פגיעה דגם אלקלי לשרוף של הקרנית neovascularization בעכבר

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Neovascularization (NV) של הקרנית יכול לסבך פתולוגיות חזותיות מרובות. ניצול מודל פציעה מבוקרת, אלקלי צריבה, רמת כימות של NV בקרנית יכולה להיות מיוצרת למחקר מכניסטית של NV והערכה של קרנית של טיפולי פוטנציאל להפרעות neovascular.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Anderson, C., Zhou, Q., Wang, S. An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse. J. Vis. Exp. (86), e51159, doi:10.3791/51159 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

בתנאים רגילים, הקרנית היא avascular, והשקיפות הזאת היא חיונית לשמירה על חדות ראייה טובה. Neovascularization (NV) של הקרנית, אשר יכול להיגרם על ידי טראומה, keratoplasty או מחלות זיהומיות, מפרק את 'זכות angiogenic' מה שנקרא של הקרנית ומהווה את הבסיס של פתולוגיות חזותיות מרובות שאף עלול להוביל לעיוורון. למרות שיש כמה אפשרויות טיפול זמינות, הצורך הרפואי המהותי שהוצג על ידי פתולוגיות neovascular קרנית נותר לא מסופק. על מנת לפתח טיפולים בטוחים, יעילים, וממוקד, נדרש מודל אמין של NV בקרנית והתערבות תרופתית. כאן, אנו מתארים מודל neovascularization קרנית פציעת אלקלי כווייה בעכבר. פרוטוקול זה מספק שיטה ליישום של פציעת אלקלי כווייה מבוקרת לקרנית, המנהלה של מתחם תרופתי של ריבית, ויזואליזציה של התוצאה. שיטה זו יכולה להוכיח instrumenטל לחקר המנגנונים וההזדמנויות להתערבות בNV בקרנית והפרעות neovascular אחרות.

Introduction

עיוורון של קרנית הוא הסיבה הרביעית הנפוצה ביותר של עיוורון, אחראית לכ -4% מכל מקרי 1. neovascularization קרנית (NV) משחק תפקיד משמעותי בהרבה של מחלות אלו, כוללים קרנית herpetic (הסיבה זיהומית המובילה לעיוורון בעולם המערבי) וגרענתי (הסיבה המובילה לעיוורון בעולם זיהומיות) 2. טיפולים שוטפים כוללים סטרואידים, תרופות נוגדות דלקת לא סטרואידיות (NSAIDs), טיפולים אנטי VEGF, וציקלוספורין, כמו גם טכניקות כירורגיות קונבנציונליות או לייזר 3. עם זאת, האופי קשה מתיש של פתולוגיות NV מבוסס הקרנית, המחסור במתקנים כירורגית מסוגלים לטפל NV בקרנית, וחוסר אפשרות תרופתית חזק ביצוע הוביל שולחן עגול מומחה האחרון למסקנה כי, למרות הטיפולים הקיימים, הצורך הרפואי המהותי שהוצג על ידי פתולוגיות אלה נותר ללא מענה 4.

הקרנית האנושיתמורכב 5 שכבות, 3 שכבות סלולריות (אפיתל, סטרומה ואנדותל) וממשק 2 (קרום באומן וקרום Descemet). הוא מתפקד כמחסום מכאני ופני שטח שבירה לעין. הטבע השקוף שלה הוא התוצאה של איזון עדין של מרכיביו, והוא חלק בלתי נפרד מהתפקוד הנכון שלה 5. בדרך כלל avascular, הקרנית מקבלת דם מmicrovessels רץ לאורך הקצה החיצוני שלה, אשר מוזנים מהריסים ועורקי עיניים. קרנית NV מתרחש כאשר גירוי מקדם אנגיוגנזה של הכלים האלה מאפשר להם לצמוח לכיוון המרכז של הקרנית ובכך להגביל את הראייה 6. אנגיוגנזה בקרנית כוללת hemangiogenesis וlymphangiogenesis, אשר תוצאת ingrowth של כלי דם וכלי הלימפה מארקייד כלי דם limbal לכיוון המרכז של הקרנית. זה מוביל להתמוטטות של "זכות angiogenic" קרנית, גידול באטימות וסיסטיק קרנית, שיבוש לה קרניyers, ובצקת 7. הגורמים המדויקים של NV בקרנית הם רבים, החל מתגובה למחלה זיהומית כגון גרענת למצב כימי שגרם גרמו לתרופות מסורתיות, כימיקלים תעשייתיים, או חומרי לחימה כימיים אפילו.

המנגנונים המולקולריים של תהליך זה אינם, עדיין, מאופיין במלואו; עם זאת, כמה שחקני מפתח זוהו. בתנאים רגילים הקרנית בעל "זכות angiogenic" ייחודית ומתוחזק על ידי מערך יתיר של גורמים אנטי angiogenic (כגון VEGF-R1 מסיס) 8. עם זאת, בתגובה לגירוי חיצוני (כגון פציעה), יהיה גברת ביטוי מקומית של גורמים פרו angiogenic (למשל VEGF-A). טיפים זה האיזון של גורמים פרו ואנטי angiogenic שבבסיס זכות angiogenic של הקרנית, ומוביל לhemangiogenesis, lymphangeogenesis, ודלקת, ולכן גורם לפתולוגיה בקרנית ואפילו עיוורון 9.

<כיתת p = "jove_content"> בהתחשב בצורך הרפואי קיים לפתולוגיה המתישה מאוד, יש בו עניין לשדה יש ​​מודל חיה אמין של NV בקרנית. כאן אנו מציגים מודל כזה: פציעת אלקלי כווייה מבוקרת. מודלים עין פציעה שונים המבוססים על שימוש בטבעות נייר סינון שימשו מאז 1970s 10. ב1989, קבוצה של רופאי עיניים בית הספר לרפואה של הרווארד מאופיין מודל סטנדרטי של פציעת אלקלי כווייה בקרנית מרכזית בארנב המבוסס על השריית פיסת נייר סינון עגול עם נתרן הידרוקסידי (NaOH) וליישם אותו לקרנית בטווח מסוים של ריכוזים 11. מאז, טכניקה זו הותאמה לשימוש ב12-14 העכבר. לאחרונה, המעבדה וואנג חקרה את ההשפעות הטיפוליות של deacetylase היסטון (HDAC) מעכב סח"ה בפתוגנזה של NV בקרנית תוך שימוש במודל עכבר של קרנית אלקלי לשרוף פציעה 15. המתודולוגיה של מודל עכבר קרנית אלקלי לשרוף פציעה שהוצג כאן נבנתהבעיקר על עבודתו המוקדמת של שני עיתונים אחרים 14,16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: הפרוטוקול הבא ותוצאות נציג להשתמש במעכבי HDAC סח"ה כתרכובת ירושלים. עם זאת, פרוטוקול זה הוא בשום אופן לא מוגבל לשימוש של סאהה, והוא מומלץ כשיטת כללית כדי לבחון את ההשפעה של תרכובות מסיסים בneovascularization קרנית. שינויים קלים יצטרכו להתבצע למידת הדילול כמו גם תדירות ומשך זמן של יישום. בנוסף, תרכובות כי הם בקלות מסיסה במים יוכלו להינתן בהעדר DMSO.

הצהרה אתית: יש לבצע את כל הניסויים בבעלי החיים רק בציות לחוק הלאומי ותקנות מוסדיות. פרוטוקול זה אושר לשימוש על ידי אוניברסיטת טוליין מוסדית טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש.

1. הכנת החומרים (לפי סדר שימוש)

  1. חותכי פיסת נייר תאית מסנן (11 מיקרומטר) לתוך 2 עיגולי מ"מ.
  2. הכן פתרון M 1 של NaOH ידיהמסת 20 גרם של NaOH ב500 מיליליטר H 2 O. מזוקק לאחסן בטמפרטורת חדר. זהירות: פתרונות NaOH הם מאכל ויכולים לגרום לכוויות אלקלי.
  3. הכן קוקטייל הרדמה על ידי דילול 10 מיליליטר של 100 מ"ג / מיליליטר קטמין ו2.5 מיליליטר של 20 מ"ג / מיליליטר בxylazine 37.5 מיליליטר של 1x PBS לריכוז סופי של 20 מ"ג / מיליליטר קטמין ו -4 מ"ג / מיליליטר xylazine.
  4. הכן פתרון 0.5% מhydrochloride proparacaine (לשיכוך כאבים אקטואליים) על ידי המסת 500 מ"ג hydrochloride proparacaine בשל PBS המסונן 100 מיליליטר.
  5. הכן PBS 1x ידי המסת 8 גרם NaCl, 0.2 גרם של KCl, 1.44 גרם Na 2 HPO 4, ו0.23 גרם לאא 2 PO 4 ב900 מיליליטר של מזוקקי H 2 O. התאם ל7.4-pH. תביא את הפתרון לנפח סופי של 1,000 מיליליטר עם מזוקקי H 2 O וסינון על מנת להבטיח סטריליות.
  6. הכן פתרונות מניות 1,000 x של סח"ה ב ~ 100 מ"מ בsulfoxide דימתיל (DMSO) על ידי המסת 26.4 מ"ג סח"ה ב 1 מיליליטר של DMSO. מדולל ל1x (~ 10 מיקרומטר)פתרון ב-PBS המסונן לכל שימוש. אחסן את פתרון המניות ב -20 ° C עד חודש אחד. זהירות: DMSO הוא רעלן וmutagen ידועים.
  7. הכן פתרון 4% מparaformaldehyde (PFA) לקיבעון. מתחת למכסת מנוע כימי, לפזר 4 גרם של PFA ב90 מיליליטר של PBS. להביא את התערובת ל65 מעלות צלזיוס ולכייל לpH של 7.4. ברגע שPFA נמס, להביא את הפתרון לנפח סופי של 100 מיליליטר. חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש. זהירות: PFA הוא ידוע להיות אלרגניים, מסרטנים, ורעיל.
  8. הכן מאגר חסימת 1x ידי דילול 5 מיליליטר של סרום עז ו500 ul של טריטון X-100 ל94.5 מיליליטר של PBS.
  9. הכן כביסה חיץ 1x ידי דילול 500 ul של טריטון X-100 ל99.5 מיליליטר של PBS.

2. אלקלי לשרוף טיפול פציעה ומתחם

  1. משרים חתיכה עגולה של נייר סינון, ~ 2 מ"מ בקוטר, בתמיסה של 1 M NaOH.
  2. להרדים את העכבר עם זריקה של 100 מ"ג / קילוגרם קטמין ו5 מ"ג / קילוגרם xylazine, WHich הוא ~ של קוקטייל ההרדמה 100 μl מצעד 1.3 ל25 עכבר גרם. הרדמה צריכה לקחת ~ דקות 1-2 להגדיר פנימה עומק של הרדמה עשוי להיקבע על ידי בעדינות צובט את הבוהן או זנב של החיה, אם ההרדמה היא מספיק לא צריכה להיות שום תגובה. הערה: יש להקפיד על מנת להבטיח את העכבר לא להיכנע להיפותרמיה הנגרמת על הרדמה.
  3. באמצעות הטפטפת, מריחה יחול ירידה של .0.5% hydrochloride proparacaine אל פני השטח של הקרנית לשיכוך כאבים מקומיים.
  4. בעזרת מלקחיים סטריליות, להרים פיסת נייר סינון NaOH ספוג. אם אתה מבחין NaOH העודף נצמד לאו נוטף מנייר הסינון, לחץ לחיצה קצרה על נייר הסינון הספוג בפיסת נייר סינון יבשה כדי לספוג את העודף. מניחים את פיסת נייר סינון NaOH ספוג על הקרנית המרכזית. תשאיר את זה במשך 30 שניות כדי ליצור אלקלי צריבה חריפה של ~ 2 x 2 מ"מ 2 באזור. מיקרוסקופ ניתוחי מועיל בהצבת נייר הסינון כראוי. הערה: רק עין אחת של של העכברhould להיפגע עם האחר משמש כבקרה.
  5. הסר את נייר הסינון. באמצעות מזרק 10 מיליליטר, בעדינות לשטוף את העין עם 10 מיליליטר של 1x PBS פעמיים כדי לשטוף שיורי M NaOH 1.
  6. מייד תחול ירידה של פתרון 1x סח"ה עובד (או שליטה ברכב בהיקף של PBS בדילול DMSO המכיל לא סח"ה) למריחה לקרנית. חזור 3x/day בקשה ל14 ימים. הערה: בתקופה זו משחה אנטיביוטית מקומית אינה מומלצת מכיוון שהוא עלול להפריע להתפתחות של הפגיעה והמסירה של המתחם. השתמש בתמיסה נוזלית לאנטיביוטיקה, כגון 3% פתרון גנטמיצין, במקום.
  7. המשך ישיר להערכה קלינית (פרוטוקול 3 להלן) או להקריב את העכבר וenucleate העיניים להר שטוח של קרנית (4 פרוטוקול להלן) או פרפין / היסטולוגיה הקפואה קונבנציונלית.

3. הערכה קלינית

  1. לבצע בדיקה יומית של העכברים בצורה עיוורה תחת מיקרוסקופ ניתוחי ולהבקיע גorneal NV מבוסס על אטימות של קרנית, NV, וגודל כלי. השתמש לפחות שני משקיפים ולהקליט את ציון סופי שהוא הממוצע של שתיים.
    1. ציון אטימות של קרנית בסולם של 0-4. 0 = ברור לחלוטין; 1 = מעט מעורפלת, קשתית ואישון עין בקלות; 2 = מעט אטומה, קשתית ואישון עדיין לזיהוי; 3 = אטומים, תלמידים כמעט לא מורגש; ו4 = לגמרי אטום ללא מבט של התלמיד.
    2. ציון NV בסולם של 0-3. 0 = אין neovessels; 1 = neovessels בימבוס הקרנית; 2 = neovessels פורש ימבוס הקרנית ומתקרבת למרכז קרני; 3 = neovessels פורש המרכז קרני.
    3. ציון גודל כלי דם בסולם של 0-3. 0 = אין neovessels; 1 = neovessels לזיהוי תחת מיקרוסקופ הניתוחי; 2 = neovessels לראות בקלות תחת מיקרוסקופ הניתוחי; 3 = neovessels לראות בקלות בלי מיקרוסקופ.
  2. שימוש במצלמה דיגיטלית, קחו את תמונות נציג של העין ב7 ימים ו14 ימים.

4.הכתמה קרנית וMounts שטוח

  1. תקן את העין enucleated PFA 4% במשך שעה לפחות 1 ב 4 ° C.
  2. העבר את העין ל1X PBS ולהשתמש במלקחיים כדי להסיר את הרקמה עודפת בזהירות.
  3. בעזרת מיקרוסקופ ניתוחי, להשתמש במחט (18 מד) או מיקרו סכין כדי לנקב את אזור pericorneal של העין (שים לב: זה צריך לשחרר את הנוזלים מהעין).
    1. מהניקוב נעשה בסעיף 4.3.1 להשתמש במספריים כירורגית לחתוך את החלק הקדמי של העין (קרנית) מהחלק האחורי.
  4. העבר את הקרנית חזרה לPFA 4% לקיבעון לילה בשעה 4 ° C.
  5. מחק את PFA 4% (זהירות: PFA הוא מסוכן וחייב להיות מסולק בהתאם לתקנות מוסדיות) ולשטוף את הקרנית שלוש פעמים עם 1x PBS להסיר כל PFA שיורית.
  6. דגירה במאגר 1x חסימה לפחות 2 שעות בטמפרטורת חדר כדי permeabilize הרקמות ולמנוע ספציפי מחייב של הנוגדן הראשוני.
    1. החל נוגדן ראשוני בחיץ חסימת 1x, בדילול של פי 100-500. (לדוגמא: עכברוש אנטי עכבר PECAM-1 לאיתור כלי דם ב1:100, ארנב נגד עכבר LYVE-1 לאיתור כלי הלימפה ב1:500, ו / או anti-mouse-F4/80 חולדה לאיתור מקרופאגים ב1:100). דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    2. שטוף שש פעמים עם חיץ הכביסה 1x עבור שעה 1 בכל פעם בטמפרטורת חדר כדי להסיר נוגדן ראשוני מאוגד באופן מלא.
    3. החל משני נוגדנים ב1x חיץ החסימה בדילול של פי 500-1,000. (למשל ניאון 488 ננומטר מתויג העז אנטי עכברוש IgG ב1:800 או ניאון 594 ננומטר מתויג העז נגד הארנב IgG-ב1:800). דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    4. לשטוף שלוש פעמים עם 1X PBS עבור שעה 1 כל אחד בטמפרטורת חדר כדי להסיר משני נוגדנים מאוגדים באופן מלא.
  7. העבר את הקרנית לטרי 1x PBS, ובעזרת מיקרוסקופ ניתוחי, לעשות ארבעה חתכים בזהירות מפריפריה לכיוון אגורהאה. זה צריך לחלק את הקרנית לארבעה רבעים של גודל שווה בערך (צורה וכתוצאה מכך צריכה להיראות ולא כמו פרפר) ולאפשר לו לשכב על שקופיות.
  8. הר עם הרכבה בינונית מתאים לדימות פלואורסצנטי. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, צריכים להיות צילמו דגימות באופן מיידי ותצלומים דיגיטליים שצולמו, אך הוא עשוי להיות מאוחסן במשך מספר שבועות המוגנים מפני אור ב 4 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

לאחר פציעת אלקלי צריבה, NV הקרנית מתרחש באופן צפוי, תלוי זמן. איור 1 מדגים את ההבדל הבולט הן בneovascularization ואטימות של קרנית בין בעלי חיים שלא טופלו (איור 1 א) ושל בעלי חיים שטופלו במעכבי HDAC סח"ה (איור 1 ב ) בנקודת הזמן של 7 ימים.

2A הדמויות ו2B להפגין הר שטוח של קרנית של העין ביקורת שלא טופלה עם מכתים עיקרי PECAM-1 וLYVE-1 והמשני אלקסה פלואוריד 488 ו594 מכתים (בהתאמה). איורים 2C ו 2D להציג את אותה הצביעה בעין טופלה מדי יום עם מעכבי HDAC סאהה, שים לב לירידה הדרמטית בשני hemangiogenesis וlymphangiogenesis.

3A הדמויות ו3B מספקים מבט מפורט על שני כתמים. PECAM-1 משמש סמן לbloכלי OD (איור 3 א), ואילו LYVE-1 נקשר באופן ספציפי לכלי הלימפה (איור 3 ב). כיסוי של שני שדות מוצג באיור 3 ג, המאפשר השוואה של hemangiogenesis לעומת lymphangiogenesis כמו גם השוואה בין המורפולוגיה של התאים השונים.

בעקבות קיבעון PFA (שלב 4.1), אתה יכול להשתמש בפרוטוקולים קונבנציונליים חתך (לא מפורטים בפרוטוקול לעיל) כדי ליצור חלקים מוטבעים או קפוא או פרפין של העין. אמנם זה לא מאפשר את אותה רמת הכימות של פלישה שהר שטוח עושה, סעיפי sagittal של הקרנית יכולים להראות לך בעובי קרני ועומק יחסי של הצינורות בתוך העין. איורים 3D-F מציג סעיפי sagittal, קפוא של הקרנית וגם F4/80 (מכתים מקרופאג), DAPI (מכתים גרעיני), או תמונה הממוזגת.

איור 1 איור 1. התקדמות של neovascularization קרנית שבעה ימים לאחר פציעת אלקלי כווייה. (א) תמונה מייצגת של העין שלא טופלה. (ב) תמונת נציג של העין שטופלה שלוש פעמים ביום עם המתחם שלנו של עניין (מעכבי HDAC סח"ה). שים לב להיבדל באטימות וneovascularization קרנית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. נציג תמונות של ביקורת שלא טופלה (A ו-B) וסח"ה טופלו (C ו & #160; קרנית ד) שבעה ימים לאחר אלקלי לשרוף פציעה (A ו-C תמונה בשדה רחב) של מכתים תא האנדותל בכלי דם עם PECAM-1.. (B ו-D) תמונה בשדה רחב של מכתים תא אנדותל הלימפה עם LYVE-1. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. () צביעת כלי דם אנדותל תא עם PECAM-1. (ב) מכתים תא אנדותל הלימפה עם LYVE-1. (C) צביעת PECAM-1/LYVE-1 ממוזגת. (ד) מכתים F4/80 של מקרופאגים בסעיף קפוא sagittal. (ה) DAPI staining של גרעין תא בסעיף חתך קפוא sagittal. (F) שמוזגו F4/80 ומכתים DAPI. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול המובא כאן תוצאות ברמות שחזור של hemangiogenesis, lymphangiogenesis, ודלקת, מה שהופך את מערכת אידיאלית ללמוד שלושת התהליכים הללו (קשורים). בעוד ששיטה זו מייצרת NV קרנית מרכזי, מספר שיטות שפותחו כדי לגרום NV יותר מכוון, כלומר תפירה של הקרנית 17 ומושתלות צמיחת פקטור המבטא כדורים 18, יכול להיות גם של עניין. הפרוטוקול שלנו מיועד לשימוש בעכבר הבוגר, מתן קל לשימוש במודל חיה בעת גם מאפשר מעבדה כדי לנצל את מלוא יתרונות של מגוון רחב של טכניקות מולקולריות ומהונדסות עדיין לא זמינות ליונקים גדולים. הפרוטוקול לעיל ותוצאות נציג פירוט שימוש בעכברים על רקע C57BL/6J. עכברי אלבינו יהיו גם מתאימים ועשויים לספק להדמיה קלה יותר; עם זאת, מחקר שנערך לאחרונה מצביע על כך שתגובת neovascular של עכברים לבקנים עלולה שלא להיות דרמטית 19 כ. יתר על כן, בניגוד לכמהמודלים neovascularization אחרים, NV קרנית יכול להיות שגמר עם בדיקה באמצעות מיקרוסקופ ניתוחי או אפילו בעין בלתי מזוינת. אם נדרש כימות קפדני יותר של ההיקף neovascularization, תמונות דיגיטליות של ההר השטוח המוכתם ניתן לנתח באמצעות מספר חבילות תוכנה, דוגמא של איך לעשות זאת עם פוטושופ CS4 ניתן לראות בקונר, et al. "כימות של רטינופתיה מושרה חמצן בעכבר" האחרונה טבע פרוטוקולי נייר 20.

hydrochloride Proparacaine הוא משכך כאבים אסתר אמינו מיושמים כפתרון מקומי (ייתכן שחברים אחרים במשפחה זו יהיו מקובלים באותה מידה). למרות שהחיה ממוקמת בהרדמה כללית להליך, שאנו סבורים שכאבים אקטואליים נוספים הכרח מוסרי כדי למנוע כאבים לבטל את הקרנית. זה הכרחי כי PBS משמש לדלל המתחם שלך ולשטוף לסנן את העין ולשמור על ניקיון ברחבי ההליך דואר (לבדוק סימנים גלויים של זיהום לפני כל שימוש). PBS נקרא למבוסס על מסורת מעבדה בודדת; כל תמיסת מלח מאוזנת שווה ערך צריכה להשיג את התוצאה הרצויה. כמו כן, שינויים בפרוטוקול אימונוהיסטוכימיה שהוצג כאן עשויים להיקרא לאם נוגדנים ממקורות אחרים נמצאים בשימוש (כלומר, את מידת הדילול הנדרש).

הכי מאתגר מבחינה טכנית חלקים של הליך זה הם המיקום הראשוני של נייר סינון NaOH הספוג והנתיחה של הקרנית. אנו ממליצים ששני הטכניקות להיות מתורגלת לפני ההליך בפועל. נייר סינון חייב להיות ממוקם במרכזה של הקרנית על מנת לקדם את רמה שווה של neovascularization מכל הצדדים. כל תואר של קיזוז יהיה ליצור רמה גבוהה של השתנות מעכבר לעכבר. נתיחת קרנית דורשת עסקה טובה של מיומנות ידנית. העין עשויה לעוות בתגובה לניסיון לנקב אזור pericorneal.אנו ממליצים להשתמש במחט מד, חדה קטנה כדי להפוך את החיתוך הראשוני ולשחרר את הלחץ שבפנים. לאחר ניקור ראשוני מורכב, מספריים כירורגית יכולים להיות מוכנסים לתוך החור ומשמשים לחיתוך לאורך קו דמיוני המפריד בין הקדמי של העין מכוס העין האחורית. עובד לאט ובזהירות אמור להניב קרנית ללא פגע.

יש לציין כי בעוד שהמטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא assay היעילות של תרכובות שונות בטיפול בפציעת אלקלי כווייה בקרנית יש לה גם הפוטנציאל לשמש כדי לחקור פצע בקרנית מחדש epitheliaztion, סיסטיק קרנית, וגזע אפיתל limbal תא התחדשות. יתר על כן, היא משמשת כמודל כללי לחקור את המנגנונים של hemangiogenesis פתולוגי, lymphangiogenesis, ודלקת. הקלות היחסית שבה ניתן לבצע את הפרוטוקול, כמו גם האופי פולשני שלה, מהווה הזדמנות אטרקטיבית להקרנת מתחם in vivo, בדיקת יעילותים, ואפיון של מודלים עכבר מהונדסים ביחס לאנגיוגנזה פתולוגית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו אסירי תודה על עזרתו של ד"ר Xinyu לי בהכנת כתב היד. SW נתמכה על ידי קרן הזנק מאוניברסיטת טוליין, המועצה למחקר החדש פרס חוקרו של הנשיא ממרכז UT Southwestern Medical, NIH גרנט EY021862, הפרס פיתוח קריירה מהמחקר למניעת קרן עיוורון, ופרס מואר פוקוס במחקר מקולרי הקשור לגיל ניוון .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 ml Syringe BD 309659
18 G Needle BD 305918
10 ml Syringe BD 306575
25 G Needle BD 305916
Anti-F4/80 (rat anti-mouse) AbD Serotech MCA497RT
Anti-LYVE-1 (rabbit anti-mouse) Abcam ab14917
Anti-PECAM-1 (rat anti-mouse) BD 553370
Anti-IgG Alexa 488 (goat anti-rat) Invitrogen A11006
Anti-IgG Alexa 594 (goat anti-rabbit) Invitrogen A11012
Camera Tucsen TCC 5.0 ICE
Coverslips Fisher 12-548-B
DMSO Sigma D4540-1L Caution: Mutagenic, Toxic
Forceps (Blunt), Iris WPI 15915
Forceps (Sharp), Dumont #4 WPI 500340
KCl Fisher P217-500
Ketamine Solution MedVet RXKETAMINE Controlled substance, proper license required for use.
Light Source for Microscope AmScope LED-14M-YA
Microscope (Stereo 7X-45X) AmScope SM-1B
Mounting Medium, VECTASHIELD Vector H-1000
NaCl Fisher S271-10
NaH2PO4 Fisher S397-500
NaOH Fisher S318-1 Caution: Corrosive
Paraformaldehyde P6148-500G Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic
Proparacaine Hydrochloride Sigma P4554-1G
Scissors (5 mm blade), Vanas WPI 14003
Goat Serum MPBio 92939249
Microscope Slides Fisher 12-550-15
Triton X-100 Sigma T8787-100ML
Whatman Grade 1 Filter Paper Whatman 1001-6508
Xylazine Solution MedVet RXANASED-20

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pascolini, D., Mariotti, S. Global estimates of visual impairment. Br. J. Ophthalmol. 96, (5), 614-618 (2010).
  2. Whitcher, J., Srinivasan, M., Upadhyay, M. Corneal Blindness: A Global Perspective. Bull. World Health Org. 79, (3), 214-221 (2003).
  3. Gupta, D., Illingworth, C. Treatments for corneal neovascularization: a review. Cornea. 30, (8), 927-938 (2011).
  4. Cursiefen, C., et al. Consensus statement on indications for anti-angiogenic therapy in the management of corneal diseases associated with neovascularisation: outcome of an expert roundtable. Br. J. Ophthalmol. 96, (1), 3-9 (2012).
  5. Delmonte, D., Kim, T. Anatomy and Physiology of the Cornea. J. Cataract Refract. Surg. 37, (3), 588-598 (2011).
  6. Cursiefen, C., Seitz, B., Dana, M. R., Streilein, J. W. Angiogenesis and lymphangiogenesis in the cornea. Pathogenesis, clinical implications and treatment options. Der Ophthalmologe. 100, (4), 292-229 (2003).
  7. Chang, J., Gabison, E., Kato, T., Azar, D. Corneal Neovascularization. Curr. Opin Ophthalmol. 12, (4), 242-249 (2001).
  8. Ambati, B., et al. Corneal Avascularity is due to Soluble VEGF Receptor-1. Nature. 443, (7114), 993-997 (2006).
  9. Cursiefen, C., et al. VEGF-A Stimulates Lymphangiogenesis and Hemangiogenesis in Inflammatory Neovascularization via Macrophage Recruitment. J. Clin. Invest. 113, (7), 1040-1050 (2004).
  10. Jiri, O. Paper Strips and Rings as Simple Tools for Standardization of Experimental Eye Injuries. Ophthal. Res. 1975, (7), 363-367 (2009).
  11. Ormerod, L., Abelson, M., Kenyon, K. Standard Models of Corneal Injury Using Alkali-Immersed Filter Discs Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30, (10), 2148-2153 (1989).
  12. Saika, S., et al. Therapeutic effects of adenoviral gene transfer of bone morphogenic protein-7 on a corneal alkali injury model in mice. Lab. Invest. 85, (4), 474-486 (2005).
  13. Ferrari, G., Bignami, F., Giacomini, C., Franchini, S., Rama, P. Safety and efficacy of topical infliximab in a mouse model of ocular surface scarring. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54, (3), 1680-1688 (2013).
  14. Sosne, G., Christopherson, P., Barrett, R., Fridman, R. Thymosin-beta4 modulates corneal matrix metalloproteinase levels and polymorphonuclear cell infiltration after alkali injury.Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, (7), 2388-2395 (2005).
  15. Li, X., et al. Inhibition of Multiple Pathogenic Pathways by Histone Deacetylase Inhibitor SAHA in a Corneal Alkali-Burn Injury Model. Mol. Pharm. 10, (1), 307-318 (2013).
  16. Yoeruek, E., et al. Safety, penetration and efficacy of topically applied bevacizumab: evaluation of eyedrops in corneal neovascularization after chemical burn. Acta Ophthalmol. 86, (3), 322-328 (2008).
  17. Bucher, F., Parthasarathy, A., Bergua, A., Onderka, J., Regenfuß, B., Cursiefen, C., Bock, F. Topical Ranibizumab inhibits inflammatory corneal hem- and lymphangiogenesis. Acta Ophthalmol. (2012).
  18. Hajrasouliha, A., Sadrai, Z., Chauhan, S., Dana, R. b-FGF induces corneal blood and lymphatic vessel growth in a spatially distinct pattern. Cornea. 31, (7), 804-809 (2012).
  19. Rogers, M., et al. The albino mutation of tyrosinase alters ocular angiogenic responsiveness. Angiogenesis. 16, (3), 639-646 (2013).
  20. Connor, K., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological. Nat. Protoc. 4, (11), 1565-1573 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics