Beurteilung von Veränderungen in volatilen Vollnarkose Empfindlichkeit von Mäusen nach lokalen oder systemischen pharmakologischen Intervention

Published 10/16/2013
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Medicine

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Summary

Der Verlust des Stellreflexes ist seit langem als ein Standard-Verhaltens Surrogat für Bewusstlosigkeit serviert, auch als Hypnose, bei Labortieren. Änderungen in volatilen Anästhetikums Empfindlichkeit durch pharmakologische Interventionen verursacht werden, können mit einer sorgfältig kontrollierten Hochdurchsatz-Bewertungssystems, die für die Lieferung von inhalativen Therapie angepasst werden können, erkannt werden.

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McCarren, H. S., Moore, J. T., Kelz, M. B. Assessing Changes in Volatile General Anesthetic Sensitivity of Mice after Local or Systemic Pharmacological Intervention. J. Vis. Exp. (80), e51079, doi:10.3791/51079 (2013).

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Abstract

Eine wünschenswerte Endpunkt der Vollnarkose ist der Zustand der Bewusstlosigkeit, auch als Hypnose bekannt. Definieren der hypnotischen Zustand bei Tieren ist weniger einfach, als es bei menschlichen Patienten ist. Eine weit verbreitete Verhaltens Surrogat für Hypnose in Nagetieren ist der Verlust des Stellreflexes (LORR) oder der Punkt, an dem das Tier nicht mehr auf ihre angeborenen Instinkt, die Anfälligkeit der Rückenlage zu vermeiden. Wir haben ein System, um LORR in 24 Mäuse gleichzeitig zu beurteilen, während sorgfältige Kontrolle für potenzielle verwechselt, einschließlich Temperaturschwankungen und unterschiedlichen Gasströme entwickelt. Diese Kammern ermöglichen zuverlässige Beurteilung der Narkose-Empfindlichkeit wie Latenz gemessen, um der aufrichtenden Reflex (RORR) nach einem festen Narkose Belichtung. Alternativ mit stufenweise erhöht (oder verringert) in der Anästhesie-Konzentration, die Kammern ermöglichen auch die Bestimmung der Empfindlichkeit einer Bevölkerung Induktion (oder Entstehung), gemessen durchEC 50 und Hill Hang. Schließlich können die hier beschriebenen kontrollierten Klimakammern für eine Vielzahl von alternativen Nutzungen, einschließlich inhalativen Lieferung von anderen Drogen, Toxikologie-Studien und gleichzeitigen Echtzeit-Überwachung der Vital angepasst werden.

Introduction

Allgemeine Anästhetika sind durch ihre Fähigkeit, eine reversible Zustand der Hypnose in einer Vielzahl von Arten, noch eine Erklärung, wie ein so vielfältiges Klasse von Medikamenten, können alle entlocken eine singuläre Endpunkt bleibt ungeklärt verursachen definiert. Eine Anzahl von Theorien über die Jahre gesetzt worden ist, beginnend mit dem Meyer-Overton Korrelation zwischen Anästhesie Potenz und Fettlöslichkeit, die allgemeine Membranstörungen als Grundlage für die Hypnose 1,2 vorgeschlagen. Neuere Hinweise darauf, dass Protein-Targets beeinflussen neuronalen Signalübertragung beitragen, betäubende Wirkung. Mäuse haben sich als unverzichtbar für die Erkundung Modell diese Theorien wegen der Homologie zwischen Maus und Mensch Betäubung Reaktionsfähigkeit sein. Obwohl eine Maus nicht um seine subjektive Bewusstsein unter Vollnarkose aufgefordert, bestimmte primitive Reflexe dienen als nützliche Ersatzgrößen von Nagetier-Hypnose. In den ersten Tagen nach der Geburt entwickeln Mäuse eine reflexive aufrichtenden bzw.onse, dass verhindert, dass sie passiv in Rückenlage 3 angeordnet. Die Dosis der Narkose, bei der eine Maus verliert seine Aufrichtungsreflexes korreliert gut mit der menschlichen hypnotischen Dosen 4.

Beurteilung der Verlust des Stellreflexes (LORR) hat sich zu einem weit verbreiteten Standard-Labor für die Prüfung Narkoseempfindlichkeit bei Mäusen als auch eine Vielzahl von anderen Arten, darunter Ratte, Meerschweinchen, Kaninchen, Frettchen, Schafe, Hund und 5-8. Die Dosis eines bestimmten Narkose an dem LORR für Mitglieder einer Spezies auftreten extrem konsistent, aber es kann wesentlich durch Umweltfaktoren verschoben werden. Zum Beispiel Schlafentzug Ratten empfindlicher auf sowohl flüchtige als intravenöse Anästhetika 9 und Ratten mit hohen aeroben Kapazität weniger empfindlich gegen Isofluran 10. Hypothermie hat sich ebenfalls gezeigt, daß die Dosis von zahlreichen Anästhetika für Hypnose in einem großen Spektrum von Spezies 11-14 erforderlich zu verringern. Umzuverlässig zu identifizieren, die Narkose Dosis, bei der LORR tritt in einer Gruppe von Versuchstieren, ist es entscheidend, dass die Bewertung Umwelt sorgfältig kontrolliert, um Stress zu minimieren, halten euthermia und liefern gleiche Mengen von Drogen für alle Fächer werden. Nicht überraschend, dass genetische Faktoren auch bekannt, Narkose 15-18 Empfindlichkeit verändern. Daher sollten sorgfältige Prüfung auch auf die Steuerung für genetische Hintergrund 19 gegeben werden.

Wir haben eine Vorrichtung, die identisch mit gasförmigem Anästhetikum Lieferung an jedes der 24 Mäuse gewährleistet, während eine konstante 37 º C-Umgebung entwickelt. Die transparenten, zylindrischen Design unserer Expositionskammern ermöglicht eine schnelle LORR Bewertung und einfache Integration von telemetrischen physiologische Messungen. Dieses System hat sich gezeigt, dass genau Isofluran, Halothan und Sevofluran Induktions EC 50 und die Zeit zu messen, um Entstehung in Wildtyp-Mäusen 20. Wir haben auchdieses System, um Änderungen in der Anästhesie Empfindlichkeit bei Mäusen mit genetischen Mutationen und gezielte Hypothalamus Läsionen 21-23 beobachten. Hier beschreiben wir zwei Möglichkeiten, in denen Narkoseempfindlichkeit nach einer pharmakologischen Intervention mit unserer Vorrichtung kontrollierten Umgebung geprüft werden. Steady-State-Phänotypisierung von volatilen Narkoseeinleitung und Entstehung Sensibilität erfordert 8-10 Stunden und ist somit am besten für Studien, in denen Versuchsbedingungen nicht ändern, wie beispielsweise bei chronischen oder lang wirkenden pharmakologische Interventionen zugeschnitten. Doch für kurz wirksame Behandlungen, deren Auswirkungen über die Zeit signifikant zu zerstreuen wir präsentieren ein einfaches Verfahren, um Änderungen in Aufrichtungsreflexes folgende stereotaktisch gezielte Mikroinjektionen oder intravenöse Behandlung mit Medikamenten, die wesentlichen Einfluss Betäubung Entstehung zu beurteilen. Diese Tests stellen eine kleine Auswahl der möglichen Anwendungen für diese kontrollierten Umgebung System, das für jede Anzahl von Sach angepasst werden kannjekte von einer Vielzahl von Arten, jede Art von inhalierten therapeutischen erhalten.

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Protocol

Alle Verfahren, die Tiere hier beschrieben wurden von der University of Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss Pennsylvania genehmigt worden.

1. Überblick über die Testvorrichtung

  1. Die Prüfvorrichtung 24 besteht aus klarem Acryl zylindrischen Kammern 10 cm Länge und 5 cm Durchmesser (Gesamtvolumen 200 ml). Diese Größe ist für eine typische 25 g erwachsenen Maus geeignet. Chambers haben Häfen an jedem Ende für Gas-und Auslass. Das Auslaßende ist abnehmbar, so dass die Tiere leicht in die Kammer geladen werden. Gaskanalöffnungen werden sorgfältig mit Teflonband abgedichtet, während die Gummi-O-Ring-Dichtungen verwendet werden, um das entfernbare Ende der zylindrischen Kammern abzudichten.
  2. Jede Kammer ist auf einem Gestell, die in einem Wasserbad sitzt montiert. Die Zahnstange eingepasst, so dass nur der untere Teil der Kammern (nachfolgend die Gaseinlässe) eingetaucht ist. Stabilität, das hintere Ende der Kammer auf einem Träger ruht, so daß der gesamte chamber sitzt horizontal. Dies gewährleistet, auch Kontakt von der gesamten Kammer mit dem Bad.
  3. Polyethylenschlauch verbindet einen Sauerstofftank zu einem Narkosemittelverdampfer, und dann durch einen 10 l / min Durchflussmesser. Die Rohrleitung 25 teilt sich in kleinem Durchmesser Widerstände gleicher Länge auf die Gleichstrom wird an jede der Kammern 24 und einem Agenten Analysator geliefert.
  4. Vakuumleitungen verlassen jede Kammer an dem gegenüberliegenden Ende des Gaseinlasses. Dies fördert die unidirektionale Strömung, die Rückatmung von ausgeatmeten Kohlendioxid eliminiert. Die Vakuumleitungen kombinieren auf einem Verteiler zu einer Inhouse-Saugleitung zu verbinden. Ein Pop-off-Ventil an der Hauptvakuumleitung sorgt dafür, atmosphärischen Druckbedingungen in jeder Kammer.
  5. Das Bad ist mit genug Wasser gefüllt, um voll und ganz an den Boden jeder Kammer. Das Wasser wird durch das Bad mit einer konstanten 37 º C durch eine Pumpe umgewälzt und gehalten.

2. Überprüfen Sie das System vor der Belichtung

  1. CHeck, dass die Temperatur des Wasserbades beträgt 37 ° C über das gesamte Bad.
  2. Sauerstoff strömt mit einer Rate von 5 l / min (200 ml / min pro Kammer + Agensanalysator). Tauchen Sie jede Kammer unter Wasser und suchen Blasen oder Eindringen von Wasser in die Kammer, die beide Hinweis auf Undichtigkeiten. Verschließen Sie alle Lecks vor Beginn des Experiments.
  3. Für jede Kammer, schließen Sie einen 500 ml / min Durchflussmesser in Zeile nach der Kammer, um sicherzustellen, dass Ströme werden über jede der 25 Gasleitungen ausgeglichen. Dies stellt sicher, dass die Eingangs 5 ​​l / min strömt gleichmäßig verteilt, so daß jede Kammer erhält 200 ml / min fließt. Jede Kammer die zu erwartende Förder nicht erhalten sollte seine Zu-und Abfluss Schlauch auf Verstopfungen überprüfen zu lassen.
  4. Kalibrieren Sie den Analysator Mittel zu einer Lesung von 0,00% Isofluran bei 100% Sauerstoff fließt zu gewährleisten.

3. Implant Temperatur Transponder

  1. Eine Woche vor der Gewöhnung betäuben jeder Maus mit 2% Isofluran.
  2. Sterilisieren Sie den dorsalen Halsbereich mit betadine.
  3. Injizieren eine Temperatur Transponder subkutan zwischen die Schulterblätter mit den sterilen, vorverpackten Düsennadel.
  4. Überwachung der Injektionsstelle täglich für Infektion und Migration des Transponders.

4. Gewöhnen Tiere zu Testing Chambers

  1. Vier Tage vor der ersten Bewertung, legen alle Mäuse in einzelne Kammern für 2 Stunden mit 100% Sauerstoff fließt.
  2. Wiederholen Sie Schritt 4.1 täglich für die vier Tage vor der Prüfung, um die verwirrende Auswirkungen von Stress auf Grund einer neuen Umgebung zu vermeiden.

5. Führen Sie die pharmakologische Intervention, die Sie wünschen, um Auswirkungen auf die Narkose Empfindlichkeitstest

  1. Dieser Eingriff kann eine stereotaktische Injektion in einen bestimmten Teil des Gehirns 24, intravenöse oder intraperitoneale Injektion 25 oder Abgabe eines Arzneimittels an einen bestimmten Bereich des Gehirns durch die Kanüle 26 ist.
  2. Da diese Verfahren selbst kann Betäubung Empfindlichkeit im Vergleich zu einem naiven Tier zu ändern, sollte eine angemessene Kontrollgruppe die gleiche Prozedur mit Fahrzeug-Injektionen unterziehen.
  3. Stellen Sie sicher, dass die pharmakologische Intervention hat eine entsprechend lange Wirkungsdauer, wenn Sie planen, eine stufenweise Erhöhung und / oder Verringerung Bestimmung der Narkose Empfindlichkeit wie in Schritt 6 unten tun werden, andernfalls fahren Sie mit Schritt 7 fort.

6. Bewerten Betäubungsmittel Empfindlichkeit mit dem EC 50 Schrittweise Bestimmung für Induktion und Entstehung

  1. Legen Sie jedes Tier in einzelne Kammern mit 100% Sauerstoff fließt.
  2. Stellen Sie die Isofluran-Konzentration von 0,4% * 15 min. Während der letzten 2 min aus dieser Zeit, zu bewerten Aufrichtungsreflexes jedes Tieres von sanften die Kammer, bis die Maus auf den Rücken gelegt. Der Stellreflex ist als ganz, wenn und nur wenn die Maus ist in der Lage, alle Wiederherstellungsseine Pfoten auf dem Boden der Kammer innerhalb von 2 min.
    1. * Beachten Sie, dass 0,4% Isofluran ist ein subhypnotic Dosis in C57BL/6J Mäusen. Wenn irgendwelche Mäuse verlieren ihre Aufrichtungsreflexes im ersten Schritt war die Anfangsdosis zu groß und sollte an den folgenden Tagen reduziert werden.
  3. Notieren Sie sich den Zustand des Stellreflexes für jede Maus und scannen jede Maus für Temperaturdaten. Ein Template-Datensatz ist in Tabelle 1 dargestellt.
  4. Erhöhen Sie die Isofluran-Konzentration von ~ 0,05% für 15 Minuten, und wiederholen Sie Schritt 7.2. Weiter, dies zu tun, bis alle Tiere haben ihre Aufrichtungsreflexes verloren.
  5. Optional: Wiederholen Sie den Vorgang für abnehm schrittweise Isofluran Dosen, bis alle Tiere haben ihre Aufrichtungsreflexes wieder (siehe Schritt 6.3).
  6. Um das Experiment zu beenden, schalten Sie die Isofluran und spülen das gesamte System mit 100% Sauerstoff für 15 Minuten. Dies wird helfen, Hypoxie zu verhindern, wie die Mäuse erholen, bevor sie in ihre Käfige zurückgebracht und wird die experime schützenGünter von jeder Narkose Exposition.
  7. Optional: Wenn die Anzahl der Tiere oder die Anzahl der Narkose-Konzentrationen werden durch Ressourcen-oder Zeitgründen beschränkt ist, die Kurve-fit-Parameterschätzungen insbesondere die Hill-Steigung kann unterschätzt, falsch niedrige Fehlerschätzung haben. In solchen Fällen kann es notwendig sein, die in den Schritten 6.1-6.6 auf bis zu zwei Tagen zu experimentellen Parameter der wahren Hill Steigung und ihrer entsprechenden Fehlerschätzung vollständig erhalten beschriebenen Anästhesieempfindlichkeitsmessung zu wiederholen.

7. Bewerten Kurzfristige Änderungen in der Narkose-Empfindlichkeit mit der Zeit zu Entstehung

  1. Legen Sie jedes Tier in einzelne Kammern mit 100% Sauerstoff fließt.
  2. Stellen Sie die Isofluran-Konzentration auf 1,2%, was auf die Induktion ED 99 für Wildtyp-C57BL/6J-Mäusen 20 entspricht. Aufrechterhaltung 30-60 min in Abhängigkeit von der voraussichtlichen Dauer der Wirkung der akuten Eingriff.
  3. Bestätigen LORR inalle Tiere von sanften jede Kammer, bis die Mäuse auf den Rücken gelegt.
  4. Schalten Sie Isofluran und fließen zu 100% Sauerstoff. Messen Sie die Zeit, bis jedes Tier wieder seine aufrichtenden Reflex. Dies wird durch die Anordnung aller vier Pfoten am Boden der Kammer definiert und durch die Anwesenheit von drei aufeinanderfolgenden Messungen mit einer intakten Aufrichtungsreflexes bestätigt.

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Representative Results

Figur 1 zeigt die Nützlichkeit der schrittweisen LORR Assay zur Bestimmung Langzeitwirkungen einer pharmakologischen Intervention. Ibotensäure (IBA) ist ein Agonist des Glutamat-N-Methyl-D-Aspartat (NMDA)-Rezeptor, der oft als Exzitotoxins permanenten neuronalen Läsionen verursachen verwendet wird. Hier spritzt wir 10 nl von 1% IBA bilateral in ventrolateralen praeopticus Bereich (VLPO) von C57BL/6J Mäusen eine Woche vor der Prüfung. Die Mehrheit der Neuronen in diesem Kern zeigen niedrige Brenn im Wachzustand und insbesondere ihre Tätigkeit im non-rapid eye movement sleep, rapid eye movement sleep, und mit der Exposition gegen hypnotischen Dosen von Narkosemittel 23,27-29 erhöhen. Erfolgreiche Läsionen in der VLPO Widerstand sollte dazu führen, dass Isofluran-induzierte Hypnose. An jedem zunehmende Isofluran wurde die Fraktion von Mäusen, die das Stellreflexes verloren gegen Anästhetikum-Konzentration auf einer Skala log 10 aufgetragen. Datenfür jede Gruppe von Mäusen (fahrzeug injiziert und IBA-injiziert) wurde dann Sitz mit einer sigmoidalen Dosis-Wirkungs-Kurve. Da dieser Test beginnt immer mit allen Tieren aufrecht und endet immer mit allen Tieren, die verlor der aufrichtenden Reflex, unten und oben Konstanten wurden auf 0 und 1 beschränkt sind. Die verbleibenden freien Parameter der Kurven sind die EC 50 oder die Konzentration des Narkosemittels, bei der 50% der Mäuse haben ihre Aufrichtungsreflexes verloren, und der Hill-Anstieg, die während ihrer hypnotischen Zustand Übergang der Varianz widerspiegelt. Ein F-Test wurde verwendet, um abzufragen, ob eine einzelne Induktionskurve mit gemeinsamen EG-50 und Hill Steigungsparameter am besten passen sowohl die Fahrzeug-und IBA-Gruppen oder ob getrennte Induktions Kurven mit unterschiedlichen Parametern besser zu den Daten passen. Die Freiheitsgrade in diesem Test ergeben sich aus den zugrundeliegenden Kurvenanpassung Rohdatenpunkte und damit von der Anzahl der Narkose Konzentrationen getestet, und die Anzahl von Parametern abhängen, wobei fit-EG-50 und Hill-Anstieg in diesem Fall. Schrittweise Entstehung Daten wurden analysiert und identisch, um Daten für Induktions modelliert. Beachten Sie, dass die EG-50 für die Entstehung ist fast immer niedriger als die der Induktion durch Betäubung Hysterese auch als neuronale Trägheit 30 bekannt. Im Gegensatz zu den erwarteten Ergebnissen, Tiere, die IBA in der VLPO wurde, zeigten sich keine signifikanten Unterschiede in der EG 50 oder Hill Steigung für Induktion oder Entstehung Vergleich zu Vehikel-injizierten Kontrollen (F 2,80 = 1,73 und p = 0,184 für die Induktion, F 2, 88 = 2.89 und p = 0,061 für die Emergenz). Dies zeigt, dass der Maus VLPO Neuronen sind beständig gegen Läsion mit 1% IBA, eine Tatsache, mit der Post-mortem-Histologie (nicht gezeigt) bestätigt. Lu et al. haben zuvor gezeigt, dass eine Dosis von 10% IBA ist erforderlich, um die Ratte VLPO 31, aber histologische Untersuchung der Maus VLPO Läsion nach Injektion von 10% IBA zeigte auch keine wesentkippe Zellverlust (nicht gezeigt). Die Ratte VLPO ist bekannt, dass NMDA-Rezeptoren 32 auszudrücken. Da 10% der IBA ist in der Lage, eine akute Wirkung auf Betäubung Empfindlichkeit ausüben, wenn in den VLPO injiziert (siehe Abbildung 2, die Diskussion unten), argumentiert das, dass die Maus VLPO müssen auch die NMDA-Rezeptoren für die IBA-Maßnahmen, die notwendig zu besitzen. Somit der Grund für die Diskrepanz zwischen den Arten, bleibt unklar. Erfolgreiche Maus VLPO Läsionen wurden mit einer gezielten Galanin-Saporin 23 erreicht.

Obwohl IBA nicht eine langfristige Wirkung auf die Isofluran-Empfindlichkeit haben, wenn in den VLPO injiziert, würde die akute erregenden Natur dieses Medikament voraussichtlich VLPO Neuronen stimulieren und vorübergehend zu erhöhen Narkoseempfindlichkeit werden. In Fig. 2 haben wir die Zeit emergence-Test verwendet, um einen großen spitzen Verschiebung Isofluran Empfindlichkeit unmittelbar nach der bilateralen IBA Mikroinjektion in die VLPO wie deutlich verlängert belegt demonstrierenHypnose nach Beendigung der Abgabe von Anästhetika (p <0,001). Umgekehrt wird die Mikroinjektion von IBA in die Nähe medialen Septum verursacht keine Änderung in der Zeit, im Vergleich zum Entstehen Fahrzeug-injizierten Kontrollen (p> 0,05). Dieser Befund fügt eine interessante Facette zu früheren Arbeiten zeigen, dass die Inaktivierung von diesem Kern erstreckt sich Zeit, um Entstehung 33,34. Daten für Versuchs-und Kontrollgruppen in der Zeit, Entstehung Test wurde gemittelt und mit einem One-Way-ANOVA.

Zeit Isofluran (atm%) Maus # 1 Maus # 2 Maus # 3 ...
0,4 - - - -
12.15 0,45 - X - -
12.30 0,5 - X X -
12.45 0,55 - X X
... 0,6 - X X X

. Tabelle 1 Beispiel einer Log Sheet für Langzeit-Narkoseempfindlichkeit Bewertung: Alle 15 Minuten wird die Narkose-Dosis wurde um 0,05% erhöht und Gewichtsreflexes wurde für jedes Tier bewertet. "X" bezeichnet Tiere, die ihre Stellreflexes zu einem gegebenen Zeitpunkt verloren, und "-" bezeichnet diejenigen, die ihre Aufrichtungsreflexes gehalten.

Figur 1
Abbildung 1. Beurteilung der Stellreflex eine Woche nach Ibotensäure Injection in der Ventrolateral präoptischen Nucleus: Die langfristige Narkoseempfindlichkeit Assay wurde an Mäusen entweder mit Fahrzeug oder Ibotensäure (IBA) durchgeführt injiziert in die ventrolateralen präoptischen Bereich (VLPO) eine Woche vor der Prüfung. Induktion und Entstehung Daten für jede Gruppe wurde mit einer sigmoidalen Dosis-Wirkungs-Kurve (Induktion in durchgezogenen Linien, Entstehung in gestrichelte Linien) zusammen mit dem 95%-Konfidenzintervall Bracketing die Best-Fit-Kurven (schraffierte Balken) passen. Narkosemittel-Konzentration wurde auf einer Skala log 10 aufgetragen. Overlapping 95%-Konfidenzintervalle sind in lila dargestellt. Die sigmoidale Dosis-repsonse passt sowohl für Fahrzeug-und IBA-Gruppen vorschlagen keine Hinweise auf deutliche Best-Fit-Kurven basierend auf EC 50 und Hill Hang. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Figur 2
2. Zeit bis ENach Verschmelzung lokalen Mikroinjektion von Ibotensäure: Unmittelbar vor der Bewertung erhielten die Mäuse eine Mikroinjektion von N-Methyl-D-Aspartat (NMDA)-Rezeptor-Agonist Ibotensäure (IBA) in den ventrolateralen praeopticus Kern (VLPO). Dieses Gebiet ist bekannt, dass während der Isofluran-induzierte Hypnose aktiviert werden. IBA Injektion führte zu einem akuten Anstieg der Zeit des Stellreflexes im Vergleich zu Vehikel-injizierten Kontrollen (p <0,001) zurückzukehren. Zeit bis zum Auftreten von Tieren mit IBA injiziert medialen Septum nicht von den Kontrollen unterscheiden (p> 0,05). Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

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Discussion

Obwohl Einschätzung LORR in einer einzigen Maus ist eine scheinbar einfache Aufgabe, ist es dennoch wichtig, identisch physiologischen Bedingungen zwischen den Themen, um verlässliche Daten aus einer Gruppe von Tieren sammeln zu halten. Die streng reguliert, hohe Kapazität LORR Gerät hier vorge bietet eine Möglichkeit, Experimente zu standardisieren und die Effizienz zu maximieren. Indem Sie die grundlegenden Lehren der Thermoregulation und Gleichstromverteilung, kann dieses System einfach neu erstellt und auf individuelle Experimentatoren Bedürfnisse angepasst werden. Kammergröße kann für andere Arten, wie Ratten skaliert werden, und zusätzliche Kammern können durch das Anbringen weitere Verzweigungspunkte mit dem Zulaufdruck und untergebracht werden. Alle Fächer sind gut sichtbar durch die klaren Acryl-Kammern, die es ermöglicht, Videoaufnahme-Experimente für Sekundär Post-hoc-Bestätigung der Ergebnisse macht. Das Acryl ist auch mit Funkfrequenz-Telemetriesysteme, die verwendet werden können, um Temperaturen zu überwachen kompatiblentur, Blutdruck, und Biopotentiale.

Wir präsentieren zwei verschiedene Methoden für die Beurteilung der Narkoseempfindlichkeit nach einer pharmakologischen Intervention. Sowohl die Zeit, um die Entstehung und das schrittweise Induktion Tests erfordern den Experimentator, um die Anwesenheit oder Abwesenheit des Stellreflexes erzielen. Selbst mit einer expliziten Definition von LORR, wie "nicht in der Lage, alle vier Pfoten auf dem Boden der Kammer innerhalb von zwei Minuten nach der auf den Rücken gerollt platzieren" können Beurteilung etwas subjektiv. Es ist am besten, um die gleiche Behandlung verblindete Einzelnote jedes Tier für die Dauer des Experiments, um die Konsistenz zu gewährleisten. Bei der Auswahl der Test für Narkoseempfindlichkeit Beurteilung verwenden, sollte der voraussichtlichen Dauer der Wirkung von pharmakologischen Intervention der entscheidende Faktor sein. Viele Medikamente haben eine kurze Wirkdauer, für die die Zeit, um akute Entstehung Paradigma nützliche Informationen über Narkose Empfindlichkeit in einem begrenzten Zeitraum zur Verfügung stellender Zeit. Jedoch kann ein Medikament bevorzugt beeinflussen Empfindlichkeit eines Tieres auf die Induktion von Hypnose statt Entstehung, Änderungen in der Zeit der Induktion sind oft schwer zu erkennen, weil Induktion erfolgt rasch und so erfordert eine kontinuierliche Beurteilung. Je länger schrittweise Test für EC 50 von Induktion und Entstehung können Informationen sowohl über Eingang und Ausgang aus der Hypnose zu geben. Die Gesamtlänge des Experiments hängt von der Größe des Inkrements durch die Anästhesiekonzentration in jeder Stufe geändert wird, mit typischen Induktions + Entstehung Tests dauerte etwa 8 Stunden ab. Die Verringerung der Narkose Schrittgröße um den erwarteten EC 50 und die Erhöhung der Anzahl der Tiere in jeder Gruppe eine bessere Einbau Dosis-Wirkungs-Kurve zu geben, sondern würde auch die erforderliche Zeit, um den Test abzuschließen verlängern.

Einige pharmakologische Interventionen können das Minutenvolumen der Versuchstiere im Vergleich zu ihren Kontrollen unterschiedlich verändern. Tsein könnte dazu führen, eine Gruppe, um die volatilen Anästhetikums in der Zeit bis zum Auftreten Test schneller als der andere ausatmen, so verwechseln die Ergebnisse. Solt et al. beschreiben eine gute Alternative Verfahren zur Prüfung Betäubung Empfindlichkeit in diesem Szenario 35. In ihrem Experiment wird systemischen Methylphenidat bei konstanter Isofluran Exposition bei Tieren, die bereits mit Betäubungsmittel ins Gleichgewicht gebracht wurden ausgeliefert. Mögliche Störfaktoren Auswirkungen auf die Minutenvolumen werden somit während der kontinuierlichen Exposition ausgeschlossen Betäubung als Narkose Aufnahme und Verteilung im stationären Bedingungen genau durch Metabolismus und Ausscheidung ausgeglichen. Die Kammern beschreiben wir, könnte leicht mit einem zusätzlichen gasdichten Anschluss um den Durchgang von Schläuchen für die intravenöse oder intrazerebralen Arzneimittelabgabe ermöglichen modifiziert werden. Es sei auch bemerkt, daß die beschriebene 15 min Äquilibrierungspuffer auf jede Konzentration des Anästhetikums in der schrittweisen Assay reicht möglicherweise nicht in bestimmten Fällen. Anesthetics mit einer höheren Löslichkeit als Isofluran, wie Halothan, wird länger dauern, um ihre volle Konzentration im Gewebe zu erreichen. Größere Tiere und Tiere, die in größeren Schritten Narkosekonzentration ausgesetzt sind, können auch mehr Zeit, um ins Gleichgewicht erfordern. Zu bestimmen, ob 15 min zur Equilibrierung wirklich ausreichend, sollte Narkosegewebeniveaus bei der gleichen Konzentration von Narkose sowohl auf der aufsteigenden und absteigenden Schenkel der Exposition gemessen werden.

In Fällen, in denen die Fähigkeit eines Tieres zu bewegen ist physikalisch oder pharmakologisch behindert, kann LORR nicht als eine gute Surrogat der Hypnose zu dienen. Die zuverlässigste und weit verbreitete Alternative ist kortikalen EEG (Elektroenzephalogramm)-Aufnahmen. Obwohl EEG kann besser in der Lage zu holen mehr subtile Veränderungen in Narkose Empfindlichkeit sein, ist es deutlich teurer einzurichten als wir das Gerät zu beschreiben. Implantieren von EEG-Elektroden ist eine invasive und zeitaufwendiges Verfahren, und die Fähigkeit, obtain Daten von mehreren Mäusen gleichzeitig wird häufig durch die Verfügbarkeit der Hardware beschränkt. Darüber hinaus ist die Analyse von EEG konzeptionell abstrakter und schwieriger zu interpretieren als die einfache binäre Ausgang LORR Beurteilung. Aus diesen Gründen sind Verhaltenstests wie die hier beschriebenen oft machbar Verfahren zur schnellen Screening Narkose Empfindlichkeit. Beachten Sie, dass EEG-Muster der Erregung und suggestive Hypnose kann nicht gut mit dem Verhalten korrelieren. LORR und EEG sind verschiedene Endpunkte, die beide wahrscheinlich nützliche Informationen über Narkoseempfindlichkeit.

Zusätzlich zu potentiellen Arzneimittel-induzierte Änderungen des Atemminutenvolumens und der Mobilität, gibt es mehrere andere Beschränkungen der hierin beschriebenen Verfahren. Obwohl LORR ist ein Standard-Surrogat für die Hypnose über das Feld, die Kriterien und die Methodik für die Messung verwendeten unterscheiden sich in Laboratorien. Einige plädieren, dass Mäuse, sollte bei einer konstanten Geschwindigkeit gedreht werden, um die Aufrichtungsreflexes bewerten. Kontinuierliche Bewertung logisch verengt den genauen Zeitpunkt, mit dem die Aufrichtungsreflexes verloren und / oder Renditen, jedoch kann der Akt der Rückenlage gedreht anregender als nur Rücken verbleibenden sein. Zusätzlich ist schrittweise LORR Beurteilung ein zeitraub Assay, kann weiter verlängert, wenn 15 Minuten Äquilibrierung bei jedem Schritt wird als unzureichend angesehen werden.

Trotz dieser Einschränkungen, die möglichen Anwendungen für dieses Protokoll weit über den konkreten Fällen wir vorgestellt haben. Offensichtlich sind pharmakologische Interventionen nicht das einzige Verfahren, mit dem Anästhetikum Empfindlichkeit kann verändert werden, gezielte Läsionen, anatomische Anomalien, und genetische Mutationen können alle mit der gleichen schrittweisen EC 50-Bestimmung getestet werden. Die kontrollierte Umgebung System hier vorge kann jede Art von Medikament inhaliert, wie Corticosteroide, Antibiotika oder Experimental Therapeutics liefern. Die Fähigkeit, viele Mäuse auf die gleiche amo aussetzenunt der Drogen macht auf einmal diese Einstellung ideal für Toxikologie-Studien. Zusätzlich dienen Kammern als ideale post-chirurgischen Wiederherstellungsumgebung mit geregelten Umgebungstemperatur und frischem Sauerstoff fließen. Diese Vorrichtung ist für jeden Fall, in dem grundlegende Tiervital müssen überwacht und gesteuert werden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von R01 und T32 GM088156 HL007713-18 unterstützt. Wir möchten Bill Pennie und Michael Carman danken von der Universität von Pennsylvania Forschungs-Besetzung Shop für ihre Hilfe bei der Zusammenstellung unserer Aufrichtungsreflexes Gerät.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of the Reagent Company Catalogue Number Comments
Oxygen Airgas OX300
Isoflurane Butler Schein Any volatile anesthetic of interest may be substituted
Name of Material Company Catalogue Number Comments
Mass flow meter- 10 SLPM Omega Engineering FMA-A2309
Mass flow meter- 500 SCCM Omega Engineering FMA-A2305
Anesthetic agent analyzer/gas indicator AM Bickford FI-21 Riken
Heating water pump Fisher Scientific 13-874-175
Temperature transponders BMDS IPTT-300
RF temperature reader BMDS DAS-6007

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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