بدء النقيلي سرطان الثدي عن طريق استهداف ظهارة الأقنية مع اتش، لجنة المساواة العرقية: رواية المعدلة وراثيا نموذج الفأر من سرطان الثدي

* These authors contributed equally
Medicine
 

ERRATUM NOTICE

Summary

تفعيل الطفرات الكامنة مع اتش، لجنة المساواة العرقية في نتائج نظام الأقنية اللبنية في الثدي النقيلي سرطان ذات الصلة سريريا. إدماج المروج YFP يسمح تتبع خلايا الورم النقيلي البعيدة. هذا النموذج هو مفيد لدراسة الانبثاث الكامنة، والحصانة المضادة للورم، وللتصميم المناعية رواية لعلاج سرطان الثدي.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Rutkowski, M. R., Allegrezza, M. J., Svoronos, N., Tesone, A. J., Stephen, T. L., Perales-Puchalt, A., Nguyen, J., Zhang, P. J., Fiering, S. N., Tchou, J., Conejo-Garcia, J. R. Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer. J. Vis. Exp. (85), e51171, doi:10.3791/51171 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

سرطان الثدي هو مرض غير المتجانسة التي تنطوي على تفاعلات معقدة بين الخلوية السرطانية النامية والجهاز المناعي، مما أدى في نهاية المطاف في نمو الورم والانبثاث الأسي إلى الأنسجة البعيدة وانهيار المناعة المضادة للورم. وجود العديد من نماذج حيوانية مفيدة لدراسة سرطان الثدي، ولكن لا شيء تماما ألخص تطور المرض الذي يحدث في البشر. من أجل الحصول على فهم أفضل للتفاعلات الخلوية التي تؤدي إلى تشكيل ورم خبيث الكامنة وانخفض البقاء على قيد الحياة، ونحن قد ولدت في نموذج الفأر وراثيا محرض من YFP، معربا عن سرطان الأقنية التي يتطور بعد إلى مرحلة النضج الجنسي في الفئران المناعة المختصة وتحركها بواسطة متسقة، الغدد الصماء مستقلة الجين الورمي التعبير. وقد تحقق تفعيل YFP، الاجتثاث من البروتين p53، وتعبير عن شكل من أنكجنيك K-راس من قبل التسليم للجنة المساواة العرقية، معربا اتش recombinase في القناة الثديية من ناضجة جنسيا، إناث الفئران عذراء. الأورامتبدأ في الظهور بعد 6 أسابيع من بدء الأحداث أنكجنيك. بعد أن تصبح الأورام واضحة، فإنها تقدم ببطء لمدة أسبوعين تقريبا قبل أن تبدأ في النمو باطراد. بعد 7-8 أسابيع بعد الحقن اتش، لوحظ الأوعية الدموية التي تربط كتلة الورم إلى العقد الليمفاوية البعيدة، مع الغزو lymphovascular في نهاية المطاف من الخلايا السرطانية YFP + إلى العقد الليمفاوية الإبطية البعيدة. التسلل السكان الكريات البيض هي مماثلة لتلك التي وجدت في سرطان الثدي البشرية، بما في ذلك وجود αβ وγδ الخلايا التائية، الضامة وMDSCs. وهذا نموذج فريد من نوعه تسهيل دراسة الآليات الخلوية والمناعية تشارك في الانبثاث الكامنة والسكون بالإضافة إلى كونها مفيدة لتصميم التدخلات immunotherapeutic جديدة لعلاج سرطان الثدي.

Introduction

سرطان الثدي هو الورم الخبيث الأكثر شيوعا التي تحدث عند النساء في جميع أنحاء العالم 1،2 والسبب الرئيسي الثاني للوفيات المرتبطة بالسرطان 2. مجمع الوراثية 3،4، 5 النسيجي، والظواهر السريرية تستخدم 6 لتوصيف أنواع فرعية مختلفة من سرطان الثدي، وغالبا ما تستخدم كوسيلة للتنبؤ البقاء على قيد الحياة. وأشار تحليل لفيف كبير من النساء المصابات بسرطان الثدي أن معظم (تقريبا 80٪) من المرضى الذين لقوا حتفهم قد تكررت في غضون 10 سنة إزالة آخر من الورم الرئيسي 7. بالنسبة لغالبية سرطانات الثدي الغازية، وقد تبين الغزو lymphovascular أن ترتبط بقوة إلى نتيجة الفقراء وبالطبع السريرية أكثر عدوانية من المرض 8.

بسبب تعقيد الوراثية والمظهرية لسرطان الثدي، لا يوجد نموذج الحيوان الذي يلخص كامل من المرض. وقد الثدي خطوط الخلايا السرطانية البشرية في كثير من الأحيانتستخدم طعم أجنبي أو 9 نماذج مثلي من سرطان الثدي الغازية والمنتشر في الفئران تعاني من نقص المناعة. على الرغم بالمعلومات، تحدث هذه النماذج في غياب الضغط المناعي، ولأنه هو الكسب غير المشروع عبر الأنواع، تشويه آثار المكروية الورم بأكمله. وقد ساهمت الطفرات الوراثية محرض يقودها المروجين محددة الثديية مثل الفئران فيروس الورم الثديية (MMTV) ومصل اللبن البروتين الحمضية (WAP) قدرا هائلا من المعرفة حول طبيعة وراثية لسرطان الثدي. ومع ذلك، يتم المساس التعبير الأنسجة محددة من هذه المروجين من قبل استجابتها للنظام الغدد الصماء 10-16، مما أدى إلى التعبير متغير من الطفرات الوراثية التي يسببها والتي لا تعكس التعبير عن الجينات المسرطنة بإفراط (overexpressed) عادة في سرطان الثدي البشرية. للتغلب على سيطرة الغدد الصماء التعبير MMTV مدفوعة من الجينات المسرطنة، موديز وآخرون. لدت مشروطة، الدوكسيسيكلين محرض نموذج overexpressing نوي في الثديظهارة 17. هذا النموذج هو مفيد لdeinducing نوي بعد تشكيل الورم لدراسة الانحدار وتكرار، ولكن يتطلب إدارة الدوكسيسيكلين المستمر للمتسقة وطويلة الأجل التعبير الجين الورمي. مناقشة شاملة للعديد من النماذج ورم الثدي ذات الصلة المتاحة يمكن العثور عليها في الاستعراض الذي فارجو-Gogola وآخرون 10

كان هدفنا لتطوير نموذج الفأر من سرطان الثدي يمكن عزوها على كامل C57BL / 6 خلفية أنه بعد تحريض دائم من الأحداث طفرية، ونماذج تشكيل الورم الوليدة في وجود ضغط المناعي. قدمنا ​​اتش معربا جنة المساواة العرقية، recombinase في القنوات الثديية من الفئران المعدلة وراثيا تحتوي على الأليلات floxed من TP53، وشكل أنكجنيك من K-راس، وYFP. لجنة المساواة العرقية التعبير ablates TP53، وهو الجين المتحور في كثير من الأحيان في العديد من سرطانات الثدي والحث على 18 أليل أنكجنيك من K-راس بالإضافة إلى YFP التعبير على وجه التحديدفي ظهارة الأقنية الثديية. على الرغم من الطفرات في K-راس نادرة في سرطان الثدي، والتي تحدث في 6.5٪ فقط من مرضى سرطان الثدي 19،20، وoverexpression من تحركات المنبع مثل محفز Her2 وEGFR النتيجة في تفعيل التأسيسية للمسار رأس يشير في أورام الثدي البشرية 21-23. كما تم الإبلاغ تفعيل مسار الإشارات رأس في كثير من خطوط الخلايا السرطانية الثدي 24،25. سنقوم بشرح الشروع في تشكيل الورم وتقنية الحقن ينترادوكتال لجنة المساواة العرقية، معربا اتش recombinase في ناضجة جنسيا، إناث الفئران عذراء. هذا النموذج من سرطان الثدي يتطور الآفات العلنية التي تنمو باطراد بعد حوالي 8 أسابيع من بطء تطور الورم، مع الغزو lymphovascular والانبثاث العقدة الليمفاوية الإبطية من قبل 7-8 أسابيع. لأن هذه الفئران هي على كامل C57BL / 6 الخلفية وYFP، معربا عن الخلايا السرطانية هي ارجاعها في الغدد الليمفاوية البعيدة، وهذا النموذج يوفر أداة ذات الصلة لدراسة مسوف آليات llular والمناعية من ورم خبيث الكامنة وتساعد على وضع نهج علاجية جديدة لعلاج سرطان الثدي النقيلي الأقنية.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدام معهد ويستار.

1. جيل والصيانة من الفئران المعدلة وراثيا

  1. تولد LSL-K-26 ورأس tm4Tyj Trp53 tm1Brn 27 (تم الحصول عليها من نماذج الماوس من لجنة التحقيق الوطنية كونسورتيوم سرطان الإنسان على خلفية مختلطة) لكامل C57BL / 6 الخلفية 28 بواسطة backcrossing لا يقل عن 10 الأجيال مع C57BL / 6 الفئران. لتتبع الانبثاث ورم، وتولد B6.129X1-GT (ROSA) 26Sor TM1 (EYFP) كوس / J (LSL-EYFP، تم الحصول عليها من مختبر جاكسون على كامل C57BL / 6 الخلفية) مع ضعف المعدلة وراثيا LSL-K-راس G12D / + الفئران البروتين p53 loxP / loxP.
    ملاحظة: الفئران المعدلة وراثيا LSL-K-راس G12D / + البروتين p53 loxP / loxP لديها مواقع loxP المرافقة أليل إسكات transcriptionally من أنكجنيك K-ras و البروتين p53 في موضع الذاتية، بحيث أنه عند الختان لجنة المساواة العرقية بوساطة، overexpression من وأنكجنيك K-راس متحولة والاجتثاث من البروتين p53 هو عشيeved.
    ملاحظة: يحتوي الماوس LSL-EYFP كودون وقف المرافقة جين لتعزيز البروتين أصفر نيون (YFP) أنه عند الختان النتائج بوساطة لجنة المساواة العرقية في التعبير عن YFP في الأنسجة حيث يتم رفعه المحطة كاسيت YFP.
    1. تتكاثر الفئران المعدلة وراثيا للحصول على LSL-K-راس G12D / + P53 الفئران loxP / loxP أو LSL-K-راس G12D / + البروتين p53 loxP / loxP الفئران LSL-EYFP لحقن ينترادوكتال.
      ملاحظة: هي ولدت الفئران كما متماثلة اللواقح بالنسبة البروتين p53 loxP / loxP ومتخالف لLSL-K-راس G12D / + لأن الفئران مع الحذف متماثلة اللواقح من K-راس يموت في الرحم. استخدام الإناث البكر السذاجة ما لا يقل عن ستة أسابيع من العمر لحقن ينترادوكتال.
      ملاحظة: الاشعال عن التنميط الجيني متماثل floxed البروتين p53 أليل هي البروتين p53 - T010-FWD (5'-AAGGGGTATGAGGGACAAGG-3 ') والبروتين p53-T011-REV (5'-GAAGACAGAAAAGGGGAGGG-3). أنها تنتج نوع أليل البرية في 391 سنة مضت والبروتين p53 floxed أليل في 461 نقطة أساس 29،30.
      ملاحظة: الاشعال للكشف عن شكل متحولة من K-راس هي oIMR8273 (5'-CGCAGACTGTAGAGCAGCG-3 ') وoIMR8274 (5'-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC-3). أنها تنتج الفرقة متحولة في الكشف عن 600BP.
      ملاحظة: للحصول على مراسل YFP الفئران المعدلة وراثيا الثلاثي، الاشعال للكشف الكاسيت ROSA (5'-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3 ')، والنوع البري أليل (5'-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3')، وأليل المشتركة (5'-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT -3 ') يؤدي إلى تضخيم العصابات في 320 نقطة أساس لأليل floxed و 600 نقطة أساس لنوع أليل البرية.

2. إعداد الجراحية

  1. المواد الجراحية النظيفة مع 75٪ ETOH والأوتوكلاف لهم قبل وبعد كل شيء الحقن.
  2. إجراء عملية جراحية على مقاعد البدلاء المختبر مرتب نظيفة في غرفة معقمة داخل منشأة الحيوانية. مسح أسفل جميع الأسطح بما في ذلك مرحلة وبطلب من المجهر الجراحي بمحلول مطهر واسع الطيف تليها 75٪ ETOH.
  3. وتزن تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من مزيج من الكيتامين (80-100 ملغ / كلغ) وزيلازين (8-10 ملغ / كلغ) في ملحي معقم.
  4. وضع بلطف الفئران مرة أخرى إلى أقفاصها دون عائق لمدة 5 دقائق في حين أنها تذهب تحت التخدير. خلال هذا الوقت تولد رواسب فيروس (انظر البروتوكول 3).
  5. التحقق من عدم وجود استجابة للألم بواسطة أخمص القدمين معسر. تغطية بلطف عيون الفئران تخدير مع مرهم البيطرية لمنع جفاف القرنية المفرطة.
  6. لمنع انخفاض حرارة الجسم، ووضع الفئران تخدير على وسادة التدفئة لتعيين درجة حرارة منخفضة أثناء إجراء العمليات الجراحية وحتى تبدأ في التعافي.
  7. لإدارة الألم، وإدارة الفئران ميلوكسيكام تحت الجلد في 1 ملغ / كغ قبل الجراحة وبعد 24 ساعة.

3. جيل من الرواسب الفيروسات

تنبيه: ناقلات اتش، على الرغم من أنها قد تم تعديلها وغير قادرين على تكرار، تشكل خطرالعدوى. التعامل مع اتش بحذر. جميع الموظفين ينبغي تدريب مناسب وفقا للمبادئ التوجيهية للمؤسسة للتعامل مع وكلاء BSL2 بعد حقن ينترادوكتال، والتخلص من اتش فقا للمبادئ التوجيهية BSL2.

  1. تتركز متجر مخزونات فيروس اتش -80 ° C المجمدة في aliquots من 4 × 10 8 PFU لكل منهما، كافية لحقن الحيوانات مع 16 مل من 3 2.5 × 10 7 PFU من الجسيمات اتش.
  2. تخزين مأخوذة اتش على الثلج الجاف حتى ما يقرب من 15-20 دقيقة قبل البدء في الحقن.
    ملاحظة: تجنب تكرار دورات تجميد ذوبان الجليد، وقطرات عيار الفيروس بشكل كبير بين كل دورة.
    ملاحظة: تتشكل رواسب اتش عن طريق تعديل بروتوكول الموصوفة سابقا 31.
  3. إعادة 504 ملغ من مسحوق MEM مع 50 مل من الماء المعقم الصف الجزيئية، الملحق مع 244 ملغ من بيكربونات الصوديوم والتصفية في ظروف معقمة وتخزينها في 4 درجات مئوية.
      <لى> تحضير محلول كلوريد الكالسيوم عن طريق إضافة 1.5 غرام من كلوريد الكالسيوم إلى 50 مل من الماء الصف الجزيئية والتصفية في ظروف معقمة وتخزينها في 4 درجات مئوية.
    1. مزيج مأخوذة تحتوي على 4 × 10 8 PFU اتش لجنة المساواة العرقية، مع ما يكفي من السكروز 3٪ في الماء المعقم عن الحجم النهائي من 10 مل. إضافة 34 مل من MEM للفيروس والمزيج بلطف. ثم إضافة 4 مل من محلول و CaCl مزيج بلطف، ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15-20 دقيقة.
    2. متجر اتش على الثلج الجاف حتى على استعداد لتشكيل الرواسب. تجنب ذوبان اتش وتخزين على الجليد أو درجة حرارة الغرفة لأوقات طويلة، ما لم يتم تشكيل الرواسب.
      ملاحظة: من الممكن أيضا مزج السكروز، MEM وو CaCl 2 قبل العمليات الجراحية إذا كان من غير الممكن لذوبان الجليد في قسامة اتش وتبدأ عملية صنع يترسب مباشرة بعد إزالة من -80 درجة مئوية. يمكن حفظ هذه قسامة من السكروز، MEM، والكالسيوم على الثلج الجاف حتى على استعداد لإضافة اتش.
      ملاحظة: جزيئات فيروس مستقرة لحوالي 1 ساعة.
    3. قبل كل حقنة، ونفض الغبار بلطف أنبوب لجعل يتم خلط جزيئات الفيروس بالتأكيد. وضع 3 مل (2.5 × 10 7 PFU) من جزيئات الفيروس في حقنة 10 مل وإعداد الماوس لحقن ينترادوكتال.

4. حقن ينترادوكتال من جزيئات الفيروس

  1. وضع بلطف الماوس على ظهرها على خشبة المسرح مضاءة المجهر تشريح نظيفة. تسليط الضوء على الجانب البطن مع مصدر ضوء إضافي وتحديد موقع اليسار أو اليمين ال 4 ال 9 الغدة الثديية الأربية من بقع صغيرة بيضاء من الفرو (مرئية على C57BL / 6 إناث) المحيطة بكل الحلمة.
  2. فرك الحلمة برفق مع الايثانول القطن المعقم غارقة يميل قضيب لمسح الشعر بعيدا عن الحلمة وتعقيم مكان الحقن. إذا كانوا من الصعب تحديد، وتطبيق بلطف طبقة سميكة من كريم مزيل الشعر أو استخدام المقصات لفضح الحلمات. إزالة المكونات الكيراتين، وهي طبقة من خلايا الجلد الميتة الكثيفة، التي تغطي الحلمة. مرة واحدة تتعرض الحلمة، يجب أن تكون المكونات الكيراتين مرئية بسهولة تحت المجهر تشريح.
  3. تأمين الحلمة مع ملقط جراحي غرامة وسحب ما يصل مع قوة الضوء لإزالة المكونات الكيراتين.
  4. استقرار الحلمة بين ملقط.
  5. إدراج بلطف الإبرة بين ملقط، cannulating القناة القناة عند 90 درجة. دخول الحلمة قليلا الماضي شطبة من الإبرة (لا يزيد عن 2 ملم) لمنع الاختراق من خلال الأنسجة الثديية وفي الأغشية المصلية من تجويف الجسم البطني.
    1. لا تقم بإدخال إبرة عميق جدا. لضمان العمق المناسب للحقن، وسحب بلطف الإبرة حتى بعد إدراجه في تجويف القناة، الرسم الحلمة على طول حواف الإبرة كما يتم سحبها عنه.
      ملاحظة: تصور الحقن من الصعب، وبالتالي الممارسهينصح الإلكترونية لهذه الخطوة باستخدام التريبان الأزرق.
  6. عندما يتم وضع الإبرة بشكل مناسب في القناة الثديية، والإفراج عن 3 مل من رواسب فيروس (2.5 × 10 7 PFU من اتش لجنة المساواة العرقية-) عن طريق حقنة تغرق بلطف مع الإبهام من يد تمسك المحقنة. الحلمة يجب تضخيم قليلا كما يضاف السائل.

5. الانتعاش من الفئران

  1. ضع الماوس مرة أخرى إلى لوحة التدفئة بعد الحقن حتى يبدأ في التعافي من التخدير.
  2. مرة واحدة يتم استرداد الماوس، وضعه مرة أخرى في قفص نظيفة ومراقبة للانتعاش الكامل والحركة.
  3. 24 ساعة بعد الحقن ينترادوكتال وإدارة ميلوكسيكام تحت الجلد في 1 ملغم / كغم.

6. رصد التقدم ورم

  1. جس الغدة الثديية حقن في اليوم 30 للتضخم وتورم.
    1. رصد تطور الورم كل 5-7 أيام مرة واحدة في GLAN الثديية تورم وتضخمويلاحظ د.
  2. قياس أحجام الورم كل 3-4 أيام لحركية نمو الورم مرة واحدة تظهر أورام واضح (الحقن حوالي 50-60 أيام آخر الغدانية).
  3. الموت ببطء الفئران عندما تتجاوز كميات الورم 10٪ من وزن الجسم للفئران.

Representative Results

نجاح استهداف شجرة الأقنية الثديية يمكن تصور من خلال إعداد يتصاعد كاملة من الغدة الثديية كما هو موضح سابقا 32 بعد حقن التريبان الأزرق (للتحقق من الأسلوب السليم حقن (الشكل 1A) أو اتش معربا عن mCherry (للتحقق من إعداد الفيروسية والعدوى السليم من الخلايا الظهارية الأقنية، الشكل 1B).

الشكل 1
الشكل 1. استهداف ينترادوكتال من الغدد الثديية عن طريق الحقن مع التريبان الأزرق أو اتش-mCherry. A) A جبل بأكمله، كما ذكرت سابقا 32، من الغدة الثديية بعد حقن الغدة الثديية # 4 مع وأعد الأزرق التريبان 3 ساعة حقن آخر ل تصور / تأكيد استهداف الأقنية كاملشجرة. الصور هي 4X التكبير. ب) العدوى من ظهارة الأقنية مع اتش عن طريق حقن 2.5 × 10 7 PFU من اتش معربا عن mCherry. تم حقن الفئران intraductally، وأعدت 4 أيام بعد الحقن، جبل كامل من الغدة الثديية لتأكيد العدوى الفيروسية من شجرة الأقنية. الصورة 4X التكبير. MG هو الغدة الثديية، LD هو ناقل للبن، أو القناة الرئيسية، والقناة TD هو محطة. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

عندما يتم بفعل أورام في البروتين p53 loxP / loxP LSL-K-راس G12D / + الفئران المعدلة وراثيا، والأورام لن يكون واضحا حتى اليوم حوالي 40 عندما الغدد الثديية سوف تصبح الموسع ومنتفخة. فمن الضروري أن تبدأ palpations عندما يلاحظ هذا، ورصد نمو الورم في كل 5-7 أيام. في أيدينا، تصلب الغدة الثديية يسبق دائما ظهور الورم التنمية. سوف الأورام التقدم ببطء ل2 أسابيع إضافية. تبدأ اليوم حول 56، وسوف تبدأ أورام لتنمو باطراد (الشكل 2B). عند هذه النقطة، فمن الأهمية بمكان لقياس كميات ورم كل 3 أيام إذا رغبت الدراسات الحركية لأنه سيكون هناك طفيف الماوس لتقلب الماوس في تطور الورم، وهو أمر طبيعي (أرقام 2A و 3A). سوف جماهير كبيرة في البطن يكون واضحا بعد يوم 80 (الشكل 2A، 2B، و3A)، وبعد ذلك يجب أن يتم التخلص الفئران إذا الأورام تتجاوز أكثر من 10٪ من وزن الجسم. وكشف تحليل [كدنا] من ثلاثة من الحيوانات المستنسخة ماوس الورم الحاملة للتعبير عن mesothelin، cytokeratin-8، محفز Her2، ومستقبلات هرمون الاستروجين-α (الشكل 2C).

الرقم 2
> الشكل 2. تطوير ورم في البروتين p53 loxP / loxP LSL-K-راس G12D / + حقن الفئران مع اتش intraductally-لجنة المساواة العرقية. A) مثالان من الأورام بعد 80 يوما حقن مع اتش معربا عن لجنة المساواة العرقية. أعطيت الفئران 2.5 × 10 7 PFU من اتش معربا عن لجنة المساواة العرقية و80 أيام آخر ورم بدء، الجماهير واضح كبيرة يمكن تصور جاحظ من جانب البطن من الحيوان. ب) حركية الورم النموذجية والجدول الزمني لملامسة الأورام الناجمة عن البروتين p53 في loxP / loxP LSL-K-راس G12D / + الفئران. C) توصيف ثلاثة استنساخ الخلايا السرطانية المستمدة من الورم نفسه المتجانس من loxP البروتين p53 / loxP LSL-K-راس G12D / + الماوس. تم استخراج الحمض النووي الريبي وكدنا] توليفها لتحليل RT-PCR باستخدام بادئات محددة لβ-الأكتين، mesothelin، cytokeratin-8، محفز Her2، مستقبلات هرمون البروجسترون، الاستروجين مستقبلات α، ومستقبلات هرمون الاستروجين-β.TPS :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51171/51171fig2highres.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

مماثلة لالمكروية الخلوية في سرطان الثدي البشرية، لاحظنا تسلل αβ وخلايا T γδ وكذلك الخلايا المشتقة النخاعي القامع والضامة في الأورام (الشكل 4). سوف تستنزف الأوعية الدموية إلى العقدة الليمفاوية الإبطية تبدأ في التهم قبل نمت لتشمل أورام الأنسجة الثديية بأكمله حيث تم إجراء حقن (الشكل 3A). يمكن تتبع الغزو Lymphovascular وورم خبيث من الخلايا السرطانية عن طريق عبور الفئران LSL-K-راس G12D / + البروتين p53 loxP / loxP مع الفئران LSL-EYFP. بعد الختان لجنة المساواة العرقية بوساطة، والكشف عن الخلايا السرطانية معربا عن YFP (على حد سواء العالية والمنخفضة) في الورم ويمكن أن تعزى إلى الانتشار إلى استنزاف العقدة الليمفاوية الإبطية (الشكل 3B). وأكد الانبثاث العقدة الليمفاوية الإبطية القاصيبواسطة زرع بنجاح خط الخلايا السرطانية من هذا الموقع في الورم الحاملة LSL-K-راس G12D / + البروتين p53 loxP / loxP الماوس (لا تظهر البيانات).

الرقم 3
الرقم 3. تشكيل الأورام والانبثاث الكامنة إلى العقدة الليمفاوية الإبطية. A) مثال من ثلاثة أورام الثدي المتقدم مع معدلات مختلفة من تطور الورم. كتلة صلبة، التي أشار إليها رأس السهم، وأشكال وتنمو في نهاية المطاف لحجم الأنسجة الثديية في البطن بأكمله. الورم يبقى محصورا في الأنسجة الثديية وليس لوحظ لغزو أو نعلق على العضلات التي تغطي التجويف البريتوني. هناك احتقان واضح من الوريد الشرسوفي السطحي بين الغدد الليمفاوية الأربية والإبطين، الرمز بواسطة السهام البيضاء. بعد 7-8 أسابيع، اله العقدة الليمفاوية الإبطية يبدأ لتصبح الموسع بسبب غزو lymphovascular من الخلايا السرطانية، وأشار السهم. B) الانبثاث من الخلايا السرطانية YFP إيجابية يمكن تصور في العقدة الليمفاوية الإبطية بواسطة التدفق الخلوي. واستخدمت الفئران LSL-K-راس G12D / + البروتين p53 loxP / loxP LSL-EYFP للحث على الأورام وتفعيل YFP عن طريق التسليم ينترادوكتال من اتش-لجنة المساواة العرقية. للتحقق من الغزو lymphovascular من الخلايا السرطانية في العقد الليمفاوية الإبطية، 80 يوما حقن آخر الغدانية، كانت تحصد الغدد الليمفاوية وأشارت الأجهزة والملون لعلامات اللمفاويات ودرست لYFP التعبير. CL يمثل nontumor المقابل استنزاف العقدة الليمفاوية. تمثل النتائج تبوب على CD45 الخلايا السرطانية السلبية، مما يدل على الخلايا السرطانية تغزو العقدة الليمفاوية الإبطية البعيدة. الأرقام تمثل الخلايا الإيجابية في المئة YFP من مجموع السكان. اضغط هنا لمشاهدة تأإيه الصورة.

الرقم 4
الشكل 4. المناعي تتسرب في الماوس أورام الثدي المعدلة وراثيا. والمتجانس أورام الثدي ماوس والملون لCD45، CD3، γδTCR، CD11b وGR1. تمثل الأرقام في المئة من الكريات البيض إيجابية في الورم بأكمله (63.5)، ومجموع CD3 + (46.7)، ومجموع السلبية CD3 (40.1)، ومجموع CD3 + + γδ (γδ خلايا T، 13)، CD3 + γδnegative (24)، GR1 مجموعه عالية CD11b (MDSC، 28.6) وإجمالي CD11b GR1 منخفضة (الضامة، 18.5). اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

ويرجع ذلك إلى تشريح الفأر وتقنية الحقن ينترادوكتال، نجد استهداف سالغدد الثديية و 4 و 9 (الشكل 5) تعطي نتائج أكثر اتساقا والحقن موثوق بها. ومع ذلك، يمكن أن تستهدف أي الغدة تبعا لتفضيل فني أداء الجراحة.

الرقم 5
الرقم 5. ويسلط الضوء على ترقيم القنوات الثديية. القنوات الثديية 4 و 9 باللون الأحمر على المخطط وأشار مع السهام على الماوس. في أيدينا، وجدنا أن الحقن كانت أسهل لأداء على هذه القنوات الثديية، ولكن كل الأنسجة الثديية الأخرى التي تستهدف الأورام المتقدمة ونحن مع حركية مماثلة. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

Discussion

نجاح هذا الإجراء يتوقف على الأسلوب السليم أثناء الحقن ينترادوكتال، والتي سوف يكون من الصعب على المجربون غير مدربين. الباحثين من ذوي الخبرة في مختبرنا عادة الحصول الجماهير ورم الثدي 79٪ من المرات التي تدير الحقن الغدانية. مشاكل مع حقن يمكن أن يؤدي إلى تأخر كثيرا، متغير، أو تطور الورم غائبة. إذا تم إدخال الإبرة العميقة جدا أو في زاوية غير مناسب، قد يكون غاب القناة الأقنية. فمن المهم لدخول الحلمة قليلا الماضي شطبة من الإبرة (لا يزيد عن 2 ملم)، لمنع الاختراق من خلال الأنسجة الثديية وإلى الأغشية المصلية من تجويف الجسم البطني. أيضا، والتنسيب ضحلة جدا من الإبرة أو الحقنة أكبر من 3 مل من رواسب الفيروس يمكن أن يؤدي إلى انسكاب الإعدادية الفيروسية خارج الغدة الثديية وتحريض الأورام غير مقصود. طريقة واحدة للتغلب على هذه القضايا هو لادخال الإبرة في الحلمة deepe قليلاص من 3 مم، واستخلاص ببطء الحقنة مرة أخرى للخروج من القناة حتى 2 ملم من غيض من شطبة. وهذا يضمن أن الأنسجة الثديية ويستهدف بدلا من العضلات المحيطة التجويف البريتوني من الفئران (الشكل 1A). وهذا أيضا تمتد الحلمة على طول حواف الحقنة بحيث عندما يتم طرد الفيروس في القناة، وليس هناك تسرب وفقدان رواسب الفيروسية.

التصور من حقن صعب وينصح الممارسة لهذه الخطوة. لاحظنا زيادة في حقن ناجحة التالية الممارسة، مما أدى إلى انتفاذ أعلى من التنمية الورم. لأن هذا الأسلوب يستخدم nonlactating الإناث البكر، فمن الأهمية بمكان لإزالة المكونات الكيراتين الذي يغطي الحلمة للكشف عن القناة القناة الأساسية. نوصي ممارسة هذه الخطوة عن طريق حقن التريبان الأزرق أو بعض الدول الأخرى صبغ ارجاعها معقمة داخل القناة وإعداد يتصاعد الثديية كله لتأكيد استهداف آر الأقنيةهه. بالإضافة إلى ذلك، بروتوكولات أخرى تصف حقن ينترادوكتال من الكواشف وقد نشرت 33،34، والتي قد تكون مفيدة لتطوير الأسلوب السليم. ويمكن أيضا القضايا مع إعداد الفيروسية أو إصابة تجويف الأقنية يتم التحقيق باستخدام معربا عن mCherry اتش. الفئران Nontransgenic يمكن استخدامها لكل من هذه الأغراض حتى يتم تحسين تقنية الحقن.

على الرغم من أن أي الغدة الثديية يمكن استخدامها لبدء الأورام، وحققنا معدلات نمو أكثر اتساقا من خلال استهداف الغدة الثديية 4 أو 9، الذي نعتقد أنه لأنه من الأسهل لإجراء الحقن السليم على هذه الغدد، مما أدى إلى استهداف أكثر كفاءة من لاصق. القرب من اليسار أو اليمين ال 4 ال 9 الغدد الثديية الأربية إلى العقدة الليمفاوية الأربية استنزاف مفيد أيضا لدراسة المضادة للورم الاستجابات المناعية خلال مختلف النقاط الزمنية لتطور الورم. لنموذج المواقع البعيدة وتتبع الانبثاث الكامنة ل، روقد عبرت الفئران ransgenic مع الفئران LSL-EYFP. كما تقدم الورم، والأوعية الدموية التي تربط الورم إلى العقد الليمفاوية الإبطية تصبح محتقن قليلا في ما يقرب من 5 أسابيع، قبل أن يبدأ الورم في النمو بشكل كبير (الشكل 3A). في نهاية المطاف، وبعد 7-8 أسابيع، وسوف الغزو lymphovascular يؤدي إلى نمو الأورام داخل العقدة الليمفاوية الإبطية (أرقام 3A 3B و). باستخدام الفئران مراسل والتكنولوجيا جنة المساواة العرقية، loxP، إدماج YFP يخلق منصة لتعقب الخلايا السرطانية الانتشار إلى المواقع البعيدة في جميع أنحاء لتطور الورم. هذا يمكن أن يسهل الدراسات التي تهدف إلى توضيح الآليات الخلوية وجينية التي تعزز الانبثاث الكامنة. في أيدينا، وأعرب خطوط الخلايا السرطانية الثدي cytokeratin-8، mesothelin، مستقبلات هرمون الاستروجين-α، ومحفز Her2، مؤكدا استهداف ظهارة الأقنية. ومع ذلك، وهذا يتوقف على الطفرات المستحثة، ونظرا لصعوبة وتباين الحقن، ونحن نوصييتم تأسيس توصيف النسيجي للأورام بمجرد أن نموذج جيد في المختبر.

لأن سرطان الثدي مثل هذا المرض الفتاك وانتشارا 1،2، فمن المهم استخدام نماذج حيوانية أن ألخص بدقة تفاعل معقد بين الورم والمضيف. نحن هنا وصف backcrossed بالكامل C57BL / 6 نموذج الفئران من ورم الثدي. أولا، عن طريق حفز الأورام من خلايا الأم، ونحن نسمح للورم أن تتطور بشكل طبيعي في المكروية المناعي الكامل. المكروية المناعي في أورام الثدي المتقدمة الماوس يلخص سكان αβ وخلايا T γδ، خلايا الدم النخاعي القامع المشتقة، والضامة يلاحظ عموما في سرطان الثدي البشرية (الشكل 4). كما نشرنا سابقا باستخدام اتش لجنة المساواة العرقية، للحث على أورام المبيض، وجدنا أن حقن الفيروس لم يكن لها أثر يذكر على تتسرب الورم المقابلة وتطور الورم 28. الثانية، والغدد الصماء مستقلةالتعبير عن الجينات المسرطنة يضمن أن الخلايا السرطانية لديهم مستويات عالية باستمرار لهدف التعبير الجيني. الثالث، من خلال الاستفادة من الطفرات الكامنة، لا يمكننا السيطرة على توقيت تكون الأورام لتسهيل تتبع الزمنية الدقيقة لتطور الورم. وتشمل تطبيقات هذا النموذج الأبحاث على بيولوجيا الخلايا السرطانية، ودراسات عن العوامل في المكروية الورم، والمضادة للورم الاستجابات المناعية، وحتى تقييم فعالية العلاجات الجديدة. من خلال توافر نظام لجنة المساواة العرقية، loxP، هذه التقنية يمكن استخدامها كمنصة للتحقيق في مجموعة متنوعة من الطفرات إضافية في بدء وتطور أورام الثدي. نأمل أن استخدام هذا النموذج من شأنها تعزيز فهم بيولوجيا سرطان الثدي، وفي نهاية المطاف تؤدي إلى علاجات جديدة تستهدف علاج سرطان الثدي النقيلي.

Disclosures

الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل لجنة التحقيق الوطنية المنح RO1CA157664 وRO1CA124515، وجائزة سرطان الثدي التحالف. نود أن نشكر جيفري فاوست، ديفيد أمبروز، وسكوت فايس من مرفق يستار التدفق الخلوي الأساسية، جيمس هايدن من مرفق يستار التصوير، وجميع موظفي مرفق الحيوان معهد ويستار للدعم التقني لا تقدر بثمن بهم.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trp53tm1Brn Transgenic mice
K-rastm4Tyj Transgenic mice
Obtained from NCI mouse models of human cancer consortium Mice were backcrossed ten times to a full C57BL/6 background
B6.129X1-

Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J

Transgenic mice
Jackson Labs 006148
Primers p53loxP/loxP Integrated DNA Technologies 5'-AAGGGGTATGAGGGACAAGG-3'
5'-GAAGACAGAAAAGGGGAGGG-3'
Primers LSL-K-rasG12D/+ Integrated DNA Technologies 5'-CGCAGACTGTAGAGCAGCG-3'
5'-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC-3'
Primers for LSL-EYFP to detect Rosa promoter Integrated DNA Technologies 5'-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3'
5'-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3'
5'-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT-3'
Primers for detection of Mesothelin expression Integrated DNA Technologies 5'-TTGGGTGGATACCACGTCTG-3'
5'-CGGAGTGTAATGTTCTTCTGTC-3'
Primers for detection of Progesterone Receptor expression Integrated DNA Technologies 5'-GCAATGGAAGGGCAGCATAA-3'
5'-TGGCGGGACCAGTTGAATTT-3'
Primers for detection of Cytokeratin 8 expression Integrated DNA Technologies 5'-ATCAGCTCTTCCAGCTTTTCCC-3'
5'-GAAGCGCACCTTGTCAATGAAGG-3'
Primers for detection of Erbb2 expression Integrated DNA Technologies 5'-ACCTGCCCCTACAACTACCT-3'
5'-AAATGCCAGGCTCCCAAAGA-3'
Primers for detection of Estrogen Receptor A expression Integrated DNA Technologies 5'-ATGAAAGGCGGCATACGGAA-3'
5'-GCGGTTCAGCATCCAACAAG-3'
Primers for detection of Estrogen Receptor B expression Integrated DNA Technologies 5'-ACCCAATGTGCTAGTGAGCC-3'
5'-TGAGGACCTGTCCAGAACGA-3'
Primers for detection of B-Actin expression Integrated DNA Technologies 5'-GCCTTCCTTCTTGGGTATGG-3'
5'-CAGCTCAGTAACAGTCCGCC-3'
Adenovirus-Cre Gene Transfer Vector Core from the University of Iowa Ad5CMVCre Store aliquots of virus (4 x 108 pfu/aliquot) at -80 °C to avoid repeated freeze thaw cycles.
Adenovirus-mCherry Gene Transfer Vector Core from the University of Iowa Ad5CMVmCherry Store aliquots of virus (4 x 108 pfu/aliquot) at -80 °C to avoid repeated freeze thaw cycles.
Hamilton syringe Hamilton company 701RN 10 μl syringe, RN series.
Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.
Custom needle Hamilton company 7803-05 33 G 0.5 in long RN needle, with a 12° bevel. Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.
Surgical forceps Dumont 52100-58 Dumostar No. 5 forceps. Clean with 75% ethanol after each use, followed by autoclaving
MEM powder Cellgro 50 012 PB Store at 4 °C in powder and reconstituted form
Sodium Bicarbonate Fisher S233 Add to MEM and filter stearilize
Calcium Chloride Sigma C4901 Minimum 96%, anhydrous

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Youlden, D., et al. The descriptive epidemiology of female breast cancer: an international comparison of screening, incidence, survival and mortality. Cancer Epidemiol. 36, 237-248 (2012).
  2. Siegel, R., Naishadham, D. Cancer statistics, 2012. Cancer J. Clin. 62, 10-29 (2012).
  3. Sorlie, T., et al. Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical implications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 10869-10874 (2001).
  4. Gatza, M., et al. A pathway-based classification of human breast cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6994-6999 (2010).
  5. Bastien, R., et al. PAM50 breast cancer subtyping by RT-qPCR and concordance with standard clinical molecular markers. BMC Med. Genom. 5, 44 (2012).
  6. Montagna, E., et al. Heterogeneity of triple-negative breast cancer: histologic subtyping to inform the outcome. Clin. Breast Cancer. 13, 31-39 (2013).
  7. Karrison, T. G., Ferguson, D. J., Meier, P. Dormancy of mammary carcinoma after mastectomy. J. Natl. Cancer Inst. 91, 80-85 (1999).
  8. Rakha, E., et al. The prognostic significance of lymphovascular invasion in invasive breast carcinoma. Cancer. 118, 3670-3680 (2012).
  9. Kim, I., Baek, S. Mouse models for breast cancer metastasis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 394, 443-447 (2010).
  10. Vargo-Gogola, T., Rosen, J. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nat. Cancer. 7, 659-672 (2007).
  11. Archer, T., et al. Steroid hormone receptor status defines the MMTV promoter chromatin structure in vivo. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 53, 421-429 (1995).
  12. Cato, A., Henderson, D., Ponta, H. The hormone response element of the mouse mammary tumour virus DNA mediates the progestin and androgen induction of transcription in the proviral long terminal repeat region. EMBO J. 6, 363-368 (1987).
  13. Schoenenberger, C., Zuk, A., Groner, B., Jones, W., Andres, A. Induction of the endogenous whey acidic protein (Wap) gene and a Wap-myc hybrid gene in primary murine mammary organoids. Dev. Biol. 327-337 (1990).
  14. Li, Y., et al. Deficiency of Pten accelerates mammary oncogenesis in MMTV-Wnt-1 transgenic mice. BMC Mol. Biol. 2, 2 (2001).
  15. Martelli, C., et al. In vivo imaging of lymph node migration of MNP- and (111)In-labeled dendritic cells in a transgenic mouse model of breast cancer (MMTV-Ras). Mol. Imaging Biol. 14, 183-196 (2012).
  16. Klover, P. J., et al. Loss of STAT1 from mouse mammary epithelium results in an increased Neu-induced tumor burden. Neoplasia. 12, 899-905 (2010).
  17. Moody, S. E., et al. Conditional activation of Neu in the mammary epithelium of transgenic mice results in reversible pulmonary metastasis. Cancer Cell. 2, 451-461 (2002).
  18. Banerji, S., et al. Sequence analysis of mutations and translocations across breast cancer subtypes. Nature. 486, 405-409 (2012).
  19. Miyakis, S., Sourvinos, G., Spandidos, D. A. Differential expression and mutation of the ras family genes in human breast cancer. Biochem. Biophys. Res. Commun. 251, 609-612 (1998).
  20. Malaney, S., Daly, R. J. The ras signaling pathway in mammary tumorigenesis and metastasis. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 6, 101-113 (2001).
  21. Loboda, A., et al. A gene expression signature of RAS pathway dependence predicts response to PI3K and RAS pathway inhibitors and expands the population of RAS pathway activated tumors. BMC Med. Genomics. 3, 26 (2010).
  22. von Lintig, F. C., et al. Ras activation in human breast cancer. Breast Cancer Res. Treat. 62, 51-62 (2000).
  23. Downward, J. Targeting RAS signalling pathways in cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 3, 11-22 (2003).
  24. Eckert, L. B., et al. Involvement of Ras activation in human breast cancer cell signaling, invasion, and anoikis. Cancer Res. 64, 4585-4592 (2004).
  25. Hollestelle, A., Elstrodt, F., Nagel, J., Kallemeijn, W., Schutte, M. Phosphatidylinositol-3-OH kinase or RAS pathway mutations in human breast cancer cell lines. Mol. Cancer Res. 5, 195-201 (2007).
  26. Jackson, E., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes Dev. 15, 3243-3248 (2001).
  27. Jonkers, J., et al. Synergistic tumor suppressor activity of BRCA2 and p53 in a conditional mouse model for breast cancer. Nat. Genet. 29, 418-425 (2001).
  28. Scarlett, U., et al. Ovarian cancer progression is controlled by phenotypic changes in dendritic cells. Exp. Med. 209, 495-506 (2012).
  29. Vooijs, M., Jonkers, J., Berns, A. A highly efficient ligand-regulated Cre recombinase mouse line shows that LoxP recombination is position dependent. EMBO Rep. 2, 292-297 (2001).
  30. Young, N., Crowley, D., Jacks, T. Uncoupling cancer mutations reveals critical timing of p53 loss in sarcomagenesis. Cancer Res. 71, 4040-4047 (2011).
  31. Dinulescu, D., et al. Role of K-ras and Pten in the development of mouse models of endometriosis and endometrioid ovarian cancer. Nat. Med. 11, 63-70 (2005).
  32. Landua, J., Visbal, A., Lewis, M. Methods for preparing fluorescent and neutral red-stained whole mounts of mouse mammary glands. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 14, 411-415 (2009).
  33. Barham, W., Sherrill, T., Connelly, L., Blackwell, T. S., Yull, F. E. Intraductal injection of LPS as a mouse model of mastitis: signaling visualized via an NF-kappaB reporter transgenic. J. Vis. Exp. e4030 (2012).
  34. Murata, S., et al. Ductal access for prevention and therapy of mammary tumors. Cancer Res. 66, 638-645 (2006).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer
Posted by JoVE Editors on 10/20/2014. Citeable Link.

A correction was made to Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer. Protocol sections 3.1, 3.3.2, 3.4, and 4.7 were updated. The materials table was also updated.

Protocol section 3.1 was updated from:

3.1) Store adenovirus concentrated virus stocks at -80°C frozen in aliquots of 4 x 108 pfu each, sufficient for injecting 16 animals with 3 ml of 2.5 x 107 pfu of adenovirus particles.

to:

3.1) Store adenovirus concentrated virus stocks at -80°C frozen in aliquots of 4 x 108 pfu each, sufficient for injecting 16 animals with 3 µl of 2.5 x 107 pfu of adenovirus particles.

Protocol section 3.3.2 was updated from:

Mix aliquots containing 4 x 108 pfu adenovirus-Cre with sufficient 3% sucrose in sterile water for a final volume of 10 ml. Add 34 ml of MEM to the virus and gently mix. Then add 4 ml of the CaCl2 solution, gently mix, and incubate at room temperature for 15-20 min.

to:

Mix aliquots containing 4 x 108 pfu adenovirus-Cre with sufficient 3% sucrose in sterile water for a final volume of 10 µl. Add 34 µl of MEM to the virus and gently mix. Then add 4 µl of the CaCl2 solution, gently mix, and incubate at room temperature for 15-20 min.

Protocol section 3.4 was updated from:

Prior to each injection, gently flick the tube to make sure virus particles are mixed. Draw up 3 ml (2.5 x 107 pfu) of virus particles into the 10 ml syringe and prepare the mouse for the intraductal injection.

to:

Prior to each injection, gently flick the tube to make sure virus particles are mixed. Draw up 3 µl (2.5 x 107 pfu) of virus particles into the 10 µl syringe and prepare the mouse for the intraductal injection.

Protocol section 4.7 was updated from:

When the needle is appropriately placed into the mammary duct, release the 3 ml of virus precipitates (2.5 x 107 pfu of adenovirus-Cre) by gently plunging the syringe with the thumb of the hand holding the syringe. The nipple should slightly inflate as the liquid is added.

to:

When the needle is appropriately placed into the mammary duct, release the 3 µl of virus precipitates (2.5 x 107 pfu of adenovirus-Cre) by gently plunging the syringe with the thumb of the hand holding the syringe. The nipple should slightly inflate as the liquid is added.

Item 15 in the Materials table under Comments was updated from:

10ml syringe, RN series Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.

to:

10µl syringe, RN series Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics