Un Alkali-brûlures modèle de néovascularisation cornéenne chez la souris

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Summary

Néovascularisation (NV) de la cornée peut compliquer multiples pathologies visuelles. Utilisant un modèle de lésion alcalin brûlage dirigé, un niveau quantifiable de la SA de la cornée peut être produite pour l'étude mécaniste de la SA de la cornée et l'évaluation des thérapies potentielles pour les troubles néovasculaire.

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Anderson, C., Zhou, Q., Wang, S. An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse. J. Vis. Exp. (86), e51159, doi:10.3791/51159 (2014).

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Abstract

Dans des conditions normales, la cornée est avasculaire, et cette transparence est essentielle pour maintenir une bonne acuité visuelle. La néovascularisation (NV) de la cornée, qui peut être causée par un traumatisme, une maladie infectieuse ou kératoplastie, se décompose de la soi-disant «privilège angiogénique 'de la cornée et forme la base de plusieurs pathologies visuelles qui peuvent même conduire à la cécité. Bien qu'il existe plusieurs options de traitement disponibles, les besoins médicaux fondamentaux présentés par des pathologies de la cornée néovasculaire reste insatisfait. Afin de développer des thérapies sûres, efficaces et ciblés, un modèle fiable de la SA de la cornée et une intervention pharmacologique est nécessaire. Ici, nous décrivons un modèle de néovascularisation cornéenne blessures en milieu alcalin de brûlure dans la souris. Ce protocole fournit un procédé pour l'application d'une blessure en milieu alcalin combustion contrôlée de la cornée, de l'administration d'un composé d'intérêt pharmacologique, et la visualisation du résultat. Cette méthode pourrait s'avérer instrumentationtal pour étudier les mécanismes et les possibilités d'intervention dans NV cornée et d'autres troubles néovasculaire.

Introduction

Cécité cornéenne est la quatrième cause la plus fréquente de cécité, responsable d'environ 4% de tous les cas 1. Néovascularisation de la cornée (NV) joue un rôle important dans bon nombre de ces pathologies, y compris la kératite herpétique (le leader de cause infectieuse de cécité dans l'Ouest) et le trachome (la principale cause de cécité infectieuse dans le monde) 2. Les traitements actuels comprennent des stéroïdes, des médicaments anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS), des thérapies anti-VEGF, et la cyclosporine A, ainsi que les techniques chirurgicales conventionnelles ou laser 3. Cependant, la nature débilitante de NV basée pathologies de la cornée, la rareté des installations chirurgicales capables de traiter NV cornée, et l'absence d'une option pharmacologique fortement d'effectuer mené une table ronde d'experts récente de conclure que, malgré les traitements existants, la nécessité médicale fondamentale présenté par ces pathologies reste insatisfait 4.

La cornée humainese compose de 5 couches, 3 couches cellulaires (épithélial, stromales et endothéliales) et 2 interface (membrane de Bowman et de la membrane de Descemet). Il fonctionne comme une barrière mécanique et de la surface de réfraction de l'oeil. Sa transparence est la conséquence d'un équilibre délicat de ses composantes et fait partie intégrante de sa fonction 5. Normalement avasculaire, la cornée reçoit le sang à partir de micro-vaisseaux qui courent le long de son bord extérieur, qui sont alimentés à partir de la ciliaire et des artères ophtalmiques. NV cornéenne se produit quand un stimulus favorise l'angiogenèse de ces vaisseaux ce qui leur permet de se développer vers le centre de la cornée et donc de limiter vision 6. L'angiogenèse cornéenne comprend hemangiogenesis et la lymphangiogenèse, qui donnent lieu à la croissance de vaisseaux sanguins et les vaisseaux lymphatiques à partir de l'arcade vasculaire limbique vers le centre de la cornée. Cela conduit à une rupture de la cornée "privilège angiogénique", une augmentation de l'opacité de la cornée et de la fibrose, la perturbation de la cornée layers, et œdème 7. Les déclencheurs précis de la SA de la cornée sont nombreux, allant d'une réponse aux maladies infectieuses telles que le trachome à un état induit chimiquement provoqué médicaments traditionnels, les produits chimiques industriels, ou des agents de guerre chimiques même.

Les mécanismes moléculaires de ce processus ne sont pas, encore, entièrement caractérisés; Cependant, quelques joueurs clés ont été identifiés. Dans des conditions normales la cornée possède un «privilège angiogénique» unique maintenu par un réseau redondant de facteurs anti-angiogéniques (tels que VEGF-R1 soluble) 8. Toutefois, en réponse à un stimulus externe (par exemple une blessure), il y aura une régulation à la hausse locale de facteurs pro-angiogéniques (par exemple, VEGF-A). Cette pencher la balance de facteurs pro-et anti-angiogéniques qui sous-tend le privilège angiogénique de la cornée, et conduit à hemangiogenesis, lymphangeogenesis, et l'inflammation, provoquant ainsi une pathologie cornéenne et même la cécité 9.

<p class = "jove_content"> Compte tenu de l'besoins médicaux non satisfaits de cette pathologie très invalidante, il est de l'intérêt sur le terrain pour avoir un modèle animal fiable de la SA de la cornée. Ici, nous présentons un tel modèle: contrôlé blessure alcali-brûlure. Différents modèles œil blessures basés sur l'utilisation des anneaux de papier filtre ont été utilisés depuis les années 1970 10. En 1989, un groupe d'ophtalmologistes Harvard Medical School caractérisé un modèle standard d'une blessure en milieu alcalin de combustion centrale de la cornée du lapin sur la base de tremper une feuille de papier filtre circulaire avec de l'hydroxyde de sodium (NaOH) et de l'appliquer à la cornée à une gamme spécifique de 11 concentrations. Depuis lors, cette technique a été adaptée pour une utilisation dans le 12-14 de la souris. Récemment, le laboratoire Wang a étudié les effets thérapeutiques de l'histone déacétylase (HDAC) SAHA dans la pathogenèse de la NV cornéenne à l'aide d'un modèle de lésion de la cornée dans les alcalis brûlure souris 15. La méthodologie de la cornée modèle de lésion alcali-brûlure souris présentée ici a été construitprincipalement sur ​​le travail préalable de deux autres documents 14,16.

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Protocol

Remarque: Le protocole suivant et les résultats représentatifs utiliser l'inhibiteur de HDAC SAHA comme un composé d'exemple. Toutefois, ce protocole n'est en aucun cas limitée à l'utilisation de SAHA, et est recommandée en tant que méthode générale pour tester les effets des composés solubles sur la néovascularisation de la cornée. Des modifications mineures doivent être pris pour que le degré de dilution ainsi que la fréquence et la durée d'application. En outre, des composés qui sont facilement solubles dans l'eau pourront être administrées en l'absence de DMSO.

Engagement éthique: Tous les expériences sur les animaux ne doivent être effectuées en conformité avec la législation nationale et les règlements institutionnels. Ce protocole a été approuvé pour une utilisation par l'Université de Tulane institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité.

Une. Préparation du matériel (dans l'ordre d'utilisation)

  1. Couper un morceau de papier filtre de cellulose (11 um) en deux cercles mm.
  2. Préparer une solution à 1 M de NaOH pardissolvant 20 g de NaOH dans 500 ml d'eau distillée H 2 O. Stocker à température ambiante. ATTENTION: des solutions de NaOH sont corrosifs et peuvent causer des brûlures alcalins.
  3. Préparer un cocktail anesthésiant en diluant 10 ml de 100 mg / ml de kétamine et de 2,5 ml de 20 mg / ml de xylazine dans 37,5 ml de 1 x PBS pour obtenir une concentration finale de 20 mg / ml de kétamine et de 4 mg / ml de xylazine.
  4. Préparer une solution à 0,5% de chlorhydrate de proparacaïne (pour une analgésie topique) en dissolvant 500 mg de chlorhydrate de proparacaïne dans 100 ml de PBS filtré.
  5. Préparer 1x PBS en dissolvant 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na 2 HPO 4 et 0,23 g de NaH 2 PO 4 dans 900 ml d'H 2 O. distillée Ajuster à pH 7,4. Porter la solution à un volume final de 1000 ml avec de l'H 2 O distillée et de filtrage pour assurer la stérilité.
  6. Préparer 1000 x solutions de stockage de SAHA à ~ 100 mM dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) en dissolvant 26,4 mg de SAHA dans 1 ml de DMSO. Diluer à un 1x (~ 10 M)solution dans du PBS filtré à chaque utilisation. Conserver la solution stock à -20 ° C pendant un mois. ATTENTION: Le DMSO est une toxine et mutagène connu.
  7. Préparer une solution à 4% de paraformaldéhyde (PFA) pour la fixation. Sous une hotte chimique, dissoudre 4 g de PFA dans 90 ml de PBS. Porter le mélange à 65 ° C et titrer jusqu'à un pH de 7,4. Une fois que le PFA est dissous, porter la solution à un volume final de 100 ml. Stocker à 4 ° C pendant un mois. ATTENTION: Le PFA est un allergénique connue, cancérigènes et toxiques.
  8. Préparer du tampon de blocage 1x par dilution de 5 ml de sérum de chèvre et de 500 ul de Triton X-100 dans 94,5 ml de PBS.
  9. Préparer le tampon de lavage en diluant 1 x 500 ul de Triton X-100 dans 99,5 ml de PBS.

2. Alkali-Burn traitement des blessures et composé

  1. Faire tremper un morceau rond de papier filtre, ~ 2 mm de diamètre, dans une solution de 1 M de NaOH.
  2. Anesthésier les souris avec une injection de 100 mg / kg de kétamine et 5 mg / kg de xylazine, which est ~ 100 pi de cocktail anesthésie de l'étape 1.3 par 25 g souris. Anesthésie devrait prendre ~ 1-2 min à mettre po profondeur de l'anesthésie peut être déterminée en pinçant doucement la pointe ou de la queue de l'animal, si l'anesthésie est suffisante il devrait y avoir aucune réponse. Remarque: Il faut veiller à assurer la souris ne succombe pas à l'anesthésie hypothermie induite.
  3. En utilisant une pipette, appliquer localement une baisse de 0,5% de chlorhydrate de proparacaïne à la surface de la cornée pour l'analgésie locale.
  4. En utilisant des pinces stériles, ramasser un morceau de papier filtre imbibé NaOH. Si vous remarquez un excès de NaOH accroché à ou s'égoutte par le papier filtre, appuyez brièvement sur le papier filtre imbibé sur un morceau sec de papier filtre pour absorber l'excès. Placer le morceau de papier filtre imbibé de NaOH sur la cornée centrale. Laissez-le pendant 30 secondes pour produire un alcali-brûlure aiguë de ~ 2 x 2 mm 2 de surface. Un microscope d'opération est utile pour placer correctement le papier filtre. Remarque: Seul un œil de la souris should se blesser avec l'autre servant de témoin.
  5. Retirez le papier filtre. En utilisant une seringue de 10 ml, rincer doucement l'œil avec 10 ml de PBS 1x deux fois pour laver résiduelle NaOH 1.
  6. Appliquer immédiatement une goutte de solution de travail 1x SAHA (ou un contrôle de véhicule constitué de PBS dilué DMSO contenant pas SAHA) par voie topique à la cornée. Répétez l'application 3 fois par jour pendant 14 jours. Remarque: au cours de cette période, un onguent antibiotique topique n'est pas recommandé car il peut interférer avec le développement de la blessure et la livraison du composé. Utilisez une solution antibiotique liquide, solution de gentamicine tels que de 3%, à la place.
  7. Passez directement à l'évaluation clinique (protocole n ° 3 ci-dessous) ou de sacrifier la souris et énucléer les yeux pour la cornée montage plat (protocole n ° 4 ci-dessous) ou de la paraffine / histologie conventionnelle congelé.

3. Évaluation clinique

  1. Procéder à un examen quotidien de la souris à l'aveugle sous un microscope chirurgical et marquer corneal NV basée sur l'opacité de la cornée, NV, et la taille du navire. Utiliser au moins deux observateurs, et enregistrer un résultat final qui est la moyenne des deux.
    1. Note opacité de la cornée sur une échelle de 0-4. 0 = pas du tout claires; 1 = légèrement brumeux, iris et la pupille facilement visible; 2 = légèrement opaques, iris et la pupille encore détectable; 3 = opaques, des élèves à peine détectables; et 4 = complètement opaques sans vue de l'élève.
    2. Note NV sur une échelle de 0-3. 0 = pas de néovaisseaux; 1 = néovaisseaux au limbe cornéen; 2 = néovaisseaux enjambant le limbe cornéen et s'approchent du centre de la cornée; 3 = néovaisseaux couvrant le centre de la cornée.
    3. Note taille du navire sur une échelle de 0-3. 0 = pas de néovaisseaux; 1 = néovaisseaux détectables au microscope chirurgical; 2 = néovaisseaux facilement vu sous microscope chirurgical; 3 = néovaisseaux facilement vus sans microscope.
  2. L'utilisation d'un appareil photo numérique, prendre des images représentatives de l'œil à 7 jours et 14 jours.

4.Cornée coloration et supports plats

  1. Corrigez les yeux énucléés dans 4% PFA pendant au moins 1 heure à 4 ° C.
  2. Transfert à l'œil de 1x PBS et utiliser une pince pour retirer soigneusement l'excès de tissu.
  3. Avec l'aide d'un microscope chirurgical, utiliser une aiguille (calibre 18) ou micro-couteau pour perforer la région péricornéenne de l'oeil (note: cela devrait libérer le fluide de l'oeil).
    1. De la perforation réalisée dans la section 4.3.1 en utilisant une paire de ciseaux chirurgicaux pour couper la partie antérieure de l'oeil (cornée) de la partie postérieure.
  4. Transférer la cornée de retour dans 4% PFA pour la fixation nuit à 4 ° C.
  5. Jeter la PFA 4% (ATTENTION: PFA est dangereux et doit être éliminé conformément à la réglementation institutionnels) et rincer la cornée trois fois avec PBS 1x pour enlever tout résidu PFA.
  6. Incuber dans du tampon de blocage 1x pendant au moins 2 heures à la température ambiante pour perméabiliser le tissu et empêcher la liaison non spécifique de l'anticorps primaire.
    1. Appliquer un anticorps primaire dans un tampon de blocage 1x, à une dilution 100-500. (Par exemple de rat anti-souris-PECAM-1 pour détecter les vaisseaux sanguins à 1:100, de lapin anti-souris-LYVE-1 pour détecter des vaisseaux lymphatiques à 1:500, et / ou de rat anti-mouse-F4/80 pour détecter les macrophages à 1:100). Incuber à 4 ° C pendant une nuit.
    2. Laver six fois avec 1x tampon de lavage pendant 1 heure à chaque fois à la température ambiante pour éliminer totalement anticorps primaire non lié.
    3. Appliquer un anticorps secondaire en 1x tampon de blocage à une dilution 500-1000. (Par exemple, une lampe fluorescente de 488 nm marqué de chèvre anti-rat-IgG à 1:800 ou une lampe fluorescente de 594 nm marqué de chèvre anti-lapin IgG à 1:800). Incuber à 4 ° C pendant une nuit.
    4. Laver trois fois avec PBS 1x pendant 1 heure chacun à la température ambiante à supprimer complètement anticorps secondaire non lié.
  7. Transférer la cornée en frais 1x PBS et, à l'aide d'un microscope chirurgical, faire attention quatre incisions de la périphérie vers le center. Cela devrait diviser la cornée en quatre quadrants de taille à peu près égale (la forme résultante devrait ressembler un peu comme un papillon) et lui permettre de reposer à plat sur une diapositive.
  8. Monter avec un milieu approprié de montage pour l'imagerie de fluorescence. Pour de meilleurs résultats, les échantillons doivent être visualisés immédiatement et photographies numériques prises, mais peuvent être stockés pendant plusieurs semaines à l'abri de la lumière à 4 ° C.

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Representative Results

Après une blessure en milieu alcalin brûlure, NV cornéenne se produit dans un mode dépendant du temps prévisible. Figure 1 montre la différence rigide à la fois dans la néovascularisation et l'opacité de la cornée entre un animal non traité (figure 1A) et un animal traité avec l'inhibiteur de HDAC SAHA (Figure 1B ) au point de temps de 7 jours.

Les figures 2A et 2B montrent un support plat de la cornée d'un oeil témoin non traité avec primaire PECAM-1 et LYVE-1 coloration et secondaire Alexa Fluor 488 et 594 coloration (respectivement). Figures 2C et 2D montrent le même coloration sur un oeil traité quotidiennement avec l'inhibiteur de HDAC SAHA, noter la baisse spectaculaire dans les deux hemangiogenesis et la lymphangiogenèse.

Les figures 3A et 3B permettent un regard détaillé sur les deux taches. PECAM-1 sert de marqueur pour le blonavires de OD (Figure 3A), tout en LYVE-1 se lie spécifiquement à des vaisseaux lymphatiques (figure 3B). Une superposition des deux champs est représenté sur la figure 3C, ce qui permet des comparaisons de hemangiogenesis vs lymphangiogenèse, ainsi que la comparaison de la morphologie des cellules différentes.

Après fixation PFA (étape 4.1), vous pouvez utiliser des protocoles de coupes classiques (non détaillés dans le protocole ci-dessus) pour générer des sections, soit congelés ou inclus en paraffine de l'œil. Bien que cela ne permet pas le même niveau de quantification de l'invasion qui a fait un montage plat, coupe sagittale de la cornée peuvent vous montrer épaisseur de la cornée et de la profondeur relative des tubes à l'intérieur de l'œil. Figures 3D-F montre des coupes sagittales, congelés de la cornée et soit F4/80 (macrophages coloration), DAPI (coloration nucléaire), ou une image fusionnée.

Figure 1 Figure 1. Progression de la néovascularisation de la cornée sept jours après blessure alcali-brûlure. (A) Représentant l'image d'un oeil non traité. (B) Représentant l'image d'un oeil traité trois fois par jour avec notre composé d'intérêt (l'inhibiteur de HDAC SAHA). Notez la différence de l'opacité de la cornée et la néovascularisation. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Des images représentatives d'un témoin non traité (A et B) et un SAHA traitées (C & et #160, D) sept jours après la cornée dans les alcalis brûlures A et C), l'image de champ large de la coloration vasculaire des cellules endotheliales avec PECAM-1 (.. (B et D) image à grand champ de lymphatique coloration des cellules endothéliales avec LYVE-1. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
La figure 3 (A). Vasculaire de coloration des cellules endotheliales avec PECAM-1 (B). Lymphatique coloration des cellules endotheliales avec LYVE-1. (C) issu de la fusion PECAM-1/LYVE-1 coloration. (D) F4/80 coloration des macrophages dans une section gelée sagittal. (E) st DAPIaining du noyau cellulaire dans une coupe sagittale de la coupe congelée. (F) Fusionné F4/80 et coloration DAPI. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Le protocole présenté ici résulte des niveaux reproductibles de hemangiogenesis, lymphangiogenèse, et l'inflammation, ce qui en fait un système idéal pour étudier ces trois processus interdépendants (). Bien que cette méthode produit NV cornée centralisée, plusieurs méthodes ont été développées pour provoquer plus dirigé NV, à savoir la suture de la cornée 17 et implantés facteur de croissance exprimer pastilles 18, pourrait également être d'intérêt. Notre protocole est conçu pour être utilisé chez la souris adulte, fournir un outil facile à utiliser modèle animal tout en permettant également un laboratoire de tirer pleinement parti d'une foule de techniques moléculaires et transgéniques pas encore disponibles pour les grands mammifères. Le protocole ci-dessus et des résultats représentatifs de détail l'utilisation de la souris sur un fond C57BL/6J. Souris albinos conviendraient également et peuvent fournir pour l'imagerie plus facile; Toutefois, une étude récente indique que la réponse néovasculaire de la souris albinos peut-être pas aussi dramatique 19. En outre, contrairement à plusieursd'autres modèles de néovascularisation, NV cornée peuvent être marqués avec un examen au microscope chirurgical ou même à l'œil nu. Si une quantification plus rigoureuse de la mesure de la néovascularisation est requise, des images numériques de la montagne plat teinté peuvent être analysés par un certain nombre de logiciels, un exemple de la façon de le faire avec photoshop CS4 peut être vu dans Conner, et al. récente nature Protocoles papier "Quantification de la rétinopathie induite par l'oxygène dans la souris» 20.

Chlorhydrate Proparacaine est un analgésique amino ester appliqué comme une solution topique (il est possible que d'autres membres de cette famille, il est également acceptable). Même si l'animal est placé sous anesthésie générale pour la procédure, nous estimons analgésie topique supplémentaire une nécessité éthique de prévenir la douleur d'annulation de la cornée. Il est impératif que le PBS utilisé pour diluer votre composé et rincez l'œil être filtrée et maintenue propre tout au long de eprocédure de e (vérifier les signes visibles de contamination avant chaque utilisation). PBS est appelé pour basé sur la tradition de chaque laboratoire; toute solution équivalente de sel équilibrée doit atteindre le résultat souhaité. De même, la révision du protocole d'immunohistochimie présentées ici peuvent être appelés pour si des anticorps provenant d'autres sources sont utilisées (par exemple le degré de dilution nécessaire).

Les parties les plus techniquement difficile de cette procédure sont le placement initial du papier filtre imbibé de NaOH et la dissection de la cornée. Nous recommandons que les deux techniques sont pratiquées avant l'intervention réelle. Le papier-filtre doit être placé dans le centre de la cornée, afin de promouvoir un niveau égal de néovascularisation à partir de tous les côtés. N'importe quel degré de décalage va créer un niveau élevé de variabilité de la souris à la souris. Dissection cornéenne nécessite une bonne dose de dextérité manuelle. L'oeil est susceptible de se déformer en réponse à une tentative pour perforer la région péricornéenne.Nous vous recommandons d'utiliser une aiguille de calibre petit pointu pour faire la coupe initiale et relâcher la pression à l'intérieur. Après une ponction initiale est faite, une paire de ciseaux chirurgicaux peuvent être insérés dans le trou et sert à couper le long d'une ligne imaginaire séparant la partie antérieure de l'oeil à partir de l'oeillère postérieure. Travailler lentement et avec précaution devrait donner une cornée intacte.

Il convient de noter que, bien que le but principal de ce protocole est de doser l'efficacité de divers composés dans le traitement des blessures en milieu alcalin brûlure de la cornée, il a aussi le potentiel d'être utilisé pour étudier plaie cornéenne re-epitheliaztion, la fibrose de la cornée, et souches épithéliales limbiques le renouvellement cellulaire. En outre, il sert de modèle général à explorer les mécanismes de hemangiogenesis pathologique, la lymphangiogenèse, et l'inflammation. La relative facilité avec laquelle le protocole peut être effectuée, ainsi que sa nature non invasive, présente une opportunité intéressante pour le dépistage in vivo de composé, test d'efficacités, et la caractérisation des modèles de souris transgéniques par rapport à l'angiogenèse pathologique.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Nous sommes reconnaissants de l'aide du Dr Li Xinyu dans la préparation du manuscrit. SW a été soutenue par un fonds de démarrage de la Tulane University, New Investigator Award Conseil de recherches du président de l'UT Southwestern Medical Center, NIH Grant EY021862, une bourse de développement de carrière de la recherche visant à prévenir fondation cécité, et un prix brillant Focus à l'âge Dégénérescence Maculaire Liée à la recherche .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 ml Syringe BD 309659
18 G Needle BD 305918
10 ml Syringe BD 306575
25 G Needle BD 305916
Anti-F4/80 (rat anti-mouse) AbD Serotech MCA497RT
Anti-LYVE-1 (rabbit anti-mouse) Abcam ab14917
Anti-PECAM-1 (rat anti-mouse) BD 553370
Anti-IgG Alexa 488 (goat anti-rat) Invitrogen A11006
Anti-IgG Alexa 594 (goat anti-rabbit) Invitrogen A11012
Camera Tucsen TCC 5.0 ICE
Coverslips Fisher 12-548-B
DMSO Sigma D4540-1L Caution: Mutagenic, Toxic
Forceps (Blunt), Iris WPI 15915
Forceps (Sharp), Dumont #4 WPI 500340
KCl Fisher P217-500
Ketamine Solution MedVet RXKETAMINE Controlled substance, proper license required for use.
Light Source for Microscope AmScope LED-14M-YA
Microscope (Stereo 7X-45X) AmScope SM-1B
Mounting Medium, VECTASHIELD Vector H-1000
NaCl Fisher S271-10
NaH2PO4 Fisher S397-500
NaOH Fisher S318-1 Caution: Corrosive
Paraformaldehyde P6148-500G Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic
Proparacaine Hydrochloride Sigma P4554-1G
Scissors (5 mm blade), Vanas WPI 14003
Goat Serum MPBio 92939249
Microscope Slides Fisher 12-550-15
Triton X-100 Sigma T8787-100ML
Whatman Grade 1 Filter Paper Whatman 1001-6508
Xylazine Solution MedVet RXANASED-20

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References

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