Ingénierie tissulaire: Construction d'un échafaudage 3D multicellulaire pour la livraison de stratifiés feuilles cellulaires

Bioengineering

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Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets. J. Vis. Exp. (92), e51044, doi:10.3791/51044 (2014).

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Abstract

Beaucoup de tissus, comme les adultes cœurs humains, sont incapables de se régénérer correctement après dommages. 2,3 Stratégies en ingénierie tissulaire proposent des innovations pour aider le corps dans la récupération et la réparation. Par exemple, les approches TE peuvent être en mesure d'atténuer le remodelage cardiaque après un infarctus du myocarde (IM) et peut-être augmenter la fonction cardiaque totale à un niveau MI pré proche de la normale. 4 Comme avec n'importe quel tissu fonctionnel, réussite de la régénération du tissu cardiaque implique la bonne exécution de plusieurs types de cellules avec des signaux environnementaux qui favorisent l'intégration et la survie de la greffe de cellules / tissus implantés. Tissus d'ingénierie devraient aborder plusieurs paramètres dont: signaux solubles, les interactions cellule-cellule et matériaux de matrice évalués comme les véhicules de livraison, de leurs effets sur la survie de la cellule, la résistance des matériaux, et la facilitation de l'organisation de cellule à tissu. Des études utilisant l'injection directe de cellules du greffon seulement ignorer ces éléments essentiels. 2,5,6Une conception de tissu combinant ces ingrédients n'a pas encore été développé. Ici, nous présentons un exemple de superposition à l'aide des dessins intégrés de feuilles de cellules à motifs avec deux types de matières biologiques contenant des dérivés du type cellulaire organes cibles et des cellules endothéliales pour l'amélioration de la formation de nouveaux vaisseaux dans le "tissu". Bien que ces études se concentrent sur la production de tissu cardiaque comme, cette conception de tissu peut être appliquée à de nombreux autres organes que le coeur de la conception et matérielles des changements minimes, et est censé être un produit hors-the-shelf pour les thérapies régénératrices. Le protocole contient cinq étapes détaillées. Une température Poly sensible (N de -isopropylacrylamide) (PNIPAAm) est utilisé pour des boîtes de culture de tissus de la robe. Ensuite, les cellules sont mises en culture tissulaire spécifique sur la surface des plaques revêtues de motif fin / des surfaces pour former des feuilles de cellules avec de fortes adhérences latérales. En troisième lieu, une matrice de base est créé pour le tissu en combinant la matrice poreuse avec Permissi néovasculaireve hydrogels et les cellules endothéliales. Finalement, les feuilles de cellules sont soulevées à partir des boîtes revêtues PNIPAAm et transférées à l'élément de base, ce qui rend l'assemblage complet.

Protocol

1 Création de plaques PNIPAAm revêtues

  1. Dissoudre 2,6 g de PNIPAAm dans 2 ml d'une solution / 40% d'hexane à 60% dans le toluène.
  2. Chauffer le mélange à 60 ° C pendant 10 min sous agitation, jusqu'à ce que l'on dissout PNIPAAm.
  3. Couper le papier filtre dans un cercle de 60 mm de diamètre et placez le papier dans l'entonnoir de Büchner.
  4. Filtrer la solution à travers un entonnoir de Büchner dans le bécher pré-pesée verre (ne pas utiliser des matières plastiques, comme l'hexane fera fondre les plastiques).
  5. Placer le bécher et contenu dans un vide de cloche (24 psi) O / N (16 h). Note: Jusqu'à ce que le résidu est traité avec isopropylique il s'oxyde alors assurez-vous qu'il n'entre pas en contact avec l'oxygène.
  6. Peser le bécher pour déterminer la masse de la PNIPAAm.
  7. Ajouter de l'alcool isopropylique à la PNIPAAm, la création d'un 50/50 p / p de la solution.
  8. Placer 2 ml de la solution sur la surface de la plaque de culture de tissu, et le pelage pendant 5 min sous une lampe UV.
  9. Laver la plaque avec 2 ml de PBS chaud deux foisavant de l'utiliser pour la culture cellulaire.

2 Création de feuilles cellulaires

Remarque: feuilles cellulaires de cellules primaires pour l'organe cible peuvent être créés en utilisant un certain nombre de méthodes différentes, ou par le revêtement de surfaces de culture de tissu de polymère thermo-sensible comme décrit ici. Plaques thermo-sensible pré-enrobées sont également offerts par un certain nombre de fournisseurs.

Remarque: Ce protocole est de culture en utilisant une boîte de 35 mm. Brièvement, les cellules sont d'abord mises en incubation à 37 ° C pendant un minimum de 24 h à confluence pour établir des connexions latérales entre les cellules adjacentes. Pour détacher les feuilles de cellules, les plaques sont soumises à des températures inférieures à 32 ° C. Le tapis cellulaire est ensuite transféré dans la matrice fibreuse de base forte contenant un hydrogel permissive néovasculaire avec des cellules endotheliales vasculaires.

  1. Isoler la population de cellules. Remarque: cette méthode dépend des procédures de dérivation individuels et le type de cellules. Rat mu lisse aortiquedes cellules sub-aigu (RASMC) sont utilisés dans cet exemple. Ce sont des primaires de cellules musculaires lisses isolées de l'aorte abdominale d'un rat.
  2. Laver les cellules avec 2 ml de PBS chaud.
  3. Ajouter 3 ml de trypsine (ou autre / solution dissocier de clivage) sur les cellules pendant 5 min.
  4. Inhibition de la trypsine par addition de 3 ml de milieu de culture, ou une solution tampon phosphate (PBS) contenant 10% de sérum bovin fœtal (FBS).
  5. Les cellules dans un tube conique et compter une aliquote.
  6. Faites tourner les cellules à 1000 rpm (228 xg) pendant 5 min.
  7. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans leur milieu de croissance (milieu de culture SmGM2 plus kit balle est utilisé pour RASMC).
  8. Placer le support contenant les cellules sur une plaque thermo-sensible 35 mm - PNIPAAm plaque revêtue à une concentration qui permettra d'atteindre 100% de confluence. Remarque: Pour CMLAR ce nombre a été déterminé que 100 000 cellules / cm 2. Toutefois, en raison de la perte de cellules lors de la transmission, que 120% de VA lue est utilisée.
  9. Placer dans un incubateur à 37 ° CO / N. Remarque: il est important de maintenir les cellules à 37 ° C pour maintenir l'adhérence cellulaire de la plaque.

3 Préparation de Matrix Foundational

Remarque: Plusieurs matrices fibreuses 3D peuvent être utilisés pour la couche solide matrice fibreuse entre les feuilles de cellules délicates. Voici quelques exemples: gelfoam, bioverre, matériaux naturels acellularized 26 ou nanospun matériaux 27,28 Le porc urinaire matrice de la vessie (UBM) utilisée dans ces études a été généreusement fourni par notre collaborateur, le Dr Badylak 29.

  1. Avant d'utiliser, de déterminer les caractéristiques de la matrice, y compris le manque de contenu cellulaire si matrice décellularisé est utilisée, 27,28 viabilité cellulaire spécifique, et un espace vide. 22
  2. Couper la matrice de pré-stérilisé dans une taille et une forme souhaitées. Note: Ici, un poinçon est utilisé pour découper un cercle de 4 mm de diamètre.
ve_title "> 4. Cellules endothéliales ensemencement dans un néovasculaire permissive hydrogel

Remarque: Les cellules endotheliales peuvent être obtenus à partir d'une variété de sources, y compris la différenciation de cellules souches ou progénitrices. Ici, on utilise des cellules HUVEC.

  1. Utilisation tout hydrogel permissive (de fibrine, des gels de collagène) aussi longtemps que le temps de reticulation est suffisamment courte pour que les cellules restent viables. Remarque: ici, un gel acide hyaluronique (HA) réticulé à base d'un pont disulfure est utilisé.
  2. Préparer l'hydrogel HA en conformité avec le protocole de la société.
  3. Recueillir les cellules endothéliales et les disperser dans une solution à une seule cellule à l'aide de la trypsine 1x. Remarque: Accutase ou tampon de dissociation cellulaire peuvent également être utilisés pour la dispersion de la cellule unique.
  4. Désactiver l'enzyme de la trypsine en utilisant une quantité égale d'inhibiteur de trypsine de soja (si il est important que les cellules ne sont pas en contact avec le sérum) ou 10% de FBS dans du PBS, la collecte de la solution / cellules dans un tube conique de 15 ml.
  5. Contant les cellules, et de calculer le volume nécessaire pour les dimensions de raccordement (auparavant quantifiés). Remarque: Pour un patch de 4 mm, ici de 2 millions de cellules endothéliales sont utilisés.
  6. Extrait 2 millions de cellules, et la placer dans un nouveau tube de 15 ml conique.
  7. Spin au (228 xg) pendant 5 min.
  8. Aspirer le surnageant, ce qui laisse les cellules en culot dans un tube conique.
  9. Mélangez les matières liquides de HA et de la gélatine dans un rapport 1: 1 ration. Ensuite, ajouter 80% du volume total dans le tube conique contenant le culot.
  10. Remettre en suspension les cellules endothéliales dans le mélange 1: 1 HA / Gélatine
  11. Mettre les cellules en suspension dans le mélange HA / gélatine dans la matrice fibreuse de base à partir de l'étape 2.
  12. Ajouter cinquième (20 pour cent) du volume total souhaité de l'agent de réticulation
  13. Incuber pendant 1 heure à 37 ° C.

5 Isolation de feuilles cellulaires

  1. Retirez les plaques de 35 mm PNIPAAm traités contenant les cellules de l'incubateur et le placer dans une hotte de culture cellulaire àRT.
  2. Aspirer rapidement les médias à partir des cellules, et ajouter 2 ml de 6% de gélatine normale qui a été chauffée à 37 ° C.
  3. Bien que la gélatine est encore chaud, placer le treillis métallique dans la gélatine, la plongeant sous la surface de la gélatine normale (Film 1).
  4. Placer la totalité de la plaque sur de la glace pendant 5 à 7 minutes, ce qui permet la gélatine à durcir.
  5. Après 7 minutes, utiliser une spatule pour bien séparer les bords de gélatine sur le côté de la plaque, puis utilisez une pince pour soulever le treillis métallique de la plaque Remarque: Le 6% de gélatine, et la feuille de cellules devrait soulever avec le réseau.
  6. Déplacer la feuille de cellules dans le plat et placer sur le dessus de la combinaison de matrice hydrogel base fibreuse, définissant avec soin le réseau au-dessus de la construction. Remarque: Le côté apical de la feuille de cellule sera toujours en position haute.
  7. Ajouter 2 ml de milieu chaud (37 ° C).
  8. Incuber O / N permettre à la feuille de cellules d'adhérer à la surface de l'hydrogel.
  9. Retirer til treillis métallique après que la solution se réchauffe (environ 1 heure), ou le jour suivant.

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Representative Results

Le diagramme de flux (figure 1) illustre le procédé global de fabrication de la plaque à couches multiples. les feuilles de cellules sont détachées de la plaque traitée PNIPAAm en laissant tomber la température en dessous de 32 ° C. Ensuite, la feuille de cellules est placée au-dessus de l'hydrogel réticulé contenant des cellules endothéliales ensemencées sur la matrice fibreuse sous-jacente (figure 1). Les plaques thermo-sensible prétraitées peuvent également être utilisés pour la création des feuilles de cellules. Surfaces topologiques spéciaux sont utilisés pour motif particulier (c.-à aligner) les cellules 30.

La matrice fibreuse de base peut être générée à partir de décellularisation matrice tissulaire natif ou électrofilées. Ici, la feuille de matière fibreuse a été réduite à un diamètre de 4 mm pour la base de plaque (Figure 2A). La caractérisation de cette matière est importante pour déterminer la quantité d'hydrogel qui peut être utilisé pour combler les espaces vides. La matrice utilisée ici a été Previousournois caractérisé et publié. 22

Les hydrogels contenant des cellules endotheliales sont réticulés après l'application des composants liquides d'hydrogel HA de la matrice fibreuse. Microscopie de fluorescence / transmission montre des cellules colorées avec calcéine AM (figure 2B) qui ont été capturés dans l'hydrogel réticulé vivre.

Le processus de création de la feuille de cellules est représenté (Figure 3), y compris la comparaison entre nos propres plaques PNIPAAm enduits et plaques pré-revêtues achetés auprès d'un fournisseur. RASMC sont plaqués sur la surface PNIPAAm traitée pendant au moins 16 heures à 37 ° C. Ce temps minimum permet aux cellules d'établir leurs adhérences latérales de frontière avec les cellules voisines (Figure 3A). Remarque: Les cellules doivent être au confluent de mettre en place ces pensionnaires latérales. Après culture pendant au moins 16 heures, la plaque de cellules doit être déplacée à la température ambiante pendant une chute au-dessous de 32 ° C, et en utilisant de la glace fou 5-8 min accélère le processus de refroidissement (figure 3B). La chute de température modifie l'angle de contact de conformation de la matière de revêtement permettant la feuille de cellules à décoller de la plaque. Figure 3C montre la feuille de la cellule de levage de la plaque.

Les plaques revêtues en laboratoire ont bien fonctionné, après une certaine optimisation, de création et de déplacement des feuilles de cellules. Figure 4D montre une monocouche confluente de RASMC avant le transfert. Lorsque les cellules ont été autorisés à lever, les feuilles ont tendance à plier et coller à lui-même (figure 3E). En fait, la manipulation des feuilles de cellules sur créés en interne PNIPAAm ou ceux achetés était difficile et souvent donné lieu à une déchirure des feuilles (Figure 3F). Par conséquent, une solution pour transférer les feuilles a été développé. Une fois que les cellules sont retirées de l'incubateur et commencent à se refroidir, 6% de gélatine a été utilisé pour recouvrir les cellules avec un métal additionnel lattice incorporé dans le gel (figure 3G). Comme la plaque refroidie, les cellules levées, et la gélatine durcit. En utilisant des pinces, la feuille de treillis et gelatin- cellule peut être enlevé en même temps à partir de la plaque de culture; tout à la fois (figure 3H). Ensuite, ces trois composants sont placés sur le dessus de la construction sur la base (figure 3I). Ici, la feuille de cellules (rose) est beaucoup plus grande que la matrice de base sous-jacente (matrice épaisse et blanche sous la feuille de cellules rose). La feuille de cellules peut facilement être découpée à la taille.

Le patch de la cellule finale (figure 4) est créé par la superposition de la feuille de cellules sur le complexe préformé de la base du patch hydrogel et permissive. De bas en haut, le patch est constitué d'une matrice fibreuse ensemencé avec l'acide hyaluronique hydrogel contenant les cellules endothéliales, et la feuille de cellules est en couches sur le dessus de cette matrice. Les premières tentatives pour manipuler des feuilles de cellules sans l'utilisation de la gélatine / maille apparATU a donné lieu à de très petites feuilles de cellules qui souvent pliés et déchirés (figure 4A-D en vue de dessus). figure 4A représente un correctif conception image de la petite composite combinant le rouge Mitotracker teint RASMC (figure 4B), la calcéine AM HUVECs fluorescentes vertes (Figure 4C), et l'image de la lumière transmise (figure 4D). Closer 10x images sont fournies pour la feuille de cellules et HA / hydrogel sans matrice (figure 4E-H). Figure 4E est le composite de la mitotraker rouge (figure 4F), la calcéine AM vert HUVEC (Figure 4G) et la lumière transmise ( La figure 4H). La vue de dessous (matrice de base, HA / HUVEC), et les images de chaque composant de la feuille de cellule est présentée dans les figures 4E-L. Les images composites est la figure 4E, avec les différentes parties représentées à la figure 4J-L, figure 4J shux de la couche de cellules (rouge), les cellules endothéliales (vert) sont sur ​​la figure 4K, et l'image de transmission (figure 4L) L'image composite (figure 4M) montre le patch avec une cellule-feuille uniforme couvrant toute la surface de la matrice sans pliage ou déchirure. Chiffres 4M-P sont aussi du fond regardant dans la matrice. Figure 4N est la feuille de cellules, contenant Rouge Neutre. Encore une fois, les bandes rouges épais apparaissent autour de la matrice parce que la feuille se replie dans ces zones directement adjacentes au bord de la matrice. l'imagerie de la lumière de transmission (figure 4O) montre la morphologie des cellules, et la structure de la matrice. Enfin (figure 4P), la matrice a une qualité spéciale de fluorescence à la même longueur d'onde que Dapi. Par conséquent, l'excitation ultraviolette de la matrice est utilisée pour visualiser clairement le séparant de la feuille de cellules (rouge vif). Les bords du patch peuvent être découpés poursupprimer tous les bords de la feuille qui sont suspendus sur les bords de la matrice.

Figure 1
Figure Graphique 1 de débit de tissus Assemblée. Cell-feuilles sont créés par l'ensemencement des cellules sur les plaques PNIPAAm revêtues thermosensibles, et laisser suffisamment de temps pour que les cellules à confluence et établir des connexions latérales aux cellules voisines. Le tapis cellulaire est libéré par la réduction de la température (disque jaune). Parallèlement, les cellules endothéliales sont intégrés dans un permissive hydrogel HA néovasculaire, injecté dans l'espace des vides de la matrice fibreuse de base plus solide, et chimiquement réticulé (disque blanc). La feuille de cellules (disque jaune) est alors en couches avec la combinaison de la matrice de l'endothélium (blanc), si nécessaire. S'il vous plaît cliquer ici pourvoir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Images de base Matrix et endothéliale encapsulation. (A) La matrice fibreuse de base forte est un coup de poing dans une forme ronde. Voici un diamètre de 4 mm est utilisé sur le modèle animal in vivo. (B) HUVECs colorées avec Mitotracker vert (calcéine AM) en suspension dans hydrogels HA sur la surface de la matrice de base (10X). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 Création de feuilles cellulaires. (A) c RASMCultured sur PNIPAAm-traité 35 mm-plats pour 16 heures (10X). (B) RASMC levée après plaçant la plaque sur la glace pendant 5-7 min. (C) Image du bord d'une feuille de cellules libérant du commerce acheté boîte de culture cellulaire thermosensible (10X). (DF) d'images représentent des résultats similaires pour la production de feuilles de cellules à partir de la vaisselle en interne créée PNIPAAm revêtues. (D) Confluent RASMC cultivé sur 35 mm des plaques de culture de tissus standards (4X). (E ) Après refroidissement, les feuilles de cellules contractés et pliées comme ils détachés (4X). (F) En raison de la fragilité de la feuille une seule cellule, les feuilles de cellules sont souvent endommagés pendant le levage ou d'autres manipulations (4X). (G) Dans afin d'atténuer les perforations de la feuille de cellules, un écran de métal est utilisé en tant que support physique pour faciliter le transfert des feuilles de cellules. RASMC ont été colorées avec du colorant rouge neutre, couvert avec 6% de gélatine et d'un support de treillis métallique poreux, unee laisse durcir. (H) Avec le soutien de l'écran, feuilles de cellules sont transférées avec un minimum de dommages (4X). (I) L' plus grande RASMC couche de feuille de cellules (de couleur rose) a ensuite été placé sur le dessus de la combinaison de base plus solide en fibre de patch-hydrogel (flèche). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Images de couches cellulaires. Patch cellules ont été cultivées sur une surface revêtue de pNIPPAM et ensuite déplacés comme une feuille à la surface de la matrice fibreuse. Les premiers essais qui n'ont pas été transférés avec le réseau gélatine / métal ont donné lieu à de petites parcelles en lambeaux (AD). (A) Image composite de (BD),(B) CMLAR dans deux draps tachés avec l'image composite d'une cellule-feuille combinée avec la combinaison de matrice hydrogel fibreux base plus solide contenant Mitotracker Rouge, et (C) HUVECs colorées de vert, et (D) en lumière transmise. (E) Calceing AM taché HUVEC (vert), et (F) Mitotracker Rouge CMLAR. (G) HUVECs fluorescentes vertes en suspension dans un hydrogel. (H) l'image de transmission de la combinaison de matrice hydrogel fibreux base plus solide. (I) Image composite à la recherche de la fond de la pièce vers le haut à travers la matrice fibreuse de base forte (non teinté), HA contenant HUVEC (vert), et plaque de cellules de CMLAR (rouge), respectivement. (J) Red feuille de CMLAR fluorescentes, comme on le voit à travers la matrice-fibreuse de base combinaison d'hydrogel. (K) des HUVEC fluorescentes vertes. (L) de l'image de transmission de la construction de patch.(M) de l'image composite de cellules-feuilles (rouges) sur la base de la combinaison de matrice hydrogel fibreux (autofluorescente-bleu). (N) Les cellules de la couverture de feuille de la base fibreuse matrice hydrogel combinaison spectacle fluorescence accrue sur les bords est due à concentration des cellules. (O) de l'image de transmission de la construction. (P) matrice fibreuse naturelle de base est autofluorescentes dans le DAPI (longueur d'onde bleue). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Film 1 . Le processus de transfert des feuilles de cellules est mis en évidence dans le film supplémentaire soumise par le document. Le film montre, dans le processus de pas-sage, l'élimination des cellules de l'incubateur; le remplacement du support avec 6% de gélatine, l'insertion d'ee de l'écran de métal, le refroidissement des cellules sur de la glace, le transfert des cellules de la boîte revêtue PNIPAAm à un autre plat, une image des cellules au cours du transfert, et enfin l'élimination de la totalité de la feuille.

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Discussion

Les étapes critiques du protocole comprennent: le revêtement des surfaces de la plaque avec le polymère thermosensible et la manipulation des feuilles de cellules après refroidissement des plaques. Parce que les cellules présentent différentes propriétés physiques différentes, comme l'adhésivité, le temps de levée doit être optimisée pour chaque type de cellule différent. La seconde, et la plus significative difficile composante de ce protocole, se concentre sur la manipulation de la feuille de cellule, un aspect critique des méthodes d'assemblage de tissus. La couche de cellule dans la feuille de cellules est très fragile et peut se déchirer facilement si manipulé avec une pince. En outre, lorsque les feuilles de cellules ne sont pas maintenus en place, ils ont tendance à se contracter et se plie facilement. Le transfert de feuilles de cellules proposé d'utiliser un écran de soutien facilite la manipulation de la feuille de cellules fragiles.

La méthodologie de conception présentée dans ce manuscrit fournit une approche assez faible coût pour la création d'une feuille de cellules pour une variété d'appli d'ingénierie tissulairecations. En outre, la création de plaques enduites PNIPAAm dans un laboratoire universitaire puisse être normalisée avec cette méthode et modifications au protocole peut être fait pour accueillir plusieurs types de cellules, et les surfaces. L'utilisation de feuilles de cellules, plutôt que des cellules individuelles non organisées, facilite le montage de tissu, et peut également augmenter la probabilité de survie et l'intégration de tissus implantés. Cependant, la méthode in vivo dans la livraison (non mentionné dans ce protocole) de ces constructions devra être optimisée pour chaque type de tissu. Parmi les futures applications explorations et des méthodologies optimisées pour générer des tissus pour les systèmes d'organes spécifiques.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Calcein-AM Invitrogen C3099 Cell tracker / live dye
Lysotracker Red Invitrogen L7528 Cell tracker
Neutral Red Sigma N7005 Visible Cell dye
pNIPAAM Sigma Aldrich 412780250 Poly(N-isopropylacrylamide)
Toluene Sigma Aldrich 244511-1L
Hexane Sigma Aldrich 296090-1L
RAOSMC Lonza R-ASM-580 Rat Aortic Smooth Muscle Cells
SmGM2 Lonza CC-4149 Smooth Muscle Media
HUVEC Invitrogen C-003-5C Human Venous Endothelial Cells
HyStem Glycosan/Biotime
Isopropyl alcohol VWR International BDH1133-4LP
Trypsin Corning Cellgro 25-053-C1
PBS Gibco 14287-072
FBS Gibco 16140-071
Specific Equipment
Filter paper Ahlstrom  6310-0900 
Buchner Funnel  Sigma Aldrich  Z247308 
UpCell Plates  Nunc  2014-11 
UV light Jelight Company  UVO Cleaner Model No.42

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References

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