Valutare Variazioni Volatile generale anestetico sensibilità dei topi dopo l'intervento farmacologico locale o sistemica

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Summary

La perdita del riflesso di raddrizzamento ha servito a lungo come un surrogato comportamentale standard per incoscienza, chiamato anche l'ipnosi, in animali da laboratorio. Alterazioni nella sensibilità anestetico volatile causati da interventi farmacologici possono essere rilevati con un sistema di valutazione ad alta produttività attentamente controllato, che può essere adattato per la fornitura di qualsiasi terapeutico inalata.

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McCarren, H. S., Moore, J. T., Kelz, M. B. Assessing Changes in Volatile General Anesthetic Sensitivity of Mice after Local or Systemic Pharmacological Intervention. J. Vis. Exp. (80), e51079, doi:10.3791/51079 (2013).

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Abstract

Un endpoint desiderabile dell'anestesia generale è stato di incoscienza, noto anche come ipnosi. Definire lo stato ipnotico negli animali è meno semplice di quanto non sia in pazienti umani. Un surrogato comportamentale ampiamente usato per ipnosi nei roditori è la perdita del riflesso di raddrizzamento (LORR), o il punto in cui l'animale non risponde più al loro istinto innato per evitare la vulnerabilità del decubito dorsale. Abbiamo sviluppato un sistema di valutazione LORR in 24 topi contemporaneamente, mentre con attenzione il controllo per potenziali confonde, comprese le fluttuazioni di temperatura e variabili flussi di gas. Queste camere consentono una valutazione affidabile della sensibilità anestetico come misurato dalla latenza ritorno del riflesso di raddrizzamento (RORR) a seguito di un'esposizione anestetico fisso. In alternativa, utilizzando aumenti graduali (o diminuisce) in concentrazione di anestetico, le camere consentono anche la determinazione della sensibilità di una popolazione a induzione (o emergenza) come misurato daEC 50 e Hill pendenza. Infine, le camere ambientali controllate qui descritti possono essere adattati per una varietà di usi alternativi, tra cui la consegna per via inalatoria di altri farmaci, studi di tossicologia e monitoraggio in tempo reale simultaneo delle funzioni vitali.

Introduction

Anestetici generali sono definite dalla loro capacità di causare uno stato reversibile di ipnosi in un'ampia varietà di specie, sei spiegazione di come tale classe diversificata di farmaci può sortire un endpoint singolare resta sfuggente. Un certo numero di teorie sono state ipotizzato nel corso degli anni, a partire dalla correlazione Meyer-Overton tra potenza anestetici e solubilità lipidica, che ha suggerito interruzioni membrana generali come base per l'ipnosi 1,2. Evidenze più recenti suggeriscono che gli obiettivi di proteine ​​che interessano la segnalazione neuronale contribuiscono agli effetti anestetici. I topi hanno dimostrato di essere un modello indispensabile per esplorare queste teorie causa della omologia tra murino e reattività anestetico umano. Anche se un mouse non può essere chiesto di sua consapevolezza personale in anestesia generale, alcuni riflessi primitivi servono misure utili surrogati di roditori ipnosi. Nei primi giorni dopo la nascita, i topi sviluppano un raddrizzamento resp riflessivaonse che impedisce loro di essere passivamente collocato in una posizione supina 3. La dose di anestesia alla quale un mouse perde il suo riflesso di raddrizzamento correla bene con dosi ipnotiche umani 4.

Valutazione della perdita del riflesso di raddrizzamento (LORR) è diventato uno standard di laboratorio ampiamente utilizzata per la prova di sensibilità anestetico in topi e una varietà di altre specie, compreso il ratto, cavia, coniglio, furetto, pecore, cani e 5-8. La dose di un determinato anestetico in cui LORR si verifica per i membri di una specie risulta costante, ma può essere spostato in modo significativo da fattori ambientali. Ad esempio, ratti privati ​​del sonno sono più sensibili ad entrambi anestetici volatili ed endovenosi 9 e ratti con elevata capacità aerobica sono meno sensibili ai isoflurano 10. L'ipotermia è stato anche dimostrato di ridurre la dose di anestetici numerose richieste per ipnosi in un ampio spettro di specie 11-14. Perper identificare in maniera affidabile la dose di anestetico in cui LORR si verifica in un gruppo di animali sperimentali, è fondamentale che l'ambiente di valutazione essere controllata attentamente per minimizzare lo stress, mantenere eutermia, e fornire la stessa quantità di farmaco a tutti i soggetti. Non sorprendentemente, i fattori genetici sono anche noti per alterare la sensibilità anestetico 15-18. Di conseguenza, un'attenta considerazione dovrebbe essere prestata al controllo di background genetico 19.

Abbiamo sviluppato un apparato che assicura identico gassoso consegna anestetico per ciascuno dei 24 topi pur mantenendo un ambiente C 37 o costante. Il design cilindrico trasparente delle nostre camere di esposizione consente per la valutazione LORR rapida e facile integrazione di misurazioni fisiologiche telemetrici. Questo sistema ha dimostrato di misurare accuratamente isoflurano, alotano e sevoflurano induzione CE 50 e il tempo di emergere in topi wild-type 20. Abbiamo usato anchequesto sistema per osservare i cambiamenti nella sensibilità anestetico nei topi con mutazioni genetiche e mirati lesioni ipotalamiche 21-23. Qui si descrive due modi in cui la sensibilità anestetico può essere valutato dopo un intervento farmacologico utilizzando il nostro apparato ambiente controllato. Steady-state fenotipizzazione dell'induzione anestetico volatile e sensibilità emergere richiede 8-10 ore ed è conseguentemente più su misura per gli studi in cui le condizioni sperimentali non cambiano, come ad esempio in interventi farmacologici croniche o lunga durata d'azione. Tuttavia, per i trattamenti di breve durata d'azione i cui effetti dissipare in modo significativo nel corso del tempo abbiamo anche presentiamo una semplice procedura per valutare le variazioni riflesso di raddrizzamento seguenti microiniezioni stereotassica mirati o trattamenti per via endovenosa di farmaci che hanno un impatto significativo emergere anestetico. Questi test rappresentano un piccolo sottoinsieme delle potenziali applicazioni di questo sistema ambiente controllato, che potrebbe essere adattato per qualsiasi numero di subjetti di una varietà di specie di ricevere qualsiasi tipo di terapia per via inalatoria.

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Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali descritti nel presente documento sono stati approvati dalla University of Institutional Animal Care ed uso commissione di Pennsylvania.

1. Panoramica dell'Apparato Testing

  1. L'apparecchiatura di prova è composto da 24 camere chiare acrilico cilindrico 10 cm di lunghezza e 5 cm di diametro (volume totale di 200 ml). Questa dimensione è appropriato per un tipico 25 g topo adulto. Chambers hanno porte ad ogni estremità per l'ingresso e l'uscita del gas. L'estremità di uscita è rimovibile in modo che gli animali possono essere facilmente caricati nella camera. Apertura delle porte del gas sono accuratamente sigillate con nastro di teflon, mentre le guarnizioni di gomma o-ring sono usati per sigillare la fine rimovibile delle camere cilindriche.
  2. Ogni camera è montata su un telaio che si trova all'interno di un bagno d'acqua. La cremagliera è montata in modo che solo la porzione inferiore delle camere (sotto i ingressi del gas) è sommerso. Per la stabilità, l'estremità posteriore della camera poggia su un supporto in modo che l'intero chamber siede in orizzontale. Questo assicura il contatto anche di tutta la camera con il bagno.
  3. Tubo di polietilene collega un serbatoio di ossigeno per un vaporizzatore di anestetico, e poi passa attraverso un L / min misuratore di flusso 10. Il tubo divide in 25 resistenze di piccolo diametro di uguale lunghezza per garantire la parità di flusso è consegnato a ciascuna delle 24 camere e di un analizzatore agente.
  4. Linee di vuoto escono ciascuna camera all'estremità opposta dell'ingresso del gas. Questo favorisce il flusso unidirezionale che elimina rirespirazione di anidride carbonica espirata. Le linee di vuoto si combinano in un collettore per il collegamento ad una linea di aspirazione in-house. Una valvola pop-off lungo la linea del vuoto centrale garantisce condizioni di pressione atmosferica all'interno di ogni camera.
  5. La vasca viene riempita con acqua sufficiente a contattare completamente il fondo di ogni camera. L'acqua viene fatta circolare attraverso il bagno e mantenuta alla temperatura costante di 37 ° C da una pompa.

2. Controllare il sistema prima esposizione

  1. Cdiamine che la temperatura del bagno d'acqua è 37 ° C per tutta la vasca.
  2. Flusso di ossigeno ad una velocità di 5 L / min (200 ml / min per camera + analizzatore agente). Immergere ciascuna camera sotto acqua e cercare bolle o ingresso di acqua nella camera, entrambi indicativi di perdite. Sigillare eventuali perdite prima di iniziare l'esperimento.
  3. Per ogni camera, collegare un ml / min misuratore di flusso 500 in linea a valle della camera di assicurarsi che i flussi sia equilibrata tra ciascuna delle linee di gas 25. Ciò garantisce che l'ingresso 5 L / min flussi saranno distribuiti uniformemente in modo che ciascuna camera riceve 200 ml / min. Ogni camera di non ricevere il flusso previsto dovrebbe avere il suo afflusso e deflusso controllato per tubi ostruzioni.
  4. Calibrare l'analizzatore agente di garantire una lettura di 0,00% isoflurano quando il 100% di ossigeno scorre.

3. Implant temperatura Transponder

  1. Una settimana prima assuefazione, anestetizzare ogni mouse con 2% isoflurano.
  2. Sterilizzare la zona del collo dorsale con Betadine.
  3. Iniettare un transponder per via sottocutanea di temperatura tra le scapole utilizzando la sterile, ago dell'iniettore preconfezionato.
  4. Controllare il sito di iniezione giornaliera per infezione e la migrazione del transponder.

4. Abituarsi Animali da test Chambers

  1. Quattro giorni prima della prima valutazione, mettere tutti i topi in camere singole per 2 ore con il 100% di ossigeno che scorre.
  2. Ripetere il punto 4.1 al giorno per quattro giorni prima valutazione per evitare gli effetti confondenti di stress a causa di un nuovo ambiente.

5. Eseguire l'intervento farmacologico che si desidera testare per gli effetti sulla anestetico Sensibilità

  1. Questo intervento può essere una iniezione stereotassica in una parte specifica del cervello 24, una iniezione endovenosa o intraperitoneale 25, o la consegna di un farmaco per una zona specifica del cervello mediante cannula 26.
  2. Poiché queste procedure stesse possono cambiare la sensibilità anestetico rispetto ad un animale ingenuo, un gruppo di controllo adeguata dovrebbe subire la stessa procedura con iniezioni di veicoli.
  3. Assicurarsi che l'intervento farmacologico ha una adeguatamente lunga durata d'azione, se avete intenzione di fare un graduale aumento e / o diminuzione determinazione della sensibilità anestetico, come indicato al punto 6 sotto, altrimenti passare al punto 7.

6. Valutare anestetico sensibilità con la graduale EC 50 Determinazione per l'induzione e Emersione

  1. Mettere ogni animale in singole camere con ossigeno al 100% che scorre.
  2. Impostare la concentrazione di isoflurano al 0,4% * per 15 min. Durante gli ultimi 2 minuti di questo periodo, valutare riflesso di raddrizzamento di ogni animale da dolci camera fino a quando il mouse è posizionato sul dorso. Il riflesso di raddrizzamento è considerato integro se e solo se il mouse è in grado di ripristinare tuttizampa al pavimento della camera entro 2 min.
    1. * Si noti che il 0,4% isoflurano è una dose subhypnotic nei topi C57BL/6J. Se eventuali topi perdono la loro riflesso di raddrizzamento al primo passo, la dose iniziale era troppo grande e deve essere ridotta nei giorni successivi.
  3. Registrare lo stato del riflesso di raddrizzamento per ogni mouse e la scansione ogni mouse per i dati di temperatura. Un template record è mostrato nella Tabella 1.
  4. Aumentare la concentrazione di isoflurano da ~ 0,05% per 15 min e ripetere il punto 7.2. Continuare a fare questo fino a quando tutti gli animali hanno perso il loro riflesso di raddrizzamento.
  5. Facoltativo: ripetere la stessa procedura per diminuire le dosi isoflurano graduale fino a che tutti gli animali hanno riacquistato la loro riflesso di raddrizzamento (vedi punto 6.3).
  6. Per terminare l'esperimento, spegnere l'isoflurano e lavare l'intero sistema con ossigeno al 100% per 15 min. Questo aiuterà a prevenire l'ipossia come i topi recuperare prima di essere tornati alle loro gabbie a casa e proteggerà il experimenter da qualsiasi esposizione anestetico.
  7. Facoltativo: se il numero di animali o il numero di concentrazioni anestetiche sono limitati a causa di vincoli di risorse o di tempo, le stime-in particolare dei parametri della curva-fit il pendio-Hill possono avere sottovalutato stima dell'errore, falsamente bassi. In questi casi, può essere necessario ripetere la misurazione sensibilità anestetico descritto nei passaggi 6,1-6,6 su un massimo di due giorni sperimentali complementare, per ottenere pienamente parametro del vero pendenza Hill e il suo corrispondente stima dell'errore.

7. Valutare i cambiamenti a breve termine in anestetico Sensibilità con il tempo di Emersione

  1. Mettere ogni animale in singole camere con ossigeno al 100% che scorre.
  2. Impostare la concentrazione di isoflurano al 1,2%, che corrisponde ad una induzione ED 99 per wild-type topi C57BL/6J 20. Mantenere per 30-60 min a seconda della durata prevista di azione dell'intervento acuta.
  3. Conferma LORR intutti gli animali di dolci ciascuna camera fino a quando i topi sono posti sulle loro spalle.
  4. Spegnere isoflurano e portata al 100% di ossigeno. Misurare il tempo fino a quando ogni animale riacquista il suo riflesso di raddrizzamento. Questo è definito dalla collocazione di tutte e quattro le zampe sul pavimento della camera e confermata dalla presenza di tre prove consecutive con un riflesso di raddrizzamento intatta.

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Representative Results

Figura 1 dimostra l'utilità del graduale saggio LORR per determinare effetti a lungo termine di un intervento farmacologico. L'acido ibotenico (IBA) è un agonista della glutamatergic N-metil-D-asparate (NMDA) che viene spesso utilizzato come excitotoxin provocare lesioni neuronali permanenti. Qui abbiamo iniettato 10 nl del 1% IBA bilateralmente nella zona ventrolaterale preottica (VLPO) dei topi C57BL/6J una settimana prima della prova. La maggior parte dei neuroni in questo nucleo esporre bassi tassi di cottura durante la veglia e in particolare ad aumentare la loro attività durante il non-sonno REM, sonno rapido movimento degli occhi, e con l'esposizione a dosi ipnotiche di anestetici generali 23,27-29. Lesioni successo nel VLPO dovrebbero causare resistenza all'ipnosi isoflurano-indotta. Ad ogni livello crescente di isoflurano, la frazione di topi che avevano perso il riflesso di raddrizzamento è stata tracciata in funzione della concentrazione di anestetico su scala logaritmica 10. Datiper ciascun gruppo di topi (veicolo-iniettato e IBA-iniettato) è stato poi forma con una curva dose-risposta sigmoidale. Poiché questo test inizia sempre con tutti gli animali montante e termina sempre con tutti gli animali che hanno perso il riflesso di raddrizzamento, inferiori e superiori costanti sono stati costretti a 0 e 1, rispettivamente. I parametri liberi delle curve rimanenti sono la CE 50, o la concentrazione di anestetico alla quale il 50% dei topi hanno perso la loro riflesso di raddrizzamento, e il pendio della collina, che riflette la varianza della popolazione durante la transizione di stato ipnotico. Un F-test è stato usato per interrogare se una curva di induzione singola con CE condiviso 50 e parametri pendio della collina meglio si adattano sia veicolo e gruppi IBA o se le curve di induzione separate con parametri distinti migliore vestibilità dei dati. I gradi di libertà in questo test provengono dai punti di dati grezzi sottostanti la forma curva e di conseguenza dipendono dal numero di concentrazioni anestetiche testati e il numero dei parametri fit-EC 50 e Hill pendenza, in questo caso. Dati emergenza Step-saggi sono stati analizzati e modellati in modo identico ai dati per l'induzione. Si noti che la CE 50 per emergere è quasi sempre inferiore a quella di induzione a causa dell'isteresi anestetico noto anche come inerzia neurale 30. Contrariamente ai risultati attesi, gli animali che hanno ricevuto IBA nel VLPO non hanno mostrato differenze significative nella CE 50 o Hill pendenza per induzione o emergere rispetto ai veicoli a iniezione controlli (F 2,80 = 1.73 ep = 0.184 per l'induzione, F 2, 88 = 2.89 ep = 0,061 per emergenza). Questo indica che i neuroni del mouse VLPO sono resistenti alla lesione con 1% IBA, un fatto confermato con l'istologia post-mortem (non mostrato). Lu et al. hanno precedentemente dimostrato che una dose di 10% IBA è necessaria alla formazione di lesioni ratto VLPO 31, ma l'esame istologico del VLPO topo dopo l'iniezione del 10% IBA anche mostrato alcun signifiperdita di cellule sopraelevazione (non mostrato). Il VLPO ratto è noto per esprimere recettori NMDA 32. Dal momento che il 10% IBA è in grado di esercitare un effetto acuto sulla sensibilità anestetico quando iniettato nel VLPO (vedi Figura 2, la discussione sotto), questo sostiene che il mouse VLPO deve anche possedere i recettori NMDA necessari per le azioni di IBA. Così la ragione della discrepanza tra le specie rimane poco chiaro. Le lesioni del mouse VLPO successo sono stati raggiunti utilizzando una mirata galanin-saporina 23.

Anche se IBA non ha un effetto a lungo termine sulla sensibilità isoflurane quando iniettato nel VLPO, la natura eccitatoria acuta di questo farmaco potrebbe essere previsto per stimolare i neuroni VLPO e transitoriamente aumentare la sensibilità anestetico. Nella figura 2, abbiamo utilizzato il tempo di prova emergere per dimostrare un grande cambiamento acuta sensibilità isoflurane immediatamente successivo bilaterale IBA microiniezione nel VLPO come dimostra nettamente prolungataipnosi dopo la cessazione della fornitura anestetico (p <0.001). Viceversa, la microiniezione di IBA nel vicino setto mediale causato alcun cambiamento nel tempo per emergere rispetto ai comandi-iniettato (p> 0.05). Questa scoperta aggiunge un aspetto interessante lavoro precedente mostra che l'inattivazione di questo nucleo si estende il tempo di emergere 33,34. I dati per i gruppi sperimentali e di controllo nel tempo a prova di emergenza è stata calcolata la media e confrontati con un one-way ANOVA.

Tempo Isoflurano (% atm) Topo # 1 Topo # 2 Topo # 3 ...
0.4 - - - -
12:15 0.45 - X - -
12:30 0.5 - X X -
12:45 0.55 - X X
... 0.6 - X X X

. Tabella 1 Esempio di un foglio di registro per lungo termine anestetico Sensibilità Assessment: ogni 15 min la dose di anestetico è aumentata del 0,05% e del riflesso di raddrizzamento è stata valutata per ogni animale. "X" indica gli animali che avevano perso il loro riflesso di raddrizzamento per un determinato punto di tempo e "-" indica quelli che hanno mantenuto la loro riflesso di raddrizzamento.

Figura 1
Figura 1. Valutazione del riflesso di raddrizzamento una settimana dopo Acido ibotenico iniezione nel Ventrolateral preottica Nucleus: Il lungo termine saggio sensibilità anestetico è stato condotto su topi con entrambi veicolo o acido ibotenico (IBA) iniettato nella zona ventrolateral preottica (VLPO) una settimana prima del test. Induzione e dati di emergenza per ogni gruppo era in forma con una curva dose-risposta sigmoidale (induzione in linee continue, emergere in linee tratteggiate) con l'intervallo di confidenza del 95% bracketing le curve di best-fit (barre ombreggiate). Concentrazione di anestetico è stata tracciata su una scala logaritmica 10. Intervalli di confidenza al 95% sovrapposti sono mostrati in viola. Il sigmoidale dose-repsonse adatta sia per veicoli e IBA gruppi suggeriscono alcuna prova per le curve di best-fit distinti in base EC 50 e Hill pendenza. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 2
Figura 2. Tempo di Eunirci Dopo microiniezione locale di acido ibotenico: Immediatamente prima valutazione, i topi ha ricevuto una microiniezione di N-metil-D-asparate (NMDA) agonista del recettore dell'acido ibotenico (IBA) nel nucleo preottica ventrolaterale (VLPO). Questa zona è conosciuta per essere attivato durante l'ipnosi isoflurano indotta. Iniezione IBA ha portato ad un aumento acuto nel tempo per tornare di riflesso di raddrizzamento rispetto ai veicoli a iniezione controlli (p <0,001). Tempo di emergenza per gli animali con IBA iniettato nel setto mediale non differivano dai controlli (p> 0,05). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

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Discussion

Sebbene valutazione di LORR in un singolo topo è un compito apparentemente semplice, è tuttavia essenziale mantenere condizioni fisiologiche identiche tra soggetti per raccogliere dati affidabili da un gruppo di animali. La strettamente regolata, apparecchi LORR ad alta capacità qui presentata offre un modo per standardizzare esperimenti e massimizzare l'efficienza. Seguendo i principi fondamentali della termoregolazione e distribuzione uguale portata, questo sistema può essere facilmente ricreato e personalizzato per soddisfare le esigenze dei singoli sperimentatori. Dimensioni camera può essere scalato per altre specie, come i ratti, e le camere supplementari possono essere ospitati attaccando più punti di filiale per l'afflusso e il vuoto. Tutti i soggetti sono facilmente visibili attraverso le camere acrilici liberi, che consente di registrare il video esperimenti di conferma post-hoc secondaria di risultati. L'acrilico è anche compatibile con i sistemi di telemetria a radiofrequenza, che possono essere utilizzati per monitorare temperatura, la pressione sanguigna, e biopotenziali.

Vi presentiamo due metodi differenti per valutare la sensibilità anestetico a seguito di un intervento farmacologico. Sia il tempo di comparsa e prove induzione stepwise richiedono lo sperimentatore per segnare la presenza o l'assenza del riflesso di raddrizzamento. Anche con una definizione esplicita di LORR, come "incapace di mettere tutte e quattro le zampe sul pavimento della camera entro due minuti di essere rotolato sulla schiena", la valutazione può essere un po 'soggettivo. E 'preferibile che il trattamento stesso individuo cieco punteggio ciascun animale per la durata dell'esperimento per garantire la coerenza. Quando si sceglie quale test da utilizzare per la valutazione della sensibilità anestesia, la durata prevista dell'effetto dall'intervento farmacologico dovrebbe essere il fattore decisivo. Molti farmaci hanno una breve durata d'azione, per la quale il tempo acuto di paradigma emergenza può fornire informazioni utili sulla sensibilità anestetico in un periodo di tempo limitatodi tempo. Tuttavia, un farmaco può preferenzialmente influenzare la sensibilità di un animale di induzione di ipnosi, piuttosto che emergere, i cambiamenti nel tempo di induzione sono spesso difficili da individuare perché l'induzione avviene rapidamente e richiede una valutazione continua così. Il test più graduale per EC 50 di induzione e di emergenza in grado di dare informazioni sia entrata e l'uscita da ipnosi. La lunghezza totale dell'esperimento dipenderà dalla dimensione dell'incremento mediante cui concentrazione anestetico viene alterato ad ogni passo, con prove tipici induzione + emergenza della durata di circa 8 ore. Diminuendo la dimensione del passo anestetico intorno il previsto CE 50 e aumentando il numero di animali in ciascun gruppo darà una curva dose-risposta più idonea, ma sarebbe anche allungare il tempo necessario per completare il saggio.

Alcuni interventi farmacologici possono differenzialmente alterare la ventilazione minuto di animali da esperimento rispetto ai loro controlli. Tsuo potrebbe causare un gruppo di espirare l'anestetico volatile nel tempo di prova emergere più rapidamente rispetto agli altri, confondendo così i risultati. Solt et al. descrivere un buon metodo alternativo per testare sensibilità anestetico in questo scenario 35. Nel loro esperimento, metilfenidato sistemica viene consegnato durante l'esposizione costante isoflurano in animali che hanno già equilibrati con anestetico. Effetti confondenti potenziali sul ventilazione minuto sono quindi escluse durante l'esposizione continua di anestetico come anestetico captazione e distribuzione in condizioni di steady-state vengono appunto bilanciate dal metabolismo ed eliminazione. Le camere che descriviamo potrebbe essere facilmente modificati con una porta a tenuta di gas supplementari per consentire il passaggio dei tubi per la somministrazione di farmaci per via endovenosa o intracerebrale. Va inoltre notato che il descritto 15 min di equilibramento per ciascuna concentrazione di anestetico nel saggio graduale potrebbe non essere sufficiente in alcuni casi. Anesteticiics con una solubilità superiore a isoflurano, come alotano, ci vorrà più tempo per raggiungere le loro concentrazioni pieno nel tessuto. Animali più grandi e gli animali sottoposti a misure più grandi concentrazioni di anestetico possono anche richiedere più tempo per equilibrare. Per determinare se 15 min è veramente adeguata per equilibrazione, i livelli tissutali anestetici alla stessa concentrazione di anestetico sia ascendenti e discendenti arti di esposizione devono essere misurate.

Nei casi in cui la capacità di un animale di muoversi è fisicamente o farmacologicamente ostacolata, LORR non può servire come una buona misura sostitutiva di ipnosi. L'alternativa più affidabile e diffuso è corticali elettroencefalografici (EEG) registrazioni. Anche se EEG può essere meglio in grado di raccogliere più sottili cambiamenti nella sensibilità anestetico, è notevolmente più costoso di istituire quanto l'apparato descriviamo. Impianto di elettrodi EEG è una procedura invasiva e richiede tempo, e la capacità di obtain dati di più topi contemporaneamente è spesso limitata dalla disponibilità di attrezzature. Inoltre, l'analisi delle registrazioni EEG è concettualmente più astratto e difficile da interpretare rispetto alla semplice uscita binaria di valutazione LORR. Per queste ragioni, test comportamentali come quelli qui descritti sono spesso metodi più fattibile per lo screening rapido sensibilità anestetico. Si noti che i modelli di EEG suggestivi di eccitazione e l'ipnosi non è necessariamente correlato bene con il comportamento. LORR e EEG sono punti finali distinti che sia probabile che forniscono informazioni utili per quanto riguarda la sensibilità anestetico.

Oltre a possibili modifiche indotte da farmaci in ventilazione minuto e la mobilità, ci sono diverse altre limitazioni per i metodi qui descritti. Anche se LORR è un surrogato standard per l'ipnosi attraverso il campo, i criteri e la metodologia utilizzati per la sua misurazione differiscono tra laboratori. Alcuni sostengono che i topi devono essere ruotati ad una velocità costante per valutare il riflesso di raddrizzamento. La valutazione continua restringe logicamente la tempistica precisa con la quale il riflesso di raddrizzamento è perso e / o rendimenti, tuttavia, l'atto di essere trasformato in posizione supina può essere più stimolante che semplicemente rimanendo in posizione supina. Inoltre, la valutazione step-wise LORR è un test che richiede tempo che può essere ulteriormente estesa se 15 minuti di equilibratura ad ogni passo si trova ad essere insufficiente.

Nonostante queste limitazioni, le potenziali applicazioni di questo protocollo si estendono ben oltre i casi specifici che abbiamo presentato. Chiaramente, interventi farmacologici non sono l'unico metodo con cui la sensibilità anestetico potrebbe essere alterato, le lesioni mirate, anomalie anatomiche, e le mutazioni genetiche possono tutti essere testati utilizzando la stessa graduale CE 50 determinazione. Il sistema ambiente controllato qui presentato può essere utilizzato per fornire qualsiasi tipo di farmaco inalato, come corticosteroidi, antibiotici o terapeutica sperimentale. La capacità di esporre molti topi allo stesso amount di droga rende subito questa configurazione ideale per gli studi di tossicologia. Inoltre, le camere servire come un ambiente di recupero post-chirurgico ideale con temperatura ambiente regolamentato e il flusso di ossigeno fresco. Questo apparecchio è utile per qualsiasi istanza in cui devono essere monitorati e controllati i segni vitali di base degli animali.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da GM088156 R01 e T32 HL007713-18. Vorremmo ringraziare Bill Pennie e Michael Carman presso la University of Pennsylvania Research Strumentazione Shop per il loro aiuto nel montaggio nostro apparato riflesso di raddrizzamento.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of the Reagent Company Catalogue Number Comments
Oxygen Airgas OX300
Isoflurane Butler Schein Any volatile anesthetic of interest may be substituted
Name of Material Company Catalogue Number Comments
Mass flow meter- 10 SLPM Omega Engineering FMA-A2309
Mass flow meter- 500 SCCM Omega Engineering FMA-A2305
Anesthetic agent analyzer/gas indicator AM Bickford FI-21 Riken
Heating water pump Fisher Scientific 13-874-175
Temperature transponders BMDS IPTT-300
RF temperature reader BMDS DAS-6007

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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