Isolamento e caracterização funcional de Ventricular Humano cardiomiócitos a partir de amostras cirúrgicas frescos

1Department NeuroFarBa, Division of Pharmacology, University of Florence, 2Department of Clinical and Experimental Medicine, Division of Physiology, University of Florence
Medicine

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Summary

O conhecimento atual sobre a base celular de doenças cardíacas se baseia principalmente em estudos em modelos animais. Aqui nós descrevemos e validar um novo método para obter simples cardiomiócitos viáveis ​​a partir de pequenas amostras cirúrgicas do miocárdio ventricular humano. Miócitos ventriculares humanos podem ser usados ​​para estudos eletrofisiológicos e testes de drogas.

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Coppini, R., Ferrantini, C., Aiazzi, A., Mazzoni, L., Sartiani, L., Mugelli, A., Poggesi, C., Cerbai, E. Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples. J. Vis. Exp. (86), e51116, doi:10.3791/51116 (2014).

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Abstract

Cardiomiócitos de corações doentes são submetidos a processos de remodelação complexas que envolvem mudanças na estrutura celular, acoplamento excitação contração e correntes de íons de membrana. Essas mudanças tendem a ser responsáveis ​​pelo aumento do risco arritmogênica e as alterações contráteis levando à disfunção sistólica e diastólica em pacientes cardíacos. No entanto, a maior parte da informação sobre as alterações da função dos miócitos em doenças cardíacas veio a partir de modelos animais.

Aqui vamos descrever e validar um protocolo para isolar miócitos viáveis ​​a partir de pequenas amostras cirúrgicas do miocárdio ventricular de pacientes submetidos a operações de cirurgia cardíaca. O protocolo está descrito em detalhe. Medições de cálcio e eletrofisiológicos intracelulares são relatados para demonstrar a viabilidade de uma série de medições de células individuais em cardiomiócitos ventriculares humanos obtidos com este método.

O protocolo relatado elere pode ser útil para futuras investigações de base celular e molecular das alterações funcionais do coração humano, na presença de doenças cardíacas diferentes. Além disso, este método pode ser utilizado para identificar novos alvos terapêuticos a nível celular e para testar a eficácia de novos compostos em cardiomiócitos humanos, com valor de translação directa.

Introduction

Dissecção das propriedades eletrofisiológicas do miocárdio progrediu acentuadamente após o desenvolvimento de técnicas para o isolamento individual dos miócitos cardíacos. Os recentes avanços na compreensão da excitação cardíaca Contração Coupling (EC-acoplamento) também têm sido possível graças à capacidade de isolar cardiomiócitos únicos viáveis ​​que conservam todas as propriedades fisiológicas do tecido intacto. Métodos de patch clamp são rotineiramente utilizados para estudar a função e modulação farmacológica de correntes iônicas sarcolemais cardíaca. Gravações da dinâmica de cálcio intracelular com Ca 2 + corantes sensíveis também são realizados regularmente em miócitos cardíacos individuais a partir de uma variedade de modelos saudáveis ​​e doentes, fornecendo dados vitais sobre a fisiologia da EC-acoplamento, bem como sobre as alterações patológicas de Ca 2 + intracelular homeostase levando a prejuízo mecânica e aumento da carga arritmogênica em doenças cardíacas. Informação a partir desses estudos é fundamental para a compreensão dos efeitos eletrofisiológicos e mecânicas de drogas no ambiente clínico. No entanto, existem diferenças específicas de espécies nas correntes transmembrana e nas proteínas EC-de acoplamento que são responsáveis ​​por características específicas do potencial de ação cardíaco e mecânica cardíaca. Assim, enquanto os estudos de miócitos isolados de mamíferos não humanos elucidaram as propriedades biofísicas e as funções fisiológicas dos canais iônicos transmembrana específicos e proteínas EC-acoplamento, eles não fornecem necessariamente modelos relevantes de miócitos cardíacos humanos. Isolamento de miócitos viáveis ​​do miocárdio humano é, portanto, essencial para compreender plenamente a fisiopatologia das doenças cardíacas e validar novas abordagens terapêuticas.

Tecido atrial humano está prontamente disponível como apêndices atriais estão muitas vezes descartados durante os procedimentos cirúrgicos. Estudos quantitativos iniciais do potencial de ação cardíaco humanos adultos e cu iônicarrents empregada células atriais enzimaticamente isolados 1-4. Gravações de potenciais de ação ou correntes a partir de células humanas adultas ventriculares isoladas foram posteriormente relatado 3,5-10. A maioria destes estudos utilizaram células obtidas a partir de corações de explante e utilizados ou de perfusão com colagenase de um segmento da artéria coronária ou a exposição de quantidades relativamente grandes de tecido excisado de colagenase para obter células isoladas. Esses estudos permitiram uma caracterização detalhada de uma série de correntes de íons transmembrana de cardiomiócitos do ventrículo humanos de corações saudáveis ​​e de pacientes com insuficiência cardíaca terminal. As gravações de tipo-L de Ca 2 + de corrente (I Ca-L) 5-7, a corrente de potássio para fora transitórias (I) 8, para dentro de potássio rectificador de corrente (I κ1) 8, os diferentes componentes da corrente de potássio rectificador retardado (I κ ) 9 foram relatados. Avanços e refino deo procedimento de isolamento 10, permitiu uma caracterização clara da base iônica do aumento do potencial arritmogênico na insuficiência cardíaca terminal, compreendendo acção potencial prolongamento 11, adiada após despolarizações 12 e aumentou engraçado atual 13 levando a despolarização diastólica e batimentos prematuros.

Miócitos cardíacos adultos são normalmente isolados a partir de pequenos animais por perfusão retrógrada do coração com toda a várias misturas de enzimas, uma técnica que produz rendimentos elevados de Ca 2 + as células tolerantes a 14. Isolamento de miócitos cardíacos de fragmentos de tecido é inerentemente menos bem sucedida, provavelmente devido ao acesso limitado de enzimas de miócitos individuais em comparação com a obtida por perfusão das artérias coronárias. Por causa da disponibilidade muito limitada de corações doados não utilizados, a única maneira prática de obter células ventriculares humanos normais em uma base regular é de digestio enzimátican dos fragmentos de tecido, muitas vezes muito pequenas excisadas durante procedimentos cirúrgicos eletivos. O único modelo de doença humana, que foi completamente caracterizada a nível celular é a insuficiência cardíaca terminal, devido à acessibilidade aos corações transplantados. No entanto, insuficiência cardíaca terminal ocorre numa minoria de pacientes e muitas vezes envolve uma via comum de remodelação grave de células do miocárdio, que é relativamente independente da causa subjacente 15. A capacidade de avaliar a função dos cardiomiócitos individuais de pacientes em um estágio não falha precoce da doença é fundamental para entender a fisiopatologia específica de diferentes condições hereditárias ou adquiridas. A cardiomiopatia hipertrófica (CMH) é um bom exemplo. HCM é uma comum (1/500 indivíduos) condição cardíaca hereditária caracterizada por hipertrofia cardíaca, aumento do risco e alterações contráteis arritmogénicos devido à obstrução da via de saída e disfunção diastólica 16. Cardiomiócitos de HCM corações undergo um processo de remodelação complexa, envolvendo mudanças na estrutura celular (hipertrofia, desarranjo miofibrilar) e EC-Coupling 17. No entanto, a maioria das informações de disfunção dos miócitos na CMH vem de modelos animais transgênicos. Uma vez que apenas uma minoria dos pacientes com CMH evolui para insuficiência cardíaca terminal e requer transplante cardíaco, HCM corações estão muito raramente disponíveis para o isolamento de células com métodos padrão. No entanto, pelo menos 30% dos portadores de CMH desenvolver sintomas obstrutivos, devido ao enorme fluxo de sangue do trato hipertrofia septal alterando fluxo durante a sístole (HCM) 18. A opção terapêutica disponível mais eficaz para o alívio da obstrução na CMH é a miectomia septal cirúrgica: durante o procedimento cirúrgico, uma parcela variável tamanho do septo superior é removido por abordagem da aorta trans. Esta porção do septo hipertrofiado é, por conseguinte, disponível para o isolamento de células a partir de tecido fresco.

Um método para o isolamento de ventricula humanor miócitos de, pequenas amostras de biópsia endomiocárdica transvenous único previamente desenvolvido e publicado em 19. Implementamos um método para isolar miócitos septo individuais a partir de amostras do miocárdio ventricular de pacientes submetidos à cirurgia cardíaca, incluindo pacientes com CMH submetidos a miectomia septal e pacientes submetidos a procedimentos de substituição de válvulas. Para além de uma descrição detalhada do protocolo de isolamento, electrofisiológico representativa e Ca 2 + de fluorescência as medições são apresentados, demonstrando a viabilidade dos isolados miócitos ventriculares humanos e a viabilidade de patch-clamp e intracelulares de Ca 2 + estudos.

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Protocol

Os protocolos experimentais sobre o tecido humano foram aprovados pelo comitê de ética do Careggi Hospital Universitário (2006/0024713; renovada Maio de 2009). Cada paciente deu consentimento informado por escrito.

1. Soluções e Equipamentos Preparação

As soluções são descritas na Tabela 1. Um fluxograma simplificado do processo de isolamento de células encontra-se na Figura 1.

Solução CP DB KB Tuberculose PS EB1 EB2
Reagente (mM) KH 2 PO 4 50
MgSO4 8 1.2 5 1.2 1.2
HEPES 10 10 10
adenosina 5
glicose 140 10 20 10 10 10
manitol 100
taurina 10 20 5 20 20
NaCl 113 136 113 113
KCl 4.7 85 5.4 25 4.7 4.7
MgCl2 </ Td> 1.2 5
KH 2 PO 4 0,6 30 0,6 0,6
Na 2 HPO 4 0,6 0,6 0,6
NaHCO3 12 12 12
KHCO3 10 10 10
Na-piruvato 4 4 4
BDM 10 10 10
BHBA 5 </ Td>
ácido succínico 5
EGTA 0,5
K 2-ATP 2
ácido pirúvico 5
creatina 5
KMES 115
Enzimas (U / ml) Colagenase tipo V 250 </ Td> 250
Protease Tipo XXIV 4
pH 7.4 KOH NaOH 7,3 7.1 KOH NaOH 7,35 7.2 KOH NaOH 7,3 NaOH 7,3

. Tabela 1 Soluções utilizadas para a coleta de amostras, isolamento de células e caracterização funcional de miócitos CP = solução cardioplégica.; DB = tampão de dissociação; KB = solução Kraft-Brühe; TB = tampão Tyrode; PS = solução da pipeta; EB1 = tampão de enzima 1; EB2 = tampão de enzima 2.

  1. Solução cardioplégica (CP) Preparar. CP solução pode ser armazenada a 4 ° C durante até 1 semana.
  2. Prepare Ca 2 tampão de dissociação livre de + (DB). Esta solução deve ser usado durante o dia.
  3. Preparar a solução Kraft-Brühe (KB). KB solução pode ser armazenada a 4 ° C durante até uma pequeninak.
  4. Prepare Ca tampão Tyrode livre de + 2 (TB). Esta solução deve ser usado durante o dia.
  5. Filtrar todas as soluções usando filtros de seringa, antes da utilização.
  6. Preparar o aparelho de digestão (Figura 2), um recipiente de raspagem feita de duas escovas de frente de elastómero de silicone, um dos quais rodados por um motor eléctrico. O dispositivo digestão é feito sob encomenda. Detalhes sobre o dispositivo de digestão são na Figura 8; imagens do dispositivo estão nas Figuras 2 C e 2D. Lava-se a câmara de tecido com 70% de etanol e água.

2. Coleta e Processamento de Amostras do miocárdio

  1. Verter 40 ml da solução cardiplegic (CP) num tubo de 50 ml e armazena-o em gelo durante o transporte da amostra a partir do quarto dispositivo para o isolamento de células de laboratório.
  2. Colete a amostra do miocárdio ventricular da sala operatória imediatamente após a excisão, lave-o com gelo frioSolução CP e armazená-lo no tubo. Use espécimes endocárdio excisadas do septo ventricular, entre superior durante a cirurgia de coração aberto, ponderação> 100 mg.
  3. Rapidamente transferir a amostra para a área do laboratório; iniciar o processamento da amostra dentro de 10 minutos a partir de amostra de excisão.
  4. Enquanto mantém a amostra em tampão gelado CP, retire cuidadosamente a camada fibrosa endocárdica usando tesoura fina sob estereomicroscópio; depois, cortar o tecido do miocárdio para pequenas peças (2-3 mm de comprimento). Dependendo do tamanho da amostra de tecido, cortar uma quantidade total de miocárdio ventricular entre 100 mg e 1 g para cada isolamento.
  5. Após a conclusão da picagem tecido, transfira os pedaços do miocárdio no dispositivo digestão, com gelo limpo solução CP frio. Evitar preenchendo todo o volume entre as duas escovas de silício (3-4 ml) com os pedaços do miocárdio, utilizando-se não mais do que 1 g de tecido total.

3. Lavar e digestão de miocárdio Pedaços

  1. À réer os pedaços são transferidos para a câmara de raspagem do dispositivo digestão, mudar o tampão CP na câmara de frio Ca 2 + tampão de dissociação-free (DB).
  2. Colocar o dispositivo de digestão num banho termostático, de modo para a câmara de estar em contacto com a água aquecida no banho (Figura 1). Definir o banho a 37,5 ° C e ligá-lo, a fim de aumentar lentamente a temperatura da câmara de tecido. Ligar o motor do dispositivo de digestão, a definição da velocidade de rotação de 1 volta / segundo.
  3. Realizar 3 ciclos de lavagem com DB, mudando a solução na câmara de limpeza com DB a cada 8 minutos. A DB é aquecido (37 ° C) e oxigênio saturado antes de entrar em contato com os pedaços do miocárdio.
  4. Preparar tampão de enzima 1 (EB1) por adição de 250 U / ml de colagenase de tipo V e 4 U / mL de protease do tipo XXIV solução DB. Prepare tampão da enzima 2 (EB2), adicionando 250 U / ml de colagenase tipo V a solução DB. Aquecimento (37 ° C) e oxygenate EB1 e EB2.
  5. Realizar dois ciclos de 12 min de digestão no dispositivo de digestão rotativo com 100% EB1 oxigenado (a 37 ° C). Em cada ciclo, utilizar ~ 3 ml de EB1. Remover a solução com uma pipeta de aspiração e descartá-lo após cada ciclo.
  6. Prepare a 6 tubos de 15 ml para recolha de células, e ~ 80 mL de água fria (4 ° C) solução KB para a eluição dos tampões.
  7. Realizar um primeiro ciclo de digestão de 15 minutos com 3 ml de 100% EB2 oxigenada a 37 ° C. Após o ciclo de digestão, recolher a solução contendo os primeiros miócitos dissociadas num tubo de 15 ml e dilui-se a suspensão de células com 12 ml de solução fria KB. Guarde o apartamento tubo à temperatura ambiente.
  8. Diluir a solução EB2 restante com uma quantidade igual de DB, a fim de reduzir pela metade a concentração de colagenase V para os seguintes ciclos de digestão.
  9. Realizar outras cinco ciclos de 12 min de digestão com 3 ml EB2 a 37 ° C; depois de cada um deles recolher de miócitos contendo tampão, num tubo cónico de 15 ml ediluir com 12 ml de solução KB. Armazenar as 6 células contendo os tubos à temperatura ambiente durante 30 min.

4. Resuspensão Celular e Ca 2 + Readaptação

  1. Adicionar 1 mg / ml de albumina de soro bovino (BSA) a 20 ml de tampão de Ca 2 +-Tyrode livre (TB). Filtrar a solução.
  2. Centrifugar os seis miócitos contendo tubos cônicos a 100 xg por 5 min para forçar miócitos para resolver. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em cada um dos tubos com uma quantidade variável (1-3 ml, dependendo do rendimento) de BSA contendo TB, à TA.
  3. Aumentar gradualmente a concentração de Ca2 + na célula contendo tampão através da adição de pequenas alíquotas de 100 mmol / L de solução de CaCl 2. Na primeira e na segunda etapas concentração de Ca2 + é elevado até 50 pmol / L e 100 pmol / L, respectivamente. Os seguintes passos de Ca 2 + de adição são realizadas a cada 5 min e a concentração é aumentada em 100 mmol / L em cada passo toa concentração final de 0,9 mmol / L.
  4. Avaliar o rendimento do processo de isolamento. Transferir 0,5 ml de solução contendo miócitos para a câmara de fundo de vidro de microscópio. Avaliar 15 campos do microscópio em 10x objetivo e calcular a percentagem de miócitos saudáveis ​​(por exemplo, em forma de bastonetes com estrias claras e sem inclusões significativas, Figura 2). O rendimento previsto é de cerca de 20%.

5. Avaliação Funcional de isolado cardiomiócitos.

O protocolo a seguir é um exemplo de avaliação funcional cardiomiócitos humano, incluindo gravações simultâneas de potenciais de ação e Ca 2 + intracelular fluxos.

  1. Preparar a solução de pipeta (PS) para experimentos de patch clamp na configuração de patch perfurado. A solução pode ser armazenada a -20 ° C durante até 3 meses.
  2. Adicionar 1,8 mmol / L de CaCl 2 a 2 Ca tampão Tyrode + livre (TB). Use esta solução para superfusão de cardiomiócitos durante as experiências braçadeira patch / fluorescência.
  3. Transferir 1 ml de suspensão de células para um tubo de 1,5 ml e adicionam-se 10 mmol / L e 10 ul Fluoforte Concentrado carga de potência. Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, defina o tubo na posição vertical e deixar a célula de se contentar com 5 min; ressuspender as células em Ca 2 + contendo TB.
  4. Transferir 0,25 ml de suspensão de células para um pequeno (0,5 ml), temperatura controlada microscópio montado câmara de registo, superfundidas por gravidade com um sistema microperfusor aquecido a uma taxa de fluxo de 0,3 ml / min (temperatura: 37 ± 0,5 ° C).
  5. Usando um puxador de micropipeta, preparar pipetas de fixação de membranas com um diâmetro de ponta de 3-5 um e uma resistência de 3 a 4,5 M, quando cheio com o PS.
  6. Adicionar anfotericina B para um lote de PS (250 ug / ml) e usá-lo para preencher os eléctrodos.
  7. Selecione uma célula em forma de haste com estrias claras, desprovido de inclusões, form o selo giga e esperar de 5 a 10 min, até que a resistência de acesso for inferior a 20 mohms.
  8. Provocar potenciais de ação no modo de fixação de corrente usando pulsos de curta duração (<3 ms) em diferentes frequências de estimulação (0,2 Hz, 0,5 Hz e 1 Hz, 1 min em cada freqüência). Durante a fase de gravação, ligar a iluminação de campo claro a 492 ± 3 nm e detectar Fluoforte fluorescência em 505-520 nm. Adquirir fluorescência e potencial de membrana usando sinais Digidata 1440A e 10,0 software pClamp. Repita a seqüência de gravação várias vezes, se necessário; no entanto, manter o tempo total de gravação inferior a 15 min, para cada célula.

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Representative Results

O método descrito acima foi utilizado para caracterizar as anormalidades funcionais de cardiomiócitos isolados do septo interventricular de pacientes com cardiomiopatia hipertrófica (CMH) que se submeteram à operação miectomia, em comparação com pacientes não falhando não hipertróficas cirúrgicos 21. Os resultados contidos nesta secção são derivados de trabalho 21 e que são mostrados aqui como um exemplo de como esta técnica pode ser utilizada para caracterizar as alterações da função das células do miocárdio em condições de doenças cardíacas.

Uma amostra representativa cirúrgica de um paciente com CMH é mostrado na Figura 2A. Amostras cirúrgicas foram extremamente variáveis, em termos de tamanho e espessura das estrias fibroso do endocárdio. A quantidade de tecido do miocárdio, que foi utilizado para cada um dos procedimentos de isolamento a partir de amostras de CMH foi de cerca de 1 g. Em vez disso, a quantidade de tecido utilizada para as amostras de controlo foi menor (100-500 mg.), Devido a Lower disponibilidade de tecido. O rendimento foi significativamente maior, quando as amostras de controlo foram processadas em relação à CMH, provavelmente, porque a quantidade relativa de células viáveis ​​do miocárdio dentro do tecido é reduzido em CMH miocárdio e EMF é aumentada 22. A partir destas observações concluiu-se que a quantidade necessária de tecido para a obtenção de células viáveis ​​pode ser variável, dependendo da presença ou ausência de doença do miocárdio.

As amostras foram cortadas em pedaços pequenos, como mostrado na Figura 2B. Em seguida, os pedaços foram transferidos para a câmara do dispositivo de digestão (Figura 2C) e utilizado para o isolamento de uma única célula como descrito acima (Figura 2D). Fotomicrografias representativas de uma suspensão de células obtida através do procedimento de isolamento de células a partir de uma amostra descrito septo interventricular é mostrado nas Figuras 3A e 3B; imagens ampliadas de ca ventricular únicardiomyocytes estão representados nas figuras 3C-3F. Cardiomiócitos a partir de amostras de HCM foram utilizados para gravações simultâneas de potenciais de ação e Ca 2 + intracelular variações como descritos na seção de protocolo. Vestígios simultâneas representativos mostram voltagem da membrana (acima) e Ca 2 + intracelular (abaixo) durante a estimulação em três frequências diferentes são apresentados na Figura 4: estes vestígios foram registados a partir de um único cardiomiócitos isolado a partir de uma amostra de CMH.

Resultados de estudos de patch clamp mostrou que a duração do potencial de acção (APD) registrado em várias freqüências de estimulação foi significativamente prolongada em cardiomiócitos de pacientes com cardiomiopatia hipertrófica (CMH cardiomiócitos) comparado aos controles (Figura 5A e 5B). Para verificar a manutenção de respostas fisiológicas em miócitos isolados, testámos os efeitos de isoproterenol, utilizada em 10 - 7 M (Figura 5C): β-adrenerestimulação gico produzido o encurtamento AP esperado em miócitos controlo. Desde prolongado APD leva ao aumento do risco de início após despolarizações (EADS) 23, a ocorrência de DAE, detectado como despolarizações espontâneas durante a fase de planalto da AP, foi medido. Em cardiomiócitos HCM, DAE foram significativamente mais freqüentes em relação aos controles (Figura 5D). Traço Representante mostrando vários DAE é mostrado na Figura 5E

Para testar se mais APD e íon atuais anomalias podem afetar os mecanismos de acoplamento excitação-contração em cardiomiócitos HCM, as propriedades de Ca 2 + intracelular variações foram avaliadas durante a estimulação. A amplitude de Ca 2 + transientes evocada em condições de corrente-clamp foram semelhantes em comparação com CMH controlar cardiomiócitos (Figura 6A). Por outro lado, a cinética de Ca 2 + transiente, eram significativamente mais em CMH (Figura6B). Além disso, intracelular diastólica Ca 2 + concentração foi marcadamente maior em relação ao controle HCM cardiomiócitos (Figura 6C) e aumentou de forma mais proeminente sobre aumento na freqüência de estimulação.

Notavelmente, os cardiomiócitos isolados com esse método a partir de amostras humanas ventriculares também têm sido utilizados com sucesso para outras aplicações, incluindo as gravações de tensão-clamp de correntes transmembranares específicos (Figura 7A), Ca 2 + intracelular e / ou celular encurtando gravações durante a estimulação de campo eléctrico (Figura 7B) e avaliação da estrutura fina do sarcolema através de microscopia confocal e etiquetas fluorescentes de membrana (Figura 7C).

Figura 1 Figura 1. Fluxograma do procedimento de isolamento celular.

Figura 2
Figura 2. Processamento de amostras para isolamento de células ventriculares. (A) Imagem representativa mostrando uma amostra de miocárdio ventricular de um paciente com CMH que foram submetidos à operação miectomia septal. Calibração bar = 5 milímetros. (B) Pedaços de corte de tecido ventricular de uma peça cirúrgica ventriculares, a serem utilizados para o isolamento de células. Bar Calibração = 5 mm. (C) Imagens do dispositivo de digestão. O dispositivo compreende uma câmara de digestão com duas escovas de silicone: a escova superior é capaz de rodar quando movido por um motor (D) Imagem mostrando o dispositivo de digestão no banho com termostato durante a digestão enzimática de tecido ventricular.. p>

Figura 3
Figura 3. Isolados cardiomiócitos do ventrículo humano. (AB) O painel mostra fotomicrografias de dois campos de microscópio (10x) mostrando objetivas suspensões de cardiomiócitos representativas. De nota, cerca de 30% das células são em forma de haste e apresentam estrias claras. Bar Calibração = 100 mm. (CE) Imagens representativas de 3 cardiomiócitos humanos isolados a partir de uma amostra de um paciente HCM (40x objetiva). Bar Calibração = 20Hm. (F) imagem que mostra um cardiomiócitos ventriculares humanos tocados pela ponta da pipeta patch para gravações. Bar Calibração = 20Hm.

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Figura 4. Gravação simultânea do potencial de membrana e de cálcio intracelular. Traço representativas mostrando o potencial de membrana (acima) e do cálcio intracelular (abaixo) gravado a partir de um único miócitos isolados a partir de uma amostra de CMH. O miócitos é estimulada através da pipeta patch 0,2 Hz, 0,5 Hz e 1 Hz.

Figura 5
Figura 5. Alterações de potenciais de ação em cardiomiócitos ventriculares a partir de amostras de HCM. (A) Representante sobreposta potenciais de ação provocou a 0,2 Hz, 0,5 Hz e 1 Hz de um dos miócitos controle (esquerda, traços de cinza) e um dos miócitos HCM (direita, traços negros ). (B) Média duração do potencial de ação em 90% de repolarização (APD90%) no HCM (n = 81) ecardiomiócitos de controle (n = 29) nas três freqüências de estimulação testadas. (C) Ocorrência de DAE em cardiomiócitos de pacientes com CMH e amostras de controle. (D) Sobreposta potenciais de ação em 0,5 Hz a partir de um controle dos miócitos na ausência (traço contínuo) e na presença de 10 -7 M de isoproterenol. (E) traço representativas mostrando o potencial de membrana de cardiomiócitos de um paciente CMH exibindo vários despolarizações espontâneas que ocorrem durante a fase de patamar (cedo após despolarizações, DAE), marcados por setas. Os estímulos são marcadas por linhas curtas abaixo do traço. ** = P <0,01 teste-t não emparelhado. Todos os painéis da figura são modificados com a permissão de Coppini et al. 21, 2012.

Figura 6
Figura6. Alterações de transientes de cálcio em cardiomiócitos do ventrículo a partir de amostras de HCM. (A) Representante sobreposta transientes de cálcio provocou durante a estimulação de 0,2 Hz através da pipeta de patch em um dos miócitos controle (cinza) e uma célula de HCM (preto). Notavelmente, a amplitude de Ca 2 + transientes não difere entre as duas células (B) cinética de Ca 2 + transientes em HCM (n = 42) e controle (n = 24): cardiomiócitos. Tempo de estímulo para o pico transitório (TP ), o tempo de pico de 50% de decomposição (T50%) e no tempo de pico de 90% de decaimento do transiente (T90%) são mostrados. (C) traços longos representativos mostram Ca 2 + intracelular durante a estimulação em três frequências diferentes e CMH miócitos de controle, com destaque para o aumento do Ca 2 + diastólica em altas taxas de estimulação na miócitos HCM. (D) Média de Ca 2 + diastólica na CMH (n = 42) e controle (n = 24) cardiomiócitos em 3 diferentes ra pacingtes. ** = P <0,01 teste t não pareado. Todos os painéis da figura são modificados com a permissão de Coppini et al. 21, 2012.

Figura 7
.. Figura 7 aplicativos adicionais experimentais usando miócitos ventriculares humanos (A) À esquerda: representante sobreposta traços mostrando-type L Ca 2 + corrente registou sob braçadeira de tensão em diferentes tensões de membrana com um protocolo específico (ver 21 para detalhes). Direita: média do tipo L Ca 2 + densidade de corrente de pico de 18 células isoladas a partir de amostras de HCM em membrana diferente. Tensões. (B) intracelular de Ca 2 + rastrear gravada a partir de um dos miócitos do ventrículo durante estimulação do campo eléctrico a 1 Hz. (C) confocal imagem de um cardiom ventricularyocyte a partir de uma amostra de CMH marcadas com um corante fluorescente ligada à membrana (Di-3-ANEPPDHQ). De notar que a densidade da ttubules é baixo, sugerindo a remodelação da membrana morfológica na CMH.

Figura 8
Figura 8. O dispositivo de digestão. (AB) Componentes do dispositivo de digestão. Um motor de rotação com velocidade variável é ligada a um primeiro braço de plástico, o qual está ligado a um segundo. O segundo braço de plástico é removível e ligada ao escova superior. Brushes são feitos com elastômero de silicone. Um molde negativo PTFE, com 100 furos espaçados ~ 1.5 mm, foi usado para lançar as escovas de silicone líquido. O espaço interior do molde tem 1,9 centímetros de diâmetro e é de 6 mm de espessura, produzindo escovas do mesmo tamanho. Os furos localizados em um dos lados do molde são feitas de modo a produzir 8 mm de comprimento, quando as cerdas de escovassão moldados e removidos do molde. Depois de o silicone líquido é colocado dentro do molde, pelo menos, 48 ​​horas são necessárias para o endurecimento completo. As escovas estão montadas no interior de um tubo de vidro (diâmetro interior = 2 cm, 2 mm de espessura) e a câmara cilíndrica formada pelas duas escovas e as paredes de vidro hermeticamente fechado por dois anéis de vedação de borracha. Escovas têm de ser empurrados um para o outro; o fundo é colada sobre uma base de plástico, enquanto a superior é colada à extremidade de plástico do braço do motor e, portanto, é capaz de rodar. (C) vista da escova superior ampliada. De notar que a escova tem de ser colada à extremidade do braço de motor, a fim de que o mesmo rode (D) Os componentes da câmara são mostrados na sua posição final. O espaço entre as duas escovas (a câmara real) é ~ 2 cm de largura e 7-8 mm de altura; este espaço encaixa facilmente 3-4 ml de tampão, excepto até 1 g de tecido do miocárdio.

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Discussion

Nós descrevemos e validado um método para isolar os miócitos viáveis ​​a partir de amostras cirúrgicas do miocárdio ventricular humano. A partir de protocolos descritos anteriormente que tinham sido usados ​​com sucesso para células isoladas a partir de amostras cirúrgicas atriais, a técnica para permitir a separação de miócitos viáveis ​​individuais de miocárdio ventricular doente foi desenvolvido e afinado. Os primeiros relatos mostraram que o isolamento dos cardiomiócitos individuais de pedaços de tecido atrial e ventricular comprometida seletivamente repolarização correntes de potássio, resultando em propriedades eletrofisiológicas alteradas e respostas aos estímulos fisiológicos 8,24, ao passo que a entrega da enzima contendo tampão via perfusão coronária não prejudicou retificador retardado correntes em células isoladas 25. Infelizmente, o isolamento de miócitos ventriculares de humanos a partir de amostras cirúrgicas do miocárdio ventricular não pode ser realizada por perfusão coronária já que a integridade de ramos coronáriosestá perdido, em desacordo com corações explante. Cardiomiócitos isolados de pedaços do miocárdio usando o nosso método de exibir uma clara adaptação da duração do potencial de ação em resposta às mudanças de freqüência de estimulação ou β estimulação adrenérgica. Para que tais respostas para ocorrer, a integridade dos canais de atraso retificador de potássio é necessária 26-28, sugerindo a integridade global desses canais não é prejudicada pelo nosso método de isolamento. Além disso, as células isoladas com os nossos métodos de mostrar não só respostas eletrofisiológicas normais (Figuras 3 e 4), mas também mostrar transientes de cálcio da forma esperada e duração (Figuras 5 e 3) e organização sarcomérica regular (Figura 2) e propriedades (não encurtando mostrados), sugerindo que a integridade estrutural global dessas células é preservada por este procedimento de isolamento. O principal avanço deste método sobre anteriortécnicas é fornecida pelo dispositivo de digestão recentemente concebido, que fornece agitação mecânica suave de pedaços de tecido, permitindo a separação de células individuais, sem danos excessivos. Além disso, a utilização do dispositivo de digestão nos permitiu empregar uma menor concentração de enzimas no tampão de isolamento de células; em particular que está a utilizar uma concentração muito menor de protease não selectiva em comparação com os métodos anteriormente relatadas 24. O dispositivo é feito sob medida no nosso laboratório: esquemas de construção são apresentados na Figura 8.

O design e estrutura simples torna muito fácil de replicar para um resultado de sucesso deste protocolo. A lenda a Figura 8 também descreve os procedimentos necessários para a produção de escovas de silicone e construção da câmara de raspagem. Devido às vantagens do dispositivo de digestão, um número relativamente alto de células viáveis ​​podem ser obtidas a partir de uma quantidade relativamente baixa de tecido ventricular (tão baixas quanto 100 mg).Um método publicado anteriormente 19 foi mostrado para fornecer uma cálcio miócitos tolerantes a partir de pequenas biópsias (até <20 mg). No entanto, o rendimento dos miócitos relatado foi muito baixo e os autores não mostram se células isoladas com que o método fosse viável para a caracterização do ciclismo de cálcio intracelular e função contrátil. Esta técnica é potencialmente aplicável a muitos pacientes cirúrgicos, desde pequenas porções do septo interventricular são freqüentemente retirado durante o procedimento de substituição da válvula (substituição por exemplo. Válvula aórtica). No entanto, o ponto crucial para obter um isolamento bem sucedido é um rápido início do processo após a coleta da amostra a partir da sala de operações. Portanto, é necessário para o laboratório de células de estar em estreita proximidade com a clínica de cirurgia cardíaca, para que esta técnica seja frutífera. Além disso, uma actividade enzimática adequada também é extremamente importante para um isolamento com sucesso. Uma vez que a actividade de protease não selectiva of cada lote de colagenase é geralmente não totalmente testado, cada lote é provável que um desempenho diferente durante o isolamento celular. Portanto, é essencial para afinar a concentração final de colagenase, a fim de alcançar os melhores resultados. Sugerimos observando suspensão de células ao microscópio, em cada ciclo, a fim de ter certeza de que células viáveis ​​começam a aparecer no ciclo 3 aparecimento precoce de células sugere atividade enzimática excessiva e pede para a redução da concentração de enzima.; aparecimento de células após o ciclo de actividade da enzima 3 sugere insuficiente. Na nossa experiência, este é o indicador mais eficazes da concentração de enzima correcta.

Temos utilizado com sucesso este método para obter os cardiomiócitos single do septo inter-ventricular de pacientes com CMH com obstrução da via de saída do ventrículo esquerdo submetidos a miectomia septal cirúrgica, bem como de não-falência pacientes cirúrgicos não-hipertróficas 21. Os resultados de que o papelmostram que os miócitos isolados com este método pode ser utilizado para a avaliação electrofisiológica completa com técnicas de fixação de membranas, enquanto simultaneamente avaliar anomalias CE-acoplamento, por gravação dinâmica do cálcio intracelular, com corantes fluorescentes. O procedimento de gravação aqui descrito nos permitiu recolher vários parâmetros fisiológicos de células com uma única gravação de cada célula, produzindo, assim, uma grande quantidade de dados com um número limitado de células e amostras. Graças a essas vantagens, este método tem sido utilizado com sucesso para caracterizar as anormalidades funcionais específicas de cardiomiócitos ventriculares de pacientes com CMH, em comparação com pacientes não hipertróficas 21. Anormalidades de correntes de íons e duração do potencial de ação, bem como anomalias cinéticos od intracelular de Ca 2 + ciclismo foram claramente identificadas através desta técnica, com alta reprodutibilidade. Além disso, têm mostrado que o tratamento com um inibidor selectivo de Na + tardia vs. placebo em pacientes com CMH 29, que está actualmente em curso.

Humana disponibilidade amostra cardíaca é relativamente modesto, mesmo em centros especializados, e pode limitar a ampla aplicabilidade desta técnica. No entanto, a qualidade das informações que podem ser obtidos diretamente a partir de amostras de pacientes sobre as mudanças de doenças relacionadas em função dos cardiomiócitos é comparável ao alcançáveis ​​a partir de modelos animais de HCM e outras doenças cardíacas. Dadas as diferenças entre as extensasfisiologia dos miócitos cardíacos humanos e murinos, os dados da avaliação funcional dos miócitos humanos pode ser extremamente valiosa. Como conclusão, acreditamos que futuras aplicações desta técnica pode contribuir significativamente para o conhecimento das doenças cardíacas, uma vez que o nosso protocolo oferece a possibilidade de executar um conjunto completo de avaliações funcionais diretamente sobre as células de amostras de pacientes, com o valor de translação imediato.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela UE (STREP Projeto 241577 "grande coração," 7 º Programa-Quadro Europeu, CP), Menarini International Operations Luxembourg (AM), Telethon GGP07133 (PB) e Gilead Sciences (AM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791
Magnesium sulfate heptahydrate(MgSO4*7H2O) Sigma-Aldrich M1880
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Adenosine Sigma-Aldrich A9251
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270
Mannitol Sigma-Aldrich M4125
Taurine Sigma-Aldrich T0625
Potassium hydroxide (KOH) Sigma-Aldrich P5958
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9333
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) Sigma-Aldrich S7907
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S6297
Potassium bicarbonate (KHCO3) Sigma-Aldrich 237205
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P2256
2,3-Butanedione monoxime Sigma-Aldrich B0753
Sodium hydroxide(NaOH) Sigma-Aldrich S8045
L-Glutamic acid monopotassium salt monohydrate Sigma-Aldrich 49601
Pyruvic acid Sigma-Aldrich 107360
3-Hydroxybutyric acid Sigma-Aldrich 166898
Adenosine 5′-triphosphate dipotassium salt dihydrate (K2-ATP) Sigma-Aldrich A8937
Creatine Sigma-Aldrich C0780
Succinic Acid Sigma-Aldrich S3674
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) Sigma-Aldrich E0396
Albumin from bovine serum Sigma-Aldrich A0281
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M8266
Collagenase from Clostridium histolyticum, Type V Sigma-Aldrich C9263
Proteinase, Bacterial, Type XXIV Sigma-Aldrich P8038
Calcium chloride solution, ~1 M in H2O Sigma-Aldrich 21115
Calcium chloride 0.1 M solution Sigma-Aldrich 53704
Potassium methanesulfonate Sigma-Aldrich 83000
FluoForte Reagent Enzo Life Sciences ENZ-52015
Powerload concentrate, 100X Life Technologies P10020
Perfusion Fast-Step System Warner Instruments VC-77SP
Amphotericin B solubilized Sigma-Aldrich A9528
Multiclamp 700B patch-clamp amplifier Molecular Devices
Digidata 1440A Molecular Devices
pClamp10.0  Molecular Devices
Digestion Device CUSTOM CUSTOM The device is custome made in our laboratory using plastic tubes, cast Sylgard and a motor; it is described in detail in Figure 1C-1D and in Figure7. We can provide further details if requested.
Silicone elastomer for the digestion device's brushes Dow Corning SYLGARD® 184
Variable speed rotating motor for the digestion device Crouzet Crouzet 178-4765
Mold for brushes casting N.A. N.A. The mold is custom made from standard PTFE 2.5 cm diameter rods.

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References

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