Ajustar o tamanho e minimizando o ruído de Solid-state Nanoporos

Engineering
 

Summary

A metodologia para a elaboração nanoporos de estado sólido em solução para experimentos de translocação biomoleculares é apresentado. Através da aplicação de pulsos curtos de altos campos elétricos, o diâmetro nanopore pode ser controlada com precisão subnanometer ampliado e suas características de ruído elétrico melhorado significativamente. Este procedimento é realizado in situ, utilizando equipamento de laboratório, em condições experimentais.

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Beamish, E., Kwok, H., Tabard-Cossa, V., Godin, M. Fine-tuning the Size and Minimizing the Noise of Solid-state Nanopores. J. Vis. Exp. (80), e51081, doi:10.3791/51081 (2013).

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Abstract

Nanoporos em estado sólido têm emergido como uma ferramenta versátil para a caracterização de biomoléculas individuais, tais como os ácidos nucleicos e as proteínas de um. No entanto, a criação de um nanoporo em uma membrana de isolamento fino permanece um desafio. Métodos de fabricação que envolvem os sistemas de feixe de elétrons focado especializadas podem produzir nanoporos bem definidas, mas o rendimento de nanoporos confiáveis ​​e de baixo ruído nas membranas disponíveis comercialmente permanece baixa 2,3 e controle de tamanho não é trivial 4,5. Aqui, a aplicação de altos campos elétricos para afinar o tamanho do nanopore, garantindo um ótimo desempenho de baixo ruído é demonstrada. Estes pulsos curtos de alta campo eléctrico são utilizados para produzir um sinal eléctrico intocada e permitir a ampliação de nanoporos com precisão subnanometer após exposição prolongada. Este método é realizado in situ num meio aquoso, utilizando equipamento de laboratório padrão, melhorando o rendimento e reprodutibilidade de sfabricação nanopore olid pelo Estado.

Introduction

Nanoporos de estado sólido Biológica e fornecer um meio de detecção de analitos biomoleculares no nível única molécula 1. Nanoporos individuais são tipicamente incorporadas em membranas isoladoras finas, proporcionando a única conduta para a corrente iónica para passar entre os dois reservatórios de líquidos. Utilizando os princípios da maior escala contadores Coulter, experiências nanopore relacionar alterações na corrente iónica para determinar o comprimento, tamanho, carga e conformação das biomoléculas carregadas, como eles são conduzidos por electroforese através de um nanoporo, na presença de um campo eléctrico externo.

Enquanto nanoporos biológicos, tais como α-hemolisina tipicamente oferecem uma maior sensibilidade e propriedades de baixo ruído 3, a bicamada lipídica de suporte é frágil e de tamanho fixo, o que limita a sua aplicabilidade. Nanoporos de estado sólido, por outro lado, são fabricadas em finas (10-50 nm), nitreto de silício ou óxido de silício e as membranas podem ser feitas de diferentes sizes, ser facilmente integrada com tecnologias bolacha escala 6,7, e são mais robustos, o que permite uma gama mais ampla de condições experimentais. Apesar destas vantagens, as tecnologias nanopore de estado sólido sofrem de vários inconvenientes práticos que limitam a sua utilidade para estudos biomoleculares. Enquanto o controle de tamanho nanopore é possível, é normalmente caro e trabalhoso para atingir, exigindo equipamentos especializados e pessoal qualificado. Por exemplo, nanoporos perfurados por feixe focalizado de iões de lítio têm sido recentemente mostrado a encolher sob condições experimentais específicas em um microscópio eletrônico de varredura (MEV) 5. Em outras abordagens, nanoporos perfurados pela microscopia eletrônica de transmissão (TEM) pode aumentar ou diminuir, dependendo das condições de feixe e uma posterior exposição a solventes aquosos 8. Nestes casos, a gama possível de tamanhos nanopore é limitado, difícil de controlar e não fiável, mesmo quando o tamanho da nanoporo podem mudar após o tratamento químico ouquando imersa num ambiente líquido em particular 9.

A corrente iônica através de nanoporos de estado sólido também podem sofrer de ruído elevado, as fontes de que são um tema intensamente investigada em nanopore literatura 2,3,10,11. Embora vários métodos têm sido propostos para reduzir o ruído elétrico, o rendimento de, estável nanoporos de baixo ruído de confiança é geralmente baixa. A deposição de resíduos carbonáceos durante a perfuração e de imagem pode ter efeitos prejudiciais sobre a qualidade do sinal elétrico, muitas vezes tornando molhar completa um desafio e causando a formação de nanobubbles que podem ser difíceis de remover 12. Além disso, o entupimento da nanopore por moléculas de analito degrada a qualidade do sinal de renderização poros inutilizável para nova experiência 13,14. No seu conjunto, estes efeitos reduzem muito a produção de dispositivos nanopore funcionais e aumentar o custo relacionado com a pesquisa nanoporo de estado sólido.

A aplicaçãoção de uma tensão, com eléctrodos de Ag / AgCl, para produzir elevados campos eléctricos no intervalo de 0,15-0,3 V / nm apresenta uma solução surpreendentemente simples para estes desafios. Através da aplicação cíclica de pulsos curtos de tensão, um ambiente limpo, de baixo ruído de superfície nanopore ideal para estudos de moléculas individuais é produzido. A exposição prolongada a elevados campos eléctricos inicia a retirada do material de membrana que constitui a parede do poro, resultando num aumento do diâmetro de nanoporos. Este crescimento pode ser controlada com precisão por meio do ajuste da força de impulso e da duração. Como vestígios actuais degradar ao longo do decurso de uma experiência, devido a entupimento do nanoporo como moléculas adsorver à superfície do nanoporo, este processo pode ser repetido para recuperar os dispositivos entupidos que teriam sido descartados. Como tal, o rendimento de nanoporos funcionais é ainda mais aumentada pela possibilidade de usar o mesmo dispositivo várias vezes. Este método proporciona várias vantagens, uma vez que é rapidamente realizada no estado líquido sob experimentalcondições, requer apenas equipamento de laboratório, pode ser automatizado com software, e produz nanoporos funcionais de alta qualidade, com um rendimento superior a 95%.

Protocol

1. Fabricação Nanopore e Limpeza

Observação: Uma vez que existe um nanoporo em uma membrana de isolamento, que pode ser montado directamente na célula de líquido, sem processamento adicional ou de limpeza, tal como descrito no passo 2. No entanto, se for necessário para remover os vestígios de contaminantes entre experiências, os chips nanopore pode ser limpo utilizando um solução piranha 3,15,16 (3:1 H 2 SO 4: H 2 O 2) ou por exposição ao plasma de oxigénio 2. Como tal, os passos de 1,2-1,9 no protocolo seguinte são opcionais se limpeza prévia por exposição a uma solução de piranha não é necessário.

  1. Desgaseifica filtrada desionizada (DI) de água, colocando-se sob vácuo num sonicador durante 30 minutos a 40 ° C.
  2. Preparar solução piranha num copo de 10 ml por adição cuidadosa de 3 mL de ácido sulfúrico seguido por 1 ml de peróxido de hidrogénio. Misturar completamente por refluxo na pipeta. CUIDADO: solução Piranha é extremamente perigoso. Por favor, ta ke todas as precauções.
  3. Usando pinças resistentes aos ácidos, inserir o chip cuidadosamente membrana contendo nanoporo borda primeiro para a solução piranha para submergir completamente o chip e evitar que flutua na superfície.
  4. Enxágüe pinças bem em água filtrada.
  5. Colocar o copo numa placa de aquecimento pré-definido para 90 ° C e deixe-a limpa por pelo menos 30 min.
  6. Remova cuidadosamente a solução piranha do copo com uma pipeta de vidro limpo e descartar em quantidades abundantes de água.
  7. Usando uma pipeta de vidro limpo, adicionar 5 ml de água deionizada desgaseificado desde o passo 1.1 para o copo para enxaguar. Retire a água e repita pelo menos 5x.
  8. Com cuidado, retire o chip nanopore do copo usando uma pinça afiada ponta limpa. Manusear com cuidado extremo como a membrana nanopore é muito frágil.
  9. Seca-se o chip através da aplicação de sucção suavemente para a sua periferia, utilizando um aspirador. Guarde o chip em um prato limpo Petri até que esteja pronto para uso.
ve_title "> 2. Montagem da Nanopore

  1. Limpar a célula nanoporo Teflon (Figura 1) através da colocação em solução de ácido nítrico a 20% e fervura durante 10 minutos. CUIDADO: Use todos os equipamentos de proteção individual necessários e lidar com ácidos com cuidado.
  2. Retire cuidadosamente o celular de ácido nítrico e coloque em ebulição DI água por 10 min.
  3. Ferver a célula em ua DI durante mais 10 minutos adicionais para assegurar a remoção completa de ácido nítrico. Retirar o copo da placa quente e deixe-a arrefecer à temperatura ambiente.
  4. Retirar a célula a partir da proveta e secar com ar filtrado ou N 2. Guarde o celular na caixa de Petri limpa.
  5. Desgaseifica filtrada solução de KCl (tamponada com HEPES a pH 8), colocando-se sob vácuo num sonicador durante 30 minutos a 40 ° C.
  6. Limpe duas juntas de elastômero de silicone para cada chip nanopore por sonicando em etanol por pelo menos 10 min.
  7. Coloque o chip nanopore em uma junta de elastômero ser carefu limpol para alinhar a janela de membrana, com a abertura da junta. Coloque e alinhar uma segunda junta em cima do chip.
  8. Colocar o chip e juntas na entrada do depósito de uma metade da célula nanoporo limpos. Montar a célula por enroscamento a outra metade no lugar. Uma vista explodida dos componentes celulares nanopore é mostrado na Figura 1.
  9. Molhar o chip nanoporo pipetando etanol para os reservatórios de células e colocar em uma câmara de vácuo, até algumas bolhas são vistos a sair das entradas.
  10. Remover o etanol através de lavagem dos reservatórios com, pelo menos, 3 ml de solução de KCl desgaseificados filtrada. Tome cuidado para remover excesso usando um aspirador.

3. Nanopore Caracterização

  1. Coloque a célula nanopore na configuração experimental eletricamente blindado e colocar eletrodos Ag / AgCl em cada reservatório. Esta configuração é semelhante à mostrada na Figura 2 com a excepção de a fonte de energia externa e um amplificador de corrente, que sãosubstituído por um amplificador de realimentação resistiva de baixo ruído.
  2. Usando o amplificador de baixo ruído em modo de tensão-clamp, aplicar potenciais varrendo de -200 mV a +200 mV e registrar as características IV.
  3. Ajustar a curva IV para obter condutância nanoporos, que pode ser usada para calcular o seu diâmetro em solução 17. Se o diâmetro calculado é muito menor do que o esperado a partir de imagens TEM, a poro é provavelmente não completamente molhadas e / ou contém detritos ou contaminação.
  4. Aplique uma mV potencial de 200 em todo o nanopore e registrar a corrente iônica por 30 seg.
  5. Realize uma análise de densidade espectral de potência (PSD) da corrente iônica e integrar para quantificar as características do ruído elétrico do nanopore. Se o ruído for superior a 15 pA RMS a largura de banda de 5 kHz, então os poros não é provável que completamente molhado e / ou contém contaminação e não pode ser usado com fiabilidade no experimento.

4. Condicionado Nanoporos Usando alta Fie elétricalds

Nota: Se a curva IV gerado assimetria exibiu ou menos do que o esperado condutância, ou o traçado atual apresentaram níveis de instabilidade e alto ruído em baixas frequências, é necessário condicionar a nanopore com altos campos elétricos para eliminar qualquer contaminação no poro de superfície e / ou molhado do poro. Embora este método não afecte o ruído de alta frequência causada pela capacitância de membrana ou qualquer capacitância parasita acoplada à entrada do amplificador de corrente utilizado em medições, o ruído de baixa frequência (também chamado ruído 1 / f) 18 pode ser grandemente reduzido. Um esquema da instalação usada para efectuar esse condicionamento é mostrado na Figura 2.

  1. Desconecte os eletrodos do amplificador de patch-clamp.
  2. Conectar um dos eléctrodos a uma fonte de alimentação controlado por computador capaz de gerar> 6 V (> 0,2 intensidade do campo eléctrico em V / nm para as membranas com uma espessura de 30 nm usados ​​aqui) e a outra a um eXternal amplificador de corrente, que pode ser monitorado em tempo real.

    Nota: A aplicação de elevados campos eléctricos pode ser utilizada para condicionar nanoporos em diferentes materiais de membrana e espessuras. Embora ambas as membranas de 30 nm e 10 nm são discutidos aqui, tensões descritos referem-se àqueles usados ​​para membranas com uma espessura de 30 nm a menos que indicado de outra forma.

  3. Aplicar uma diferença de potencial de 400 mV (tensão de medição) entre os nanoporos durante pelo menos 5 segundos.
  4. Calcular o valor de corrente significativo a partir do final de 1 seg de dados para determinar a condutância da nanoporos. Calcular o diâmetro do nanoporo baseado nesta condutância, o que deve ser feito automaticamente utilizando o software e o modelo de condutância nanoporo de escolha com base na geometria mais provável. Ele deve corresponder ao diâmetro medido a partir da curva IV.
  5. Aplicar um impulso de 200 mseg de 6 V (tensão de molhagem) através do nanoporo para produzir um campo eléctrico de 0,2 V / nm seguido de um período de medição de 5 sega 400 mV. Mais uma vez, o cálculo de um diâmetro do nanoporo usando o final de 1 seg de dados e comparação com o valor esperado a partir de medições de MET para assegurar que o nanoporo é completamente molhado. Se necessário, repita várias vezes.
  6. Se necessário, repetir a aplicação dos pulsos de alta do campo eléctrico com o aumento da tensão até que o sinal de corrente durante o período de medição é estável e mostrando a condutância esperado. Não é recomendado para ser superior a 10 V (ou seja,> 0,3 V / nm), pois isso pode aumentar significativamente ou danificar o nanopore rapidamente.

5. Ampliando Nanoporos Usando altos campos elétricos

Nota: O diâmetro da nanoporo é crucial para determinar a sua funcionalidade para uma aplicação de detecção biomolecular particular. Para este fim, um nanoporo criado usando uma ETM pode ser alargada para uma dimensão desejada através da aplicação de campos eléctricos elevados, até o diâmetro adequado é conseguido com a mesma configuração utilizada para limpar e molhar ananoporo (Figura 2).

  1. Usando a mesma configuração eletrônica como na parte 4, aplique um viés 200-500 mV através do poro para obter uma medida do diâmetro. Embora menos precisa do que a montagem de uma curva IV, uma medida único ponto pode ser usado para estimar aproximadamente o tamanho nanopore rapidamente.
  2. Aplicar a 2 seg pulso de 8 V através do nanopore seguido por um período de medição de pelo menos 5 segundos a 400 mV. O cálculo do novo diâmetro tipicamente mostram um aumento muito pequeno no tamanho nanoporo (<0,1 nm).
  3. Repita este processo cíclico, alternando entre alargamento e medição tensões obter in situ e medições em tempo real de aumento do diâmetro nanopore.
  4. Se a taxa de crescimento mais rápida é desejável, aumentar a magnitude da voltagem aplicada incrementalmente até 10 V. de crescimento tipicamente irá acelerar à medida que a poro aumenta com a taxa de aumento da condutância variando de 0,03 ns / s ec & #160; de 10 nS / sec, dependendo do tamanho do nanoporo, a força do campo eléctrico e as propriedades da solução de electrólito.
  5. Quando o diâmetro desejado é atingido, parar a aplicação de elevados campos eléctricos. Isto pode ser feito automaticamente utilizando o programa de computador.
  6. Volte a ligar o amplificador de patch-clamp para os eletrodos.
  7. Adquirir novo IV e dados de rastreamento atuais a 200 mV para confirmar o diâmetro do nanopore e verificar sinais de corrente de baixo ruído como nas etapas 3,2-3,5 acima. Se necessário, repita condicionado e protocolo de ampliação (passos 4,1-5,5).

6. DNA translocação

  1. Antes da adição de uma amostra biomolecular, realizar uma experiência de controlo para assegurar que não existe contaminação no reservatório. Adquirir um traço atual sob um potencial aplicado de 150-300 mV, na ausência de qualquer amostra para verificar se há bloqueios atuais são detectados após 2 min.
  2. Adicionar DNA λ (48,5 kbp de cadeia dupla) para o <in> reservatório cis para uma concentração final de 0,5-2 ng / mL. Refluxo suavemente com uma pipeta, durante pelo menos 10 segundos para assegurar uma distribuição homogénea da amostra ao longo do reservatório.
  3. Para a 30 nm de espessura nanopore, aplique um viés de 150-300 mV para o reservatório trans e medir a corrente iônica passando pelo nanopore. Para eventos de translocação muito curtos, é desejável para provar em uma alta freqüência (250 kHz ou mais) com uma freqüência relativamente alta de filtragem passa-baixa (100 kHz).
  4. Monitorar a corrente iônica utilizando o software para detectar bloqueios atuais transitórios como moléculas translocar através do nanopore. Os vestígios correntes iónicas de translocação molecular pode ser analisada para determinar a profundidade de bloqueio, a duração ea frequência de inferir informações sobre a amostra de interesse. Por outro lado, se a informação sobre as moléculas de translocação é conhecido, esta informação pode ser utilizada para investigar as propriedades da própria nanoporos.

Representative Results

Os nanoporos utilizados neste estudo foram perfurados em 30 nm ou 10 nm janelas de membrana de nitreto de silício de espessura. Embora o protocolo descrito pode ser aplicado a nanoporos de estado sólido de vários materiais fabricados utilizando qualquer método, são vulgarmente perfurado por MET utilizando protocolos previamente estabelecidos 11,14. Nanoporos perfurados por TEM são tipicamente entre 4-8 nm de diâmetro (Figura 2). Embora ambas as membranas com uma espessura de 30 nm e 10 nm pode ser montado e condicionada utilizando o protocolo anteriormente referido, desvios de tensão descritos referem-se às necessárias para membranas com uma espessura de 30 nm a menos que indicado de outra forma. Para as membranas de tamanho diferente, a tensão aplicada deverá ser ajustado para gerar um campo eléctrico na gama de 0,15-0,3 V / nm dentro do nanoporo.

A Figura 3a mostra dois traços de condutância típica de um nanoporo 10-nm de uma membrana de espessura de 30 nm, antes e depois do tratamento com elevados campos eléctricos. Após a montagem de um recém-dencheu nanopore, a probabilidade de obter um sinal de corrente iônica instável e barulhento, exibindo um alto grau de oscilação de baixa freqüência, é geralmente elevado. O nanoporo mostrado na Figura 3a destaca este comportamento. A sua condutibilidade é consideravelmente menos do que o esperado para um nanoporo do seu tamanho, muito provavelmente devido a molhagem incompleta. Mediante a aplicação de elevados campos eléctricos de 0,27 V / nm em magnitude produzido por 8 V pulsos (90 impulsos de duração de 2 segundos), no nanoporo torna-se totalmente molhada e é subsequentemente alargado para 21 nm de diâmetro. Neste ponto, a poro apresenta uma condutividade estável com propriedades de baixo ruído. A análise quantitativa de ruído em nanoporos semelhantes é mostrado como fonte de gráficos de densidade espectral na Figura 3B. A amplitude do ruído de baixa frequência dos poros unwet e / ou obstruídos é muito elevado (> 20 pA RMS), tornando-os inutilizáveis ​​no experimento. Após condicionamento com altos campos elétricos, potência de ruído em baixas freqüências (<10 kHz) é diminisele tinha em até 3 ordens de magnitude e pronto para os experimentos de baixo ruído.

Figura 4a mostra uma medição de corrente típico como o potencial aplicado é pulsada entre altos campos elétricos para ampliar e períodos de medição de baixa de campo elétrico. Depois de cada impulso subsequente, a corrente iónica resultante através do nanoporo na tensão de medição (isto é, a condutância nanoporo) aumentado em um valor finito. Isto demonstra que o nanoporo é aumentado em tamanho, como o diâmetro d pode ser inferida a partir da sua condutância G em uma solução de condutividade σ, aproximando-o nanoporo como tendo geometria cilíndrica de comprimento efectivo L EFF. Embora existam vários outros modelos para relacionar nanopore condutância à sua geometria 17,19-21, a seguinte relação, que incorpora um termo geométrica e um termo de resistência de acesso, foi provado válido por nanoporos TEM-perfurados em alta salAs concentrações, mais de uma vasta gama de diâmetros de interesse para dsDNA translocação 17,22.

Uma vez que o diâmetro desejado é alcançado, o processo é interrompido automaticamente pelo software. O diâmetro nanoporo resultante pode então ser confirmada utilizando medições precisas IV, como mostrado na Figura 4b.

É importante notar que nanoporos tratados usando campos eléctricos elevados são totalmente funcionais. Isto é validado por meio da detecção de ADN λ translocação, como mostrado nos traços de condutância apresentado na Figura 5a. Nesta figura, ADNcd é conduzido através de dois nanoporos, que foram aumentados para 11 nm e 32 nm, utilizando o método descrito. Em cada caso, a condutância da linha de base é extremamente estável e bloqueios claros são observados como moléculas de dsDNA translocar através do nanoporo, exibindo alta relação sinalRuído única molécula eventos de translocação, em comparação com os poros não tratados que apresentam alto ruído. Tal como mostrado nas inserções da Figura 5a, múltiplos níveis de bloqueio discretos são observados como moléculas dobradas individuais translocar, como esperado para nanoporos destes tamanhos. Os histogramas da condutância nanoporo durante eventos de translocação através de cada poro são mostrados na Figura 5b. As propriedades de baixo ruído dos nanoporos revelar picos distintos, facilmente resolúveis correspondentes à linha de base (sem DNA), único (uma cadeia de DNA - desdobrado) e os estados de bloqueio duplo (duas fitas de DNA - dobradas). É digno de nota o facto de que a alteração na condutância correspondente a uma única molécula de dsDNA ocupando a poro é diferente para as pequenas e grandes nanoporos. Isso fornece evidências indiretas de que a aplicação de altos campos elétricos é de fato a ampliação nanoporos já existentes, como a mesma amplitude bloqueio seria observado se outros poros ou fissuras eram criados em tele membrana durante o processo de 17.

Similarmente, a Figura 6 ilustra a eficácia de campos eléctricos elevados para ampliar nanoporos fabricados em membranas de diferentes espessuras. Aqui, um nanoporo criado em uma membrana SiNx 10 nm é inicialmente parcialmente unwet, exibindo condutância instável e relativamente pequena. Mediante a aplicação alternada de ± 3 V (± 0,3 V / nm) pulsos de 4 segundos de duração (30 no total), o nanoporo se torna húmida e apresenta características ideais IV para uma poro de 3 nm. A metodologia foi então repetido para 400 pulsos subseqüentes eo nanopore foi ampliado para 8 nm. Este alargamento, realizado em campos elétricos comparáveis, mas viés tensão aplicada inferior à nanoporos fabricados em membranas de 30 nm, mostra que o processo é o campo elétrico impulsionado principalmente. Como o bloqueio corrente produzida pela translocação através de uma membrana mais fina é maior do que a produzida em mais espessas poros, nanoporos em membranas finastratada desta maneira pode ser usado para estudar as moléculas mais curtas, tais como as proteínas, com sensibilidade aumentada.

Figura 1
Figura 1. Conjunto de células Nanopore. Uma membrana de nitreto de silício contendo uma nanopore é colocado entre as juntas de elastômero de silicone, que são, por sua vez comprimido por duas meias-células de teflon contendo reservatórios de eletrólitos. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Figura 2
Figura 2. Nanopore condicionado e ampliação de instalação. Uma nanopore perfurado em um 30 nm de espessura da membrana de silício nitreto (esquerda) conecta dois reservatórios de eletrólitos. Acomputador é usado para controlar ou um amplificador de patch-clamp ou fonte de alimentação externa (cartão DAQ) que se aplica um viés potencial através do nanopore através de eletrodos de Ag / AgCl imersos nos reservatórios de eletrólitos. O amplificador de corrente retransmite a corrente iónica medido para ser monitorado em tempo real, utilizando software de computador. Este valor foi modificado a partir de [11]. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Figura 3
Figura 3. Traços atuais antes e após a aplicação de altos campos elétricos. (A) Após a montagem, e mesmo após a limpeza com solução piranha, a condutância da nanopore é instável e menos do que o esperado para um cilíndrico de poros de 10 nm (azul). Após a aplicação de 2 impulsos sec de 8 V, onanoporo está completamente molhado e ampliada, que apresenta uma condutividade estável e pode ser utilizado para experiências de detecção de biomoléculas (verde). (B) gráficos de densidade espectral de potência de um nanopore incompleta molhado e entupido (azul e laranja, respectivamente). Após a aplicação de 200 pulsos ms de 8 V, os nanoporos foram molhadas e detritos removidos (verde e vermelho, respectivamente). Este valor foi modificado a partir de [11]. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Figura 4
Figura 4. Nanopore ampliando utilizando altos campos elétricos. (A) Alternando entre alargamento e medição potenciais vieses (vermelho) revela que a corrente iônica através do nanopore (azul) aumenta em passos finitos. A conduta que resultouance medição pode ser utilizado para inferir diâmetro nanopore. Uma vez que o diâmetro desejado tiver sido alcançado, o processo é interrompido. (B) As medições precisas de condutividade IV confirmam que os tamanhos nanopore aumentaram. Tais tramas fornecer uma melhor estimativa do tamanho do poro do que os valores actuais de um único ponto em que pode estar em forma o seu comportamento e simétrica e Ôhmico pode ser confirmada. Este valor foi modificado a partir de [11]. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Figura 5
Figura 5. Translocação através de ADN nanoporos condicionado. (A) A adição de ADNcd (48,5 kpb) para um lado da nanoporo uma polarização de 150 mV produz bloqueios transientes nos traços de condutância de 11 nm (azul) e 32 nm PORes (vermelhos). (B) Os histogramas da condutância de cada um dos nanoporos mostram picos distintos correspondentes aos valores de referência, simples e duplas eventos de translocação. Este valor foi modificado a partir de [11]. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Figura 6
Figura 6. Alargamento de nanoporos em 10 membranas nm. Uma nanopore em uma membrana de 10 nm originalmente exposições muito pouco condutância e características IV assimétricas (laranja). Após a aplicação de 30 pulsos de alternância entre ± 3 V (4 seg duração), os molha nanopore e apresenta propriedades ideais IV com uma condutância consistente com o esperado para um poro 3 nm (azul). A mais de 400 pulsos de ± 3 V aumenta o nanoporo para um diâmetro de 8 nm(Verde). Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Discussion

Controle de tamanho nanopore é de fundamental importância para aplicações de sensoriamento biomoleculares. Diâmetros Nanopore deve ser da ordem do tamanho das moléculas a ser sondados, eles devem ser suficientemente grande para acomodar a amostra, mas suficientemente pequeno para atingir o ruído de sinal-para-óptima. Embora o controlo do tamanho, utilizando o método apresentado em aplicar elevados campos eléctricos é unidireccional em que os diâmetros nanopore só são aumentados ao longo do processo, com nanoporos diâmetros entre 3-100 nm, pode ser formado, com precisão subnanometer. Como 3-4 poros nm pode ser facilmente fabricado usando um MET 23, isto permite a fabricação segura de nanoporos de estado sólido para uma ampla gama de aplicações de sondagem estrutura ADNcs para a interacção de complexos de proteína-ligando volumoso. Embora o crescimento nanopore acima de 100 nm pode ser muito rápido e menos preciso, ampliando as condições mais moderadas podem ser empregados para alcançar um melhor controle sobre o processo. Como suito, o passo mais importante para conseguir o controlo do tamanho eficaz é a escolha da força de impulso e duração, a fim de equilibrar a eficiência de ampliação e o nível de precisão necessária para se alcançar um diâmetro de poro desejado. Isto é ainda mais realçada pelo alargamento da nanoporos fino (espessura de 10 nm), onde alargamento é observado um viés mais baixo, mas a força do campo elétrico comparável. Consoante o tamanho final, que é, geralmente, possível aumentar um nanoporo para diâmetros sub-100 nm, em poucos minutos.

Da mesma forma, as grandes flutuações de corrente de baixa freqüência impede estudos de moléculas individuais, pois é quase impossível diferenciar sinais de translocação do ruído de fundo. Incompleta molhar 24, a presença de resíduos carbonáceos restantes após a fabricação inicial de 25 e adsorção de detritos na parede do nanopore 13 pode degradar a qualidade do sinal, exigindo limpeza adicional com tratamentos químicos agressivos que muitas vezes são inefficacious. Curiosamente, é comum que os protocolos nanopore de estado sólido para enfatizar a importância da limpeza do nanopore em solução piranha ou com plasma de oxigênio antes de montar para ajudar molhar ou eliminar qualquer contaminação que sobraram dos processos de perfuração, de imagem e de manuseio. Mesmo com o tratamento, no entanto, muitas vezes não o fazem nanoporos molhado ou continuar a apresentar ruído elevado, ea solução sugerida para tentativas falhadas é a realização de uma limpeza adicional, que pode ser extremamente demorado 14. Com a aplicação de elevados campos eléctricos, estes protocolos longas pode não ser necessário, dependendo da aplicação. Verificou-se que a maior parte dos dispositivos pode ser recondicionadas in situ, utilizando o método aqui descrito, consequentemente, reduzir o tempo de preparação e a necessidade de lidar com produtos químicos. Os passos mais importantes na mitigação de ruído elétrico é um simples aumento de tensão e / ou duração do pulso para molhar completamente os poros e remover detritos frouxamente ligado.Nanoporos tratados por este método pode ser utilizada com segurança em experiências de translocação de biomoléculas, tais como a passagem de ADN e proteínas. Se essas moléculas aderem à parede dos poros levando a um sinal elétrico entupido e barulhento, altos pulsos de campo elétrico pode ser reaplicado para remover a obstrução e recuperar propriedades de baixo ruído para novas experiências, sem desmontar do chip nanopore da célula fluídica.

A aplicação de elevados campos eléctricos que utilizam a configuração descrita é limitada pela exigência de uma fonte de alimentação externa, que pode aplicar-se a 10 V e um amplificador de corrente, que não têm a sensibilidade e propriedades de baixo ruído de largura de banda alta (> 1 kHz) para único sensor molécula. Enquanto experiências típicas biomoleculares contar com um amplificador de corrente de baixo ruído que é limitada a ± 1 V, é muito simples para projetar um sistema único que poderia realizar tanto alto campo condicionado elétrico e medição de corrente sensível com uma ajuganho estável. Apesar desta limitação, a transição de uma configuração para o outro é simples e rápido. Em comparação com as técnicas existentes para controlar o tamanho nanoporo, tais como a utilização de SEM 5, a oxidação térmica e membrana remodelar 8, elevados campos eléctricos oferecer um método mais rápido, mais preciso e barato, que pode ser realizado na bancada do laboratório utilizando equipamento padrão e fornecer uma ampla gama de tamanhos nanopore. A capacidade de reduzir rápida e reproduzível ruído de baixa frequência também faz fabricação inicial mais confiável e prolonga a vida útil de nanoporos de estado sólido, como poros usados ​​anteriormente pode ser rejuvenescido para novas experiências. Ao todo, mais de 95% dos nanoporos de diferentes espessuras condicionado com altos campos elétricos exibiu muito pouco característico ruído de baixa frequência, tornando-os adequados para a detecção de biomoléculas. Fabricação é, portanto, mais fácil e confiável, fazendo experiências nanopore de estado sólido mais acesble para pesquisadores e potencialmente permitindo um caminho para a comercialização de tecnologias nanopore através de processos de fabricação mais robustos.

Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Reconhecemos o apoio pelas Ciências Naturais e Council of Canada, a Fundação Canadense para Inovação, e do Fundo de Investigação Ontário Pesquisa de Engenharia. Agradecemos Y. Liu para a ajuda na fabricação de nanoporos e caracterização, L. Andrzejewski pelas valiosas discussões e apoio técnico, e A. Marziali ajuda com o software nanopore e design de instrumentação.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
JEM-2100F TEM JEOL Drilling requires 200 kV accelerating voltage
Axon Axopatch 200B patch-clamp amplifier Molecular Devices Low-noise voltage and current amplifier
X-Series data acquisition card National Instruments PCI-6351 Interfacing with setup, apply of high electric fields
LabVIEW 2012 software National Instruments Apply voltages, record current, data analysis
Current amplifier Keithley Current amplification during high electric field pulses
30-nm thick silicon nitride TEM membrane windows Norcada Inc. NT005X Substrate in which nanopores are created
10-nm thick silicon nitride TEM membrane windows Norcada Inc. NT005Z Substrate in which nanopores are created
Silicone elastomer O-rings Marian Chicago HT6135 Punched for sealing the nanopore chip
Ag/AgCl electrodes In Vivo Metric E255
Nitric acid Fisher Scientific 52004P Used for cleaning cells - handle with caution
Hydrogen peroxide Fisher Scientific H323 Used for piranha solution - handle with caution
Sulfuric acid Fisher Scientific A300 Used for piranha solution - handle with caution
Potassium chloride Fisher Scientific P335
HEPES Fisher Scientific BP310 Buffering KCl solution
Primary Faraday cage Shielding nanopore cell, electrodes
Secondary Faraday cage Shielding headstage, electrode wires
Teflon cell To hold nanopore chip and reservoirs
Hot plate VWR Heating piranha solution

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References

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