आकार में बदलाव और ठोस राज्य nanopores के शोर को कम

Engineering
 

Summary

Biomolecular स्थानान्तरण प्रयोगों के लिए समाधान में ठोस राज्य nanopores तैयार करने के लिए एक पद्धति को प्रस्तुत किया है. उच्च बिजली क्षेत्र दालों की कमी को लागू करके, nanopore व्यास controllably subnanometer परिशुद्धता के साथ विस्तारित किया जा सकता है और अपने बिजली के शोर विशेषताओं में काफी सुधार हुआ. यह प्रक्रिया प्रयोगात्मक शर्तों के तहत मानक प्रयोगशाला के उपकरण का उपयोग कर बगल में किया जाता है.

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Beamish, E., Kwok, H., Tabard-Cossa, V., Godin, M. Fine-tuning the Size and Minimizing the Noise of Solid-state Nanopores. J. Vis. Exp. (80), e51081, doi:10.3791/51081 (2013).

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Abstract

ठोस राज्य nanopores ऐसे न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन के रूप में 1 एकल biomolecules के लक्षण वर्णन के लिए एक बहुमुखी उपकरण के रूप में उभरा है. हालांकि, एक पतली इन्सुलेट झिल्ली में एक nanopore की रचना चुनौती बनी हुई है. विशेष केंद्रित इलेक्ट्रॉन बीम सिस्टम से जुड़े निर्माण विधियों अच्छी तरह से परिभाषित nanopores उत्पादन कर सकते हैं, लेकिन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध झिल्ली में विश्वसनीय और कम शोर nanopores की उपज 2,3 कम रहता है और आकार नियंत्रण 4,5 nontrivial है. यहाँ, ठीक धुन करने के लिए उच्च बिजली क्षेत्र के आवेदन इष्टतम कम शोर प्रदर्शन सुनिश्चित करते हुए nanopore के आकार का प्रदर्शन किया है. उच्च बिजली के क्षेत्र की ये कम दालों एक प्राचीन बिजली के संकेत उत्पादन और लंबे समय तक निवेश पर subnanometer परिशुद्धता के साथ nanopores के विस्तार के लिए अनुमति देने के लिए उपयोग किया जाता है. इस विधि है की उपज और reproducibility में सुधार, मानक प्रयोगशाला के उपकरण का उपयोग कर एक जलीय वातावरण में बगल में किया जाता हैबदबूदार राज्य nanopore निर्माण.

Introduction

जैविक और ठोस राज्य nanopores एक अणु स्तर 1 में Biomolecular analytes संवेदन का एक साधन प्रदान करते हैं. व्यक्तिगत nanopores आम तौर पर दो तरल जलाशयों के बीच पारित करने के लिए ईओण वर्तमान के लिए ही नाली प्रदान करने, पतली इन्सुलेट झिल्ली में एम्बेडेड रहे हैं. बड़े पैमाने पर कल्टर काउंटर के सिद्धांतों का उपयोग, nanopore प्रयोगों वे electrophoretically एक बाहरी बिजली क्षेत्र की उपस्थिति में एक nanopore के माध्यम से संचालित कर रहे हैं के रूप में वसूल biomolecules की लंबाई, आकार, प्रभारी और रचना का निर्धारण करने के लिए ईओण वर्तमान में परिवर्तन से संबंधित हैं.

ऐसे α-hemolysin रूप में जैविक nanopores आम तौर पर अधिक से अधिक संवेदनशीलता और कम शोर गुण 3 की पेशकश करते हैं, का समर्थन लिपिड bilayer उनकी प्रयोज्यता सीमित, नाजुक और निश्चित आकार की है. ठोस राज्य nanopores, दूसरी ओर, पतली (10-50 एनएम) सिलिकॉन नाइट्राइड या सिलिकॉन ऑक्साइड झिल्ली में निर्मित कर रहे हैं और विभिन्न siz का बनाया जा सकता हैतों, आसानी वेफर पैमाने टेक्नोलॉजीज 6,7 के साथ एकीकृत, और अधिक मजबूत कर रहे हैं, प्रयोगात्मक स्थितियों की एक व्यापक श्रृंखला के लिए अनुमति हो. इन फायदों के बावजूद, ठोस राज्य nanopore टेक्नोलॉजीज biomolecular पढ़ाई के लिए उनकी उपयोगिता है कि सीमा कई व्यावहारिक कमियों से ग्रस्त हैं. Nanopore आकार के नियंत्रण संभव है, यह विशेष उपकरणों और कुशल कर्मियों की जरूरत पड़ेगी, प्राप्त करने के लिए आमतौर पर महंगी और श्रमसाध्य है. उदाहरण के लिए, ध्यान केंद्रित आयन बीम द्वारा drilled nanopores हाल ही में एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (SEM) 5 में विशिष्ट प्रयोगात्मक शर्तों के तहत हटना करने के लिए दिखाया गया है. दूसरे दृष्टिकोण में, ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) द्वारा drilled nanopores बीम की स्थिति और जलीय सॉल्वैंट्स 8 के लिए बाद में जोखिम के आधार पर विस्तार या सिकुड़ कर सकते हैं. Nanopore के आकार रासायनिक उपचार के बाद बदल सकते हैं या कर सकते हैं के रूप में इन मामलों में, nanopore आकार के प्राप्त सीमा, सीमित नियंत्रण के लिए मुश्किल और भी अविश्वसनीय हैएक विशेष तरल वातावरण 9 में डूबे हैं.

ठोस राज्य nanopores के माध्यम से आयनिक वर्तमान में भी उच्च शोर से ग्रस्त कर सकते हैं, जिनमें से सूत्रों nanopore साहित्य 2,3,10,11 में एक तीव्रता से जांच की विषय हैं. विभिन्न तरीकों बिजली के शोर को कम करने के लिए प्रस्तावित किया गया है, विश्वसनीय, स्थिर कम शोर nanopores की उपज आम तौर पर कम है. ड्रिलिंग और इमेजिंग के दौरान कारबोनकेयस अवशेषों का बयान अक्सर पूरा गीला एक चुनौती बना रही है और 12 को हटाने के लिए मुश्किल हो सकता है कि nanobubbles के गठन के कारण, बिजली के संकेत गुणवत्ता पर हानिकारक प्रभाव हो सकता है. इसके अलावा, analyte अणुओं से nanopore के clogging संकेत गुणवत्ता प्रतिपादन आगे प्रयोग 13,14 के लिए व्यर्थ pores degrades. कुल मिलाकर, इन प्रभावों को बहुत कार्यात्मक nanopore उपकरणों की उपज को कम करने और ठोस राज्य nanopore अनुसंधान के साथ जुड़े लागत में वृद्धि.

आवेदन0.15-0.3 वी / एनएम की सीमा में उच्च बिजली क्षेत्र का उत्पादन करने के लिए एजी / AgCl इलेक्ट्रोड के साथ एक वोल्टेज की tion इन चुनौतियों के लिए एक आश्चर्यजनक सरल समाधान प्रस्तुत करता है. कम वोल्टेज दालों, एकल अणु के अध्ययन के लिए एक स्वच्छ, कम शोर nanopore सतह आदर्श की चक्रीय आवेदन के माध्यम से उत्पादन किया जाता है. उच्च बिजली क्षेत्र के लिए दीर्घ विवरण nanopore व्यास में वृद्धि के परिणामस्वरूप ताकना दीवार गठन झिल्ली सामग्री को हटाने शुरू की. इस विकास ठीक नाड़ी शक्ति और अवधि ट्यूनिंग द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है. अणुओं nanopore सतह को सोखना के रूप में वर्तमान निशान के कारण nanopore के clogging के लिए एक प्रयोग के दौरान अधिक नीचा के रूप में, इस प्रक्रिया अन्यथा खारिज कर दिया गया होता कि भरा उपकरणों को ठीक करने के लिए दोहराया जा सकता है. जैसे, कार्यात्मक nanopores की उपज आगे ही डिवाइस कई बार उपयोग करने की क्षमता की वृद्धि हुई है. यह तेजी से प्रयोगात्मक तहत तरल में किया जाता है के रूप में इस विधि के कई लाभ प्रदान करता हैशर्तों, केवल मानक प्रयोगशाला उपकरणों की आवश्यकता है सॉफ्टवेयर के साथ स्वचालित किया जा सकता है, और 95% से अधिक की उपज के साथ कार्यात्मक उच्च गुणवत्ता nanopores पैदा करता है.

Protocol

1. Nanopore निर्माण और साफ सफाई

नोट: एक nanopore एक इन्सुलेट झिल्ली में मौजूद है एक बार चरण 2 में वर्णित के रूप में, यह सीधे आगे की प्रक्रिया या सफाई के बिना तरल सेल में रखा जा सकता है. या ऑक्सीजन प्लाज्मा 2 के लिए जोखिम: यह प्रयोगों के बीच contaminants के निशान को दूर करने के लिए आवश्यक है हालांकि, अगर nanopore चिप्स पिरान्हा समाधान 3,15,16 (एच 2 2 हे 03:01 एच 2 एसओ 4) का उपयोग कर साफ किया जा सकता. जैसे, पिरान्हा समाधान के लिए जोखिम के precleaning आवश्यक नहीं है, तो निम्नलिखित प्रोटोकॉल में 1.2-1.9 वैकल्पिक हैं दोहराएँ.

  1. देगास 40 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक sonicator में शून्य के नीचे रखकर विआयनीकृत (डी) पानी फ़िल्टर
  2. ध्यान से 3 मिलीग्राम 1 मिलीलीटर हाइड्रोजन पेरोक्साइड द्वारा पीछा सल्फ्यूरिक एसिड जोड़कर एक 10 मिलीलीटर बीकर में पिरान्हा समाधान तैयार करें. पिपेट में refluxing द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं. चेतावनी: पिरान्हा समाधान अत्यंत खतरनाक है. कृपया टा सभी सावधानियों के.
  3. एसिड प्रतिरोधी चिमटी का प्रयोग, ध्यान पूरी तरह से चिप डूब और सतह पर तैरती यह से बचने के लिए पिरान्हा समाधान में बढ़त पहले nanopore युक्त झिल्ली चिप डालने.
  4. फ़िल्टर्ड पानी में अच्छी तरह चिमटी कुल्ला.
  5. 90 डिग्री सेल्सियस के लिए एक गर्म थाली पूर्व निर्धारित पर बीकर प्लेस और यह कम से कम 30 मिनट के लिए साफ करने के लिए अनुमति देते हैं.
  6. ध्यान से एक साफ ग्लास पिपेट का उपयोग बीकर से पिरान्हा समाधान निकालने और पानी की प्रचुर मात्रा में त्यागें.
  7. एक साफ ग्लास विंदुक का प्रयोग कुल्ला करने बीकर में 1.1 कदम से degassed विआयनीकृत पानी के 5 मिलीलीटर जोड़ें. पानी निकालें और कम से कम 5x दोहराने.
  8. ध्यान से साफ तेज नोक चिमटी का उपयोग बीकर से nanopore चिप हटा दें. Nanopore झिल्ली बहुत नाजुक है के रूप में अत्यधिक सावधानी से संभालना.
  9. धीरे एक Aspirator का उपयोग कर अपनी बढ़त को सक्शन लगाने से चिप सूखी. उपयोग के लिए तैयार है जब तक एक स्वच्छ पेट्री डिश में चिप की दुकान.
ve_title "> 2. Nanopore बढ़ते

  1. 20% नाइट्रिक एसिड के घोल में रखने और 10 मिनट के लिए उबलते द्वारा Teflon nanopore सेल (चित्रा 1) साफ करें. चेतावनी: सभी आवश्यक व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण का उपयोग करें और देखभाल के साथ एसिड संभाल.
  2. ध्यान से 10 मिनट के लिए उबलते डि पानी में नाइट्रिक एसिड और जगह से सेल को हटा दें.
  3. नाइट्रिक एसिड का पूरी तरह हटाने सुनिश्चित करने के लिए एक अतिरिक्त 10 मिनट के लिए डि पानी में सेल उबाल लें. गर्म थाली से बीकर निकालें और यह कमरे के तापमान को शांत करने के लिए अनुमति देते हैं.
  4. बीकर से सेल निकालें और फ़िल्टर्ड हवा या 2 एन के साथ सूखी झटका. एक साफ पेट्री डिश में सेल स्टोर.
  5. देगास 40 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक sonicator में शून्य के नीचे रखकर (पीएच 8 में HEPES के साथ बफर) KCl समाधान फ़िल्टर्ड
  6. कम से कम 10 मिनट के लिए इथेनॉल में sonicating द्वारा प्रत्येक nanopore चिप के लिए स्वच्छ दो सिलिकॉन elastomer गास्केट.
  7. एक साफ इलास्टोमेर गैसकेट जा रहा carefu पर nanopore चिप रखेंगैस्केट खोलने के साथ झिल्ली खिड़की संरेखित करने के लिए एल. प्लेस और चिप के ऊपर एक दूसरा गैसकेट संरेखित.
  8. साफ nanopore सेल के एक आधे के जलाशय इनलेट पर चिप और गास्केट रखें. जगह में अन्य आधा पंगा लेना सेल इकट्ठे. Nanopore सेल घटकों के एक विस्फोट देखें चित्र 1 में दिखाया गया है.
  9. सेल जलाशयों में इथेनॉल pipetting और कुछ बुलबुले inlets बाहर निकलने के लिए देखा जाता है जब तक एक निर्वात चैम्बर में रखकर nanopore चिप गीले.
  10. फ़िल्टर किया KCl समाधान degassed कम से कम 3 मिलीलीटर के साथ जलाशयों निस्तब्धता से इथेनॉल निकालें. एक Aspirator का उपयोग अतिप्रवाह दूर करने के लिए ध्यान रखना.

3. Nanopore विशेषता

  1. विद्युत परिरक्षित प्रयोगात्मक सेटअप में nanopore सेल प्लेस और प्रत्येक जलाशय में एजी / AgCl इलेक्ट्रोड जगह. इस सेटअप कर रहे हैं, जो बाहरी बिजली की आपूर्ति और वर्तमान एम्पलीफायर के अपवाद के साथ चित्रा 2 में दिखाया गया है कि इसी तरह हैएक कम शोर प्रतिरोधक प्रतिक्रिया एम्पलीफायर के साथ बदल दिया.
  2. वोल्टेज दबाना मोड में कम शोर एम्पलीफायर का उपयोग, 200 एम वी -200 एम वी से व्यापक और चतुर्थ विशेषताओं रिकॉर्ड क्षमता लागू होते हैं.
  3. समाधान 17 में इसका व्यास की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जो nanopore प्रवाहकत्त्व, प्राप्त करने के लिए चतुर्थ वक्र फिट. गणना व्यास मंदिर इमेजिंग से उम्मीद की तुलना में काफी छोटा है, तो ताकना पूरी तरह से गीला नहीं होने की संभावना है और / या मलबे या संक्रमण होता है.
  4. Nanopore भर में एक 200 एम वी संभावित लागू करें और 30 सेकंड के लिए आयनिक मौजूदा रिकॉर्ड है.
  5. ईओण वर्तमान की एक शक्ति वर्णक्रमीय घनत्व (PSD) विश्लेषण करते हैं और nanopore के बिजली के शोर विशेषताओं यों को एकीकृत. शोर 5 kHz बैंडविड्थ पर 15 पीए आरएमएस के ऊपर है, तब ध्यान में लीन होना पूरी तरह से गीला नहीं होने की संभावना है और / या संक्रमण होता है और मज़बूती से प्रयोग में इस्तेमाल नहीं किया जा सकता.

4. उच्च विद्युत धिक का प्रयोग कंडीशनिंग Nanoporesएलडीएस

नोट: चतुर्थ वक्र प्रदर्शित विषमता या कम से भी उम्मीद प्रवाहकत्त्व उत्पन्न, या वर्तमान ट्रेस कम आवृत्तियों पर अस्थिरता और उच्च शोर स्तर से पता चला है, यह ताकना पर किसी भी संक्रमण को दूर करने के लिए उच्च बिजली क्षेत्रों के साथ nanopore हालत के लिए आवश्यक है सतह और / या ताकना गीला. इस विधि झिल्ली समाई या माप में इस्तेमाल वर्तमान एम्पलीफायर के इनपुट के लिए युग्मित किसी भी परजीवी समाई की वजह से उच्च आवृत्ति शोर को प्रभावित नहीं करता है, (जो भी 1 / शोर कहा जाता है) कम आवृत्ति शोर 18 बहुत कम हो सकता है. इस कंडीशनिंग प्रदर्शन किया सेटअप का एक योजनाबद्ध चित्रा 2 में दिखाया गया है.

  1. पैच दबाना एम्पलीफायर से इलेक्ट्रोड डिस्कनेक्ट.
  2. पैदा करने में सक्षम एक कंप्यूटर नियंत्रित बिजली की आपूर्ति करने के लिए इलेक्ट्रोड की एक कनेक्ट> 6 वी (> 0.2 वी / एनएम बिजली क्षेत्र का यहां इस्तेमाल किया 30 एनएम मोटी झिल्ली के लिए शक्ति) और एक ई करने के लिए अन्यवास्तविक समय में निगरानी की जा सकती है कि मौजूदा एम्पलीफायर xternal.

    नोट: उच्च बिजली क्षेत्र के आवेदन विभिन्न झिल्ली सामग्री और मोटाई में nanopores हालत के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. जब तक अन्यथा कहा दोनों 30 एनएम और 10 एनएम झिल्ली यहां चर्चा कर रहे हैं, वहीं वर्णित voltages 30 एनएम मोटी झिल्ली के लिए इस्तेमाल किया उन लोगों के लिए देखें.

  3. कम से कम 5 सेकंड के लिए nanopore भर में 400 एम वी (माप वोल्टेज) की एक संभावित अंतर लागू करें.
  4. Nanopore के प्रवाहकत्त्व निर्धारित करने के लिए डेटा की अंतिम 1 सेकंड से मतलब वर्तमान मूल्य की गणना. सबसे अधिक संभावना ज्यामिति पर आधारित सॉफ्टवेयर और पसंद के nanopore प्रवाहकत्त्व मॉडल का उपयोग कर स्वचालित रूप से किया जाना चाहिए जो इस प्रवाहकत्त्व पर आधारित nanopore के व्यास की गणना. यह चतुर्थ वक्र से मापा व्यास के अनुरूप होना चाहिए.
  5. एक 5 सेकंड माप अवधि के बाद 0.2 वी / एनएम के एक बिजली के क्षेत्र का निर्माण करने के nanopore भर में 6 वी की एक 200 मिसे नाड़ी (गीला वोल्टेज) लागू करें400 एम वी पर. फिर, डेटा की अंतिम 1 सेकंड का उपयोग nanopore के एक व्यास की गणना और nanopore पूरी तरह गीला है कि यह सुनिश्चित करने के लिए मंदिर माप से उम्मीद मूल्य के साथ तुलना करें. यदि आवश्यक हो, कई बार दोहराएँ.
  6. यदि आवश्यक हो, माप अवधि के दौरान वर्तमान संकेत तक बढ़ती वोल्टेज के साथ उच्च बिजली क्षेत्र दालों के आवेदन दोहराने स्थिर और उम्मीद प्रवाहकत्त्व दिखा है. यह काफी बड़ा आकार देखने या तेजी से nanopore नुकसान पहुंचा सकता है, क्योंकि यह 10 वी (यानी> 0.3 वी / एनएम) को पार करने की सिफारिश नहीं है.

5. उच्च विद्युत क्षेत्र का उपयोग Nanopores विस्तार

नोट: nanopore के व्यास एक विशेष biomolecular सेंसिंग एप्लीकेशन के लिए अपनी कार्यक्षमता का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण है. इस प्रयोजन के लिए एक nanopore उचित व्यास को साफ और गीला करने के लिए इस्तेमाल किया ही स्थापना के साथ हासिल की है जब तक एक मंदिर उच्च बिजली क्षेत्र लागू करने के द्वारा एक वांछित आकार के लिए विस्तारित किया जा सकता है का उपयोग कर बनायाnanopore (चित्रा 2).

  1. भाग 4 में उसी के रूप में इलेक्ट्रॉनिक विन्यास का उपयोग करना, एक व्यास माप प्राप्त करने के लिए ताकना भर में एक 200-500 एम वी पूर्वाग्रह लागू होते हैं. एक चतुर्थ वक्र ढाले से भी कम सटीक है, जबकि एक एकल बिंदु माप मोटे तौर पर तेजी से nanopore आकार का अनुमान किया जा सकता है.
  2. 400 एम वी पर कम से कम 5 सेकंड की एक माप अवधि के बाद nanopore भर में 8 वी के एक 2 सेकंड पल्स लागू करें. नई व्यास की गणना आम तौर पर nanopore आकार में एक बहुत छोटे से वृद्धि (<0.1 एनएम) दिखाएगा.
  3. सीटू और nanopore व्यास में वृद्धि का वास्तविक समय माप में प्राप्त करने के लिए वृद्धि और माप voltages के बीच बारी, cyclically इस प्रक्रिया को दोहराएं.
  4. तेजी से विकास दर वांछनीय है, तो ताकना 0.03 एन एस / एस से चुनाव आयोग & # लेकर प्रवाहकत्त्व में वृद्धि की दर के साथ मायनों में इजाफा के रूप में आम तौर पर गति देगा 10 वी. ग्रोथ अप करने के लिए संवर्द्धित लागू वोल्टेज की भयावहता वृद्धि160, 10 के एन एस / सेक, बिजली क्षेत्र की nanopore, ताकत और इलेक्ट्रोलाइट समाधान गुणों के आकार पर निर्भर करता है.
  5. वांछित व्यास तक पहुँच जाता है, उच्च बिजली क्षेत्र के आवेदन रोक. इस कंप्यूटर प्रोग्राम का उपयोग कर स्वचालित रूप से किया जा सकता है.
  6. इलेक्ट्रोड के लिए पैच दबाना एम्पलीफायर फिर से कनेक्ट करें.
  7. ऊपर 3.5 - nanopore के व्यास की पुष्टि करें और कदम 3.2 में के रूप में कम शोर मौजूदा संकेतों को सत्यापित करने के लिए 200 एम वी पर नए चतुर्थ और वर्तमान ट्रेस डेटा मोल. यदि आवश्यक हो, कंडीशनिंग और विस्तार प्रोटोकॉल (4.1-5.5 कदम) दोहराएँ.

6. डीएनए स्थानान्तरण

  1. पिछले एक biomolecular नमूना जोड़ने के लिए, जलाशय में कोई संदूषण है कि यह सुनिश्चित करने के लिए एक नियंत्रण प्रयोग करते हैं. कोई मौजूदा blockades 2 मिनट के बाद पता चला रहे हैं, यह सत्यापित करने के लिए किसी भी नमूने के अभाव में 150-300 एम वी के एक आवेदन के संभावित तहत एक वर्तमान ट्रेस मोल.
  2. को λ डीएनए (48.5 KBP डबल असहाय) जोड़ें <उन्हें> 0.5-2 एनजी / μl के अंतिम एकाग्रता के लिए सीआईएस जलाशय. जलाशय भर नमूना की सजातीय वितरण सुनिश्चित करने के लिए कम से कम 10 सेकंड के लिए पिपेट द्वारा धीरे भाटा.
  3. एक 30 एनएम मोटी nanopore के लिए, ट्रांस जलाशय के लिए 150-300 एम वी का एक संभावित पूर्वाग्रह लागू करते हैं और nanopore के माध्यम से गुजर आयनिक मौजूदा उपाय. बहुत ही कम स्थानान्तरण घटनाओं के लिए, यह एक अपेक्षाकृत उच्च कम पास छानने आवृत्ति (100 kHz) के साथ एक उच्च आवृत्ति (250 kHz या अधिक) पर नमूने के लिए वांछनीय है.
  4. अणुओं nanopore के माध्यम से सरकाना के रूप में क्षणिक वर्तमान blockades पता लगाने के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग कर आयनिक मौजूदा मॉनीटर. आणविक स्थानान्तरण की आयनिक वर्तमान निशान रुकावट गहराई, अवधि और ब्याज का नमूना के बारे में जानकारी करने के लिए अनुमान आवृत्ति निर्धारित करने के लिए विश्लेषण किया जा सकता है. Translocating अणुओं के बारे में जानकारी भी जाना जाता है इसके विपरीत, यदि, यह डेटा nanopore खुद के गुणों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Representative Results

इस अध्ययन में इस्तेमाल nanopores 30 एनएम या 10 एनएम मोटी सिलिकॉन नाइट्राइड झिल्ली खिड़कियों में drilled थे. वर्णित प्रोटोकॉल विभिन्न सामग्री का ठोस राज्य nanopores किसी भी विधि का उपयोग कर निर्मित करने के लिए लागू किया जा सकता है, वे आमतौर पर पहले से स्थापित प्रोटोकॉल 11,14 का उपयोग मंदिर द्वारा drilled हैं. मंदिर द्वारा drilled Nanopores व्यास में 4-8 एनएम (चित्रा 2) के बीच आम तौर पर कर रहे हैं. दोनों 30 एनएम और 10 एनएम मोटी झिल्ली घुड़सवार और ऊपर प्रोटोकॉल का उपयोग वातानुकूलित किया जा सकता है, वर्णित वोल्टेज पूर्वाग्रहों जब तक अन्यथा कहा 30 एनएम मोटी झिल्ली के लिए आवश्यक उन देखें. विभिन्न आकार की झिल्ली के लिए, लागू वोल्टेज nanopore अंदर 0.15-0.3 वी / एनएम के रेंज में एक बिजली के क्षेत्र उत्पन्न करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए.

चित्रा 3a एक 30 एनएम मोटी झिल्ली में एक 10 एनएम nanopore के दो विशिष्ट प्रवाहकत्त्व निशान से पहले और उच्च बिजली क्षेत्रों के साथ उपचार के बाद पता चलता है. एक नव डी बढ़ते परnanopore rilled,,, एक अस्थिर और शोर आयनिक वर्तमान संकेत प्राप्त करने के लिए कम आवृत्ति अस्थिरता के एक उच्च स्तर का प्रदर्शन करने की संभावना को आमतौर पर उच्च है. चित्रा 3 ए में दिखाया nanopore इस व्यवहार पर प्रकाश डाला गया. इसके प्रवाहकत्त्व के कारण अधूरा गीला करने के लिए सबसे अधिक संभावना है इसके आकार के एक nanopore के लिए उम्मीद की तुलना में काफी कम है. 8 वी दालों (2 सेकंड की अवधि का 90 दालों) द्वारा उत्पादित परिमाण में 0.27 वी / एनएम के उच्च बिजली क्षेत्र के आवेदन पर, nanopore पूरी तरह गीला हो जाता है और बाद में व्यास में 21 एनएम के लिए बढ़ा है. इस बिंदु पर, ताकना कम शोर गुणों के साथ एक स्थिर प्रवाहकत्त्व दर्शाती है. इसी तरह nanopores में शोर के मात्रात्मक विश्लेषण चित्रा 3 बी में शक्ति वर्णक्रमीय घनत्व भूखंडों के रूप में दिखाया गया है. unwet और / या भरा हुआ pores के कम आवृत्ति शोर आयाम प्रयोग में व्यर्थ उन्हें प्रतिपादन, (> 20 पीए आरएमएस) बहुत अधिक है. उच्च बिजली क्षेत्र, कम आवृत्तियों पर शोर शक्ति (<10 kHz) के साथ कंडीशनिंग diminis है परअप करने के लिए 3 परिमाण के आदेश और कम शोर प्रयोगों के लिए तैयार द्वारा hed.

लागू संभावित विस्तार और कम बिजली क्षेत्र माप अवधि के लिए उच्च बिजली क्षेत्रों के बीच स्पंदित है के रूप में चित्रा -4 ए एक ठेठ वर्तमान माप से पता चलता है. प्रत्येक बाद नाड़ी के बाद, (nanopore प्रवाहकत्त्व आईई) माप वोल्टेज में nanopore के माध्यम से परिणामी आयनिक वर्तमान एक निश्चित राशि से बढ़ जाती है. यह व्यास डी प्रभावी लंबाई एल EFF के बेलनाकार ज्यामिति होने के रूप में nanopore approximating, चालकता σ का एक समाधान में अपनी प्रवाहकत्त्व जी से अनुमान लगाया जा सकता है के रूप में nanopore, आकार में वृद्धि हुई है कि यह दर्शाता है. विभिन्न अन्य मॉडल अपने ज्यामिति 17,19-21 को nanopore प्रवाहकत्त्व संबंधित के लिए मौजूद हैं, एक ज्यामितीय अवधि और एक का उपयोग प्रतिरोध अवधि को शामिल किया गया है जो निम्न संबंध, उच्च नमक में मंदिर drilled nanopores के लिए वैध साबित किया गया हैdsDNA स्थानान्तरण 17,22 के लिए ब्याज की व्यास की एक विस्तृत श्रृंखला पर सांद्रता.

वांछित व्यास तक पहुँच गया है, एक बार प्रक्रिया स्वचालित रूप से सॉफ्टवेयर द्वारा बंद कर दिया है. चित्रा 4 बी में दिखाया गया है, जिसके परिणामस्वरूप nanopore व्यास फिर, सटीक चतुर्थ माप का उपयोग करने की पुष्टि की जा सकती है.

यह उच्च बिजली क्षेत्र का उपयोग कर इलाज nanopores पूरी तरह से कार्य कर रहे हैं कि नोट करना महत्वपूर्ण है. चित्रा 5A में प्रस्तुत प्रवाहकत्त्व निशान में दिखाया गया है, क्योंकि यह λ डीएनए स्थानान्तरण का पता लगाने के द्वारा मान्य है. इस चित्र में, dsDNA वर्णित विधि का उपयोग 11 एनएम और 32 एनएम तक बढ़े थे कि दो nanopores के माध्यम से संचालित है. प्रत्येक मामले में, आधारभूत प्रवाहकत्त्व अत्यंत स्थिर है और dsDNA अणुओं nanopore के माध्यम से सरकाना के रूप में स्पष्ट blockades उच्च संकेत से प्रदर्शित कर रहे हैं मनायाशोर एकल अणु स्थानान्तरण उच्च शोर है कि प्रदर्शन अनुपचारित pores की तुलना में घटनाओं. चित्रा 5A की insets में दिखाया गया है कि इन आकारों की nanopores के लिए उम्मीद के रूप में व्यक्तिगत मुड़ा अणु, सरकाना के रूप में, कई असतत रुकावट के स्तर को मनाया जाता है. प्रत्येक ताकना के माध्यम से स्थानान्तरण की घटनाओं के दौरान nanopore प्रवाहकत्त्व के histograms चित्रा 5B में दिखाया गया. और डबल रुकावट अमेरिका (दो किस्में डीएनए - मुड़ा हुआ) - nanopores के कम शोर गुण आधारभूत इसी को अलग, आसानी से ढूढने चोटियों (कोई डीएनए), एकल (सामने आया एक कतरा डीएनए) का पता चलता है. नोट ताकना कब्जे में एक भी dsDNA अणु को इसी प्रवाहकत्त्व में परिवर्तन बड़े और छोटे nanopores के लिए अलग है कि इस तथ्य है. यह अन्य pores या दरारें टी में बनाया जा रहा था, तो उच्च बिजली क्षेत्र के आवेदन एक ही रुकावट आयाम मनाया जाएगा, जैसा कि मौजूदा nanopores विस्तार वास्तव में है कि अप्रत्यक्ष सबूत प्रदान करता हैवह प्रक्रिया 17 के दौरान झिल्ली.

इसी तरह, चित्रा 6 अलग मोटाई की झिल्ली में गढ़े nanopores के विस्तार के लिए उच्च बिजली क्षेत्र की प्रभावशीलता को दिखाता है. इधर, एक 10 एनएम SiNx झिल्ली में बनाया एक nanopore अस्थिर और अपेक्षाकृत छोटे प्रवाहकत्त्व प्रदर्शित, शुरू में आंशिक रूप से unwet है. ± 3 वी बारी के आवेदन पर 4 सेकंड की अवधि (30 कुल) के दालों (0.3 वी / एनएम ±), nanopore गीला हो जाता है और एक 3 एनएम ताकना के लिए आदर्श चतुर्थ विशेषताओं को दर्शाती है. कार्यप्रणाली फिर 400 बाद में दालों के लिए दोहराया गया था और nanopore 8 एनएम के लिए बढ़ा दिया गया है. इस वृद्धि, तुलनीय बिजली क्षेत्र में प्रदर्शन किया लेकिन 30 एनएम झिल्ली में गढ़े nanopores के लिए की तुलना में कम वोल्टेज लागू पूर्वाग्रह, प्रक्रिया संचालित मुख्य रूप से बिजली के क्षेत्र है कि दिखाता है. एक पतली झिल्ली के माध्यम से स्थानान्तरण द्वारा निर्मित वर्तमान नाकाबंदी पतली झिल्ली में मोटा pores, nanopores में उत्पादित उस से भी बड़ा है जैसाइस फैशन में इलाज ऐसी वृद्धि की संवेदनशीलता के साथ प्रोटीन के रूप में छोटे अणुओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. Nanopore सेल विधानसभा. एक nanopore युक्त एक सिलिकॉन नाइट्राइड झिल्ली इलेक्ट्रोलाइट जलाशयों युक्त दो Teflon आधा कोशिकाओं द्वारा संकुचित बारी में हैं जो सिलिकॉन elastomer गास्केट के बीच रखा गया है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. Nanopore कंडीशनिंग और सेटअप विस्तार. एक 30 एनएम मोटी सिलिकॉन नाइट्राइड झिल्ली (बाएं) में drilled एक nanopore दो इलेक्ट्रोलाइट जलाशयों से जोड़ता है. एककंप्यूटर एक पैच दबाना एम्पलीफायर या इलेक्ट्रोलाइट जलाशयों में विसर्जित एजी / AgCl इलेक्ट्रोड के माध्यम से nanopore भर में एक संभावित पूर्वाग्रह लागू होता है, जो बाहरी बिजली की आपूर्ति (DAQ कार्ड) या तो नियंत्रित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. वर्तमान एम्पलीफायर कंप्यूटर सॉफ्टवेयर का उपयोग कर वास्तविक समय में निगरानी रखी जा मापा आयनिक वर्तमान रिले. यह आंकड़ा [11] से संशोधित किया गया है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. उच्च बिजली क्षेत्र की वर्तमान निशान से पहले और बाद में आवेदन. (एक) बढ़ते हैं, और यहां तक कि पिरान्हा समाधान के साथ सफाई निम्नलिखित पर, nanopore के प्रवाहकत्त्व अस्थिर और एक बेलनाकार 10 एनएम ताकना (नीला) के लिए कम से कम उम्मीद है. 8 वी के 2 सेकंड दालों, के आवेदन के बादnanopore पूरी तरह गीला और बढ़े, एक स्थिर प्रवाहकत्त्व प्रदर्शन और biomolecular संवेदन प्रयोगों (हरा) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. (ख) पावर वर्णक्रमीय घनत्व एक अधूरे गीला और भरा nanopore (क्रमशः नीले और नारंगी,) के भूखंडों. 8 वी के 200 मिसे दालों के आवेदन पर, nanopores गीला और मलबे (हरे और लाल, क्रमशः) को हटा दिया गया. यह आंकड़ा [11] से संशोधित किया गया है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 4
चित्रा 4. उच्च बिजली क्षेत्र का उपयोग विस्तार nanopore. (क) वृद्धि और माप संभावित पूर्वाग्रहों (लाल) के बीच बारी nanopore (नीला) के माध्यम से आयनिक वर्तमान परिमित चरणों में बढ़ जाती है कि पता चलता है. परिणामस्वरूप आचरणमंजूरी माप nanopore व्यास अनुमान किया जा सकता है. वांछित व्यास हासिल हो जाने के बाद प्रक्रिया बंद कर दिया है. (ख) प्रवाहकत्त्व की सटीक माप चतुर्थ nanopore आकार में वृद्धि हुई है कि इस बात की पुष्टि. वे फिट हो सकते हैं और उनके सममित और Ohmic व्यवहार की पुष्टि की जा सकती है के रूप में इस तरह के भूखंडों एकल बिंदु वर्तमान मूल्यों से छेद के आकार का एक बेहतर अनुमान प्रदान करते हैं. यह आंकड़ा [11] से संशोधित किया गया है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 5
चित्रा 5. वातानुकूलित nanopores के माध्यम से डीएनए स्थानान्तरण. 150 एमवी का एक पूर्वाग्रह पर nanopore के एक तरफ करने के लिए dsDNA (क) इसके (48.5 KBP) क्षणिक 11 एनएम (नीला) के प्रवाहकत्त्व निशान में blockades और 32 एनएम पोर का उत्पादनतों (लाल). (ख) nanopores में से प्रत्येक के प्रवाहकत्त्व की Histograms एकल आधार रेखा को इसी असतत चोटियों, और डबल स्थानान्तरण घटनाओं को दिखाने के. यह आंकड़ा [11] से संशोधित किया गया है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 6
चित्रा 6. 10 एनएम झिल्ली में nanopores की वृद्धि. एक 10 एनएम झिल्ली मूल रूप से दर्शाती है बहुत कम प्रवाहकत्त्व और असममित चतुर्थ विशेषताओं (नारंगी) में एक nanopore. 30 ± 3 वी (4 सेकंड की अवधि) के बीच बारी की दाल, nanopore wets और के आवेदन पर एक 3 एनएम ताकना (नीला) के लिए उम्मीद है कि संगत के साथ एक प्रवाहकत्त्व साथ आदर्श चतुर्थ गुण दर्शाती है. ± 3 वी का एक और 400 दालों 8 एनएम के एक व्यास को nanopore मायनों में इजाफा(हरा). बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

Discussion

Nanopore आकार के नियंत्रण biomolecular संवेदन अनुप्रयोगों में बुनियादी महत्व की है. Nanopore व्यास की जांच की जा रही अणुओं के आकार के आदेश पर होना चाहिए, वे नमूना समायोजित करने के लिए काफी बड़ी है, लेकिन इष्टतम संकेत करने वाली शोर हासिल करने के लिए काफी छोटा होना चाहिए. आकार के नियंत्रण उच्च बिजली क्षेत्र लागू करने की प्रस्तुत विधि का उपयोग करते हुए कि nanopore व्यास में दिशाहीन है केवल प्रक्रिया भर में बढ़ रहे हैं, 3-100 एनएम के बीच व्यास के साथ nanopores subnanometer परिशुद्धता के साथ, फैशन हो सकता है. 3-4 एनएम pores आसानी से एक मंदिर में 23 का उपयोग कर गढ़े जा सकते हैं, इस भारी प्रोटीन ligand परिसरों की बातचीत के लिए ssDNA संरचना की जांच कर से आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए ठोस राज्य nanopores के विश्वसनीय निर्माण के लिए अनुमति देता है. 100 एनएम ऊपर nanopore विकास बहुत तेजी से और कम सटीक हो सकता है, और अधिक उदार विस्तार शर्तों प्रक्रिया पर बेहतर नियंत्रण प्राप्त करने के लिए नियोजित किया जा सकता. एस के रूप मेंuch, प्रभावी आकार नियंत्रण प्राप्त करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम विस्तार दक्षता और एक वांछित ताकना व्यास को प्राप्त करने में आवश्यक परिशुद्धता के स्तर को संतुलित करने के क्रम में नाड़ी शक्ति और अवधि की पसंद है. यह आगे बढ़ने को एक कम पूर्वाग्रह लेकिन तुलनीय बिजली क्षेत्र शक्ति मनाया जाता है जहां पतले nanopores (10 एनएम मोटाई), की वृद्धि से प्रकाश डाला है. अंतिम आकार पर निर्भर करता है, यह कुछ ही मिनटों में उप 100 एनएम व्यास को एक nanopore विस्तार करने के लिए आम तौर पर संभव है.

यह पृष्ठभूमि शोर से स्थानान्तरण संकेतों को अलग करने के लिए लगभग असंभव है के रूप में इसी तरह, बड़े कम आवृत्ति मौजूदा उतार चढ़ाव के एकल अणु पढ़ाई में बाधा. अधूरा 24 गीला, प्रारंभिक निर्माण 25 और nanopore दीवार 13 पर मलबे की सोखना के बाद शेष कारबोनकेयस अवशेषों की उपस्थिति अक्सर मैं हैं कि कठोर रासायनिक उपचार के साथ अतिरिक्त सफाई की आवश्यकता होती है, संकेत गुणवत्ता नीचा कर सकते हैंnefficacious. ठोस राज्य nanopore प्रोटोकॉल गीला सहायता या ड्रिलिंग, इमेजिंग और हैंडलिंग प्रक्रियाओं से बचे किसी भी संक्रमण को दूर करने के लिए बढ़ते से पहले पिरान्हा समाधान में या ऑक्सीजन प्लाज्मा के साथ nanopore सफाई के महत्व पर जोर करने के लिए दिलचस्प है, यह आम बात है. यहां तक कि इस उपचार के साथ, तथापि, nanopores अक्सर गीला नहीं करते या उच्च शोर प्रदर्शन जारी है, और असफल प्रयास के लिए सुझाव दिया समाधान अत्यंत समय 14 लगता हो सकता है जो अतिरिक्त सफाई प्रदर्शन करने के लिए है. उच्च बिजली क्षेत्र के आवेदन के साथ, इन लंबा प्रोटोकॉल आवेदन के आधार पर आवश्यक हो सकता है. यह सबसे उपकरणों फलस्वरूप तैयारी के समय और कठोर रसायनों से निपटने के लिए जरूरत को कम करने, इस के साथ साथ वर्णित विधि का उपयोग बगल में उसकी मरम्मत की जा सकती है कि पाया गया था. बिजली के शोर को कम करने में सबसे महत्वपूर्ण कदम पूरी तरह से ध्यान में लीन होना गीला और शिथिल बाध्य मलबा हटाने के लिए वोल्टेज और / या नाड़ी की अवधि में एक साधारण वृद्धि हुई है.इस फैशन में इलाज Nanopores मज़बूती से इस तरह के डीएनए और प्रोटीन के पारित होने के रूप में बायोमोलिक्यूल स्थानान्तरण प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है. इन अणुओं एक भरा और शोर बिजली के संकेत के लिए अग्रणी ताकना दीवार का पालन करना है, तो उच्च बिजली क्षेत्र दालों बाधा हटाने और fluidic सेल से nanopore चिप की unmounting बिना आगे प्रयोग के लिए कम शोर गुण हासिल करने के लिए लागू की जा सके.

वर्णित सेटअप का उपयोग उच्च बिजली क्षेत्र के आवेदन के लिए उच्च बैंडविड्थ (> 1 kHz) पर संवेदनशीलता और कम शोर गुणों की कमी है जो 10 वी और वर्तमान एम्पलीफायर, अप करने के लिए आवेदन कर सकते हैं कि एक बाहरी बिजली की आपूर्ति की आवश्यकता द्वारा सीमित है एक अणु संवेदन. ठेठ biomolecular प्रयोगों ± 1 वी तक सीमित है कि एक कम शोर वर्तमान एम्पलीफायर पर भरोसा करते हैं, यह एक adju साथ उच्च बिजली के क्षेत्र कंडीशनिंग और संवेदनशील वर्तमान माप दोनों हासिल कर सकते हैं कि एक एकल प्रणाली डिजाइन करने के लिए सरल हैस्थिर लाभ. इस सीमा के बावजूद, दूसरे के लिए एक सेटअप से संक्रमण त्वरित और सरल है. ऐसे SEM 5, थर्मल ऑक्सीकरण और 8 देगी झिल्ली के उपयोग के रूप nanopore आकार को नियंत्रित करने के लिए मौजूदा तकनीक के साथ इसकी तुलना में, उच्च बिजली क्षेत्र मानक उपकरण का उपयोग कर प्रयोगशाला बेंच पर प्रदर्शन किया और प्रदान की जा सकती है कि एक तेज, और अधिक सटीक और कम खर्चीला कार्यप्रणाली की पेशकश nanopore आकार की एक व्यापक रेंज. तेजी से और reproducibly कम आवृत्ति शोर को कम करने की क्षमता भी प्रारंभिक निर्माण अधिक विश्वसनीय बनाता है और पहले से इस्तेमाल किया है pores आगे के प्रयोगों के लिए भी दोबारा से किया जा सकता है, के रूप में ठोस राज्य nanopores के जीवनकाल को बढ़ाता है. कुल मिलाकर, उच्च बिजली क्षेत्र के साथ वातानुकूलित अलग मोटाई की nanopores के 95% से अधिक बायोमोलिक्यूल संवेदन के लिए उपयुक्त उन्हें प्रतिपादन, बहुत कम कम आवृत्ति शोर विशेषता प्रदर्शन किया. निर्माण ठोस राज्य nanopore प्रयोगों अधिक accessi, जिससे इस प्रकार तेजी से और अधिक विश्वसनीय हैशोधकर्ताओं के ble और संभवतः अधिक मजबूत निर्माण प्रक्रियाओं के माध्यम से nanopore प्रौद्योगिकियों के व्यावसायीकरण की दिशा में एक पथ के लिए अनुमति देता है.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा, अभिनव के लिए कनाडा फाउंडेशन, और ओंटारियो रिसर्च फंड के इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल द्वारा समर्थन को स्वीकार करते हैं. हम nanopore सॉफ्टवेयर और इंस्ट्रूमेंटेशन डिजाइन के साथ मदद के लिए बहुमूल्य विचार विमर्श और तकनीकी समर्थन के लिए nanopore निर्माण और लक्षण, एल Andrzejewski में सहायता के लिए वाई लियू धन्यवाद, और ए Marziali.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
JEM-2100F TEM JEOL Drilling requires 200 kV accelerating voltage
Axon Axopatch 200B patch-clamp amplifier Molecular Devices Low-noise voltage and current amplifier
X-Series data acquisition card National Instruments PCI-6351 Interfacing with setup, apply of high electric fields
LabVIEW 2012 software National Instruments Apply voltages, record current, data analysis
Current amplifier Keithley Current amplification during high electric field pulses
30-nm thick silicon nitride TEM membrane windows Norcada Inc. NT005X Substrate in which nanopores are created
10-nm thick silicon nitride TEM membrane windows Norcada Inc. NT005Z Substrate in which nanopores are created
Silicone elastomer O-rings Marian Chicago HT6135 Punched for sealing the nanopore chip
Ag/AgCl electrodes In Vivo Metric E255
Nitric acid Fisher Scientific 52004P Used for cleaning cells - handle with caution
Hydrogen peroxide Fisher Scientific H323 Used for piranha solution - handle with caution
Sulfuric acid Fisher Scientific A300 Used for piranha solution - handle with caution
Potassium chloride Fisher Scientific P335
HEPES Fisher Scientific BP310 Buffering KCl solution
Primary Faraday cage Shielding nanopore cell, electrodes
Secondary Faraday cage Shielding headstage, electrode wires
Teflon cell To hold nanopore chip and reservoirs
Hot plate VWR Heating piranha solution

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References

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