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Heterotópico Rata auxiliar Trasplante de Hígado Con Flujo regulado Portal Vein Arterialización en aguda Insuficiencia Hepática

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Summary

Trasplante hepático auxiliar proporciona un soporte temporal en la insuficiencia hepática aguda, hasta que la regeneración del hígado no. El trasplante heterotópico auxiliar hígado (HALT) con arterialización vena porta (PVA) hace una función hepática suficiente. Hemos desarrollado una técnica análoga en la rata, para examinar la influencia de la arterialización de la vena porta en la morfología y la función del injerto.

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Schleimer, K., Kalder, J., Grommes, J., Jalaie, H., Tawadros, S., Greiner, A., Jacobs, M., Kokozidou, M. Heterotopic Auxiliary Rat Liver Transplantation With Flow-regulated Portal Vein Arterialization in Acute Hepatic Failure. J. Vis. Exp. (91), e51115, doi:10.3791/51115 (2014).

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Abstract

En la insuficiencia hepática aguda del trasplante hepático auxiliar es un enfoque alternativo interesante. El objetivo es proporcionar un soporte temporal hasta que el hígado nativo no se ha regenerado. 1-3 El APOLT-método, el implante ortotópico de segmentos- auxiliar evita la mayoría de los problemas técnicos. Sin embargo este método requiere de resecciones extensas tanto en el hígado nativo y el. Injerto 4 En 1998, Erhard desarrolló el trasplante heterotópico auxiliar hígado (HALT) utilizando arterialización de la vena porta (PVA) (Figura 1). Esta técnica mostró prometedores resultados clínicos iniciales. 5-6 Hemos desarrollado una técnica HALT-con-regulada flujo de PVA en la rata para examinar la influencia de PVA-flujo regulado en la morfología y función (Figura 2) injerto.

Un injerto de hígado reducido a un 30% de su tamaño original, se implantó heterotópicamente en la región renal derecha del receptor después de la explantación del riñón derecho.60; La vena cava infra-hepática del injerto se anastomosa con la vena cava infrahepática del destinatario. El arterialización de la vena porta del donante se llevó a cabo a través de la arteria renal derecha del destinatario con la técnica de stent. La regulación del flujo sanguíneo de la vena porta arterializada se logró con el uso de un stent con un diámetro interno de 0,3 mm. El tronco celíaco del injerto fue implantado era de extremo a lado anastomosa con la aorta del receptor y el conducto biliar en el duodeno. Una resección subtotal del hígado nativo se realizó para inducir insuficiencia hepática aguda. 7

De esta manera se realizaron 112 trasplantes. La tasa de supervivencia perioperatoria fue del 90% y la tasa de supervivencia de 6 semanas fue del 80%. Seis semanas después de la operación, el hígado regenerado nativo, mostrando un aumento de peso de 2,3 ± 0,8 g a 9,8 ± 1 g. En este momento, el peso del injerto disminuyó de 3,3 ± 0,8 g a 2,3 ± 0,8 g. Hemos sido capaces de obtener resultados prometedores a largo plazo en términos de morfología y función del injerto. HALT con flujo regulado PVA tiende un puente fiable insuficiencia hepática aguda hasta que regenera el hígado nativo.

Introduction

Insuficiencia hepática aguda plantea un problema grave en la medicina clínica que lleva a una tasa de mortalidad del 60-80%. 8 En la insuficiencia hepática aguda, el trasplante hepático auxiliar es una terapia alternativa prometedora para superar la fase aguda. El hígado nativo se deja de regenerarse y siguiendo a la regeneración de los medicamentos inmunosupresores pueden ser descontinuados. Como consecuencia, el injerto se convertirá atrófica. Sin embargo aún se discute la técnica quirúrgica de trasplante hepático auxiliar. 1.3 En este contexto, Terpstra informó la falta de espacio para el injerto, la sangre portal robar fenómeno y el problema de la congestión venosa y drenaje. 9-10 vena porta del donante fue anastomosada extremo a un lado a la vena porta del receptor. Esto dio lugar a la competencia flujo portal entre el injerto y el hígado nativo y en la trombosis de la vena porta. La mayoría de los problemas técnicos se pueden evitar con el uso del método APOLT (orthotopic implantación de segmentos auxiliares). 4 Sin embargo, este método requiere resecciones extensas tanto del hígado nativo y el. injerto 4 En 1998, Erhard y su equipo desarrollaron el trasplante heterotópico auxiliar hígado (HALT) utilizando arterialización de la vena porta (PVA) (Figura 1 ). El hilio y la vena porta del hígado nativo se respetan con el uso de este método. Esto ahorra el destinatario de los efectos secundarios no deseados, como la trombosis de la vena porta y de la sangre portal fenómeno de robo, lo que podría perturbar la recuperación del hígado nativo. Además, no se requieren extensas resecciones hepáticas del hígado nativo y del injerto para este método, por consiguiente, con menos sangrado y más masa total del parénquima hepático restante para puentear (injerto) y la regeneración (hígado nativo). Esta técnica mostró prometedores resultados clínicos iniciales. 5-6 El objetivo de este trabajo experimental fue el desarrollo de una técnica HALT con arterialización vena porta enla rata para fines de investigación (Figura 2). En los experimentos preliminares no tomamos en cuenta la regulación del flujo sanguíneo de la vena portal arterializada, que dio lugar a la congestión del injerto trasplantado después de la reperfusión y sangrado masivo de la cápsula hepática. 11 Desde entonces, el flujo de sangre en la vena porta arterializada se reguló en un stent con un diámetro interior de 0,3 mm y una longitud de 8 mm. Experimentos piloto había demostrado que un diámetro del stent de 0,3 mm produce un flujo promedio de sangre en la vena porta arterializada que está dentro del intervalo fisiológico superior (1.7 +/- 0,4 ml / min / g de peso de hígado). 12 Nuestros resultados sin regulación del flujo sanguíneo correlacionar con los resultados de Hong, que realizó HALT con PVA a través de la arteria ilíaca del destinatario. 13 En sus experimentos sin regulación del flujo sanguíneo portal masiva y se produjo congestiones sinusoide.

El objetivo de nuestro video es demonstrate paso a paso esta técnica quirúrgica experimental ne.w en la rata. A largo plazo, la técnica propuesta puede ser utilizada en los estudios sobre la regeneración del hígado y de la competencia inter-hígado y arterialización vena porta, hiperperfusión vena porta y la regulación del flujo sanguíneo portal.

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Protocol

1. Animales Experimentales

  1. Obtenga una aprobación del Comité de Ética local para todos los experimentos que se llevarán a cabo, de conformidad con las directrices de protección animal FELASA (K 40, 17/99).
  2. Utilice ratas Lewis macho disponible para comprar desde cualquier criador comercial (por ejemplo, Charles River Wiga GmbH, Sulzfeld, Alemania). En este caso, se utilizaron 224 animales (112 donantes, 112 destinatarios) para realizar 112 trasplantes. Los receptores fueron sacrificados a las 6 semanas después de la operación. En el momento de la operación, los animales deben pesar 250 a 350 g.
  3. Mantener a los animales en las habitaciones climatizadas con acceso libre a comida y agua.

2. Anestesia y Preparación Operativo

  1. Coloque la rata en una caja de plexiglás conectado a la máquina de anestesia con una tasa de flujo de oxígeno de 1 L / min, y un vaporizador con gas anestésico isofluorano al 5% para inducir la anestesia. Mantener la anestesia en el 1,5% isofluorano.
  2. Coloque las ratas endecúbito supino sobre una placa de calentamiento.
  3. Retire la piel del abdomen con una crema de depilación.
  4. Preparar un campo quirúrgico estéril de la siguiente manera: Utilice un desinfectante para limpiar la mesa de trabajo. Para la desinfección del sitio de la incisión el uso de clorhexidina primero, segundo alcohol y, finalmente, una solución exfoliante (por ejemplo, clorhexidina y 70% de alcohol isopropílico). Póngase una bata quirúrgica desechable y guantes quirúrgicos.
  5. Utilizar instrumentos de microcirugía estériles.
  6. Utilice un microscopio quirúrgico en el porcentaje de 12 a 20 veces.

3. Procedimiento Quirúrgico

  1. Donantes de operación

    Preparación
    1. Lleve a cabo una laparotomía media y resección del lóbulo lateral izquierdo y el lóbulo medio del injerto según lo descrito por Higgins. 14
    2. A continuación, preparar el ligamento hepatoduodenal. En primer ligar el conducto biliar para inducir congestión y dilatación de la pequeña conducto biliar. Entonces ligar y seccionar el gastroduodevena y arteria nal. Después, aislar el tronco celíaco y la arteria hepática común y seccionar la arteria gástrica izquierda y la arteria esplénica. Incisión en el conducto biliar congestionada, e introducir un stent 20-G en él. El posicionamiento de la endoprótesis debe garantizar el drenaje de todo el sistema de conductos biliares hiliar. Seccionar el conducto biliar distal al stent.
    3. Aislar el segmento infrahepática de la vena cava derecha por encima de la vena renal derecha.

      Perfusión
    4. Después de la ligadura de la aorta por encima del tronco celíaco, sujetar la vena porta y incisión ella. Introducir el catéter de perfusión (14 G) en la vena porta, y realizar la perfusión con 30 ml de-triptófano-cetoglutarato histidina (HTK) solución al (12 cm H2O, 4 ° C).
    5. Cortar el diafragma y la vena cava suprahepática para permitir que el líquido de perfusión fluya hacia fuera.
    6. Cortar el tronco celíaco, junto con un parche aórtico y enjuague con solución de histidina-triptófano-cetoglutarato.

      Explantación
    7. Seccionar la vena cava infrahepática justo encima de la vena renal derecha.
    8. Luego, colocar un stent con un diámetro de 0,3 mm en la vena porta y fijarlo con una ligadura. Durante la siguiente operación, la vena porta se arterializada través de la arteria renal derecha. Seccionar la vena porta distal al stent.
    9. Después de la ligadura de la vena cava suprahepática, seccionar junto con un manguito de diafragma.
    10. Explante el injerto y almacenarlo en histidina-triptófano-cetoglutarato (HTK) solución al a 4 ° C en una bolsa de plástico con hielo. Suturas Lugar de esquina (8-0 Ethilon) en la vena cava infrahepática.
  2. Operación Receptor
    1. Lleve a cabo una laparotomía media y preparar la vena cava infrahepática. Entonces aislar la arteria renal derecha y el uréter, ligar el uréter y seccionar ella. Sujete la arteria renal derecha en su origen, a continuación, ligar la vena renal derecha. Luego, después de la transección de ambos revasos nales, realizan la nefrectomía. Posteriormente, acortar la arteria renal derecha, enjuague con solución salina de heparina (40 UI de heparina solución salina / ml).
    2. Seccionar la vena renal derecha proximal a la ligadura después de sujeción proximal y distal de la vena cava infrahepática para crear un lumen ovales en la vena cava infrahepática. Enjuague la vena cava con solución salina de heparina. Implante el injerto en la región renal derecha del abdomen del destinatario.
    3. Anastomose infrahepática extremo a lado de la vena cava del donante a la recipient`s vena cava con una sutura continua 8-0 Ethilon.
    4. Después de aclarar con solución de heparina / solución salina, introducir el stent en la vena porta en la arteria renal derecha (Figura 3). Conecte la vena porta y la arteria renal con 2 puntos (8-0 Ethilon). Fijar el stent que une en la arteria renal con una ligadura (trenzado de seda negro 7-0).
    5. Para permitir la reperfusión, primero retire la pinza arterial, entonces ambosabrazaderas venosos (Figura 4).
    6. Preparar la aorta infrarrenal, luego coloque una proximal y distal y microclamp incidir la aorta justo entre las dos pinzas. Lleve a cabo una anastomosis término-lateral entre la aorta y el tronco celíaco del donante, el uso de un parche de aorta, con una sutura continua 10-0 Ethilon.
    7. Inserte el conducto biliar en el duodeno: Aplicar una sutura en bolsa de tabaco en la pared duodenal, hacer una pequeña incisión en la pared duodenal justo en el medio de la bolsa de tabaco. Introducir el conducto biliar con stent en el duodeno, y apretar la sutura en bolsa de tabaco. Finalmente, mantenga el duodeno y el conducto biliar firmemente juntos con dos puntos de sutura (Ethilon 8-0) (Figura 5).
    8. A continuación, realice una resección subtotal del hígado nativo, descrito por primera vez por Emond et al. para imitar la insuficiencia hepática aguda. 7
    9. Fijar la vena cava suprahepática del injerto, junto con un manguito de diafragma, a la pared abdominal lateral de la reincipiente con 4-0 Vicryl. Enjuague el abdomen con solución salina (Figura 6).
    10. Para la capa muscular de usar una sutura continua de Vicryl 4-0 y para la cutánea una sutura continua de Vicryl 3-0.

4. Recuperación y Manejo Postoperatorio

  1. Deje que los animales se recuperen de la anestesia bajo una lámpara infrarroja calentamiento.
  2. Inyectar buprenorfina a una dosis de 0,03-0,05 mg / kg BW sc cada 8-12 horas durante 2 días.
  3. Examine los animales en relación con el estado general y signos de enfermedad o infecciones.

5. Cálculo de la inicial Nativo Peso Hígado

Calcular el peso inicial hígado nativo de la siguiente manera: restar el peso de los lóbulos del hígado resecados del peso del hígado completo (2,66% del peso corporal (este valor con una desviación estándar de 0,49% +/- se determinó en experimentos anteriores con n = 80 animales de la misma cepa y unge)). 15

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Representative Results

La duración media del trasplante fue de alrededor de 150 min. El tiempo de isquemia fría fue de 64 +/- 7 min, el tiempo de isquemia caliente fue de menos de 25 min.

La tasa de supervivencia perioperatoria fue del 90% y la tasa de supervivencia de 6 semanas fue del 80%. La pérdida de 20% se debió a una peritonitis debido a la dislocación del stent y la fuga biliar (cuatro animales) durante la primera semana postoperatoria y debido a la neumonía, absceso intraabdominal e íleo (siete animales) durante las siguientes cinco semanas. Los animales que sobrevivieron estaban en excelente estado general.

Los parámetros de hígado-síntesis (valor de Quick: 110 +/- 7,8%, AT III: 104 +/- 6%) se encontraban dentro del rango normal de seis semanas a la operación.

En este punto del tiempo, el hígado nativo se había regenerado, mostrando un aumento de peso de 2,3 ± 0,8 g a 9,8 ± 1 g (P: 0,0065). El peso del injerto disminuyó de 3,3 ± 0,8 g a 2,3 ± 0,8 g (P: 0,06). Thpeso total de ambos e hígados estaba dentro de la relación fisiológica de peso del hígado / peso corporal (Figura 7).

En la tinción histológica de los injertos con Hematoxilina-Eosina a las 6 semanas después de HALT, hepatocitos normales se observaron con ni edema ni degeneración grasa (Figura 8). Todos los injertos mostraron una ligera proliferación de ductuli biliar y colangitis debido a la formación de lodos (Figura 8). Bajo grado intra-parenquimatosa necrosis hepatocelular se pudieron observar en sólo dos injertos. Después de seis semanas, la histología del hígado nativo no reveló alteraciones.

Figura 1
Figura 1 Representación esquemática del trasplante heterotópico auxiliar hígado (HALT) con arterialización vena porta (PVA) en humanos. Del PORTal vena (3) se arterializada a través de una bifurcación de la arteria ilíaca interposición de injerto (5), que es también el alimentador recipiente de la arteria hepática (6).

Figura 2
Figura 2. presentación esquemática del trasplante heterotópico auxiliar hígado (HALT) con arterialización de la vena porta (PVA) en la rata. La vena portal (a) se arterializada través de la arteria renal derecha (E) por un stent.

Figura 3
Figura 3. Portal arterialización de la vena durante HALT con PVA en la rata. (A) El stent en la vena porta se introduce en la arteria renal derecha. (B) El POR tal vena y la arteria renal derecha están conectados con dos suturas. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Situs después de la reperfusión del injerto a través de la vena porta arterializada en la rata. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5.-colédoco duodenostomía durante HALT en la rata. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6. Situs después de HALT con PVA en la rata. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7
Figura 7. Presentación gráfica del peso del hígado (gr) de nativo hígado, injerto ytotal del hígado, en el punto de operación de tiempo y después de seis semanas.

Figura 8
Figura 8. Corte histológico del injerto después de seis semanas, se tiñeron con hematoxilina-eosina (HE) (x100 magnificación (A) y x400 (B)). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La primera heterotópico auxiliar trasplante de hígado de rata fue descrito por Lee et al., 16 en 1966 seguido por Hess. 17 La vena porta del injerto se anastomosa con la vena porta del receptor. Durante este procedimiento, se ve comprometido el suministro de sangre venosa portal al hígado nativo.

En 1991 Hong realiza HALT con PVA a través de la arteria ilíaca del destinatario. 13 Sin regulación del flujo sanguíneo portal masiva y se produjo congestiones sinusoide.

Además Aguirrezabalaga et al., HALT realizado con PVA, sin embargo, sin prestar la atención necesaria a la regulación del flujo sanguíneo en la vena porta arterializada. 18

El uso de un stent que tiene un diámetro interior de 0,3 mm y una longitud de 8 mm se obtiene un flujo de sangre portal de media después de la reperfusión de la vena porta arterializada que está dentro del Rang fisiológica superiore. 12

El drenaje biliar es el talón de Aquiles de un trasplante de hígado. Los animales receptores se encuentran en peligro de morir debido a una fuga biliar y peritonitis. Para este fin se utilizó un stent para realizar el colédoco-duodenostomía. Además se aplicó una sutura en bolsa de tabaco con un par de suturas adicionales para evitar fugas y desconexión. En consecuencia, las complicaciones biliares se redujeron a 4%.

En este estudio actual, se realizó una resección subtotal del hígado nativo para inducir la insuficiencia hepática aguda. Esta técnica fue descrita por primera vez por Emond, es estandarizada y no muestra efectos secundarios en otros sistemas de órganos o en el injerto. 7

En 2002, publicó la técnica Palmes APOLT en la rata con una tasa de supervivencia de 70 a 80%, los animales fueron sacrificados después de dos semanas. 19 En este modelo, el lóbulo izquierdo del injerto fue trasplantado después de la resección del lóbulo izquierdo de la native hígado. Vena porta del injerto se anastomosa de extremo a extremo a la izquierda de la vena porta segmentaria del receptor, lo que resulta en dificultad quirúrgica para realizar la operación, ya que el lumen de los vasos se hace muy pequeña.

A diferencia de un trasplante de hígado ortotópico, durante el trasplante hepático heterotópico no hay fase de anhepática. Las anastomosis se pueden realizar sin ningún tiempo-presión. Por otra parte, en la posición heterotópica, no hay interferencia por el diafragma móvil. Además, la vena porta del destinatario no se sujeta, evitando así la congestión venosa del intestino delgado, bazo, páncreas y estómago.

Se obtuvieron buenos resultados a largo plazo relativos a la microcirculación del injerto, la morfología y función. 20 HALT con el flujo regulado PVA puede cerrar de forma fiable una fase de insuficiencia hepática aguda, mientras que el hígado nativo regenera. 15

HALT con el flujo regulado es un PVAn innovadora técnica, relativamente fáciles de establecer. Este modelo permite a los futuros estudios sobre la regeneración hepática y la competencia entre el hígado y el arterialización vena porta, hiperperfusión vena porta y la regulación del flujo sanguíneo portal. 20, 21

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Disclosures

Todos los autores declaran intereses en conflicto.

Acknowledgments

Este estudio fue financiado por la "Deutsche Forschungsgemeinschaft" (DFG). K. Schleimer fue apoyada por el Lise Meitner de Becas del Ministerio de Ciencia e Investigación de NRW. Nos gustaría dar las gracias a la señora Mary-Joan Blümich por su asistencia en la edición excelente. Dr. Maria Kokozidou se financió con Fresenius 2011_A61.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Braided Silk black 7-0  Ethicon Products 892100
Vicryl 3-0 Ethicon Products J285G
Vicryl 4-0 Ethicon Products J284G
Ethilon 8-0 Ethicon Products 1714G
Ethilon 10-0 Ethicon Products 7770G
Vasofix safety 14G B Braun 2758853
Vasofix safety 20G B Braun 2758818
2 French (0.012”/0.3 mm ID x 0.025”/0.6 mm OD) x 24”/60 cm polyurethane catheter Access technologies a division of Norfolk Medical, Inc., Illinois, USA CNC-2P
HTK solution, Custodiol Dr. Franz Köhler Chemie GmbH, Alsbach-Hähnlein, Germany
Isofluorane 5 % Any genericon
Heparin Any genericon
0.9% saline Any genericon
Buprenorphine Any genericon

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References

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