Fare Kornea Neovaskülarizasyonunun bir Alkali-yanık Yaralanma Modeli

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Korneanın neovaskülarizasyon (NV) çoklu görsel patolojileri karmaşık hale getirebilir. Kontrollü, alkali-yanık yaralanması modeli kullanılarak, korneal NV bir ölçülebilir düzeyde neovasküler hastalıkları için potansiyel tedavilerinin kornea NV ve değerlendirme mekanik çalışma için üretilebilir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Anderson, C., Zhou, Q., Wang, S. An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse. J. Vis. Exp. (86), e51159, doi:10.3791/51159 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Normal koşullar altında, kornea avasküler, ve bu iyi bir şeffaflık görme keskinliği korumak için gereklidir. Travma, keratoplasti veya bulaşıcı hastalığa neden olabilir kornea, Neovaskülarizasyon (NV) korneanın sözde 'Anjiyojenik ayrıcalığı' ayırır ve hatta körlüğe neden olabilir birden fazla görsel patolojilerin temelini oluşturur. Çeşitli tedavi seçenekleri olmasına rağmen, kornea neovasküler patolojilerin tarafından sunulan temel tıp ihtiyacı karşılanmamış kalır. Güvenli, etkili ve hedefli tedaviler geliştirmek amacıyla, kornea NV ve farmakolojik müdahale güvenilir bir model gereklidir. Burada, fare içinde bir alkali-yanık yaralanması korneal neovaskularizasyon modeli açıklar. Bu protokol, kornea, ilgi konusu bir farmakolojik bileşik uygulaması, ve sonuç görselleştirilmesi için kontrollü bir alkali-yanık uygulanması için bir metot sağlar. Bu yöntem instrumen olabilecektal kornea NV ve diğer neovasküler bozukluklarında müdahale mekanizmaları ve fırsatları eğitim için.

Introduction

Kornea körlük tüm olgularda 1 yaklaşık 4% sorumlu körlüğün en yaygın dördüncü nedenidir. Kornea neovaskülarizasyon (NV) herpetik keratit (Batı'da körlüğün en önde gelen nedenidir bulaşıcı) ve trahom (dünya çapında bulaşıcı körlüğün önde gelen nedenidir) 2 dahil olmak üzere bu patolojilerin, çok önemli bir rol oynar. Mevcut tedaviler steroidler, steroidal olmayan anti-enflamatuar ilaçlar (NSAID), anti-VEGF terapileri, A ve yanı sıra, geleneksel lazer ya da cerrahi teknikleri 3 siklosporin içerir. Ancak, kornea NV bazlı patolojilerin ciddi zayıflatıcı doğa, cerrahi kornea NV tedavi edebilen tesisleri ve güçlü bir performans farmakolojik seçeneği eksikliği yetersizliği, kaybolmamış tedavilere rağmen, temel tıbbi ihtiyacı olduğu sonucuna yeni bir uzman yuvarlak masa açtı Bu patolojilerde tarafından sunulan 4 karşılanmamış kalır.

Insan kornea5 kat, 3 hücre tabakaları (epitelyal, stromal ve endotelyum) ve 2 arabirimi (Bowman ve zar Descemet) oluşur. Bu göz için mekanik bir engel ve refraktif yüzeyi olarak işlev görür. Onun şeffaf doğası onun bileşenlerinin hassas bir denge sonucudur ve doğru fonksiyon 5 ayrılmaz bir parçasıdır. Normal avasküler, kornea ve göz siliyer arterlerden beslenir dış kenarı boyunca uzanan kılcal kan alır. Bir uyarıcı onları kornea merkezine doğru büyür ve böylece görme 6 sınırlamak için izin Bu damarların anjiyojenezi teşvik zaman korneal NV oluşur. Kornea anjiyojenez kornea merkezine doğru limbal damar pasajı kan damarları ve lenf damarlarının büyümesinin neden olan hemangiogenesis ve lenfanjiyogenezin içerir. Bu kornea "Anjiyojenik ayrıcalık", korneal opasite ve fibrozis bir artış, korneal la bozulması bozulmasına yol açarkuramsal ve ödem 7. Kornea NV'nin kesin tetikler geleneksel ilaçlar, endüstriyel kimyasallar, hatta kimyasal savaş ajanları neden olduğu bulaşıcı hastalığa bir tepki böyle trahom gibi bir kimyasal kaynaklı durumuna kadar çoktur.

Bu sürecin moleküler mekanizmalar, henüz tam olarak karakterize edici özelliği değildir; Ancak, birkaç anahtar oyuncular tespit edilmiştir. Normal koşullar altında, kornea (örneğin, çözünür VEGF-R1 gibi) anti-anjiyojenik faktörler 8 bir yedek dizisi tarafından tutulan bir benzersiz bir 'anjiyojenik ayrıcalık' sahiptir. Bununla birlikte, (örneğin, bir yaralanma gibi) harici bir uyarana yanıt olarak, pro-anjiyojenik faktörler (VEGF-A) yerel bir yukarı-regülasyonu olacaktır. Bu ipuçları kornea Anjiyojenik ayrıcalığını yatan ve bu nedenle kornea patolojisi ve hatta körlüğe neden 9, hemangiogenesis, lymphangeogenesis ve inflamasyona neden olur yanlısı ve anti-anjiyogenik faktörlerin dengesi.

<p class = "jove_content"> Bu son derece zayıflatıcı patolojinin karşılanmamış tıbbi ihtiyaçları göz önüne alındığında, bu kornea NV güvenilir bir hayvan modeli var alanına ilgi. Kontrollü alkali-yanık: İşte biz böyle bir model sunuyoruz. Filtre kağıdı yüzük kullanmaya dayalı çeşitli göz yaralanması modelleri 1970'lerden 10 beri kullanılmaktadır. 1989 yılında, Harvard Medical School oftalmologların bir grup, sodyum hidroksit (NaOH) ile yuvarlak bir filtre kağıdı parçası ıslatma ve belirli bir aralığının en kornea uygulamadan göre tavşan merkezi bir korneal alkali yanığı hasarının bir standart model özelliği, konsantrasyonları 11. O zamandan beri, bu teknik, fare 12-14 kullanılmak üzere adapte edilmiştir. Son zamanlarda, Wang laboratuvar fare korneal alkali yanık yaralanma modeli 15 kullanılarak kornea NV patogenezinde histon deasetilaz (HDAC) inhibitörü SAHA terapötik etkilerini inceledi. Burada yer alan fare korneal alkali-yanık yaralanması modeli inşa edilmiş metodolojiEsas olarak iki diğer kağıtlar 14,16 önceden çalışmaları.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Not: Aşağıdaki protokol ve sonuçlar temsili bir örneği, bir bileşik olarak HDAC inhibitörü SAHA kullanın. Bununla birlikte, bu protokol SAHA kullanımıyla hiçbir şekilde sınırlı değildir ve korneal neovaskularizasyon üzerindeki çözünür bileşiklerin etkisini test etmek için genel bir yöntem olarak tavsiye edilir. Küçük değişiklikler seyreltme derecesi hem de frekans ve uygulama süresi için yapılmış olması gerekir. Ek olarak, su içinde kolayca çözünür olan bileşikleri DMSO yokluğunda tatbik edilmesi mümkün olacaktır.

Etik Açıklama: Tüm hayvan deneyleri sadece ulusal hukuk ve kurumsal düzenlemelere uygun olarak yapılmalıdır. Bu protokol, Tulane Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kullanım için onaylanmıştır.

1.. (Kullanım Düzeninde) Malzemelerin Hazırlanması

  1. 2 mm daire içine selüloz filtre kağıdı (11 mikron) bir parça kesin.
  2. NaOH ile 1 M çözelti hazırlayın500 ml damıtılmış H2O içinde NaOH 20 g çözülmesi Oda sıcaklığında saklayın. DİKKAT: NaOH çözümleri aşındırıcı ve alkali-yanıklara neden olabilir.
  3. Nihai 20 mg / ml ketamin konsantrasyonu ve 4 mg / ml ksilazin 1x PBS 37.5 ml 20 mg / ml ksilazin 10 ila 100 mg / ml ketamin ml ve 2,5 ml seyreltilmesi ile bir anestezi kokteyl hazırlayın.
  4. Filtre PBS 100 ml proparakain hidroklorür 500 mg çözülmesiyle (lokal analjezi için) proparakain hidroklorür ile% 0.5 'lik çözelti hazırlayın.
  5. 8 g NaCl, 0.2 g KCI, 1.44 g 2 Na HPO 4 ve damıtılmış H2O içinde 900 ml NaH 2 PO 4, 0.23 g çözülerek 1x PBS hazırlayın 7.4 pH ayarlayın. Sterilite sağlamak için damıtılmış H2O ve filtre ile 1000 ml 'lik bir son hacim için çözüm getirmek.
  6. DMSO içinde 1 ml SAHA 26.4 mg çözülmesiyle dimetil sülfoksit (DMSO) içinde ~ 100 mM'de SAHA 1000 x stok çözelti hazırlayın. Bir 1x sulandırmak (~ 10 uM)her bir kullanım için, filtre PBS çözeltisi. Kadar bir ay boyunca -20 ° C de stok solüsyonu saklayın. DİKKAT: DMSO bilinen bir toksin ve mutajen olduğu.
  7. Tespit için paraformaldehid (PFA) bir% 4 çözelti hazırlayın. Kimyasal bir başlık altında, PBS içinde 90 ml PFA 4 g çözülür. 65 ° C'ye kadar karışımın getirin ve 7.4 arasında bir pH'a titre edilir. PFA çözündükten sonra, 100 ml 'lik bir son hacim için bir çözüm getirir. Kadar bir ay boyunca 4 ° C'de saklayın. DİKKAT: PFA bir, alerjik karsinojenik ve toksik olduğu bilinmektedir.
  8. PBS içinde 94.5 ml keçi serumu içinde 5 ml ve Triton X-100'ün 500 ul seyreltilmesi ile 1 x bloke edici tamponu hazırlayın.
  9. PBS içinde 99.5 ml Triton X-100, 500 ul seyreltilmesi ile 1x yıkama tamponu hazırlayın.

2. Yaralanma ve Bileşik Tedavisi Alkali-Yanık

  1. 1 M NaOH çözeltisi içinde, çapı filtre kağıdı yuvarlak parça, yaklaşık 2 mm bekletin.
  2. WH, 100 mg / kg ketamin ve 5 mg / kg ksilazin enjeksiyonu ile fare anestezisiich ~ 25 g fare başına aşama 1.3 anestezik kokteyl 100 ul. Anestezi anestezi yanıt olmalıdır yeterli ise, yavaşça hayvanın parmak veya kuyruğu kısma belirlenebilir ~ anestezi derinliği in ayarlamak için 1-2 dakika sürer. Not: Bakım fare anestezi kaynaklı hipotermi yenik değildir sağlamak için alınmalıdır.
  3. Bir damlalık kullanarak, topikal lokal analjezi için kornea yüzeyinin 0.5% proparakain hidroklorür bir damla uygulanır.
  4. Steril forseps kullanarak, NaOH ıslatılmış filtre kağıdı bir parça almak. Eğer aşırı NaOH tutunarak veya filtre kağıdı damlayan fark ederseniz, kısaca aşırı emmek için filtre kağıdı kuru bir parça üzerinde ıslatılmış filtre kağıdı dokunun. Merkezi kornea üzerinde NAOH ıslatılmış filtre kağıdı parçası koyun. Bölgede ~ 2 x 2, 2 mm arasında akut alkali-yanık oluşturmak için 30 saniye boyunca bekletin. Bir cerrahi mikroskop düzgün bir filtre kağıdı koyularak yararlıdır. Not: fare s Sadece bir gözünühould diğer bir kontrol olarak hizmet veren yaralanabilir.
  5. Filtre kağıdı çıkarın. Bir 10 ml şırınga kullanarak, yumuşak kalıntı 1 M NaOH aşındırmak için iki kez 1 x 10 ml PBS ile göz yıkayın.
  6. Hemen 1x SAHA hazır çözelti (ya da PBS içeren bir araç kontrol no SAHA içeren seyreltilmiş DMSO) topikal kornea bir damla uygulanır. 14 gün boyunca uygulama 3x/day tekrarlayın. Not: zedelenmesinin gelişiminde ve bileşiğin verilmesine bir müdahalede olabileceğinden bu dönemde bir lokal antibiyotik merhem tavsiye edilmez. Bir sıvı antibiyotik çözüm gibi% 3 Gentamisin çözüm yerine kullanın.
  7. Klinik Değerlendirme (aşağıda Protokolü 3) doğrudan devam veya fare kurban ve (aşağıda Protokolü 4) ya da geleneksel parafin / dondurulmuş histoloji kornea düz montaj için gözleri tanıttılar.

3. Klinik Değerlendirme

  1. Cerrahi bir mikroskop altında bir kör şekilde farelerin günlük inceleme yapın ve c skororneal NV korneal opasite, NV ve damar boyutuna göre. En az iki gözlemci kullanmak ve iki ortalama bir skor kaydedebilirsiniz.
    1. 0-4 bir ölçekte kornea saydamlığını skor. 0 = tamamen açık; 1 = hafif puslu, iris ve öğrenci kolayca görülebilir; 2 = hafif opak, iris ve öğrenci hala saptanabilir; Zor saptanabilir 3 = opak, öğrenciler; ve öğrencinin hiçbir manzaralı tamamen opak 4 =.
    2. 0-3 arasındaki bir ölçek üzerinde NV Skor. 0 = hayır neoveselleri; Korneal limbusta 1 = neoveselleri; Kornea limbus kapsayan ve kornea merkezine yaklaşırken 2 = neoveselleri; Kornea merkezi kapsayan 3 = neoveselleri.
    3. 0-3 arasındaki bir ölçek üzerinde damar büyüklüğü Skor. 0 = hayır neoveselleri; Ameliyat mikroskobu altında tespit 1 = neoveselleri; Kolayca cerrahi mikroskop altında görülebilen 2 = neoveselleri; Kolayca mikroskop olmadan görülen 3 = neoveselleri.
  2. Bir dijital kamera kullanıyorsanız, 7 gün ve 14 gün gözün temsilcisi görüntü almak.

4.Kornea Boyama ve Düz Mounts

  1. 4 ° C'de en az 1 saat süreyle% 4 PFA içinde enüklee göz saptamak
  2. PBS 1x ve dikkatle aşırı doku çıkarmak için forseps kullanabilir göz aktarın.
  3. Bir cerrahi mikroskop yardımı ile, (Bu göz sıvının serbest gereken dikkat edin) gözün pericorneal bölgesini delmek için bir iğne (18 ölçü) veya mikro bıçak kullanın.
    1. Bölüm 4.3.1 'de yapılan delikli itibaren arka kısmından göz (kornea) ön kısmını kesmek için cerrahi bir makas kullanımı.
  4. 4 ° C'de gece boyunca sabitlenmesi için geri% 4 PFA içine kornea aktarın
  5. (: PFA tehlikeli ve kurumsal düzenlemelere uygun olarak bertaraf edilmelidir DİKKAT) ve kalan PFA çıkarmak için 1x PBS ile korneaya üç defa çalkalayın% 4 PFA atın.
  6. Doku permeabilize ve birincil antikorun özel olmayan bağlanmasını önlemek üzere, oda sıcaklığında en az 2 saat boyunca 1 x bloke edici tamponu içinde inkübe.
    1. Bir 100-500 kat seyreltmede, 1 x bloke edici tampon maddesi içinde birincil antikor uygulayın. 1:100 kan damarlarının tespit etmek için (örneğin, sıçan anti-fare PECAM-1, tavşan anti-fare-LYVE-1 makrofajlar tespit etmek için 1:500 'de lenf damarlarına tespit ve / veya fare için anti-mouse-F4/80 1:100). Gece boyunca 4 ° C'de inkübe edilir.
    2. Tam Bağlanmamış birinci antikorları ayıklamak için oda sıcaklığında 1 saat boyunca 1 x Yıkama tamponu ile her altı kez yıkayın.
    3. 1x bir 500-1000 kat seyreltmede bloke edici tampon içinde bir ikincil antikor uygulayın. (Örneğin, 488 nm floresan 1:800 at, keçi anti-fare-IgG'si etiketli ya da 594 nm floresan 1:800 da keçi anti-tavşan-IgG'si etiketli). Gece boyunca 4 ° C'de inkübe edilir.
    4. Tam Bağlanmamış ikinci antikorları ayıklamak için oda sıcaklığında 1 saat için, her 1x PBS ile üç kez yıkanır.
  7. Taze 1x PBS içine aktarın ve kornea, bir cerrahi mikroskop yardımıyla, dikkatlice yüzde doğru çevresinden dört kesiler yapmaker. Bu (edilen şekil yerine bir kelebek gibi görünmelidir) yaklaşık olarak eşit büyüklükte dört parçaya bölünür kornea bölmek ve bir slayt düz yatmak için izin vermelidir.
  8. Floresan görüntüleme için bir montaj orta uygun şekilde monte edilir. En iyi sonuçlar için, numuneler hemen görüntülü olmalıdır ve dijital fotoğraf alınmıştır, ancak, 4 ° C'de ışıktan korunmuş olarak birkaç hafta boyunca depolanabilir

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Alkali-yanık yaralanması sonrasında, kornea NV tahmin edilebilir, zamana bağlı bir şekilde oluşur. 1, bir muamele edilmemiş hayvan (Şekil 1A) ve HDAC inhibitörü SAHA (Şekil 1B ile tedavi edilmiş bir hayvan arasında yeni damarlanma ve kornea opasitesi hem de sade farkı gösterir Şekil ) 7 günlük bir zaman noktasında gerçekleştirilir.

Şekiller 2A ve 2B, primer PECAM-1 ve LYVE-1 lekeleme ve ikincil Alexa Fluor 488 ve 594 lekeleme (sırasıyla) ile muamele edilmemiş kontrol göz bir kornea düz bir montaj gösterilmektedir. 2C ve 2D ile günlük olarak tedavi edilmiş bir göz üzerinde aynı boyama göstermektedir HDAC inhibitörü SAHA, hemangiogenesis lenfanjiyogenezin ve hem de dramatik bir düşüş dikkat edin.

Şekil 3A ve 3B iki lekeleri ayrıntılı bir görünüm sağlar. PECAM-1 blo için bir işaretleyici ile karşılık vermektedirod kaplar (Şekil 3A), LYVE-1 lenf damarları (Şekil 3B) spesifik olarak bağlanan ise. Iki alan bir bindirme lenfanjiyogenezin genel hemangiogenesis karşılaştırılması hem de farklı hücre morfolojisi bir mukayesesini sağlayan, Şekil 3C 'de gösterilmiştir.

PFA fiksasyon (adım 4.1) ardından, gözün dondurulmuş veya parafin ya gömülü bölümleri oluşturmak için (yukarıdaki protokolde ayrıntılı değil) geleneksel kesit protokollerini kullanabilirsiniz. Bu düz bir montaj yapar işgali miktarının aynı düzeyde izin vermez iken, korneanın sagital bölümlerde, kornea kalınlığı ve göz içindeki tüplerin nispi derinliğini gösterebilir. 3D-F kornea sagital, dondurulmuş bölümler gösterir Rakamlar ve F4/80 (makrofaj boyama), ya DAPI (nükleer boyanma), ya da bir birleştirilmiş görüntü.

Şekil 1 Şekil 1. Tedavi edilmeyen göz yedi gün alkali-yanık sonrası korneal neovaskülarizasyon İlerlemesi. (A) Temsilcisi görüntü. (B) bir göz Temsilcisi görüntü ilgi bizim bileşik (HDAC inhibitörü SAHA) ile günde üç kez tedavi. Korneal opasite ve neovaskülarizasyondan farkı unutmayın. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Şekil 2. İşlem yapılmamış bir kontrol (A ve B) ve bir SAHA temsili görüntüleri (C & # tedaviYaralanma alkali-yanık D) Kornea yedi gün sonra (PECAM-1 ile vasküler endotelyal hücre boyama A ve C) Geniş alanlı görüntü; 160.. (B ve D) LYVE-1 ile lenfatik endotel hücre boyama Geniş alanlı görüntü. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3,. PECAM-1 (A) Vasküler endotel hücre boyama. (B) LYVE-1 lenfatik endotel hücre boyama. (C) PECAM-1/LYVE-1 lekeleme birleştirilmiştir. (D) bir sajital frozen makrofajların F4/80 boyama. (E) DAPI stsagittal bir kesim donmuş bölümünde hücre çekirdeğinin Aining. (F) F4/80 ve Dapi birleştirilmiştir. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada sunulan protokol bu üç (birbiriyle) süreçleri incelemek için ideal bir sistem haline hemangiogenesis, lenfanjiyogenezin ve inflamasyon tekrarlanabilir seviyeleri ile sonuçlanır. Bu yöntem merkezi kornea NV, hapların 18 ifade büyüme faktörü korneanın 17 yani sütür daha yönetti NV, neden geliştirilmiş ve implante edilmiş çeşitli yöntemler üretirken, aynı zamanda ilgi çekici olabilir. Bizim protokol de büyük memeliler için henüz mevcut değil moleküler ve transgenik teknikleri bir dizi tam olarak yararlanmak için bir laboratuvar izin verirken hayvan modeli kullanımı kolay bir sağlayarak, yetişkin fare kullanım için tasarlanmıştır. Yukarıdaki protokol ve temsili sonuçlar ayrıntılı bir C57BL/6J background farelerin kullanımı. Albino fareler de uygun olacaktır ve daha kolay görüntüleme sağlayabilir; Ancak, yeni bir çalışma albino farelerin neovasküler cevabı 19 gibi dramatik olmayabilir gösterir. Bundan başka, çok sayıda farklıDiğer neovaskülarizasyon modelleri, kornea NV cerrahi mikroskop aracılığıyla hatta çıplak gözle muayene ile atılır olabilir. Neovaskularizasyonun ölçüde daha titiz bir miktar gerekiyorsa, lekeli düz mount dijital görüntüleri yazılım paketleri bir dizi üzerinden analiz edilebilir, photoshop CS4 ile bunu yapmak için nasıl bir örnek ark Conner, görülebilir. 20 yeni Nature Protokolleri kağıt "fare oksijen kaynaklı retinopati Kantitasyonu".

Proparakain hidroklorür topikal çözelti (bu ailenin diğer üyeleri eşit olarak uygun olacaktır mümkündür) olarak uygulanan bir amino ester analjeziktir. Hayvan işlem için genel anestezi altında olsa da, biz ek topikal analjezi korneaya geri alma ağrıyı önlemek için etik bir zorunluluk görüyoruz. Bu PBS sizin bileşik sulandırmak ve göz filtre edilecek temizlemek için kullanılan ve inci boyunca temiz tutulması zorunludurE prosedürü (her kullanımdan önce kontaminasyon görünür belirtileri kontrol). PBS bireysel laboratuvar geleneğine dayanan denir; veya herhangi bir eşdeğer dengeli tuz çözeltisi, istenen sonucu elde etmek gerekir. Aynı şekilde, burada sunulan immünhistokimya protokol revizyonlar diğer kaynaklardan antikorlar (seyreltme gerekli derecesi yani) kullanıldığı takdirde çağrısında olabilir.

Bu prosedürün en teknik zorlu bölümleri NaOH ıslatılmış filtre kağıdı ilk yerleştirme ve kornea diseksiyon. Biz de teknik önce gerçek prosedür uygulanan öneririz. Filtre kağıdı her taraftan neovaskülarizasyon eşit düzeyde teşvik etmek için kornea ortasına yerleştirilmesi gerekir. Ofset herhangi bir derecesi fareden fareye değişkenlik yüksek düzeyde yaratacaktır. Kornea diseksiyon el becerisi iyi bir anlaşma gerektirir. Göz pericorneal bölgesini delmek için bir girişim yanıt olarak deforme muhtemeldir.Biz ilk kesim yapmak ve iç basıncı serbest bırakmak için keskin, küçük bir iğne kullanmanızı öneririz. Ilk lastik yapıldıktan sonra, cerrahi makas bir çift deliğe sokulur ve posterior göz bardaktan gözün anterior ayıran hayali bir hat boyunca kesmek için kullanılabilir. Yavaş ve dikkatli çalışan sağlam bir kornea verim gerekir.

Bu protokol birincil amacı kornea alkali-yanık tedavisinde çeşitli bileşiklerin etkinliğini tahlil için ise, aynı zamanda bir yara kornea yeniden epitheliaztion, korneal fibroz ve limbal epitel kök incelemek için kullanılacak olan bir potansiyele sahip olduğunu belirtmek gerekir hücre yenilenmesi. Ayrıca, patolojik hemangiogenesis, lenfanjiyogenezin ve inflamasyon mekanizmalarını keşfetmek için genel bir model olarak hizmet vermektedir. Protokol yapılabilir ki nispeten kolay olması, hem de invazif olmayan doğası gibi, in vivo tarama bileşik, etkinlik testi için cazip bir fırsat sunars ve patolojik anjiyojenez ile ilgili transgenik fare modelleri karakterizasyonu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Biz yazının hazırlanmasında Dr Xinyu Li'nin yardım için minnettarız. SW Tulane Üniversitesi, UT Güneybatı Tıp Merkezi, NIH Hibe EY021862, Körlük vakıf Engellenir Research bir kariyer geliştirme ödülü itibaren Başkanlık Araştırma Konseyi, Yeni Araştırmacı Ödülü, ve Yaşa Bağlı Makula Dejenerasyonu Araştırma Parlak Odak Ödülü bir başlangıç ​​fonu tarafından desteklenen .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 ml Syringe BD 309659
18 G Needle BD 305918
10 ml Syringe BD 306575
25 G Needle BD 305916
Anti-F4/80 (rat anti-mouse) AbD Serotech MCA497RT
Anti-LYVE-1 (rabbit anti-mouse) Abcam ab14917
Anti-PECAM-1 (rat anti-mouse) BD 553370
Anti-IgG Alexa 488 (goat anti-rat) Invitrogen A11006
Anti-IgG Alexa 594 (goat anti-rabbit) Invitrogen A11012
Camera Tucsen TCC 5.0 ICE
Coverslips Fisher 12-548-B
DMSO Sigma D4540-1L Caution: Mutagenic, Toxic
Forceps (Blunt), Iris WPI 15915
Forceps (Sharp), Dumont #4 WPI 500340
KCl Fisher P217-500
Ketamine Solution MedVet RXKETAMINE Controlled substance, proper license required for use.
Light Source for Microscope AmScope LED-14M-YA
Microscope (Stereo 7X-45X) AmScope SM-1B
Mounting Medium, VECTASHIELD Vector H-1000
NaCl Fisher S271-10
NaH2PO4 Fisher S397-500
NaOH Fisher S318-1 Caution: Corrosive
Paraformaldehyde P6148-500G Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic
Proparacaine Hydrochloride Sigma P4554-1G
Scissors (5 mm blade), Vanas WPI 14003
Goat Serum MPBio 92939249
Microscope Slides Fisher 12-550-15
Triton X-100 Sigma T8787-100ML
Whatman Grade 1 Filter Paper Whatman 1001-6508
Xylazine Solution MedVet RXANASED-20

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pascolini, D., Mariotti, S. Global estimates of visual impairment. Br. J. Ophthalmol. 96, (5), 614-618 (2010).
  2. Whitcher, J., Srinivasan, M., Upadhyay, M. Corneal Blindness: A Global Perspective. Bull. World Health Org. 79, (3), 214-221 (2003).
  3. Gupta, D., Illingworth, C. Treatments for corneal neovascularization: a review. Cornea. 30, (8), 927-938 (2011).
  4. Cursiefen, C., et al. Consensus statement on indications for anti-angiogenic therapy in the management of corneal diseases associated with neovascularisation: outcome of an expert roundtable. Br. J. Ophthalmol. 96, (1), 3-9 (2012).
  5. Delmonte, D., Kim, T. Anatomy and Physiology of the Cornea. J. Cataract Refract. Surg. 37, (3), 588-598 (2011).
  6. Cursiefen, C., Seitz, B., Dana, M. R., Streilein, J. W. Angiogenesis and lymphangiogenesis in the cornea. Pathogenesis, clinical implications and treatment options. Der Ophthalmologe. 100, (4), 292-229 (2003).
  7. Chang, J., Gabison, E., Kato, T., Azar, D. Corneal Neovascularization. Curr. Opin Ophthalmol. 12, (4), 242-249 (2001).
  8. Ambati, B., et al. Corneal Avascularity is due to Soluble VEGF Receptor-1. Nature. 443, (7114), 993-997 (2006).
  9. Cursiefen, C., et al. VEGF-A Stimulates Lymphangiogenesis and Hemangiogenesis in Inflammatory Neovascularization via Macrophage Recruitment. J. Clin. Invest. 113, (7), 1040-1050 (2004).
  10. Jiri, O. Paper Strips and Rings as Simple Tools for Standardization of Experimental Eye Injuries. Ophthal. Res. 1975, (7), 363-367 (2009).
  11. Ormerod, L., Abelson, M., Kenyon, K. Standard Models of Corneal Injury Using Alkali-Immersed Filter Discs Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30, (10), 2148-2153 (1989).
  12. Saika, S., et al. Therapeutic effects of adenoviral gene transfer of bone morphogenic protein-7 on a corneal alkali injury model in mice. Lab. Invest. 85, (4), 474-486 (2005).
  13. Ferrari, G., Bignami, F., Giacomini, C., Franchini, S., Rama, P. Safety and efficacy of topical infliximab in a mouse model of ocular surface scarring. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54, (3), 1680-1688 (2013).
  14. Sosne, G., Christopherson, P., Barrett, R., Fridman, R. Thymosin-beta4 modulates corneal matrix metalloproteinase levels and polymorphonuclear cell infiltration after alkali injury.Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, (7), 2388-2395 (2005).
  15. Li, X., et al. Inhibition of Multiple Pathogenic Pathways by Histone Deacetylase Inhibitor SAHA in a Corneal Alkali-Burn Injury Model. Mol. Pharm. 10, (1), 307-318 (2013).
  16. Yoeruek, E., et al. Safety, penetration and efficacy of topically applied bevacizumab: evaluation of eyedrops in corneal neovascularization after chemical burn. Acta Ophthalmol. 86, (3), 322-328 (2008).
  17. Bucher, F., Parthasarathy, A., Bergua, A., Onderka, J., Regenfuß, B., Cursiefen, C., Bock, F. Topical Ranibizumab inhibits inflammatory corneal hem- and lymphangiogenesis. Acta Ophthalmol. (2012).
  18. Hajrasouliha, A., Sadrai, Z., Chauhan, S., Dana, R. b-FGF induces corneal blood and lymphatic vessel growth in a spatially distinct pattern. Cornea. 31, (7), 804-809 (2012).
  19. Rogers, M., et al. The albino mutation of tyrosinase alters ocular angiogenic responsiveness. Angiogenesis. 16, (3), 639-646 (2013).
  20. Connor, K., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological. Nat. Protoc. 4, (11), 1565-1573 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics