaka (pembe) temel taban matrisi (pembe hücre zarının altında koyu beyaz bir matris) çok daha büyüktür. Hücre tabaka kolayca boyutunda kesilmiş olabilir.

Nihai hücre patch (Şekil 4) ve ılımlı bir baz yama hidrojelin Önceden oluşturulmuş bir kompleksi, hücre levhasının üzerine yerleştirilmesi ile oluşturulur. Alttan üste, yama hiyalüronan hidrojel endotel hücreleri ihtiva eden ve daha sonra bu tabaka, hücre matrisinin üzerine katmanlı ile tohumlandı lifli bir matristen oluşur. Erken jelatin / kafes appar kullanılmadan hücre tabakaları işlemek için çalışırATUS (Şekil 4A-D, yukardan bakıldığında). Şekil 4A, Mitotracker kırmızı birleştiren ilk yama tasarım kompozit resmi temsil eder, genellikle, katlanmış ve parçalanmış, çok küçük hücre tabakaları ile sonuçlanmıştır boyanmış RASMC (Şekil 4B), kalsein AM yeşil floresan HuVECler (Şekil 4 ° C) ve geçen ışık görüntüsü (Şekil 4D). Closer 10x görüntüleri hücre zarının için sağlanır ve HA / Hidrojel matris (Şekil 4E-H) olmadan. Şekil 4E mitotraker kırmızı (Şekil 4F) bir kompozit, Calcein AM yeşil HuVECler (Şekil 4G) ve iletilen ışık ( Şekil 4H). (Baz matris, HA / HuVEC), ve her bileşenin hücre tabakası görüntüleri alttan görünümü Şekil 4I-L göstermeleridir. Kompozit görsel Şekil 4J-L olarak temsil edilmekte olan ayrı parçalar ile, Şekil 4I; Şekil 4J shhücre zarının (kırmızı), endotel hücreleri (yeşil), Şekil 4 K olan ve iletim görüntüsü (Şekil 4L) akımları bileşik görüntü (Şekil 4E), matrisin sağladığı tüm alanı kaplayan tek tip bir hücre tabakası ile bölümü göstermektedir herhangi bir katlama veya yırtılma. olmayan 4M-P matriks içine bakan alt ve aynı zamanda bir biçimde göstermektedir. Şekil 4 N ihtiva eden nötr kırmızı hücre tabakasıdır. Tabaka matrisin kenarına doğrudan bitişik kıvrımlar bu alanlarda yeniden, bir kalın kırmızı şeritler matris etrafında görünür. Transmisyon ışığı görüntüleme (Şekil 4O), hücrelerin morfolojisi ve matrisin yapısı gösterilmektedir. Son olarak (Şekil 4P), matris Dapi aynı dalga boyunda fluoresan özel bir kaliteye sahiptir. Bu yüzden, matris ultraviyole uyarım açıkça hücre zarının (parlak kırmızı) ayırmak görüntülemek için kullanılır. Yamanın kenarları kesilmiş olabilirMatrisin kenarları üzerinde asılı olan tabakanın her ucu ortadan kaldırmak.

Şekil 1
Doku Meclis. Hücre-yaprak Şekil 1. Akış Şeması izdiham ulaşmak ve komşu hücrelere yanal bağlantı kurmak hücreleri için yeterli zaman thermoresponsive pNIPAAM kaplı plakalar üzerine tohum hücreleri, ve izin tarafından oluşturulur. Hücre tabaka sıcaklığı (sarı diski) azaltarak serbest bırakılır. Aynı zamanda, endotel hücreleri boşluklar güçlü baz fibröz matriks alanı ve kimyasal çapraz (beyaz disk) enjekte, bir neovasküler müsamahakar HA hidrojel içine gömülürler. Hücre tabakası (sarı diski) endotel matris kombinasyonu (beyaz) ile daha sonra katmanlı olduğu, gerektiği gibi. için tıklayınızBu rakamın büyük bir versiyonunu görmek.

Şekil 2
Baz Matrix ve endotel Kapsüllemenin 2. Görüntüler Şekil. (A), kuvvetli bir baz, bir elyaflı matris yuvarlak bir biçim içinde kalıpla kesilerek alındı. Burada çapı 4 mm in vivo hayvan modeline göre kullanılır. Baz matrisi (10X) yüzeyinde HA hidrojeller içerisinde süspanse Mitotracker yeşil (Calcein AM) ile boyanmıştır (B) 'HUVECler. daha büyük bir görüntülemek için tıklayın Bu rakamın sürümü.

Şekil 3,
Hücre Sheets 3. Yaratılış Şekil. (A), C RASMCticari olarak satın alınan bir salma hücre tabakanın kenarının ultured 16 saat (10X) için 35 mm-yemekler pNIPAAM-işlemden geçirildi. (B) 'RASMC 5-7 dakika boyunca buz üzerinde plaka yerleştirdikten sonra kaldırılır. (c) Görüntü thermoresponsive hücre kültür çanağı (10X). (DF) Çıkan in-house oluşturulan pNIPAAM-kaplı kaplar hücre tabakaların üretilmesi için benzer sonuçları gösterir. (D) konfluent RASMC 35 mm'lik standart doku kültürü plakaları (4X) üzerinde yetiştirildi. (E ) soğutulduktan sonra), hücre tabakaları almasına ve müstakil olarak (4X kapandı. (F) nedeniyle tek hücre tabakasının kırılganlığı, hücre levhaları genellikle) 4X (kaldırma ya da diğer manipülasyonlar sırasında zarar görür. (G) Hücre tabaka delikler azaltmak amacıyla, bir metal elek hücre tabakaları transferini yardımcı olmak üzere bir fiziksel destek olarak kullanılmıştır. RASMC% 6 jelatin ve gözenekli bir metal elek desteği, kaplı, Nötr Kırmızı ile boyandınd sertleşmesine izin verilir. (H), ekran destek ile, hücre tabakaları az hasar (4X) ile aktarılır. (I) ' Büyük RASMC hücre levha tabakası (pembe renkli) sonra güçlü baz lifli yama-hidrojel kombinasyonu (ok) üstüne konuldu. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4
Katmanlı bir cep yama. Hücrelerin Şekil 4. Görüntüler, bir pNIPPAM kaplanmış yüzey üzerinde kültürlendi ve daha sonra lifli matris yüzeyine bir tabaka halinde taşındı. Jelatin / metal kafes ile transfer değil erken denemeler küçük püskü yamalar (AD) sonuçlandı. (BD) (A) Bileşik görüntü,(B) Mitotracker kırmızı ve yeşil ile boyanmıştır (C) edilmiş HuVeclerden ve içten geçen ışıkta (D). (E) kuvvetli bir baz lifli matris, hidrojel ihtiva eden bir kombinasyon ile birlikte, bir hücre-tabakasının kompozit görüntü ile boyanmış iki yaprak RASMCs Calceing PM bir hidrojel içinde süspansiyon haline getirilmiştir. kuvvetli bir baz elyaflı matris hidrojel kombinasyonunun (Y) resim İletim HUVECler (yeşil), ve (F) Mitotracker Kırmızı RASMCs. (G), Yeşil floresan HUVECler boyandı. (I) 'in Bileşik görüntü seyir yukarı doğru güçlü bir baz elyaflı matrisi (lekelenmemiştir) baz lifli matris ile görülür, HA, HUVECler (yeşil) ve RASMCs hücre levha (kırmızı), sırasıyla. (J) kırmızı flüoresan RASMCs Ön ihtiva eden yama yoluyla alt hidrojel bileşimi. (K) 'Yeşil floresan HuVECler. (L) yama yapısının iletim görüntüsü.(E), taban elyaflı matris hidrojel kombinasyonu (otofloresan mavi) üzerinden hücre levhaları (kırmızı) Bileşik fotoğrafı. Tabaka kapağındaki (K) Hücreler kenarlarında taban elyaflı matris hidrojel kombine bir artış göstermiştir floresan nedeniyle hücrelerin toplanmasıdır. yapının (O) İletim görüntü. (P) Doğal lifli taban matris DAPI (mavi dalga boyu) olarak autofluorescent edilir. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Film 1 . hücrelerin yaprak aktarılması süreci belge ile sunulan ek filmde vurgulanır. Film gösterir, adım şeklinde bir işlemde, inkübatör hücrelerin kaldırılması; % 6 jelatin, th yerleştirilmesi ile ortamın değiştirilmesiE metal perde, buz üzerinde hücrelerin soğutma, başka bir kaba transfer sırasında hücrelerin bir görüntü ve son tabakadan ekranın giderilmesi için pNIPAAM kaplanmış çanak hücre transferi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokolde kritik adımlar şunlardır: thermoresponsive polimer ile levha yüzeylerinin kaplanması ve plakaların soğutulduktan sonra hücre tabakalan manipüle. Farklı hücrelerin farklı fiziksel özellikler sergiler, çünkü yapışkanlık gibi, kaldırma zaman her bir farklı bir hücre tipi için optimize edilmelidir. Bu protokolün ikinci ve en önemlisi zorlu bileşeni, hücre zarının, doku montaj yöntemleri eleştirel bir yönü manipülasyon merkezleri. Hücre sayfasındaki tek hücre tabakası oldukça kırılgan ve forseps ile manipüle bile kolayca yırtılabilir. Hücre tabakaları yerinde düzenlenen değildir Üstelik, bunlar sözleşme eğilimindedir ve kolayca katlayabilirsiniz. Destekleyici bir ekran kullanılarak önerilen hücre tabaka transferi kırılgan hücre zarının manipülasyon yardımcı olur.

Bu yazıda sunulan tasarım metodolojisi doku mühendisliği aletle çeşitli bir hücre tabakasını oluşturmak için oldukça düşük maliyetli bir yaklaşım sağlarkatyonlar. Ayrıca, bir üniversite laboratuarda pNIPAAM kaplanmış plakalar oluşturmak çok hücre tipi ve yüzeyleri karşılamak için yapılabilir edilen protokole, bu metot ve modifikasyonlar ile standardize edilebilir. Hücre tabakaları yerine düzensiz tek hücrelerin kullanımı, doku montaj yardımcıları, ayrıca hayatta kalma ve yerleşen dokuların entegrasyon olasılığını arttırabilir. Ancak, bu yapıların (değil bu protokolde belirtilen) in vivo dağıtım yöntemi her bir doku tipi için optimize edilmesi gerekir. Gelecek uygulamalar araştırmaları ve spesifik organ sistemleri için dokular üretmek için optimize edilmiş uygulamaları bulunmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Calcein-AM Invitrogen C3099 Cell tracker / live dye
Lysotracker Red Invitrogen L7528 Cell tracker
Neutral Red Sigma N7005 Visible Cell dye
pNIPAAM Sigma Aldrich 412780250 Poly(N-isopropylacrylamide)
Toluene Sigma Aldrich 244511-1L
Hexane Sigma Aldrich 296090-1L
RAOSMC Lonza R-ASM-580 Rat Aortic Smooth Muscle Cells
SmGM2 Lonza CC-4149 Smooth Muscle Media
HUVEC Invitrogen C-003-5C Human Venous Endothelial Cells
HyStem Glycosan/Biotime
Isopropyl alcohol VWR International BDH1133-4LP
Trypsin Corning Cellgro 25-053-C1
PBS Gibco 14287-072
FBS Gibco 16140-071
Specific Equipment
Filter paper Ahlstrom  6310-0900 
Buchner Funnel  Sigma Aldrich  Z247308 
UpCell Plates  Nunc  2014-11 
UV light Jelight Company  UVO Cleaner Model No.42

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ohashi, K., Okano, T. Functional tissue engineering of the liver and islets. Anat Rec (Hoboken). 297, 73-82 (2014).
  2. Chen, Q. Z., Harding, S. E., Ali, N. N., Lyon, A. R., Boccaccini, A. R. Biomaterials in cardiac tissue engineering: Ten years of research survey. Mat Sci Eng R. 59, 1-37 (2008).
  3. Jakob, P., Landmesser, U. Current status of cell-based therapy for heart failure. Curr Heart Fail Rep. 10, 165-176 (2013).
  4. Tongers, J., Losordo, D. W., Landmesser, U. Stem and progenitor cell-based therapy in ischaemic heart disease: promise, uncertainties, and challenges. Eur Heart J. 32, 1197-1206 (2011).
  5. Etzion, S., et al. Influence of embryonic cardiomyocyte transplantation on the progression of heart failure in a rat model of extensive myocardial infarction. J Mol Cell Cardiol. 33, 1321-1330 (2001).
  6. Masuda, S., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T. Cell sheet engineering for heart tissue repair. Adv Drug Deliv Rev. 60, 277-285 (2008).
  7. Koh, G. Y., Soonpaa, M. H., Klug, M. G., Field, L. J. Strategies for myocardial repair. J Interv Cardiol. 8, 387-393 (1995).
  8. Li, R. K., et al. Construction of a bioengineered cardiac graft. J Thorac Cardiovasc Surg. 119, 368-375 (2000).
  9. Muller-Ehmsen, J., et al. Rebuilding a damaged heart: long-term survival of transplanted neonatal rat cardiomyocytes after myocardial infarction and effect on cardiac function. Circulation. 105-1720 (2002).
  10. Reinecke, H., Zhang, M., Bartosek, T., Murry, C. E. Survival, integration, and differentiation of cardiomyocyte grafts: a study in normal and injured rat hearts. Circulation. 100-193 (1999).
  11. Roell, W., et al. Cellular cardiomyoplasty improves survival after myocardial injury. Circulation. 105, 2435-2441 (2002).
  12. Soonpaa, M. H., et al. Potential approaches for myocardial regeneration. Ann N Y Acad Sci. 752, 446-454 (1995).
  13. Akins, R. E. Can tissue engineering mend broken hearts. Circ Res. 90, 120-122 (2002).
  14. Goodell, M. A., et al. Stem cell plasticity in muscle and bone marrow. Ann N Y Acad Sci. 938, 208-218 (2001).
  15. Menasche, P., et al. Myoblast transplantation for heart failure. Lancet. 357, 279-280 (2001).
  16. Murry, C. E., Wiseman, R. W., Schwartz, S. M., Hauschka, S. D. Skeletal myoblast transplantation for repair of myocardial necrosis. J Clin Invest. 98, 2512-2523 (1172).
  17. Orlic, D., et al. Transplanted adult bone marrow cells repair myocardial infarcts in mice. Ann N Y Acad Sci. 938, 221-229 (2001).
  18. Elia, R., et al. Silk-hyaluronan-based composite hydrogels: a novel, securable vehicle for drug delivery. J Biomater Appl. 27, 749-762 (2013).
  19. Kai, D., et al. Stem cell-loaded nanofibrous patch promotes the regeneration of infarcted myocardium with functional improvement in rat model. Acta Biomater. (2014).
  20. Hong, H. J., et al. Tracheal reconstruction using chondrocytes seeded on a poly(l-lactic-co-glycolic acid)-fibrin/hyaluronan. J Biomed Mater Res A. (2014).
  21. Serpooshan, V., et al. The effect of bioengineered acellular collagen patch on cardiac remodeling and ventricular function post myocardial infarction. Biomaterials. 34, 9048-9055 (2013).
  22. Turner, W. S., et al. Cardiac tissue development for delivery of embryonic stem cell-derived endothelial and cardiac cells in natural matrices. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 100, 2060-2072 (2012).
  23. Sato, M., Yamato, M., Hamahashi, K., Okano, T., Mochida, J. Articular cartilage regeneration using cell sheet technology. Anat Rec (Hoboken). 297, 36-43 (2014).
  24. Sawa, Y., Miyagawa, S. Present and future perspectives on cell sheet-based myocardial regeneration therapy. Biomed Res Int. 2013, 583912 (2013).
  25. Demirbag, B., Huri, P. Y., Kose, G. T., Buyuksungur, A., Hasirci, V. Advanced cell therapies with and without scaffolds. Biotechnol J. 6, 1437-1453 (2011).
  26. Song, J. J., Ott, H. C. Organ engineering based on decellularized matrix scaffolds. Trends Mol Med. 17, 424-432 (2011).
  27. Badylak, S. F., et al. The use of extracellular matrix as an inductive scaffold for the partial replacement of functional myocardium. Cell Transplant. 15, Suppl 1. S29-S40 (2006).
  28. Wang, Y., et al. Lineage restriction of human hepatic stem cells to mature fates is made efficient by tissue-specific biomatrix scaffolds. Hepatology. 53, 293-305 (2011).
  29. Gilbert, T. W., et al. Collagen fiber alignment and biaxial mechanical behavior of porcine urinary bladder derived extracellular matrix. Biomaterials. 29, 4775-4782 (2008).
  30. Luna, J. I., et al. Multiscale biomimetic topography for the alignment of neonatal and embryonic stem cell-derived heart cells. Tissue Eng Part C Methods. 17, 579-588 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats