Isolering og funktionel karakterisering af human Ventrikulær kardiomyocytter fra Fresh Kirurgiske Prøver

1Department NeuroFarBa, Division of Pharmacology, University of Florence, 2Department of Clinical and Experimental Medicine, Division of Physiology, University of Florence
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Aktuel viden om den cellulære grundlag af hjertesygdomme meste afhængig af undersøgelser af dyremodeller. Her beskriver vi og validere en ny metode til at opnå en enkelt levedygtige cardiomyocytter fra små kirurgiske prøver af human ventrikulær myokardiet. Menneskelige ventrikelmyocytter kan bruges til elektrofysiologiske undersøgelser og narkotika testning.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Coppini, R., Ferrantini, C., Aiazzi, A., Mazzoni, L., Sartiani, L., Mugelli, A., Poggesi, C., Cerbai, E. Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples. J. Vis. Exp. (86), e51116, doi:10.3791/51116 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kardiomyocytter fra syge hjerter er udsat for komplekse remodeling processer, der involverer ændringer i cellestruktur, excitation sammentrækning kobling og membran ionstrømme. Disse ændringer vil sandsynligvis være ansvarlige for den øgede arytmogene risiko og de kontraktile ændringer, der fører til systolisk og diastolisk dysfunktion i hjertepatienter. Imidlertid har de fleste oplysninger om de ændringer af myocyt funktion i hjertesygdomme kommer fra dyremodeller.

Her er vi beskrive og validere en protokol til at isolere levedygtige myocytes fra små kirurgiske prøver af ventrikulære myokardiet fra patienter, der gennemgår hjertekirurgi operationer. Protokollen er beskrevet i detaljer. Elektrofysiologiske og intracellulære calcium målinger er rapporteret at demonstrere muligheden for en række encellede målinger i human ventrikulære cardiomyocytter opnået med denne metode.

Protokollen rapporterede hanre kan være nyttige for fremtidige undersøgelser af den cellulære og molekylære grundlag for funktionelle ændringer af det menneskelige hjerte i tilstedeværelsen af ​​forskellige hjertesygdomme. Endvidere kan denne metode anvendes til at identificere nye terapeutiske mål på cellulært niveau og for at teste effektiviteten af ​​nye forbindelser på humane cardiomyocytter med direkte translationel værdi.

Introduction

Dissektion af elektrofysiologiske egenskaber af myokardiet er skredet markant efter udvikling af teknikker for enkelt hjerte-myocyt isolation. Nylige fremskridt i forståelsen af ​​hjerte Excitation Sammentrækning Kobling (EF-kobling) er også blevet gjort muligt ved evnen til at isolere levedygtige enkelt cardiomyocytter, der bevarer alle de fysiologiske egenskaber af intakt væv. Patch clamp metoder rutinemæssigt anvendes til at studere funktionen og farmakologisk modulation af hjerte sarcolemmal ionstrømme. Optagelser af intracellulære calcium dynamik med Ca 2 + følsomme farvestoffer er også regelmæssigt udføres på enkelte hjertemyocytter fra en række sunde og syge modeller, der giver vigtige oplysninger om fysiologi EF-Kobling samt på de patologiske ændringer i intracellulær Ca 2 + homeostase fører til mekanisk svækkelse og øget arytmogene byrde i hjertesygdomme. Information fra disse studier er afgørende for at forstå de elektrofysiologiske og mekaniske virkninger af lægemidler i kliniske omgivelser. Men der er artsspecifikke forskelle i transmembrane strømninger og i EF-Hunstik proteiner, der tegner sig for specifikke træk ved hjertets handling potentiale og hjerte mekanik. Således, mens undersøgelser af myocytter isoleret fra ikke-humane pattedyr har belyst de biofysiske egenskaber og fysiologiske roller specifikke transmembrane ionkanaler og EF-Hunstik proteiner, har de ikke nødvendigvis relevante modeller for humane hjertemyocytter. Isolering af levedygtige myocytes fra menneskelig myokardiet er derfor vigtigt at forstå patofysiologien af ​​hjertesygdomme og validere nye terapeutiske tilgange.

Humant atrialt væv er let tilgængelig som atriale vedhæng ofte kasseres under kirurgiske procedurer. Indledende kvantitative undersøgelser af voksne hjerte-virkningspotentialer menneskelige og ioniske currents ansat enzymatisk isolerede atrielle celler 1-4. Optagelser af handling potentialer eller strømninger fra isolerede voksne humane ventrikulære celler er efterfølgende blevet rapporteret 3,5-10. De fleste af disse undersøgelser har anvendt celler fra eksplanterede hjerter og anvendt enten collagenase perfusion af en koronararterie segment eller eksponering af relativt store mængder af udskåret væv collagenase til opnåelse af isolerede celler. Disse undersøgelser have en detaljeret karakterisering af et antal transmembrane ionstrømme fra humane ventrikulære kardiomyocytter fra sunde hjerter og fra patienter med terminal hjertesvigt. Optagelser af L-typen Ca2 + strøm (I Ca-L) 5-7, transient udadgående kaliumstrøm (I) 8, aktiv ensretter kalium (I κ1) 8, de forskellige komponenter af forsinkede ensretter kalium (I κ ) 9 er blevet rapporteret. Forskud og raffinering afisolation procedure 10, gav en klar karakterisering af den ioniske grundlag af den øgede arrhythmogene potentiale i terminal hjertesvigt, omfattende virkningspotentiale forlængelse 11, forsinket efter depolariseringer 12 og øget sjov strøm 13, der fører til diastolisk depolarisering og præmature beats.

Voksen hjertemyocytter normalt isoleres fra små dyr ved retrograd perfusion af hele hjertet med forskellige enzymblandinger, en teknik, der producerer høje udbytter af Ca 2 +-tolerante celler 14. Isolering af hjertemyocytter fra fragmenter af væv i sig selv er mindre vellykket sandsynligvis på grund af den begrænsede adgang af enzymer til individuelle myocytter sammenlignes med den, der opnås ved perfusion af koronararterier. På grund af den meget begrænsede tilgængelighed af ubrugte donorhjerter, den eneste praktiske måde at opnå normale humane ventrikulære celler på en regelmæssig basis er ved enzymatisk digestion af de ofte meget små væv fragmenter skåret under elektive kirurgiske procedurer. Den eneste sygdomsmodel menneske, som er blevet grundigt karakteriseret på celleniveau er terminal hjertesvigt på grund af adgang til transplanterede hjerter. Forekommer imidlertid terminal hjertesvigt hos et mindretal af patienterne og ofte indebærer en fælles vej af alvorlig ombygning af myokardieceller, hvilket er relativt uafhængig af den underliggende årsag 15. Evnen til at vurdere funktionen af ​​enlige cardiomyocytes fra patienter på et tidligere ikke undlade stadium af sygdommen er afgørende at forstå den specifikke patofysiologi forskellige nedarvede eller erhvervede tilstande. Hypertrofisk kardiomyopati (HCM) er et sigende eksempel. HCM er en almindelig (1/500 individer) arvelig hjertesygdom karakteriseret ved hjertehypertrofi, øget arytmogene risiko-og kontraktile ændringer på grund af udstrømning tarmkanalen obstruktion og diastolisk dysfunktion 16. Kardiomyocytter fra HCM hjerter undergo en kompleks remodeling processer, der involverer ændringer i cellestruktur (hypertrofi, myofibrillar uorden) og EF-Kobling 17. Imidlertid har de fleste oplysninger om myocyt dysfunktion i HCM kommer fra transgene dyremodeller. Da kun et mindretal af HCM patienter udvikler mod terminal hjertesvigt og kræver hjertetransplantation, er meget sjældent tilgængelige for celleisolering med standardmetoder HCM hjerter. Men mindst 30% af HCM patienter udvikler obstruktive symptomer på grund af massiv septal hypertrofi ændre udstrømning tarmkanalen blodgennemstrømning under systole (HCM) 18. Den mest effektive tilgængelige terapeutisk mulighed for lindring af obstruktion i HCM er kirurgisk septal myectomy: I løbet af denne kirurgiske procedure, er en variabel størrelse del af øvre septum fjernes ved trans aorta tilgang. Denne del af hypertrophied septum er derfor tilgængelig for celle isolation fra frisk væv.

En fremgangsmåde til isolering af humant ventricular myocytter fra enkelte, små transvenøse endomyokardiel biopsipræparater tidligere har været udviklet og udgivet 19. Vi implementerede en metode til at isolere enkelte septumdefekter myocytes fra ventrikulære myocardium prøver fra patienter, der gennemgår hjertekirurgi, herunder patienter med HCM gennemgår septal myectomy og patienter, der gennemgår ventil udskiftning procedurer. Ud over en detaljeret beskrivelse af isolation protokollen, repræsentativ elektrofysiologiske og Ca 2 + fluorescens målinger præsenteres, dokumentere levedygtigheden af de isolerede humane ventrikelmyocytter og gennemførligheden af patch clamp og intracellulære Ca 2 + studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De eksperimentelle protokoller om humant væv blev godkendt af den etiske komité i Careggi University Hospital (2006 / 0.024.713; fornyet maj 2009). Hver patient gav skriftligt informeret samtykke.

1. Løsninger og udstyr Forberedelse

Løsninger er beskrevet i tabel 1. Et forenklet rutediagram over celleisolering procedure findes i figur 1..

Opløsning CP DB KB TB PS EB1 EB2
Reagens (mM) KH 2 PO4 50
MgSO4 8. 1.2 5. 1.2 1.2
HEPES 10 10 10
adenosin 5.
glukose 140 10 20 10 10 10
mannitol 100
taurin 10 20 5. 20 20
NaCl 113 136 113 113
KCl 4.7 85 5.4 25 4.7 4.7
MgCl2 </ Td> 1.2 5.
KH 2 PO4 0.6 30 0.6 0.6
Na 2 HPO 4 0.6 0.6 0.6
NaHCO3 12 12 12
KHCO3 10 10 10
Na-pyruvat 4. 4. 4.
BDM 10 10 10
BHBA 5 </ Td>
ravsyre 5.
EGTA 0.5
K 2-ATP 2
pyrodruesyre 5.
kreatin 5.
KMES 115
Enzymer (U / ml) Collagenase type V 250 </ Td> 250
Protease Type XXIV 4.
pH 7.4 KOH 7.3 NaOH 7.1 KOH 7,35 NaOH 7.2 KOH 7.3 NaOH 7.3 NaOH

. Tabel 1 Løsninger bruges til prøvetagning, celleisolering og funktionel karakterisering af myocytter CP = cardioplegisk løsning.; DB = dissociation buffer; KB = Kraft-Bruhe opløsning; TB = Tyrode buffer; PS = pipette løsning; EB1 = enzymbuffer 1; EB2 = enzymbuffer 2.

  1. Forbered cardioplegisk (CP) løsning. CP opløsning kan opbevares ved 4 ° C i op til 1 uge.
  2. Forbered Ca2 +-fri dissociation buffer (DB). Denne løsning bør anvendes inden for dagen.
  3. Forbered Kraft-Bruhe (KB) løsning. KB Opløsningen kan opbevares ved 4 ° C i op til 1 week.
  4. Forbered Ca2 +-fri Tyrode buffer (TB). Denne løsning bør anvendes inden for dagen.
  5. Alle opløsninger filtreres ved hjælp sprøjtefiltre før brug.
  6. Forbered digestionsindretningen (figur 2), en skraber beholder fremstillet af to modstående børster af silikone elastomer, hvoraf den ene er roteret med en elektrisk motor. Digestionsindretningen er specialfremstillede. Oplysninger om digestionsindretningen er i figur 8; billeder af enheden er i figur 2 C og 2D. Vask vævet kammer med 70% ethanol og vand.

2.. Indsamling og behandling af myokardial Prøver

  1. Hæld 40 ml cardiplegic (CP) opløsning i en 50 ml rør og gemme det i is i prøven transport fra den operative rum til cellen isolation lab.
  2. Saml de ventrikulære myokardie eksemplar fra den operative rum umiddelbart efter excision, vask det med iskoldCP løsning, og gemme det i røret. Brug endokardiale prøver udskåret fra den øvre inter ventrikelseptumdefekt under åben hjertekirurgi, vægtning> 100 mg.
  3. Hurtigt overføre prøven til laboratoriet område; starte prøvebehandling inden 10 min fra prøven excision.
  4. Mens du holder modellen i iskold CP buffer, forsigtigt fjerne endokardiale fibrotiske lag ved hjælp af fine saks under et stereomikroskop; bagefter, skære myokardie væv til små stykker (2-3 mm lang). Afhængig af vævsprøve størrelse, klippe et samlet beløb på ventrikulære myokardiet mellem 100 mg og 1 g for hver isolation.
  5. Ved afslutningen af ​​væv hakning, overføre myokardiets bidder i fordøjelsen enhed, med ren iskold CP løsning. Undgå udfylde hele volumenet mellem de to silicium børster (3-4 ml) med myokardiale bidder uden brug af mere end 1 g af den samlede væv.

3.. Vask og fordøjelse af Myocardial Chunks

  1. Aftis klumper overføres til skrabning kammer digestionsindretningen ændre CP buffer i kammeret med koldt Ca 2 +-fri dissociation buffer (DB).
  2. Placer digestionsindretningen i et termostatisk bad, for kammeret for at være i kontakt med det opvarmede vand i badet (figur 1). Indstil badet til 37,5 ° C, og tænd det, med henblik på langsomt at hæve temperaturen af ​​vævet kammeret. Tænd motor digestionsindretningen, indstille rotationshastigheden til 1 omdrejning / sekund.
  3. Udfør 3 vaskecyklusser med DB, ændre løsningen i kammeret med rent DB hver 8 min. BF opvarmes (37 ° C), og oxygen mættet før at komme i kontakt med myocardiale bidder.
  4. Forbered enzymbuffer 1 (EB1) ved tilsætning af 250 U / ml collagenase type V og 4 U / ml Protease Type XXIV til DB løsning. Forbered enzym buffer 2 (EB2) ved at tilføje 250 U / ml Collagenase type V til DB løsning. Varm op (37 ° C) og oxygenate EB1 og EB2.
  5. Udføre to 12 min cyklusser af fordøjelse i roterende fordøjelse enhed med 100% oxygeneret EB1 (ved 37 ° C). Ved hver cyklus, skal du bruge ~ 3 ml EB1. Fjern løsning med pipette aspiration og kassér den efter hver cyklus.
  6. Forbered 6 15 ml rør til celleudtagningsmetoden og ~ 80 ml koldt (4 ° C) KB opløsning til eluering af de buffere.
  7. Udfør en første 15 min fordøjelse cyklus med 3 ml 100% iltet EB2 ved 37 ° C. Efter fordøjelsen cyklus, indsamle opløsningen indeholdende de første dissocierede myocytter i et 15 ml rør og fortyndes cellesuspensionen med 12 ml kold KB løsning. Opbevar røret flade ved stuetemperatur.
  8. Den resterende EB2 fortyndes med et tilsvarende beløb af DB for at halvere koncentrationen af ​​collagenase V for de følgende fordøjelsen cyklusser.
  9. Udføre andre 5 12 min fordøjelse cykler med 3 ml EB2 ved 37 ° C; efter hver af dem samle af myocyt puffer i et 15 ml konisk rør ogfortyndes med 12 ml KB løsning. Opbevar 6 celle indeholdende rør ved stuetemperatur i 30 minutter.

4.. Cell Resuspension og Ca 2 + omskoling

  1. Tilsæt 1 mg / ml bovint serumalbumin (BSA) til 20 ml Ca2 +-fri Tyrode buffer (TB). Opløsningen filtreres.
  2. Centrifuger de seks myocyt indeholder koniske rør ved 100 xg i 5 min for at tvinge myocytter at slå sig ned. Fjern supernatanten og resuspender cellerne i hvert rør med en variabel mængde (1-3 ml, afhængigt af udbytte) af BSA indeholdende TB ved stuetemperatur.
  3. Gradvist øge Ca 2 +-koncentration i den celle, der indeholder puffer ved tilsætning af små portioner af 100 mmol / l CaCl2-opløsning. I det første og andet trin Ca2 +-koncentration er hævet op til 50 mmol / l og 100 mmol / l hhv. Følgende Ca 2 + additionssalte trin udføres hver 5 min, og koncentrationen er hævet med 100 pmol / L på hvert trin toa slutkoncentration på 0,9 mmol / L.
  4. Vurdere udbyttet af isolation procedure. Overfør 0,5 ml myocyt opløsning på glasbund kammer i et mikroskop. Evaluer 15 mikroskopfelter 10x objektiv forstørrelse og beregne andelen af sunde myocytter (f.eks stavformede celler med klare Rillerne og ingen signifikante inklusioner, figur 2). Det forventede afkast er omkring 20%.

5.. Funktionel Evaluering af Isoleret cardiomyocytes.

Følgende protokol er et eksempel på menneskelig cardiomyocyte funktionel vurdering, herunder samtidige optagelser af action potentialer og intracellulære Ca 2 + flusmidler.

  1. Forbered pipette løsning (PS) til patch clamp eksperimenter i perforeret patch konfiguration. Opløsningen kan opbevares ved -20 ° C i op til 3 måneder.
  2. Tilføj 1,8 mmol / l CaCl2 til Ca2 +-fri Tyrode buffer (TB). USE denne løsning for superfusion af kardiomyocytter under patch clamp / fluorescens eksperimenter.
  3. Overfør 1 ml cellesuspension til et 1,5 ml rør og tilsættes 10 mmol / L Fluoforte og 10 pi kraftladning koncentrat. Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur. Bagefter sætte røret i lodret position og forlade cellen til at nøjes med 5 min; cellerne resuspenderes i Ca2 + indeholdende TB.
  4. Overfør 0,25 ml cellesuspension til en lille (0,5 ml), temperaturkontrolleret mikroskop monteret optagelse kammer superfusioneret af tyngdekraften med en opvarmet microperfusor systemet ved en strømningshastighed på 0,3 ml / min (temperatur: 37 ± 0,5 ° C).
  5. Med en mikropipette aftrækker, forberede patch clamp pipetter med en spids diameter på 3 til 5 m og en modstand på 3 til 4,5 m når den er fyldt med PS.
  6. Tilføj amphotericin B til en batch af PS (250 mg / ml) og bruge det til at fylde elektroderne.
  7. Vælg en stang formet celle med klare striber, blottet for indeslutninger, form Giga sæl og vent 5 til 10 min, indtil adgang modstand falder under 20 MOhm.
  8. Fremkalde handling potentialer i strømtang tilstand ved hjælp af korte pulser (<3 ms) ved forskellige frekvenser af stimulation (0,2 Hz, 0,5 Hz og 1 Hz, 1 min på hver frekvens). Under optagelsen fase tænde lys feltbelysning ved 492 ± 3 nm og opdage Fluoforte fluorescens ved 505-520 nm. Anskaf fluorescens og membranpotentialet signaler ved hjælp Digidata 1440A og pClamp 10,0 software. Gentage optagelsen sekvens flere gange, hvis det er nødvendigt; dog holde den samlede optagetid under 15 min for hver celle.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den ovenfor beskrevne metode blev anvendt til at karakterisere de funktionelle abnormiteter i cardiomyocytes isoleret fra interventricular septum af patienter med hypertrofisk kardiomyopati (HCM), som gennemgik myectomy drift, sammenlignet med ikke svigtende ikke hypertrofisk kirurgiske patienter 21. Resultaterne i dette afsnit stammer fra dette arbejde 21 og er her vist som et eksempel på, hvordan denne teknik kan bruges til at karakterisere ændringer af myocardial celle funktion i hjerte sygdomstilstande.

En repræsentativ kirurgisk prøve fra en patient med HCM er vist i figur 2A. Kirurgiske prøver var yderst variabel med hensyn til størrelse og tykkelse af endokardiale fiberholdigt striber. Mængden af ​​myokardie væv, vi bruges til hver isolation procedure fra HCM prøver var omkring 1g. I stedet mængden af ​​væv, der anvendes til kontrolprøver var mindre (100-500 mg). Grund Lower væv tilgængelighed. Udbyttet var signifikant højere, når kontrolprøver blev behandlet med hensyn til HCM, sandsynligvis fordi den relative mængde af levedygtige myocardiale celler i vævet reduceres i HCM myocardium og endomyokardiel fibrose forøges 22. Fra disse observation konkluderede vi, at den nødvendige mængde af væv til opnåelse af levedygtige celler kan være variabel afhængig af fraværet eller tilstedeværelsen af ​​myokardiesygdom.

Prøverne blev skåret i små stykker, som vist i figur 2B. Bagefter blev stykker overført til kammeret i fordøjelsen enhed (figur 2C) og anvendt til enkelt-celle isoleret som beskrevet ovenfor (Figur 2D). Repræsentative mikrofotografier af en cellesuspension opnået under anvendelse af den beskrevne celleisolering proceduren fra et interventricular septum prøve er vist i figur 3A og 3B; forstørrede billeder af enkelt ventrikulær cardiomyocytes er afbildet i figur 3C-3F. Kardiomyocytter fra HCM prøver blev anvendt til samtidige optagelser af action potentialer og intracellulære Ca 2 + variationer som beskrevet i protokollen afsnit. Repræsentative samtidige spor viser membran spænding (ovenfor), og intracellulært Ca2 + (nedenfor) under stimulering på tre forskellige frekvenser er vist i figur 4: disse spor blev registreret fra en enkelt cardiomyocyte isoleret fra en HCM prøve.

Resultater af patch clamp-forsøg viste, at aktionspotentialets varighed (APD) optaget ved forskellige frekvenser af stimulation markant forlænget i cardiomyocytes fra patienter med HCM (HCM cardiomyocytes) i forhold til kontrol (figur 5A og 5B). For at konstatere opretholdelse af fysiologiske reaktioner i isolerede myocytter, testede vi virkningerne af isoproterenol, der anvendes ved 10-7 M (figur 5C): β-adrenerGIC stimulation produceret den forventede AP afkortning i kontrol myocytes. Da langvarig APD fører til øget risiko for tidligt efter efterdepolarisering (EADS) 23, forekomsten af EADS detekteret som spontane efterdepolarisering under plateau fase af AP, blev målt. I HCM kardiomyocytter EADS var signifikant hyppigere i forhold til kontrolgruppen (figur 5D). Repræsentative spor viser flere EAD er vist i figur 5E

For at teste om længere APD og ion nuværende abnormiteter kan påvirke excitation-sammentrækning koblingsmekanismer i HCM cardiomyocytes blev egenskaberne af intracellulære Ca 2 + variationer vurderes under stimulation. Amplituden af Ca 2 + transienter fremkaldte i strøm-clamp betingelser var ens i HCM forhold til at styre cardiomyocytes (figur 6A). Omvendt kinetikken af Ca 2 + forbigående, var signifikant længere i HCM (figur6B). Derudover intracellulær diastolisk Ca 2 + koncentration var markant højere i HCM i forhold til at styre cardiomyocytes (figur 6C) og steg mere fremtrædende plads på øget stimulation frekvens.

Især cardiomyocytter isoleret med denne metode fra humane ventrikulære prøver er også med succes blevet anvendt til andre formål, herunder spænding-clamp optagelser af specifikke transmembrane strømme (fig. 7A), intracellulær Ca 2 + og / eller celler afkortning optagelser under elektrisk felt stimulering (figur 7B) og vurdering af den fine struktur af sarcolemma hjælp konfokal mikroskopi og membranbundne fluorescerende etiketter (Figur 7C).

Figur 1 Figur 1. Rutediagram celle isolation procedure.

Figur 2
Figur 2. Behandling af ventrikulære prøver til celleisolering. (A) repræsentant billede, der viser et udsnit af ventrikulær myocardium fra en patient med HCM som gennemgik septale myectomy drift. Kalibrering bar = 5mm. (B) Bidder af ventrikulær væv skåret fra en ventrikulær kirurgisk eksemplar, der skal anvendes til celleisolering. Kalibrering bar = 5mm. (C) Billeder af fordøjelsen enhed. Indretningen omfatter en rådnetank med to silicium børster: overlegne børsten er i stand til at rotere, når den bevæges af en motor (D) Billede viser fordøjelse enheden i vandbad ved enzymatisk fordøjelse af ventrikulær væv.. p>

Figur 3
Figur 3.. Isolerede menneskelig ventrikulære cardiomyocytter. (AB) Panelet viser mikrofotografier af to mikroskopfelter (10x objektiv), der viser repræsentative cardiomyocyte suspensioner. Notatet, omkring 30% af cellerne er stang formet og vise tydelige striber. Kalibrering bar = 100 um. (CE) Repræsentative billeder af 3 menneskelige cardiomyocytter isoleret fra en model af HCM patient (40x objektiv). Kalibrering bar = 20 um. (F) billede, der viser et menneske ventrikulære cardiomyocytter rørt ved spidsen af plasteret pipette til optagelser. Kalibrering bar = 20 um.

es.jpg "src =" / files/ftp_upload/51116/51116fig4.jpg "/>
Figur 4.. Samtidig optagelse af membranpotentialet og intracellulær calcium. Repræsentant spor viser membran potentiale (ovenfor) og intracellulær calcium (nedenfor), der er optaget fra en enkelt myocyt isoleret fra en HCM prøve. Den myocyt stimuleres via patch-pipetten ved 0,2 Hz, 0,5 Hz og 1 Hz.

Figur 5
Figur 5.. Ændringer i handling potentialer i ventrikulære cardiomyocytter fra HCM-prøver. (A) Repræsentant overlejret virkningspotentialer fremkaldte ved 0,2 Hz, 0,5 Hz og 1 Hz fra en kontrol myocyt (venstre, grå spor) og en HCM myocyt (højre, sorte spor ). (B) Gennemsnit aktionspotentialets varighed ved 90% repolarisering (APD90%) i HCM (n = 81), ogkontrol kardiomyocytter (n = 29) på testede de tre pacing frekvenser. (C) Forekomst af EAD i cardiomyocytes fra HCM patienter og kontrolprøver. (D) Indtonet virkningspotentialer på 0,5 Hz fra et kontrolrum myocyt i fravær (kontinuerlig trace) og i nærværelse af 10 -7 M isoproterenol. (E) Repræsentant spor viser potentiale membran af en cardiomyocyte fra en HCM patient, der udviser flere spontane depolariseringer opstår under plateaufasen (tidligt efter depolariseringer EADS), der er markeret med pile. Stimuli er præget af korte linjer under sporingen. ** = P <0,01 uparret t-test. Alle paneler i figuren er ændret med tilladelse fra Coppini et al. 2012 21.

Figur 6
Figur6. Ændringer i calcium transienter i ventrikulære kardiomyocytter fra HCM prøver. (A) repræsentant overlejret calciumtransienter fremkaldte under stimulering ved 0,2 Hz via patch-pipetten i en kontrolgruppe myocyt (grå) og en HCM celle (sort). Især betyder amplituden af Ca 2 + transienter ikke forskellig mellem de to celler (B) kinetik Ca 2 + transienter i HCM (n = 42) og kontrol (n = 24) cardiomyocytes:. Time fra stimulus til peak forbigående (TP ), er tiden fra top til 50% forfald (T50%) og tid fra top til 90% forfald af forbigående (T90%) vist. (C) Repræsentative lange spor viser intracellulær Ca 2 + under stimulation på 3 forskellige frekvenser i HCM og kontrol myocytes, fremhæver den øgede diastoliske Ca 2 + ved høje pacing satser i HCM myocyt. (D) Gennemsnitlig diastoliske Ca 2 + i HCM (n = 42) og kontrol (n = 24) kardiomyocytter på 3 forskellige pacing rates. ** = P <0,01 uparret t-test. Alle paneler i figuren er ændret med tilladelse fra Coppini et al. 2012 21.

Figur 7
.. Figur 7 Yderligere eksperimentelle applikationer ved hjælp af menneskelige ventrikelmyocytter (A) Venstre: repræsentant overlejret spor, der viser L-typen Ca 2 + strøm registreret under spænding klemme ved forskellige membran spændinger med en særlig protokol (se 21 for detaljer). Til højre: gennemsnitlig L-typen Ca 2 + strømspids tæthed fra 18 celler isoleret fra HCM prøver på forskellige membran. Spændinger. (B) Intracellulær Ca2 + spore optaget fra en ventrikulær myocyt under elektrisk felt stimulation ved 1 Hz. (C) konfokal billede af en ventrikulær cardiomyocyte fra en HCM prøve farvet med et fluorescerende membranbundet farvestof (Di-3-ANEPPDHQ). Af note, tætheden af ​​ttubules er lav, hvilket tyder på morfologisk membran remodeling i HCM.

Figur 8
Figur 8. Fordøjelsen enhed. (AB) Komponenter af digestionsindretningen. En variabel hastighed roterende motor er forbundet til en første plast arm, som er forbundet til en anden. Den anden plast arm er aftageligt og forbundet til den øvre børste. Børster er lavet med silikone elastomer. En PTFE negativ støbeform, med 100 huller fordelt ~ 1,5 mm blev brugt til at kaste børsterne fra flydende silikone. Det indvendige rum i formen har 1,9 cm diameter og 6 mm tykke, og producerer børster af samme størrelse. Hullerne ligger på den ene side af formen er fremstillet for at frembringe 8 mm lange børstehår, når børsterneer støbt og fjernet fra formen. Efter den flydende silikone er sat ind i formen, er der behov for mindst 48 timer for komplet hærdning. Børster er monteret inde i et glasrør (indvendig diameter = 2 cm, tykkelse 2 mm) og det cylindriske kammer dannet af de to børster og glasvæggene er hermetisk forseglet af to gummi O-ringe. Børster skal skubbes den ene til den anden; den nederste er limet på et plastunderlag, mens den øverste er limet til plast ende af motoren arm og således er i stand til at rotere. (C) Forstørret visninger af den øverste børste. Af note, der skal limes til enden af motoren armen, for at rotere (D) komponenter af kammeret er vist i deres endelige stilling børsten. Mellemrummet mellem de to børster (den egentlige kammer) er ~ 2 cm bred og 7-8 mm høje; denne plads let passer 3-4 ml buffer, bortset op til 1 g myokardie væv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har beskrevet og valideret en metode til at isolere levedygtige myocytes fra kirurgiske prøver af human ventrikulær myokardiet. Begyndende fra tidligere beskrevne protokoller, der var blevet anvendt til at isolerede celler fra atrielle kirurgiske prøver, en teknik til at muliggøre separation af enkelte levedygtige myocytter fra syge ventrikulære myocardium blev udviklet og finjusteret. Tidlige rapporter viste, at isolation af enkelte cardiomyocytter fra bidder af atrial og ventrikulær væv selektivt værdiforringede repolarizing kaliumstrømme, hvilket resulterer i ændrede elektrofysiologiske egenskaber og reaktioner på fysiologiske stimuli 8,24, mens leveringen af de enzymholdige buffer via koronar perfusion ikke forringe forsinket ensretter strømninger i isolere celler 25. Desværre kan isolering af humane ventrikelmyocytter fra kirurgiske prøver ventrikulære myocardium ikke kan udføres af koronar perfusion, da integriteten af ​​koronare greneer tabt, i strid med eksplanterede hjerter. Cardiomyocytter isoleret fra myokardie bidder ved hjælp af vores metode vise en klar tilpasning af aktionspotentialets varighed som reaktion på ændringer af pacing hyppighed eller β adrenerg stimulation. For at sådanne reaktioner opstår, er integriteten af forsinkede ensretter kaliumkanaler krævede 26-28, hvilket tyder på den overordnede integritet af disse kanaler er ikke svækket af vores isolation metode. Derudover celler isoleret med vores metoder viser ikke kun almindelige elektrofysiologiske responser (figur 3 og 4), men også vise calcium transienter i den forventede form og varighed (figur 3 og 5) og regelmæssig sarcomerisk organisation (Figur 2) og afkorte egenskaber (ikke vist), hvilket tyder på, at den samlede strukturelle integritet af disse celler bevares ved denne isolation procedure. Den vigtigste udvikling af denne metode i forhold til tidligereteknikker fra den nyudviklede fordøjelse enhed, som leverer forsigtig mekanisk omrøring af vævs-stykker, så enkelt celle adskillelse uden for stor skade. Endvidere er anvendelsen af ​​digestionsindretningen tilladt os at anvende en lavere koncentration af enzymer i celleisolering buffer; især vi bruger en meget lavere koncentration af uselektiv protease i sammenligning med tidligere rapporteret metoder 24. Enheden er specialfremstillet i vores laboratorium: bygning diagrammer er vist i figur 8..

Det enkle design og struktur gør det meget let at kopiere for et vellykket resultat af denne protokol. Legenden til figur 8 beskriver også de procedurer, der kræves for at producere silikone børster og opbygge skrabe kammer. På grund af fordelene ved fordøjelsen enhed, kan et relativt stort antal af levedygtige celler opnås fra en relativt lille mængde af ventrikulær væv (så lavt som 100 mg).Et tidligere publiceret metode 19 viste sig at give en calcium tolerante myocytter fra små biopsier (selv <20 mg). Imidlertid rapporterede myocyt udbyttet var meget lav, og forfatterne ikke vise, om celler isoleret med denne metode var muligt for karakterisering af intracellulært calcium cykling og kontraktile funktion. Denne teknik er potentielt anvendelig til mange kirurgiske patienter, eftersom små portioner af interventricular septum ofte udskæres under ventil udskiftning procedurer (f.eks. Aortaklappen udskiftning). Men det afgørende punkt for at opnå en succesfuld isolation er en hurtig indledning af proceduren efter prøvetagningen fra operationsstuen. Derfor er det nødvendigt for cellen laboratorium til at være i tæt nærhed til hjertekirurgi klinikken, for denne teknik at være frugtbar. Derudover en ordentlig enzymaktivitet er også yderst vigtig for en vellykket isolering. Da selektive proteaseaktivitet of hver collagenase parti er normalt ikke helt testet hvert parti er tilbøjelige til at udføre forskelligt under celle isolation. Det er derfor vigtigt at finjustere den endelige koncentration af collagenase med henblik på at opnå de bedste resultater. Vi foreslår at observere celle suspension under mikroskop ved hver cyklus, for at være sikker på, at levedygtige celler blive vist på cyklus 3 Tidlig udseende celler tyder overdreven enzymaktivitet og beder til reduktion af enzymkoncentration.; udseendet af celler efter cyklus 3 antyder utilstrækkelig enzymaktivitet. Det er vores erfaring, er dette den mest effektive for den rigtige enzym koncentration.

Vi har med succes brugt denne metode til at opnå en enkelt cardiomyocytter fra den inter-ventrikulære septum af HCM patienter med venstre ventrikeludløbsobstruktion undergår kirurgiske septal myectomy, samt fra ikke-nødlidende ikke-hypertrofiske kirurgiske patienter 21. Resultater fra at papirviser, at myocytter isoleret med denne metode kan anvendes til komplet elektrofysiologiske evaluering med patch clamp-teknikker samtidig vurdere EF-kobling abnormiteter, ved at optage intracellulære calcium dynamik med fluorescerende farvestoffer. Optagelsen beskrevet her tilladt os at samle flere fysiologiske celleparametre med en enkelt optagelse fra hver celle, hvilket frembringer en stor mængde data med et begrænset antal celler og prøver. Takket være disse fordele har denne metode med succes blevet brugt til at karakterisere de specifikke funktionelle abnormiteter i ventrikulære cardiomyocytter fra HCM patienter, sammenlignet med ikke hypertrofisk patienter 21. Abnormaliteter af ion strømme og aktionspotentialets varighed samt kinetiske anomalier od intracellulære Ca 2 + cykling var klart identificeret ved hjælp af denne teknik, med høj reproducerbarhed. Endvidere har vi vist, at behandling med en selektiv inhibitor af sene Na + vs. placebo hos patienter med HCM 29, som i øjeblikket er i gang.

Menneskelige hjerte-eksemplar tilgængelighed er relativt beskeden, selv i specialiserede centre, og det kan begrænse en bred anvendelighed af denne teknik. Ikke desto mindre, at kvaliteten af ​​de oplysninger, der direkte kan opnås fra patientprøver på sygdomsrelaterede ændringer i cardiomyocyte funktion er sammenlignelig med opnåelige fra dyremodeller for HCM og andre hjertesygdomme. I betragtning af de store forskelle mellemfysiologi af humane og murine hjertemyocytter kan data fra funktionel vurdering af menneskelige myocytes være yderst værdifuldt. Som konklusion mener vi, at fremtidige anvendelser af denne teknik kan bidrage væsentligt til den viden om hjertesygdomme, da vores protokol giver mulighed for at udføre et komplet sæt af funktionelle vurderinger direkte på celler fra patientprøver med øjeblikkelig translationel værdi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af EU (STREP projekt 241577 "BIG HEART," 7. europæiske rammeprogram, KP), Menarini International Operations Luxembourg (AM), Telethon GGP07133 (KP) og Gilead Sciences (AM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791
Magnesium sulfate heptahydrate(MgSO4*7H2O) Sigma-Aldrich M1880
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Adenosine Sigma-Aldrich A9251
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270
Mannitol Sigma-Aldrich M4125
Taurine Sigma-Aldrich T0625
Potassium hydroxide (KOH) Sigma-Aldrich P5958
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9333
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) Sigma-Aldrich S7907
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S6297
Potassium bicarbonate (KHCO3) Sigma-Aldrich 237205
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P2256
2,3-Butanedione monoxime Sigma-Aldrich B0753
Sodium hydroxide(NaOH) Sigma-Aldrich S8045
L-Glutamic acid monopotassium salt monohydrate Sigma-Aldrich 49601
Pyruvic acid Sigma-Aldrich 107360
3-Hydroxybutyric acid Sigma-Aldrich 166898
Adenosine 5′-triphosphate dipotassium salt dihydrate (K2-ATP) Sigma-Aldrich A8937
Creatine Sigma-Aldrich C0780
Succinic Acid Sigma-Aldrich S3674
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) Sigma-Aldrich E0396
Albumin from bovine serum Sigma-Aldrich A0281
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M8266
Collagenase from Clostridium histolyticum, Type V Sigma-Aldrich C9263
Proteinase, Bacterial, Type XXIV Sigma-Aldrich P8038
Calcium chloride solution, ~1 M in H2O Sigma-Aldrich 21115
Calcium chloride 0.1 M solution Sigma-Aldrich 53704
Potassium methanesulfonate Sigma-Aldrich 83000
FluoForte Reagent Enzo Life Sciences ENZ-52015
Powerload concentrate, 100X Life Technologies P10020
Perfusion Fast-Step System Warner Instruments VC-77SP
Amphotericin B solubilized Sigma-Aldrich A9528
Multiclamp 700B patch-clamp amplifier Molecular Devices
Digidata 1440A Molecular Devices
pClamp10.0  Molecular Devices
Digestion Device CUSTOM CUSTOM The device is custome made in our laboratory using plastic tubes, cast Sylgard and a motor; it is described in detail in Figure 1C-1D and in Figure7. We can provide further details if requested.
Silicone elastomer for the digestion device's brushes Dow Corning SYLGARD® 184
Variable speed rotating motor for the digestion device Crouzet Crouzet 178-4765
Mold for brushes casting N.A. N.A. The mold is custom made from standard PTFE 2.5 cm diameter rods.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. Isolated cardiac myocytes. I. Preparation of adult myocytes and their homology with the intact tissue. Cardiovascular Research. 15, 483-514 (1981).
  2. Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. Isolated cardiac myocytes. II. Functional aspects of mature cells. Cardiovascular Research. 15, 549-579 (1981).
  3. Harding, S. E., et al. Species dependence of contraction velocity in single isolated cardiac myocytes. Cardioscience. 1, 49-53 (1990).
  4. Bustamante, J. O., Watanabe, T., Murphy, D. A., McDonald, T. F. Isolation of single atrial and ventricular cells from the human heart. Canadian Medical Association Journal. 126, 791-793 (1982).
  5. Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. Characteristics of calcium-current in isolated human ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 23, 929-937 (1991).
  6. Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. Intracellular calcium handling in isolated ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circulation. 85, 1046-1055 (1992).
  7. Cohen, N. M., Lederer, W. J. Calcium current in single human cardiac myocytes. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 4, 422-437 (1993).
  8. Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. Alterations of K+ currents in isolated human ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circulation Research. 73, 379-385 (1993).
  9. Virag, L., et al. The slow component of the delayed rectifier potassium current in undiseased human ventricular myocytes. Cardiovascular Research. 49, 790-797 (2001).
  10. Nanasi, P. P., Varro, A., Lathrop, D. A. Isolation of human ventricular and atrial cardiomyocytes: technical note. Cardioscience. 4, 111-116 (1993).
  11. Benitah, J. P., et al. Slow inward current in single cells isolated from adult human ventricles. Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 421, 176-187 (1992).
  12. Verkerk, A. O., et al. Ionic mechanism of delayed afterdepolarizations in ventricular cells isolated from human end-stage failing hearts. Circulation. 104, 2728-2733 (2001).
  13. Cerbai, E., et al. Characterization of the hyperpolarization-activated current, I(f), in ventricular myocytes from human failing heart. Circulation. 95, 568-571 (1997).
  14. Kohncke, C., et al. Isolation and kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (2013).
  15. Tomaselli, G. F., Marban, E. Electrophysiological remodeling in hypertrophy and heart failure. Cardiovascular Research. 42, 270-283 (1999).
  16. Maron, B. J. Hypertrophic cardiomyopathy: a systematic review. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 287, 1308-1320 (2002).
  17. Olivotto, I., et al. The many faces of hypertrophic cardiomyopathy: from developmental biology to clinical practice. Journal of Cardiovascular Translational Research. 2, 349-367 (2009).
  18. Maron, M. S., et al. Hypertrophic cardiomyopathy is predominantly a disease of left ventricular outflow tract obstruction. Circulation. 114, 2232-2239 (2006).
  19. Peeters, G. A., et al. Method for isolation of human ventricular myocytes from single endocardial and epicardial biopsies. The American Journal of Physiology. 268, 1757-1764 (1995).
  20. Lippiat, J. D. Whole-cell recording using the perforated patch clamp technique. Methods Mol Biol. 491, 141-149 (2008).
  21. Coppini, R., et al. Late sodium current inhibition reverses electromechanical dysfunction in human hypertrophic cardiomyopathy. Circulation. 127, 575-584 (2013).
  22. Kuusisto, J., et al. Low-grade inflammation and the phenotypic expression of myocardial fibrosis in hypertrophic cardiomyopathy. Heart. 98, 1007-1013 (2012).
  23. Yan, G. X., et al. Phase 2 early afterdepolarization as a trigger of polymorphic ventricular tachycardia in acquired long-QT syndrome : direct evidence from intracellular recordings in the intact left ventricular wall. Circulation. 103, 2851-2856 (2001).
  24. Yue, L., Feng, J., Li, G. R., Nattel, S. Transient outward and delayed rectifier currents in canine atrium: properties and role of isolation methods. The American Journal of Physiology. 270, 2157-2168 (1996).
  25. Li, G. R., Feng, J., Yue, L., Carrier, M., Nattel, S. Evidence for two components of delayed rectifier K+ current in human ventricular myocytes. Circulation research. 78, 689-696 (1996).
  26. Viswanathan, P. C., Shaw, R. M., Rudy, Y. Effects of IKr and IKs heterogeneity on action potential duration and its rate dependence: a simulation study. Circulation. 99, 2466-2474 (1999).
  27. Volders, P. G., et al. Probing the contribution of IKs to canine ventricular repolarization: key role for beta-adrenergic receptor stimulation. Circulation. 107, 2753-2760 (2003).
  28. Sanguinetti, M. C., Jurkiewicz, N. K., Scott, A., Siegl, P. K. Isoproterenol antagonizes prolongation of refractory period by the class III antiarrhythmic agent E-4031 in guinea pig myocytes. Mechanism of action. Circulation Research. 68, 77-84 (1991).
  29. Coppini, R., et al. A translational approach to treatment of hypertrophic cardiomyopathy: pre-clinical rationale and design of a prospective randomized pilot trial with ranolazine. Circulation. 125, 1 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics