הערכת שינויים בנדיפות כללית הרדמה רגישות של עכברים לאחר התערבות תרופתי מקומית או מערכתית

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

אובדן של רפלקס ליישר שימש עוד פונדקאית התנהגותיות סטנדרטית לחוסר הכרה, המכונה גם היפנוזה, בחיות מעבדה. שינויים ברגישות לחומר הרדמה נדיפים הנגרמים על ידי התערבויות תרופתיים יכולים להיות מזוהים עם מערכת מבוקרת בקפידה תפוקה גבוהה הערכה, אשר עשוי להיות מותאמת לאספקה ​​של כל טיפולי בשאיפה.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

McCarren, H. S., Moore, J. T., Kelz, M. B. Assessing Changes in Volatile General Anesthetic Sensitivity of Mice after Local or Systemic Pharmacological Intervention. J. Vis. Exp. (80), e51079, doi:10.3791/51079 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

נקודת סיום רצויה אחד מהרדמה הכללית הוא המצב של חוסר הכרה, הידוע גם בהיפנוזה. הגדרת המצב ההיפנוטי בבעלי חיים היא פחות ברורה מאשר בחולים אנושיים. הפונדקאי התנהגותי בשימוש נרחב להיפנוזה במכרסמים הוא אובדן ליישר רפלקס (LORR), או הנקודה שבה החיה כבר לא מגיבה לאינסטינקט המולד שלהם, כדי למנוע את הפגיעות של כיבה על גב. אנחנו פיתחנו מערכת להערכת LORR ב24 עכברים בו זמנית תוך שליטה בזהירות לבלבול פוטנציאלי, כוללים תנודות טמפרטורה ושונים תזרים גז. תאים אלה יאפשר הערכה אמינה של רגישות הרדמה כפי שהיא נמדדת על ידי חביון להשבה של רפלקס ליישר (RORR) בעקבות חשיפת הרדמה קבועה. לחלופין, באמצעות עלייה בשלבים (או ירידה) בריכוז חומר הרדמה, התאים גם לאפשר קביעת הרגישות של אוכלוסייה לאינדוקציה (או הופעתה), כפי שנמדדו על ידיEC 50 ומדרון גבעה. לבסוף, תאי הסביבה המבוקר המתוארים כאן ניתן להתאים למגוון רחב של שימושים אלטרנטיביים, כוללים משלוח בשאיפה של תרופות אחרות, מחקרי רעלים, וניטור בזמן אמת בו זמנית של סימנים חיוניים.

Introduction

הרדמה כללית מוגדרות על ידי היכולת שלהם לגרום למצב הפיך בהיפנוזה במגוון רחב של מינים, ובכל זאת הסבר איך כיתה מגוונת כגון תרופות כל יכולה לעורר נקודת סיום ביחיד נותרת חמקמקה. מספר התיאוריות שהציג לאורך השנים, החל מהמתאם מאייר-אוברטון בין עוצמת הרדמה ומסיסות שומנים בדם, אשר הציע שיבושי קרום כלליים כבסיס ל1,2 היפנוזה. ראיות חדשות יותר מצביעות על כך שמטרות חלבון משפיעים על איתות עצבית לתרום להשפעות הרדמה. עכברים הוכיחו להיות מודל חיוני לחקר התיאוריות אלה בגלל ההומולוגיה בין עכברי והיענות הרדמה אנושית. למרות שעכבר לא יכול להישאל על המודעות הסובייקטיבית שלה תחת הרדמה כללית, רפלקסים פרימיטיביים מסוימים לשמש מדדים פונדקאיות כשימושיים של היפנוזה מכרסם. בימים הראשונים שלאחר לידה, עכברים לפתח שו"ת ליישר רפלקסיביתonse שמונע מהם שיוצבו באופן פסיבי במצב שכיבה 3. המינון של הרדמה שבה עכבר מאבד את רפלקס ליישרה וקושרת היטב עם מינונים היפנוטיים אדם 4.

ההערכה של אובדן רפלקס ליישר (LORR) הפכה לסטנדרטית במעבדה בשימוש נרחבת לבדיקת רגישות הרדמה בעכברים, כמו גם מגוון רחב של מינים אחרים, כולל עכברים, שפן ניסיונות, ארנבת, החמוס, כבשים וכלב 5-8. המינון של חומר הרדמה שניתנה בי LORR יתרחש לחברים של מינים הוא עקבי מאוד, אבל זה יכול להיות מוזז באופן משמעותי על ידי גורמים סביבתיים. לדוגמא, חולדות שנשללה שינה רגישות יותר לשני חומרי הרדמה נדיפים ווריד 9 וחולדות עם יכולת אירובית גבוהה פחות רגישים לisoflurane 10. היפותרמיה גם הוכח להקטין את המינון של חומרי הרדמה רבות הנדרשות להיפנוזה במגוון גדול של מיני 11-14. על מנתכדי לזהות את מינון חומר ההרדמה שבי LORR מתרחש בקבוצה של חיות ניסוי מהימן, זה קריטי, כי סביבת ההערכה להיות מבוקרת בקפידה כדי למזער את הלחץ, לשמור על euthermia, ולספק כמויות שווה של תרופה לכל הנושאים. באופן לא מפתיע, גורמים גנטיים ידועים גם לשנות את רגישות ההרדמה 15-18. כתוצאה מכך, שיקול זהיר יש לתת גם לשליטה על רקע גנטי 19.

פיתחנו מנגנון שמבטיח אספקת חומר הרדמה גזים זהה לכל אחד מ24 עכברים תוך שמירה על סביבת C 37 o קבועה. העיצוב הגלילי השקוף של תאי החשיפה שלנו מאפשר להערכת LORR המהיר ושילוב קל של מדידות פיסיולוגיות telemetric. מערכת זו הוכח כדי למדוד במדויק isoflurane, halothane, ואינדוקצית sevoflurane 50 EC וזמן הופעתה בwild-type עכברים 20. יש לנו גם בשימושבמערכת זו כדי לצפות שינויים ברגישות לחומר הרדמה בעכברים עם מוטציות גנטיות ונגעי ההיפותלמוס ממוקדים 21-23. כאן אנו מתארים שתי דרכים שבהן רגישות הרדמה ניתן להעריך לאחר התערבות תרופתית באמצעות מנגנון הסביבה המבוקר שלנו. phenotyping מצב היציב של אינדוקציה הרדמה נדיפים ורגישות הופעה דורש 8-10 שעות וכתוצאה מכך הוא מותאם ביותר ללימודים שבתנאי ניסוי לא משתנים, כמו בהתערבויות תרופתיים כרוניות או ארוכות טווח. עם זאת, לטיפולים, משחק קצר תופעות שיתפזרו באופן משמעותי לאורך זמן אנחנו גם להציג הליך פשוט כדי להעריך את השינויים בליישר רפלקס הבא microinjections stereotactically הממוקד או טיפולים תרופתיים תוך ורידי המשפיעים הופעת הרדמה באופן משמעותי. בדיקות אלה מייצגות קבוצה קטנה של היישומים הפוטנציאליים עבור מערכת של הסביבה מבוקרת זו, אשר יכולה להיות מותאמת לכל מספר של Subjects של מגוון מינים כדי לקבל כל סוג של טיפול בשאיפה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים כרוכים בבעלי חיים המפורטים במסמך זה אושרו על ידי האוניברסיטה והעדה מוסדי הטיפול בבעלי חיים ושימוש של פנסילבניה.

1. סקירה כללית של מנגנון הבדיקה

  1. מנגנון הבדיקה מורכב מ24 תאים גליליים אקריליק ברורים 10 סנטימטר אורך ו 5 ס"מ קוטר (נפח כולל של 200 מיליליטר). גודל זה הוא מתאים לעכבר בוגר 25 גרם טיפוסי. יש לשכות יציאות בכל קצה לכניסת גז וחשמל. הסוף לשקע הוא נשלף, כך שעשויים להיות טעונים בעלי חיים בקלות אל תוך החדר. פתחי יציאת גז חתומים בזהירות עם סרט טפלון, בעוד אטמי הגומי O-טבעת משמשים לאטום את הסוף להסרה של התאים גליליים.
  2. כל תא הוא רכוב על מדף שיושב בתוך אמבט מים. המתלה מצוידת, כך שהחלק התחתון בלבד של התאים (מתחת לפתחי כניסת הגז) הוא שקוע. ליציבות, הקצה האחורי של החדר נשען על תמיכה, כך שכל chambאה יושב בצורה אופקית. זה מבטיח מגע אפילו של כל החדר עם האמבטיה.
  3. צינורות פוליאתילן מתחבר מיכל חמצן למאדת הרדמה, ולאחר מכן עוברים דרך L / מד זרימת דקות 10. הצינור מתפצל ל25 נגדים בקוטר קטן באורך שווה, כדי להבטיח זרימה שווה מועברת לכל אחד מהתאים 24 ומנתח סוכן.
  4. קווי אבק לצאת מכל חדר בקצה השני של כניסת הגז. זה מקדם את הזרימה חד כיווני שמונעת נשימה חוזרת של נשף פחמן דו חמצני. קווי הוואקום לשלב בסעפת כדי להתחבר לקו יניקה בתוך הבית. שסתום קופץ מלאורך קו הוואקום העיקרי מבטיח תנאי לחץ אטמוספרי בתוך כל תא.
  5. האמבטיה מלאה במספיק מים כדי ליצור קשר עם החלק התחתון של כל תא באופן מלא. המים מופצים דרך האמבטיה ומתוחזק בC 37 o מתמדת על ידי משאבה.

2. בדוק את מערכת לפני החשיפה

  1. Cלעזאזל שהטמפרטורה של אמבט המים היא 37 C o לאורך האמבטיה.
  2. זרימת חמצן בשיעור של 5 ליטר / דקה (200 מיליליטר / דקה לכל תא + מנתח סוכן). להטביע כל תא מתחת למים ולחפש בועות או כניסה של מים לתוך התא, אשר שניהם מעידים על הדלפות. לאטום כל הדלפות לפני תחילת הניסוי.
  3. לכל חדר, להתחבר 500 מד זרימת מיליליטר / דקה בתור אחרי קאמרי לוודא כי תזרים מאוזנים על פני כל אחד מ25 קווי הגז. הדבר מבטיח כי תזרים קלט 5 ליטר / דקה יחולק באופן שווה, כך שכל תא מקבל 200 זרימת מיליליטר / דקה. כל תא אינו מקבל את הזרימה הצפויה צריך להיות הזרימה שלה וצינורות יצוא בדקו עבור חסימות.
  4. כייל את מנתח הסוכן כדי להבטיח קריאה של isoflurane 0.00% כאשר 100% חמצן זורם.

3. משדר טמפרטורת שתל

  1. שבוע לפני הרגלה, להרדים כל עכבר עם isoflurane 2%.
  2. לחטא את אזור צוואר הגב עם בטאדין.
  3. להזריק תת עורי משדר טמפרטורה בין השכמות באמצעות מחט מזרק סטרילי, ארוזה מראש.
  4. לפקח על אתר ההזרקה יומי לזיהום והגירה של המשדר.

4. להרגיל בעלי חיים לתאי בדיקה

  1. ארבעה ימים לפני ההערכה הראשונה, למקם את כל העכברים לתאים בודדים במשך שעה 2 עם 100% חמצן זורם.
  2. חזור על שלב 4.1 יומי לארבעה ימים שקדמו להערכה, כדי למנוע תופעות של הבלבול של לחץ בשל סביבה חדשה.

5. לבצע התערבות תרופתי שאתה רוצה לבדוק להשפעות על ההרדמה רגישות

  1. התערבות זו עשויה להיות הזרקת stereotaxic לחלק מסוים של המוח 24, הזרקה תוך ורידית או intraperitoneal 25, או מסירה של תרופה לאזור ספציפי במוח באמצעות צינורית 26.
  2. מכיוון שהליכים אלה עצמם עשויים לשנות את רגישות חומר הרדמה בהשוואה לבעלי חיים תמימים, קבוצת ביקורת ראויה צריכה לעבור את אותו תהליך עם זריקות רכב.
  3. ודא שיש לו את ההתערבות תרופתי משך הפעולה ארוך כראוי אם אתם מתכננים לעשות בשלבים הגדלת ו / או הקטנת קביעת רגישות הרדמה כפי שמוצג בשלב 6 שלהלן, אחרת, דלג לשלב 7.

6. להעריך הרדמה רגישות באמצעות קביעה בשלבים EC 50 לאינדוקציה וצמיחה

  1. מניחים כל בעלי חיים לתאי אדם עם 100% חמצן זורם.
  2. קבע את ריכוז isoflurane ל* 0.4% ל15 דקות. במהלך 2 דקות האחרונות של תקופה זו, להעריך את רפלקס ליישר של כל בעלי חיים על ידי בעדינות מגלגל את החדר עד שהעכבר ממוקם על הגב שלה. רפלקס ליישר נחשב שלם אם ורק אם העכבר הוא מסוגל לשחזר את כלמכפותיו על הרצפה של החדר בתוך 2 דקות.
    1. * שים לב שisoflurane 0.4% הוא מינון subhypnotic בעכברי C57BL/6J. אם כל עכברים לאבד את רפלקס ליישרם בשלב הראשון, במינון הראשוני היה גדול מדי ויש להפחית בימים שלאחר מכן.
  3. הקלט את המדינה ליישר רפלקס לכל עכבר ולסרוק כל עכבר לנתוני טמפרטורה. שיא תבנית מוצג בטבלה 1.
  4. להגדיל את ריכוז isoflurane ידי ~ 0.05% במשך 15 דקות וחזור על שלב 7.2. תמשיך לעשות את זה עד שכל בעלי החיים שאיבדו רפלקס ליישרם.
  5. אופציונאלי: לחזור על אותה הפרוצדורה להפחתת מינוני isoflurane צעד חכם עד שכל בעלי החיים יש חזרה רפלקס ליישרם (ראה שלב 6.3).
  6. כדי לסיים את הניסוי, כבה את isoflurane ולשטוף את המערכת כולה עם 100% חמצן במשך 15 דקות. זה יעזור כדי למנוע היפוקסיה כעכברים להתאושש לפני שחזרו לכלובים בביתם ויגן על experimenter מכל חשיפת הרדמה.
  7. אופציונאלי: אם מספר בעלי החיים או מספר ריכוזי הרדמה מוגבל בשל אילוצי משאבים או זמן, המדרון עשויה היל יש הערכות-במיוחד פרמטר עקומה בכושר הערכת מעריכים, באופן כוזב נמוכה שגיאה. במקרים כאלה, ייתכן שיהיה צורך לחזור על מדידת רגישות ההרדמה מתואר בשלבים 6.1-6.6 בעד שני ימי ניסיון נוספים להשיג פרמטר של מדרון הגבעה האמיתי והערכת השגיאה המקבילה שלה באופן מלא.

7. להעריך את השינויים לטווח קצר בהרדמת רגישות עם זמן להופעה

  1. מניחים כל בעלי חיים לתאי אדם עם 100% חמצן זורם.
  2. קבע את ריכוז isoflurane ל.1.2%, אשר תואם את האינדוקציה ED 99 לעכברי C57BL/6J פראי מסוג 20. לשמור על 30-60 דקות בהתאם למשך הצפוי של פעולה של ההתערבות חריפה.
  3. לאשר LORR בכל בעלי החיים על ידי בעדינות מגלגל את כל חדר עד שעכברים מונחים על גבם.
  4. כבה את isoflurane וזרימת חמצן 100%. מדוד את הזמן עד שכל חיה חוזר לרפלקס ליישרה. זה מוגדר על ידי מיקום של כל ארבע כפות הרגליים על הרצפה של החדר ואושר על ידי נוכחותם של שלוש בדיקות ברציפות עם רפלקס ליישר ללא פגע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1 מדגים את התועלת של assay LORR צעד החכם לקביעת השפעות ארוך טווח של התערבות תרופתית. חומצת Ibotenic (רשות השידור) היא אגוניסט של glutamatergic קולטן N-methyl-D-asparate (NMDA) המשמש לעתים קרובות כexcitotoxin לגרום לנגעים עצביים קבועים. כאן אנו הזרקנו 10 NL של 1% בילטרלי רשות השידור לאזור ventrolateral preoptic (VLPO) של עכברי C57BL/6J שבוע לפני הבדיקה. רוב הנוירונים בגרעין זה מפגין שיעורים נמוכים של ירי בערויות ובמיוחד להגביר את פעילותם בזמן השינה שאינה מהירה תנועת העין, שנת תנועות עיניים מהירה, ועם חשיפה למינונים היפנוטיים של הרדמה כללית 23,27-29. נגעים מוצלחים בVLPO צריכים לגרום להתנגדות להיפנוזה מושרה isoflurane. בכל רמה הולך וגדל של isoflurane, את החלק היחסי של עכברים שאיבדו את רפלקס ליישר היה זמם נגד ריכוז הרדמה ביומן 10 קנה מידה. נתוניםלכל קבוצה של עכברים (והזריק-IBA הזריק רכב) היה אז בכושר עם עקומת מנת תגובת sigmoidal. בגלל assay זה תמיד מתחיל עם כל בעלי החיים זקופים ותמיד מסתיים בכל בעלי החיים שאיבדו את רפלקס ליישר, התחתון וקבועים העליונים היו מוגבלים ל 0 ו -1, בהתאמה. הפרמטרים חופשיים הנותרים של העקומות הם EC 50, או הריכוז של חומר הרדמה שבי 50% מעכברים שאיבדו את רפלקס ליישרם, ואת מדרון הגבעה, המשקף את שונות האוכלוסייה במהלך מעבר המצב ההיפנוטי שלהם. מבחן F שימש לשאילתא אם עקומת אינדוקציה יחידה עם EC המשותף 50 ופרמטרי מדרון גבעה בכושר הטוב ביותר הן רכב וקבוצות רשות השידור או אם עקומות אינדוקציה נפרדות עם פרמטרים שונים בכושר טוב יותר את הנתונים. דרגות חופש במבחן זה נובעים מנקודות נתוני הגלם הבסיסיות בכושר העקום וכתוצאה מכך תלויות במספר ריכוזי חומר הרדמה שנבדקו ומספר פרמטרים להיות Fit-EC 50 ומדרון גבעה במקרה זה. נתונים הופעתה צעד חכמים נותחו ודגם זהה לנתונים לזירוז. שים לב שEC 50 להופעתה הוא כמעט תמיד נמוך מזה של אינדוקציה בשל hysteresis הרדמה הידוע גם באינרציה עצבית 30. בניגוד לתוצאות צפויות, חיות שקיבלו רשות השידור בVLPO לא הראו הבדלים משמעותיים בEC 50 או מדרון גבעה לזירוז או הופעתה בהשוואה לקבוצת ביקורת, הזריק רכב (F = 2,80 1.73 וp = 0.184 לזירוז, F 2, 88 = 2.89 וp = 0.061 להופעתה). זה מצביע על כך נוירונים העכבר VLPO עמידים לנגע ​​עם 1% רשות השידור, אישר למעשה עם היסטולוגיה נתיחה שלאחר המוות (לא מוצג). Lu et al. הוכיחו בעבר כי מינון של 10% רשות השידור נדרש נגע החולדה 31 בVLPO, אבל בדיקה היסטולוגית של VLPO העכבר לאחר הזרקה של 10% רשות השידור גם לא הראתה באופן משמעותיאובדן צביעות תא (לא מוצג). VLPO החולדה ידוע להביע את קולטני ה-NMDA 32. מאז 10% רשות השידור הוא מסוגל להפעיל השפעה אקוטית על רגישות הרדמה כאשר מזריק VLPO (ראה איור 2, דיון בהמשך), זו טוענת כי VLPO העכבר חייב גם להחזיק את קולטני NMDA ההכרחי לפעולותיה של רשות השידור. לכן הסיבה לפער בין מינים עדיין לא ברורה. נגעי VLPO העכבר מוצלחים הושגו באמצעות galanin-saporin ממוקד 23.

למרות שרשות השידור אין השפעה לטווח ארוך על רגישות isoflurane כאשר מזריק VLPO, הטבע מעורר החריף של תרופה זו יהיה צפוי לעורר נוירונים VLPO וtransiently להגביר את רגישות חומר הרדמה. באיור 2, יש לנו נצלתי את הזמן למבחן הופעה כדי להדגים שינוי חריף גדול ברגישות isoflurane מייד לאחר microinjection רשות השידור דו צדדי לVLPO כפי שמעיד ממושך במידה ניכרתהיפנוזה לאחר הפסקה של אספקת חומר הרדמה (p <0.001). לעומת זאת, microinjection של רשות השידור למחץ המדיאלי הסמוכה לא גרם לשינוי בזמן הופעתה בהשוואה לקבוצת ביקורת, הזריק רכב (p> 0.05). ממצא זה מוסיף פן מעניין לעבודה קודמת שהראתה כי איון של גרעין זה מרחיב את הזמן להופעה 33,34. נתונים עבור קבוצות ניסוי ובקרה בזמן מבחן הופעה היה בממוצע ולעומת ANOVA בכיוון אחד.

זמן Isoflurane (ATM%) עכבר # 1 עכבר # 2 עכבר # 3 ...
0.4 - - - -
12:15 0.45 - X - -
12:30 0.5 - X X -
12:45 0.55 - X X
... 0.6 - X X X

. טבלה 1 דוגמא לגיליון התחבר להרדמת הערכת רגישות לטווח ארוך: בכל דקות 15 מינון ההרדמה היה גדל ב 0.05% וליישר רפלקס הוערכה עבור כל חיה. "X" מציין בעלי חיים שאיבדו את רפלקס ליישרם לנקודת זמן נתונה ו" - "מציין אלה ששמרו על רפלקס ליישרם.

איור 1
איור 1. הערכה של השבוע ליישר רפלקס אחת לאחר הזרקת Ibotenic חומצה בVentrolateral Preoptic Nucleus: assay רגישות הרדמה ארוך הטווח נערך על עכברים עם או רכב או חומצת ibotenic (רשות השידור) שהוחדר לאזור ventrolateral preoptic (VLPO) שבוע לפני הבדיקה. אינדוקציה ונתוני צמיחה לכל קבוצה הייתה בקנה אחד עם עקומת sigmoidal מנת תגובה (אינדוקציה בקווים מוצקים, הופעתה בקווים מקווקווים) יחד עם 95% למסגר את העקומות מיטבית (ברים מוצלים). ריכוז חומר הרדמה שזמם על יומן 10 קנה מידה. מרווחי ביטחון 95% חופפים מוצגים בסגול. מינון repsonse sigmoidal מתאים עבור שני כלי רכב ורשות השידור קבוצות מראות שום עדות לעקומות מיטבית מובחנות המבוססות על EC 50 ומדרון גבעה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 2
איור 2. זמן Emergence לאחר מקומי Microinjection של Ibotenic חומצה: בסמוך למועד הערכה, עכברים קיבלו microinjection של N-methyl-D-asparate (NMDA) חומצת ibotenic אגוניסט קולטן (רשות השידור) לתוך גרעין preoptic ventrolateral (VLPO). אזור זה ידוע להיות מופעל במהלך היפנוזה מושרה isoflurane. הזרקת רשות השידור הובילה לעלייה חריפה בזמן כדי לחזור מליישר רפלקס השוואה לקבוצת ביקורת, הזריק רכב (p <0.001). זמן הופעתה לבעלי חיים ברשות השידור שהוחדר לתוך מחיצה המדיאלי לא היה שונה מקבוצת ביקורת (p> 0.05). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

למרות הערכה של LORR בעכבר אחת היא משימה פשוטה לכאורה, זה בכל זאת חיוני כדי לשמור על תנאים פיסיולוגיים זהים בין נושאים על מנת לאסוף נתונים מהימנים מקבוצה של בעלי חיים. , מנגנון LORR קיבולת גבוהה המוסדר היטב שהוצג כאן מציע דרך לתקנן ניסויים ולמקסם את היעילות. על ידי ביצוע פעולות בעקרונות הבסיסיים של ויסות חום וזרימת חלוקה שווה, מערכת זו ניתן ליצור מחדש בקלות ומותאמת אישית כדי שתתאים לצרכימים 'הנסיינים בודדים. גודל חדר עשוי להיות מדורגת למינים אחרים, כגון חולדות, וחדרים נוספים ניתן לאכלס על ידי הצמדת יותר נקודות הסניף קשר ליבוא והוואקום. כל הנושאים הם נראים בקלות דרך תאי אקריליק ברורים, שמאפשר להקליט וידאו ניסויים לאישור post hoc-המשני של תוצאות. אקריליק הוא גם תואם עם מערכות טלמטריה בתדר רדיו, שבו ניתן להשתמש כדי לפקח על טמפרהture, לחץ דם, וbiopotentials.

אנו מציגים שתי שיטות שונות להערכת רגישות ההרדמה הבאה התערבות תרופתית. שניהם זמן הופעתה והבדיקות בשלבים האינדוקציה דורשים הנסיין להבקיע נוכחות או עדר של רפלקס ליישר. אפילו עם הגדרה מפורשת של LORR, כגון "לא הצליח למקם את כל ארבע כפות הרגליים על רצפת החדר בתוך שתי דקות של להיות מגולגל על ​​הגב שלה", ההערכה יכולה להיות סובייקטיבית במידה מסוימת. זה הכי טוב שיש באותו האדם עיוור הטיפול להבקיע כל חיה לתקופת הניסוי כדי להבטיח עקביות. בעת הבחירה בו מבחן לשימוש לצורך הערכת רגישות הרדמה, אורכו הצפוי של האפקט מההתערבות תרופתית צריך להיות הגורם המכריע. יש תרופות רבות משך זמן קצר של פעולה, שעבורו הזמן חדה את הפרדיגמה הופעתה יכול לספק מידע שימושי על רגישות הרדמה בתקופה מוגבלתשל זמן. עם זאת, תרופה עלולה להשפיע באופן מועדף הרגישות של בעל חיים לאינדוקציה של היפנוזה ולא הופעתה; שינויים בזמן אינדוקציה הם לעתים קרובות קשה לזהות כי אינדוקציה מתרחשת במהירות ובכך דורשת הערכה מתמשכת. המבחן בשלבים הארוך יותר לEC 50 של אינדוקציה והופעתה יכול לתת מידע על שני כניסה וליציאה מהיפנוזה. האורך הכולל של הניסוי יהיה תלוי בגודל של התוספת שבו ריכוז חומר הרדמה משתנה בכל שלב, עם בדיקות אינדוקציה + הופעה טיפוסיות שנמשכות כ -8 שעות. הקטנת גודל צעד ההרדמה סביב 50 EC הצפוי והגדלת מספרם של בעלי חיים בכל קבוצה תיתן עקומת מנת תגובה מצויד טוב יותר, אלא גם היה מאריך את הזמן הנדרש כדי להשלים את assay.

כמה התערבויות תרופתי עשויות לשנות באופן דיפרנציאלי אוורור הדקה של חיות ניסוי בהשוואה לקבוצת הביקורת שלהם. Tשלו יכול לגרום לקבוצה אחת לנשוף הרדמה נדיפים בזמן מבחן הופעתה במהירות רבה יותר מאשר אחרים, ובכך מבלבלת את התוצאות. Solt et al. מתאר שיטת אלטרנטיבה טובה לבדיקת רגישות הרדמה בתרחיש זה 35. בניסוי שלהם, methylphenidate המערכתי מועבר במהלך חשיפת isoflurane קבועה בבעלי חיים שכבר equilibrated עם הרדמה. תופעות של בלבול פוטנציאליים על אוורור דקות בכך נשללו במהלך חשיפת הרדמה מתמשכת כספיגת חומר הרדמה והפצה בתנאי מצב יציב, מאוזנות במדויק על ידי חילוף חומרים וחיסול. התאים שאנו מתארים יכולים להיות שונה בקלות עם יציאת גז חזק נוספת כדי לאפשר מעבר של צינורות לאספקת סמים תוך ורידית או תוך מוחית. צריך גם לציין כי 15 דקות המתוארות של איזון לכל ריכוז של חומר הרדמה בassay הצעד חכם עלולות שלא להספיק במקרים מסוימים. AnesthetICS עם מסיסות גבוהה יותר מאשר isoflurane, כגון halothane, ייקח זמן רב יותר כדי להגיע לריכוזים מלאים שלהם ברקמות. בעלי חיים גדולים יותר ובעלי חיים שעוברים צעדים גדולים יותר בריכוז חומר הרדמה גם עשויים לדרוש זמן רב יותר כדי לאזן. כדי לקבוע אם 15 דקות היא באמת מתאימות לאיזון, רמות רקמות הרדמה בריכוז זהה של הרדמה על שני עולה ויורדים גפיים חשיפה צריכה להיות מדודות.

במקרים בהם יכולתו של בעל חיים כדי להעבירו מבחינה פיזית או פרמקולוגית הפריעו, LORR לא יכול לשמש כמדד חלופי טוב של היפנוזה. האלטרנטיבה אמינה ביותר בשימוש נרחב היא הקלטות קליפת המוח electroencephalographic (EEG). למרות EEG עשוי להיות יכולת טובה יותר כדי לאסוף את שינויים עדינים יותר ברגישות לחומר הרדמה, הוא באופן משמעותי יקר יותר להקמה מאשר המנגנון שאנו מתארים. השתלת אלקטרודות EEG היא הליך פולשני וזמן רב, ואת היכולת obtaבנתונים מעכברים מרובים בו זמנית הוא מוגבל לעתים קרובות על ידי זמינות ציוד. יתר על כן, ניתוח של קלטות EEG הוא מושגית יותר מופשט וקשה לפרש מאשר הפלט בינארי פשוט של הערכת LORR. מסיבות אלה, בדיקות התנהגותיות כמו אלה שתוארו כאן הן בדרך כלל שיטות אפשריים יותר עבור מהירות הקרנת רגישות הרדמה. שים לב שדפוסים המעידים על עוררות והיפנוזה EEG לא יכולים לתאם גם עם התנהגות. LORR וEEG הם נקודות קצה שונות אשר שניהם צפויים לספק מידע שימושי לגבי רגישות הרדמה.

בנוסף לשינויי סמים פוטנציאליים באוורור וניידות דקות, יש כמה מגבלות אחרות לשיטות שתוארו במסמך זה. למרות LORR הוא פונדקאית סטנדרטי להיפנוזה על פני השדה, הקריטריונים והמתודולוגיה ששמשו למדידתו שונה בכל מעבדות. כמה עו"ד שצריכים לסובב עכברים במהירות קבועה על מנת להעריך את רפלקס ליישר. הערכה רציפה לוגית מצמצמת את התזמון המדויק שבה רפלקס ליישר הולך לאיבוד ו / או החזרים, אך המעשה הפך להיות שכיבה עשוי להיות מעורר יותר מאשר פשוט הנותר שכיבה. בנוסף, הערכת LORR צעד נבונה היא assay גוזל זמן שניתן להאריך עוד יותר אם 15 דקות של איזון בכל שלב הוא נמצא להיות בלתי מספק.

למרות מגבלות אלה, היישומים הפוטנציאליים עבור פרוטוקול זה להרחיב הרבה מעבר למקרים הספציפיים שהוצגנו. ברור, התערבויות תרופתיים אינן השיטה היחידה שבו רגישות הרדמה עלולה להיות שונה; נגעים ממוקדים, מומים אנטומיים, ומוטציות גנטיות עשויים כולם להיבדק באמצעות אותו EC 50 הנחישות בשלבים. מערכת הסביבה מבוקרת שהוצגה כאן יכולה לשמש כדי לספק כל סוג של תרופה בשאיפה, כגון סטרואידים, אנטיביוטיקה, או תרופות ניסיוניות. היכולת לחשוף עכברים רבים לאותו amoהאנט של תרופה בבת אחת גורם למחקרי רעלים זו הגדרה אידיאלית. בנוסף, תאים לשמש סביבת התאוששות לאחר ניתוח אידיאלית עם טמפרטורת סביבה בפיקוח, וזרימת חמצן טרי. מנגנון זה שימושי לכל מקרה בו סימנים חיוניים של בעלי חיים בסיסיים צריכים להיות במעקב ובשליטה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי R01 GM088156 וT32 HL007713-18. ברצוננו להודות ביל Pennie ומייקל קרמן מאוניברסיטת פנסילבניה מחקר חנות מכשור על עזרתם בהרכבת מנגנון רפלקס ליישר שלנו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of the Reagent Company Catalogue Number Comments
Oxygen Airgas OX300
Isoflurane Butler Schein Any volatile anesthetic of interest may be substituted
Name of Material Company Catalogue Number Comments
Mass flow meter- 10 SLPM Omega Engineering FMA-A2309
Mass flow meter- 500 SCCM Omega Engineering FMA-A2305
Anesthetic agent analyzer/gas indicator AM Bickford FI-21 Riken
Heating water pump Fisher Scientific 13-874-175
Temperature transponders BMDS IPTT-300
RF temperature reader BMDS DAS-6007

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meyer, H. H. Zur theorie der alkoholnarkose. I. Mittheilung. Welche Eigenschaft der An#228;sthetica bedingt ihre narkotische Wirkung? Naunyn Schmiedebergs Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 42, 109-137 Forthcoming.
  2. Overton, C. E. Studien über die Narkose: Zugleich ein Beitrag zur allgemeinen Pharmakologie. Fischer. Jena. (1901).
  3. Bignall, K. E. Ontogeny of levels of neural organization: the righting reflex as a model. Exp. Neurol. 3, (3), 566-573 (1974).
  4. Franks, N. P. General anaesthesia: from molecular targets to neuronal pathways of sleep and arousal. Nat. Rev. Neurosci. 9, (5), 370-386 (2008).
  5. Smith, W. Responses of laboratory animals to some injectable anaesthetics. Lab. Anim. 27, (1), 30-39 (1993).
  6. Schernthaner, A., Lendl, C., Busch, R., Henke, J. Clinical evaluation of three medetomidine--midazolam--ketamine combinations for neutering of ferrets (Mustela putorius furo)]. Berliner und Münchener tierärztliche Wochenschrift. 121, (1-2), 1-10 (2008).
  7. Mohammad, F. K., Zangana, I. K., Abdul-Latif, A. R. Medetomidine sedation in sheep. Zentralblatt für Veterinärmedizin. Reihe A. 40, (5), 328-331 (1993).
  8. Nicholls, E. A., Louie, G. L., Prokocimer, P. G., Maze, M. Halothane anesthetic requirements are not affected by aminophylline treatment in rats and dogs. Anesthesiology. 65, (6), 637-641 (1986).
  9. Tung, A., Szafran, M. J., Bluhm, B., Mendelson, W. B. Sleep Deprivation Potentiates the Onset and Duration of Loss of Righting Reflex Induced by Propofol and Isoflurane. Anesthesiology. 97, (4), 906-911 (2002).
  10. Pal, D., et al. Determination of Minimum Alveolar Concentration for Isoflurane and Sevoflurane in a Rodent Model of Human Metabolic Syndrome. Anesth. 2, (2), 297-302 (2012).
  11. Eger, E. I., Saidman 2nd,, J, L., Brandstater, B. Temperature dependence of halothane and cyclopropane anesthesia in dogs: correlation with some theories of anesthetic action. Anesthesiology. 26, (6), 764-770 (1965).
  12. Vitez, T. S., White, P. F., Eger, E. I. 2nd Effects of hypothermia on halothane MAC and isoflurane MAC in the rat. Anesthesiology. 41, (1), 80-81 (1974).
  13. Antognini, J. F. Hypothermia eliminates isoflurane requirements at 20 degrees C. Anesthesiology. 78, (6), 1152-1156 (1993).
  14. McKenzie, J. D., et al. Effects of temperature on the anaesthetic potency of halothane, enflurane and ethanol in Daphnia magna (Cladocera: Crustacea). Comp. Biochem. Physiol. C. 101, (1), 15-19 (1992).
  15. Icaza, E. E., et al. Isoflurane-Induced Changes in Righting Response and Breathing are Modulated by RGS Proteins. Anesth. Analg. 109, (5), 1500-1505 (2009).
  16. Drexler, B., Antkowiak, B., Engin, E., Rudolph, U. Identification and characterization of anesthetic targets by mouse molecular genetics approaches. Can. 2, (2), 178-190 (2011).
  17. Wafford, K. A., et al. Differentiating the role of gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptor subtypes. Biochem. 32, (Pt3), 553-556 (2004).
  18. Lakhlani, P. P., et al. Substitution of a mutant α2a-adrenergic receptor via "hit and run" gene targeting reveals the role of this subtype in sedative, analgesic, and anesthetic-sparing responses in. Proc. Natl. Acad. Sci. 94, (18), 9950-9955 (1997).
  19. Sonner, J. M., Gong, D., Eger, E. I. Naturally Occurring Variability in Anesthetic Potency Among Inbred Mouse Strains. Anesth. 91, (3), 720-726 (2000).
  20. Sun, Y., et al. High throughput modular chambers for rapid evaluation of anesthetic sensitivity. BMC Anesthesiol. 6, (1), 13 (2006).
  21. Hu, F. Y., et al. Hypnotic Hypersensitivity to Volatile Anesthetics and Dexmedetomidine in Dopamine β-Hydroxylase Knockout Mice. Anesthesiology. (2012).
  22. Kelz, M. B., et al. An essential role for orexins in emergence from general anesthesia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, (4), 1309-1314 (2008).
  23. Moore, J. T., et al. Direct Activation of Sleep-Promoting VLPO Neurons by Volatile Anesthetics Contributes to Anesthetic Hypnosis. Curr. 22, (21), 2008-2016 (2012).
  24. Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat. J. Vis. Exp. (65), e4079 (2012).
  25. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. J. Vis. Exp. (67), e2771 (2012).
  26. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents. J. Vis. Exp. (20), e880 (2008).
  27. Szymusiak, R., Alam, N., Steininger, T. L., McGinty, D. Sleep-waking discharge patterns of ventrolateral preoptic/anterior hypothalamic neurons in rats. Brain Res. (1-2), 178-188 (1998).
  28. Nelson, L. E., et al. The sedative component of anesthesia is mediated by GABAA receptors in an endogenous sleep pathway. Nat. Neurosci. 5, (10), 979-984 (2002).
  29. Li, K. Y., Guan, Y., Krnjević, K., Ye, J. H. Propofol Facilitates Glutamatergic Transmission to Neurons of the Ventrolateral Preoptic Nucleus. Anesthesiology. 111, (6), 1271-1278 (2009).
  30. Friedman, E. B., et al. A Conserved Behavioral State Barrier Impedes Transitions between Anesthetic-Induced Unconsciousness and Wakefulness: Evidence for Neural Inertia. PLoS ONE. 5, (7), e11903 (2010).
  31. Lu, J., Greco, M. A., Shiromani, P., Saper, C. B. Effect of lesions of the ventrolateral preoptic nucleus on NREM and REM sleep. J. Neurosci. 20, (10), 3830-3842 (2000).
  32. Sun, X., Whitefield, S., Rusak, B., Semba, K. Electrophysiological analysis of suprachiasmatic nucleus projections to the ventrolateral preoptic area in the rat. Eur. J. Neurosci. 14, (8), 1257-1274 (2001).
  33. Ma, J., Shen, B., Stewart, L. S., Herrick, I. A., Leung, L. S. The septohippocampal system participates in general anesthesia. J. Neurosci. 22, (2), RC200 (2002).
  34. Leung, L. S., Ma, J., Shen, B., Nachim, I., Luo, T. Medial septal lesion enhances general anesthesia response. Exp. Neurol. (2013).
  35. Solt, K., et al. Methylphenidate Actively Induces Emergence from General Anesthesia. Anesthesiology. 115, (4), 791-803 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics