स्तन कैंसर के एक उपन्यास ट्रांसजेनिक माउस मॉडल: Adenovirus-Cre साथ Ductal उपकला के लक्षित करके metastatic स्तन कार्सिनोमा की शुरूआत

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Summary

एक नैदानिक ​​प्रासंगिक metastatic स्तन कैंसर में स्तन वाहिनीपरक प्रणाली परिणामों में adenovirus-Cre साथ अव्यक्त परिवर्तन के सक्रियण. एक YFP प्रमोटर के समावेश बाहर का metastatic ट्यूमर कोशिकाओं की ट्रैकिंग की अनुमति देता है. इस मॉडल अव्यक्त मेटास्टेसिस, विरोधी ट्यूमर प्रतिरक्षा, और स्तन कैंसर के इलाज के लिए उपन्यास immunotherapies डिजाइन करने के लिए अध्ययन करने के लिए उपयोगी है.

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Rutkowski, M. R., Allegrezza, M. J., Svoronos, N., Tesone, A. J., Stephen, T. L., Perales-Puchalt, A., Nguyen, J., Zhang, P. J., Fiering, S. N., Tchou, J., Conejo-Garcia, J. R. Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer. J. Vis. Exp. (85), e51171, doi:10.3791/51171 (2014).

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Abstract

स्तन कैंसर के अंत में बाहर का ऊतकों और विरोधी ट्यूमर प्रतिरक्षा के पतन के लिए घातीय ट्यूमर के विकास और मेटास्टेसिस, जिसके परिणामस्वरूप विकासशील ट्यूमर और प्रतिरक्षा प्रणाली के बीच जटिल सेलुलर बातचीत से जुड़े एक विषम रोग है. कई उपयोगी पशु मॉडल स्तन कैंसर के अध्ययन के लिए मौजूद हैं, लेकिन कोई भी पूरी तरह से इंसानों में होता है कि रोग प्रगति पुनरावृत्ति. अव्यक्त मेटास्टेसिस के गठन में परिणाम और अस्तित्व के लिए कम है कि सेलुलर बातचीत का एक बेहतर समझ हासिल करने के लिए, हम प्रतिरक्षा सक्षम चूहों में यौन परिपक्वता के बाद विकसित और संचालित है कि YFP व्यक्त ductal कार्सिनोमा के एक inducible ट्रांसजेनिक माउस मॉडल उत्पन्न किया है संगत, अंत: स्रावी स्वतंत्र ओंकोजीन की अभिव्यक्ति से. YFP, p53 की पृथक के सक्रियण, और कश्मीर रास की एक oncogenic फार्म की अभिव्यक्ति यौन परिपक्व, कुंवारी मादा चूहों की स्तन वाहिनी में Cre-recombinase व्यक्त एक adenovirus के वितरण के द्वारा प्राप्त किया गया था. ट्यूमर6 सप्ताह oncogenic घटनाओं की दीक्षा के बाद आने लगते हैं. ट्यूमर स्पष्ट हो जाने के बाद वे तेजी से बढ़ने लगते हैं, इससे पहले कि वे लगभग दो सप्ताह के लिए धीरे धीरे प्रगति. 7-8 सप्ताह के बाद adenovirus इंजेक्शन के बाद, vasculature बाहर कक्षा लिम्फ नोड्स में YFP + ट्यूमर कोशिकाओं के अंतिम lymphovascular आक्रमण के साथ, बाहर का लिम्फ नोड्स में ट्यूमर जन को जोड़ने मनाया जाता है. घुसपैठ ल्युकोसैट आबादी αβ और γδ टी कोशिकाओं, मैक्रोफेज और MDSCs की उपस्थिति सहित मानव स्तन कार्सिनोमा, में पाए जाने वाले के समान हैं. यह अनूठा मॉडल इनवेसिव स्तन कैंसर के इलाज के लिए उपन्यास immunotherapeutic हस्तक्षेप डिजाइनिंग के लिए उपयोगी होने के अलावा अव्यक्त मेटास्टेसिस और निद्रा में शामिल सेलुलर और प्रतिरक्षा तंत्र के अध्ययन की सुविधा होगी.

Introduction

स्तन कैंसर दुनिया 1,2 और कैंसर से संबंधित मौतों 2 का दूसरा प्रमुख कारण भर में महिलाओं में सबसे अधिक होने वाली द्रोह है. जटिल आनुवंशिक 3,4, ऊतकीय 5, और नैदानिक ​​phenotypes 6 स्तन कैंसर के विभिन्न उपप्रकार को चिह्नित करने के लिए उपयोग किया जाता है और अक्सर अस्तित्व की भविष्यवाणी करने के लिए एक साधन के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं. स्तन कैंसर के साथ महिलाओं की एक बड़ी पलटन के विश्लेषण से निधन हो गया है कि रोगियों की (लगभग 80%) सबसे प्राथमिक ट्यूमर 7 की 10 साल पद से हटाने के भीतर recurred था कि संकेत दिया. इनवेसिव स्तन कार्सिनोमा के बहुमत के लिए, lymphovascular आक्रमण दृढ़ता से एक गरीब परिणाम और रोग 8 से अधिक आक्रामक नैदानिक ​​पाठ्यक्रम के लिए सहसंबद्ध होना दिखाया गया है.

क्योंकि स्तन कैंसर के आनुवंशिक और प्ररूपी जटिलता के कारण, रोग का पूरा कोर्स स्मरण दिलाता है कि कोई जानवर मॉडल है. मानव स्तन ट्यूमर सेल लाइनों अक्सर किया गया हैxenograft या प्रतिरक्षा कमी चूहों में आक्रामक और metastatic स्तन कैंसर के orthotopic 9 मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया. जानकारीपूर्ण हालांकि यह एक पार प्रजातियों भ्रष्टाचार है, क्योंकि इन मॉडलों पूरे ट्यूमर microenvironment के प्रभाव बिगाड़ना, प्रतिरक्षा दबाव के अभाव में होते हैं और. ऐसे murine स्तन ट्यूमर वायरस (MMTV) और मट्ठा अम्लीय प्रोटीन (वैप) के रूप में स्तन विशिष्ट प्रमोटरों द्वारा संचालित inducible आनुवंशिक उत्परिवर्तन स्तन कैंसर के आनुवंशिक प्रकृति के बारे में ज्ञान का एक जबरदस्त राशि का योगदान दिया है. हालांकि, इन प्रमोटरों के ऊतक विशिष्ट अभिव्यक्ति आम तौर पर मानव स्तन कैंसर में overexpressed ओंकोजीन की अभिव्यक्ति का आईना नहीं है कि प्रेरित आनुवंशिक परिवर्तन के चर अभिव्यक्ति में जिसके परिणामस्वरूप, अंत: स्रावी प्रणाली 10-16 को उनकी जवाबदेही से समझौता किया है. ओंकोजीन की MMTV संचालित अभिव्यक्ति की अंत: स्रावी नियंत्रण पर काबू पाने, मूडी एट अल. स्तन में Neu overexpressing एक सशर्त, डॉक्सीसाइक्लिन inducible मॉडल उत्पन्नउपकला 17. इस मॉडल प्रतिगमन और पुनरावृत्ति अध्ययन करने के लिए ट्यूमर गठन के बाद Neu deinducing के लिए उपयोगी है, लेकिन लगातार, लंबे समय तक ओंकोजीन की अभिव्यक्ति के लिए निरंतर डॉक्सीसाइक्लिन प्रशासन की आवश्यकता है. उपलब्ध कई प्रासंगिक स्तन ट्यूमर मॉडल के व्यापक चर्चा Vargo-Gogola एट अल. 10 द्वारा समीक्षा में पाया जा सकता है

हमारा लक्ष्य एक पूर्ण C57BL 6 / पृष्ठभूमि पर मिल स्तन कैंसर के एक माउस मॉडल विकसित करने के लिए था कि, उत्परिवर्तनीय घटनाओं, मॉडल प्रतिरक्षा दबाव की उपस्थिति में एक नवजात ट्यूमर के गठन की स्थायी प्रेरण के बाद. हम TP53 की floxed alleles, और कश्मीर रास की एक oncogenic फार्म, और YFP युक्त ट्रांसजेनिक चूहों के स्तन नलिकाओं में Cre-recombinase व्यक्त एक adenovirus की शुरुआत की. रचनात्मक अभिव्यक्ति TP53, कई स्तन कैंसर के 18 में एक अक्सर उत्परिवर्तित जीन ablates और विशेष रूप से YFP अभिव्यक्ति के अलावा कश्मीर रास की एक oncogenic एलील लातीस्तन ductal उपकला में. कश्मीर रास में उत्परिवर्तन स्तन कैंसर के रोगियों 19,20 का केवल 6.5% में होने वाली स्तन कैंसर में निराला रहे हैं, इस तरह के मानव स्तन ट्यूमर में रास संकेतन मार्ग का विधान सक्रियण में HER2/neu और EGFR परिणाम के रूप में नदी के ऊपर kinases की overexpression 21-23. कई स्तन ट्यूमर सेल लाइनों में रास संकेतन मार्ग के सक्रियण भी 24,25 सूचित किया गया है. हम ट्यूमर गठन की दीक्षा और यौन परिपक्व, कुंवारी मादा चूहों में Cre-recombinase व्यक्त एक adenovirus की intraductal इंजेक्शन की तकनीक के बारे में बताएगी. स्तन कैंसर के इस मॉडल 7-8 हफ्तों से कक्षा लिम्फ नोड के लिए lymphovascular आक्रमण और मेटास्टेसिस के साथ, धीमी गति से ट्यूमर प्रगति के बारे में 8 सप्ताह के बाद तेजी से बढ़ने कि प्रकट घावों को विकसित करता है. इन चूहों को एक पूर्ण C57BL 6 / पृष्ठभूमि पर हैं और YFP व्यक्त ट्यूमर कोशिकाओं बाहर का लिम्फ नोड्स में मिल रहे हैं, क्योंकि इस मॉडल CE अध्ययन करने के लिए एक प्रासंगिक उपकरण प्रदान करता हैllular और प्रतिरक्षाविज्ञानी अव्यक्त मेटास्टेसिस के तंत्र और metastatic ductal स्तन कैंसर के उपचार के लिए उपन्यास चिकित्सकीय दृष्टिकोण को विकसित करने में मदद मिलेगी.

Protocol

सभी पशु प्रयोगों Wistar संस्थान पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया.

1. ट्रांसजेनिक चूहों की पीढ़ी और रखरखाव

  1. C57BL 6 / चूहों के साथ कम से कम 10 पीढ़ियों backcrossing द्वारा एक पूर्ण C57BL 6 / पृष्ठभूमि से 28 LSL कश्मीर रास tm4Tyj 26 और (एक मिश्रित पृष्ठभूमि पर मानव कैंसर संघ के NCI माउस मॉडल से प्राप्त) Trp53 tm1Brn 27 नस्ल. ट्रैक करने के लिए ट्यूमर मेटास्टेसिस, नस्ल B6.129X1-GT (रोजा) 26Sor TM1 (EYFP) (एक पूर्ण C57BL 6 / पृष्ठभूमि पर जैक्सन प्रयोगशाला से प्राप्त LSL-EYFP,) भं.नि. / जम्मू डबल ट्रांसजेनिक LSL कश्मीर रास G12D साथ / + p53 loxP / loxP चूहों.
    नोट: ट्रांसजेनिक LSL कश्मीर रास G12D / + p53 loxP / loxP चूहों, oncogenic कश्मीर रास और अंतर्जात p53 लोकस की एक transcriptionally खामोश एलील flanking loxP साइटों है Cre की मध्यस्थता छांटना, एक oncogenic कश्मीर रास की overexpression पर इतना है कि उत्परिवर्ती और p53 की पृथक achi हैeved.
    नोट: LSL-EYFP माउस YFP स्टॉप कैसेट excised है जहां ऊतकों में YFP की अभिव्यक्ति में Cre की मध्यस्थता छांटना परिणामों पर बढ़ाया पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) के लिए है कि एक जीन flanking एक बंद codon शामिल हैं.
    1. LSL कश्मीर रास G12D / + p53 loxP / loxP चूहों या LSL कश्मीर रास G12D / + p53 loxP / intraductal इंजेक्शन के लिए loxP LSL-EYFP चूहों प्राप्त करने के लिए ट्रांसजेनिक चूहों नस्ल.
      नोट: कश्मीर रास की एक समयुग्मक विलोपन के साथ चूहों गर्भ में मर LSL कश्मीर रास G12D / + क्योंकि चूहे p53 loxP / loxP और के लिए विषमयुग्मजी लिए homozygous के रूप में पैदा कर रहे हैं. Intraductal इंजेक्शन के लिए कम से कम छह सप्ताह पुरानी भोले कुंवारी महिलाओं का प्रयोग करें.
      नोट: जीनोटाइपिंग समयुग्मक के लिए प्राइमरों हैं p53 एलील floxed p53 - T010-अग्रेषित (5'-AAGGGGTATGAGGGACAAGG -3 ') और p53-T011 फिरना (5'-GAAGACAGAAAAGGGGAGGG -3'). वे 391 बीपी पर एक जंगली प्रकार एलील उत्पादन और p53 461 बीपी 29,30 पर एलील floxed.
      नोट: कश्मीर रास के उत्परिवर्ती फार्म का पता लगाने के लिए प्राइमरों oIMR8273 (5'-CGCAGACTGTAGAGCAGCG -3 ') और oIMR8274 (5'-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC -3') हैं. वे 600bp पर पता चला उत्परिवर्ती बैंड का उत्पादन.
      नोट: YFP संवाददाता ट्रिपल ट्रांसजेनिक चूहों के लिए, प्राइमरों ('(5'-GGAGCGGGAGAAATGGATATG -3, जंगली प्रकार एलील) (5'-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC -3)' रोजा कैसेट का पता लगाने, और एक साझा एलील को 5'-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT -3 ') floxed एलील और जंगली प्रकार एलील के लिए 600 बीपी के लिए 320 बीपी पर बैंड के प्रवर्धन में परिणाम.

2. शल्य चिकित्सा की तैयारी

  1. 75% EtOH के साथ और सभी इंजेक्शन से पहले और बाद में उन्हें आटोक्लेव स्वच्छ सर्जिकल सामग्री.
  2. एक जानवर की सुविधा के भीतर एक साफ कमरे में एक स्वच्छ uncluttered प्रयोगशाला बेंच पर सर्जरी प्रदर्शन. 75% EtOH के बाद एक व्यापक स्पेक्ट्रम निस्संक्रामक समाधान के साथ सर्जिकल माइक्रोस्कोप के मंच और डायल सहित सभी सतहों के नीचे साफ कर लें.
  3. वजन और बाँझ खारा में ketamine (80-100 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (8-10 मिलीग्राम / किग्रा) के एक मिश्रण की intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा चूहों anesthetize.
  4. वे संज्ञाहरण के तहत जाना है, जबकि धीरे 5 मिनट तक अछूता उनके पिंजरों में वापस चूहों जगह है. इस समय के दौरान वायरस अवक्षेप उत्पन्न (प्रोटोकॉल 3 देखें).
  5. पैर की अंगुली pinching द्वारा दर्द की प्रतिक्रिया की कमी की जाँच करें. धीरे अत्यधिक कार्निया सुखाने को रोकने के लिए पशु चिकित्सा मरहम के साथ anesthetized चूहों की आंखों को कवर किया.
  6. वे ठीक करने के लिए शुरू जब तक, हाइपोथर्मिया को रोकने शल्य प्रक्रिया के दौरान कम गर्मी के लिए सेट एक हीटिंग पैड पर anesthetized चूहों जगह और.
  7. दर्द के प्रबंधन के लिए, चूहों सर्जरी और बाद 24 घंटा पहले 1 मिलीग्राम / किग्रा में subcutaneously meloxicam प्रशासन.

3. वायरस अवक्षेप की पीढ़ी

चेतावनी: Adenovirus वैक्टर, वे संशोधित और नकल करने में असमर्थ रहे हैं किया गया है, हालांकि, के जोखिम मुद्रासंक्रमण. सावधानी के साथ adenovirus संभाल लेना. सभी कर्मियों को उचित BSL2 दिशा निर्देशों के अनुसार adenovirus के निपटान, intraductal इंजेक्शन के बाद BSL2 एजेंटों से निपटने के लिए संस्था के दिशा निर्देशों के अनुसार प्रशिक्षित किया जाना चाहिए.

  1. स्टोर adenovirus 3 मिलीलीटर adenovirus कणों की pfu 7 10 x 2.5 के साथ 16 जानवरों को इंजेक्शन लगाने के लिए पर्याप्त 4 x 10 8 pfu प्रत्येक, की aliquots में जम -80 डिग्री सेल्सियस पर वायरस शेयरों ध्यान केंद्रित किया.
  2. इंजेक्शन के शुरू होने से पहले लगभग 15-20 मिनट तक सूखी बर्फ पर adenovirus aliquots स्टोर.
    नोट: दोहराया फ्रीज पिघलना चक्र से बचें, वायरस टिटर प्रत्येक चक्र के बीच काफी बूंदों के रूप में.
    ध्यान दें: Adenovirus अवक्षेप एक प्रोटोकॉल को संशोधित करने से गठन कर रहे हैं कि पहले 31 में वर्णित है.
  3. बाँझ आणविक ग्रेड पानी की 50 मिलीलीटर, 4 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ शर्तों और दुकान में सोडियम बाइकार्बोनेट और फिल्टर के 244 मिलीग्राम के साथ पूरक के साथ सदस्य पाउडर के 504 मिलीग्राम Reconstitute
      <ली> 4 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ शर्तों और दुकान में आणविक ग्रेड पानी और फिल्टर के 50 एमएल के लिए कैल्शियम क्लोराइड का 1.5 ग्राम जोड़कर कैल्शियम क्लोराइड समाधान तैयार
    1. 10 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा के लिए बाँझ पानी में पर्याप्त 3% sucrose के साथ 4 x 10 8 pfu adenovirus-Cre युक्त aliquots मिलाएं. वायरस के सदस्य के 34 मिलीलीटर जोड़ें और धीरे मिश्रण. फिर, 2 CaCl समाधान के 4 एमएल जोड़ने धीरे मिश्रण, और 15-20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
    2. स्टोर अवक्षेप फार्म तैयार है जब तक सूखी बर्फ पर adenovirus. अवक्षेप गठन कर रहे हैं जब तक, adenovirus के विगलन और विस्तारित समय के लिए बर्फ या कमरे के तापमान पर संग्रहीत करने से बचें.
      नोट: यह तुरंत सेल्सियस -80 से हटाने के बाद precipitates यह adenovirus विभाज्य पिघलना और बनाने शुरू करना संभव नहीं है, तो पूर्व सर्जरी के लिए सुक्रोज, सदस्य और 2 CaCl मिश्रण करने के लिए भी संभव है सुक्रोज, सदस्य, और कैल्शियम की यह विभाज्य adenovirus जोड़ने के लिए तैयार है जब तक सूखी बर्फ पर बचाया जा सकता है.
      नोट: वायरस कणों लगभग 1 घंटे के लिए स्थिर रहे हैं.
    3. पहले प्रत्येक इंजेक्शन के लिए, धीरे यकीन है कि वायरस कणों मिश्रित कर रहे हैं बनाने के लिए ट्यूब झटका. 10 मिलीलीटर सिरिंज में वायरस कणों के 3 मिलीलीटर (2.5 x 10 7 pfu) ड्रा और intraductal इंजेक्शन के लिए माउस को तैयार.

4. वायरस कणों की intraductal इंजेक्शन

  1. धीरे एक स्वच्छ विच्छेदन खुर्दबीन के प्रबुद्ध मंच पर अपनी पीठ पर माउस जगह. एक अतिरिक्त प्रकाश स्रोत के साथ पेट की ओर रोशन और प्रत्येक निपल आसपास (C57BL 6 / महिलाओं पर दिखाई) फर के छोटे सफेद धब्बे द्वारा छोड़ा 4 वें या सही 9 वें वंक्षण स्तन ग्रंथि का पता लगाने.
  2. एक बाँझ इथेनॉल लथपथ कपास के साथ धीरे निप्पल रगड़ो दूर निपल से बाल साफ़ करने के लिए और इंजेक्शन स्थल बाँझ applicator इत्तला दे दी. वे पता लगाने के लिए मुश्किल हो जाता है, तो धीरे निपल्स को बेनकाब करने के लिए एक लोमनाशक क्रीम का उपयोग करें या कैंची की एक मोटी परत लागू होते हैं. निप्पल को कवर है जो केरातिन प्लग, घने मृत त्वचा कोशिकाओं की एक परत, निकालें. निपल उजागर होने के बाद, केरातिन प्लग विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे आसानी से दिखाई जानी चाहिए.
  3. ठीक शल्य संदंश के साथ निपल सुरक्षित और केरातिन प्लग को दूर करने के लिए प्रकाश बल के साथ अपने आप को रोकना.
  4. संदंश के बीच निप्पल को स्थिर.
  5. धीरे 90 डिग्री पर वाहिनी नहर cannulating, संदंश के बीच सुई डालें. स्तन के ऊतकों के माध्यम से और उदर शरीर गुहा के तरल झिल्ली में प्रवेश को रोकने के लिए थोड़ा सुई (नहीं तो और अधिक से अधिक 2 मिमी) का उठाव पिछले निप्पल दर्ज करें.
    1. बहुत गहरे सुई डालने मत करो. इंजेक्शन का उचित गहराई सुनिश्चित करने के लिए, धीरे इसे खींच लिया है के रूप में सुई के किनारों के साथ निपल ड्राइंग, वाहिनी के लुमेन में डालने के बाद सुई ऊपर खींच.
      नोट: इंजेक्शन के दृश्य के लिए मुश्किल है, इसलिए प्रथाओंइस चरण के लिए ई trypan नीले रंग का उपयोग की सिफारिश की है.
  6. सुई उचित स्तन वाहिनी में रखा जाता है, धीरे सिरिंज पकड़े हाथ के अंगूठे के साथ सिरिंज डूबनेवाला द्वारा (adenovirus-cre के 2.5 x 10 7 pfu) वायरस अवक्षेप के 3 मिलीलीटर जारी. तरल जोड़ा गया है के रूप में निपल थोड़ा फुलाना चाहिए.

5. चूहे की रिकवरी

  1. यह संज्ञाहरण से उबरने के लिए शुरू होता है जब तक इंजेक्शन के बाद हीटिंग पैड पर वापस माउस रखें.
  2. माउस बरामद हो जाने के बाद, एक साफ पिंजरे में वापस डाल दिया है और पूरी वसूली और आंदोलन के लिए निगरानी.
  3. 24 घंटा intraductal इंजेक्शन के बाद, subcutaneously 1 मिलीग्राम / किग्रा में meloxicam प्रशासन.

6. निगरानी ट्यूमर प्रगति

  1. इज़ाफ़ा और सूजन के लिए 30 दिन में इंजेक्शन स्तन ग्रंथि टटोलना.
    1. ट्यूमर प्रगति पर नजर रखने के लिए एक बार एक सूजन और बढ़े हुए स्तन GLAN हर 5-7 दिनोंडी मनाया जाता है.
  2. स्पर्शनीय ट्यूमर (लगभग 50-60 दिनों के बाद adenoviral इंजेक्शन) प्रकट एक बार ट्यूमर के विकास कैनेटीक्स के लिए हर 3-4 दिनों ट्यूमर संस्करणों उपाय.
  3. ट्यूमर मात्रा में चूहों के शरीर के वजन के 10% से अधिक जब चूहों euthanize.

Representative Results

स्तन वाहिनीपरक पेड़ के सफल लक्ष्यीकरण पहले trypan नीले (उचित इंजेक्शन तकनीक (चित्रा 1 ए) या ​​(उचित वायरल तैयारी और संक्रमण को सत्यापित करने के लिए mCherry व्यक्त एक adenovirus सत्यापित करने के लिए इंजेक्शन के बाद 32 में वर्णित के रूप में स्तन ग्रंथि के पूरे mounts तैयारी से देखे जा सकते हैं ductal उपकला कोशिकाओं की, चित्रा 1 बी).

चित्रा 1
चित्रा 1. Trypan नीले या adenovirus-mCherry. ए) के साथ इंजेक्शन से स्तन ग्रंथियों के intraductal लक्ष्य बनाने वाले पूरे माउंट, trypan नीले रंग के लिए 3 घंटे बाद इंजेक्शन तैयार किया गया था के साथ पहले से स्तन ग्रंथि # 4 के इंजेक्शन के बाद स्तन ग्रंथि के 32, रिपोर्ट में कल्पना / पुष्टि पूरे वाहिनीपरक का लक्ष्यपेड़. छवियाँ mCherry व्यक्त adenovirus के 2.5 x 10 7 pfu इंजेक्शन द्वारा adenovirus साथ ductal उपकला की 4X बढ़ाई. बी) के संक्रमण हैं. चूहे intraductally इंजेक्शन थे, और 4 दिनों के बाद इंजेक्शन, स्तन ग्रंथि की एक पूरी माउंट वाहिनीपरक पेड़ के वायरल संक्रमण की पुष्टि के लिए तैयार किया गया था. छवि 4X बढ़ाई है. एमजी एलडी दुग्ध - क्षीरवाही, या मुख्य वाहिनी है, और टीडी टर्मिनल वाहिनी है, स्तन ग्रंथि है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

ट्यूमर p53 loxP में प्रेरित कर रहे हैं / loxP LSL कश्मीर रास G12D / + ट्रांसजेनिक चूहों, ट्यूमर स्तन ग्रंथियों बढ़े और सूजन हो जाएगा जब चारों ओर दिन 40 तक स्पष्ट नहीं हो जाएगा. यह इस मनाया जाता है जब हर 5-7 दिनों के ट्यूमर के विकास की निगरानी, ​​palpations शुरू करने के लिए आवश्यक है. हमारे हाथ में, स्तन ग्रंथि का सख्त हमेशा ट्यूमर के विकास की शुरुआत पछाड़. ट्यूमर एक अतिरिक्त 2 सप्ताह के लिए धीरे धीरे प्रगति होगी. सुबह 56 के आसपास शुरू, ट्यूमर (चित्रा 2B) तेजी से बढ़ने शुरू हो जाएगा. इस बिंदु पर, यह (आंकड़े 2A और 3 ए) सामान्य है जो ट्यूमर प्रगति, में माउस परिवर्तनशीलता को मामूली माउस नहीं होगा क्योंकि गतिज पढ़ाई वांछित हैं अगर हर 3 दिन ट्यूमर संस्करणों को मापने के लिए महत्वपूर्ण है. बड़े पेट जनता ट्यूमर उनके शरीर के वजन के 10% से अधिक से अधिक अगर चूहों euthanized किया जाना चाहिए, जिसके बाद (चित्रा 2A, 2B, और 3 ए) सुबह 80 से स्पष्ट हो जाएगा. एक ट्यूमर असर माउस से तीन क्लोन के सीडीएनए विश्लेषण mesothelin की अभिव्यक्ति का पता चला, cytokeratin-8, HER2/neu, और एस्ट्रोजन रिसेप्टर α (चित्रा -2).

चित्रा 2
P53 loxP में> चित्रा 2. ट्यूमर के विकास / loxP LSL कश्मीर रास G12D / + चूहों 80 दिनों Cre व्यक्त adenovirus साथ इंजेक्शन के बाद ट्यूमर के adenovirus-रचनात्मक. ए) दो उदाहरणों के साथ intraductally इंजेक्शन. चूहे / Cre व्यक्त adenovirus के 2.5 x 10 7 pfu दिए गए थे और 80 दिनों के बाद ट्यूमर दीक्षा, बड़े स्पर्शनीय जनता जानवर. बी) विशिष्ट ट्यूमर कैनेटीक्स और p53 loxP में प्रेरित ट्यूमर के लिए टटोलने का कार्य निर्धारित समय से पेट की तरफ से फैला हुआ देखे जा सकते हैं loxP LSL कश्मीर रास G12D / + चूहों. सी) एक p53 loxP / loxP LSL कश्मीर रास G12D / + माउस की एक ही homogenized ट्यूमर से व्युत्पन्न तीन ट्यूमर सेल क्लोन की विशेषता. शाही सेना निकाले और RT-पीसीआर विश्लेषण के लिए संश्लेषित सीडीएनए, mesothelin, cytokeratin-8, HER2/neu, प्रोजेस्टेरोन रिसेप्टर, एस्ट्रोजन रिसेप्टर α, और एस्ट्रोजन रिसेप्टर β-actin β के लिए विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग किया गया था.टीपीएस :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51171/51171fig2highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

मानव स्तन कैंसर में सेलुलर microenvironment के लिए इसी प्रकार, हम αβ और γδ टी कोशिकाओं की घुसपैठ के साथ ही ट्यूमर में माइलॉयड व्युत्पन्न शमन कोशिकाओं और मैक्रोफेज (चित्रा 4) मनाया है. कक्षा लिम्फ नोड के लिए draining vasculature ट्यूमर इंजेक्शन प्रदर्शन किया था जहां पूरे स्तन के ऊतकों (चित्रा 3) शामिल हो गए हैं पहले लालच से खाना शुरू कर देंगे. ट्यूमर कोशिकाओं के Lymphovascular आक्रमण और मेटास्टेसिस LSL-EYFP चूहों के साथ LSL कश्मीर रास G12D / + p53 loxP / loxP चूहों को पार करके लगाया जा सकता है. Cre की मध्यस्थता छांटना के बाद, YFP (उच्च और निम्न दोनों) व्यक्त ट्यूमर कोशिकाओं को ट्यूमर में पाया जाता है और draining कक्षा लिम्फ नोड (3B चित्रा) के लिए metastasizing का पता लगाया जा सकता है. बाहर का कक्षा लिम्फ नोड के लिए मेटास्टेसिस पुष्टि की गईसफलतापूर्वक एक ट्यूमर असर LSL कश्मीर रास G12D / + p53 loxP / loxP माउस (नहीं दिखाया डेटा) में इस स्थल से एक ट्यूमर कोशिका लाइन संवर्धन द्वारा.

चित्रा 3
कक्षा लिम्फ नोड के लिए ट्यूमर और अव्यक्त मेटास्टेसिस के चित्रा 3. संरचना. ट्यूमर प्रगति की विभिन्न दरों के साथ तीन उन्नत स्तन ट्यूमर का एक) उदाहरण. अंततः Arrowhead, रूपों और ने संकेत दिया एक ठोस मास, पूरे पेट स्तन ऊतक के आकार तक की होती है. ट्यूमर स्तन के ऊतकों तक ही सीमित रहता है और आक्रमण या peritoneal गुहा कवर की मांसपेशियों को संलग्न करने के लिए नहीं मनाया जाता है. सफेद तीर से चिह्नित वंक्षण और कक्षा लिम्फ नोड्स के बीच सतही अधिजठर नस का स्पष्ट अतिपूरण है. 7-8 सप्ताह, वीं के बादई कक्षा लिम्फ नोड के कारण YFP सकारात्मक ट्यूमर कोशिकाओं की मेटास्टेसिस प्रवाह cytometry द्वारा कक्षा लिम्फ नोड में देखे जा सकते हैं तीर. बी ने संकेत दिया ट्यूमर कोशिकाओं के lymphovascular आक्रमण,) करने के लिए बढ़े बनने के लिए शुरू होता है. LSL कश्मीर रास G12D / + p53 loxP / loxP LSL-EYFP चूहों adenovirus-cre के intraductal वितरण से ट्यूमर और YFP की सक्रियता को उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया. कक्षा लिम्फ नोड, 80 दिनों के बाद adenoviral इंजेक्शन में ट्यूमर कोशिकाओं के lymphovascular आक्रमण को सत्यापित करने के लिए, संकेत दिया लिम्फ नोड्स और अंगों काटा और लिम्फोसाइट मार्करों के लिए दाग और YFP अभिव्यक्ति के लिए जांच की गई. सी.एल. लिम्फ नोड draining contralateral nontumor का प्रतिनिधित्व करता है. परिणाम ट्यूमर कोशिकाओं बाहर कक्षा लिम्फ नोड हमला कर रहे हैं, यह दर्शाता है CD45 नकारात्मक ट्यूमर कोशिकाओं पर gating का प्रतिनिधित्व करते हैं. संख्या कुल जनसंख्या से प्रतिशत YFP सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं. larg देखने के लिए यहां क्लिक करेंएर छवि.

चित्रा 4
चित्रा 4. इम्यून माउस ट्रांसजेनिक स्तन ट्यूमर में पैठ. माउस स्तन ट्यूमर homogenized और CD45, CD3, γδTCR, CD11b और GR1 के लिए दाग रहे थे. नंबर पूरे ट्यूमर (63.5) में सकारात्मक leukocytes के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करते हैं, कुल CD3 + (46.7), कुल CD3 नकारात्मक (40.1), कुल CD3 + γδ + (टी कोशिकाओं γδ, 13), CD3 + γδnegative (24), कुल GR1 उच्च CD11b (MDSC, 28.6) और कुल CD11b GR1 कम (मैक्रोफेज, 18.5). बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

कारण माउस और intraductal इंजेक्शन की तकनीक की शारीरिक रचना से, हम को लक्षित ओ मिलच स्तन ग्रंथियों 4 और 9 (चित्रा 5) सबसे अनुरूप परिणाम और विश्वसनीय इंजेक्शन पैदावार. हालांकि, किसी भी ग्रंथि सर्जरी प्रदर्शन तकनीशियन की वरीयता के आधार पर लक्षित किया जा सकता है.

चित्रा 5
चित्रा 5. स्तन नलिकाओं की नंबरिंग. स्तन नलिकाओं 4 और 9 चित्र पर लाल रंग में प्रकाश डाला और माउस पर तीर के साथ संकेत कर रहे हैं. हमारे हाथ में, हम इंजेक्शन, इन स्तन नलिकाओं पर प्रदर्शन करने के लिए हम इसी तरह कैनेटीक्स के साथ विकसित ट्यूमर को निशाना बनाया है. हालांकि अन्य सभी स्तन के ऊतकों के लिए सबसे आसान पाया गया कि बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

इस प्रक्रिया की सफलता अप्रशिक्षित प्रयोगकर्ताओं के लिए मुश्किल हो जाएगा, जो intraductal इंजेक्शन के दौरान उचित तकनीक पर टिका है. हमारी प्रयोगशाला में अनुभवी शोधकर्ताओं आम तौर पर स्तन ट्यूमर जनता वे adenoviral इंजेक्शन प्रशासन टाइम्स की 79% प्राप्त करते हैं. इंजेक्शन के साथ कोई समस्या काफी देरी, चर, या अनुपस्थित ट्यूमर के विकास में परिणाम कर सकते हैं. सुई भी गहरी या एक अनुचित कोण पर डाला जाता है, तो वाहिनीपरक नहर याद किया जा सकता है. यह स्तन के ऊतकों के माध्यम से और उदर शरीर गुहा के तरल झिल्ली में प्रवेश को रोकने के लिए, थोड़ा सुई (नहीं तो और अधिक से अधिक 2 मिमी) का उठाव पिछले निप्पल दर्ज करने के लिए महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, वायरस अवक्षेप के एक से अधिक 3 मिलीग्राम की सुई या इंजेक्शन की भी उथले प्लेसमेंट स्तन ग्रंथि और अनजाने में ट्यूमर के शामिल होने के बाहर वायरल प्रस्तुत करने के spillage में परिणाम कर सकते हैं. इन मुद्दों पर काबू पाने के लिए एक तरह से थोड़ा deepe निप्पल में सुई डालने के लिए हैआर 3 मिमी, और धीरे धीरे उठाव की नोक से 2 मिमी तक वापस ऊपर वाहिनी के बाहर सिरिंज आकर्षित से. यह स्तन के ऊतकों के बजाय चूहों की peritoneal गुहा (चित्रा 1 ए) के आसपास के मांसपेशियों का लक्ष्य रखा गया है कि यह सुनिश्चित करेंगे. वायरस वाहिनी में निष्कासित कर दिया है जब, वायरल अवक्षेप का कोई spillage और नुकसान है कि वहाँ तो यह भी सिरिंज के किनारों के साथ निपल खिंचाव जाएगा.

इंजेक्शन के दृश्य के लिए मुश्किल है और इस कदम के लिए अभ्यास की सिफारिश की है. हम ट्यूमर के विकास का एक उच्च penetrance में जिसके परिणामस्वरूप, अभ्यास के बाद सफल इंजेक्शन में वृद्धि देखा है. इस तकनीक कुंवारी महिलाओं nonlactating उपयोग करता है, यह अंतर्निहित वाहिनी नहर प्रकट करने के निप्पल को कवर केरातिन प्लग को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है. हम वाहिनी के अंदर trypan नीले या कुछ अन्य बाँझ मिल डाई इंजेक्शन लगाने और ductal टीआर का लक्ष्य पुष्टि करने के लिए पूरे स्तन mounts तैयारी द्वारा इस कदम का अभ्यास करने की अनुशंसाई. इसके अतिरिक्त, अभिकर्मकों की intraductal इंजेक्शन का वर्णन अन्य प्रोटोकॉल उचित तकनीक के विकास के लिए उपयोगी हो सकता है, जो 33,34 प्रकाशित किया गया है. वाहिनीपरक लुमेन के वायरल तैयारी या संक्रमण के साथ मुद्दे भी एक mCherry व्यक्त adenovirus का उपयोग करके जांच की जा सकती है. इंजेक्शन तकनीक अनुकूलित है जब तक Nontransgenic चूहों इन उद्देश्यों में से प्रत्येक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

किसी भी स्तन ग्रंथि के ट्यूमर आरंभ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, हम हम इसे और अधिक कुशल लक्ष्यीकरण, जिसके परिणामस्वरूप इन ग्रंथियों पर उचित इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए आसान है क्योंकि मेरा मानना ​​है कि जो स्तन ग्रंथि 4 या 9, लक्षित करके सबसे लगातार विकास दर हासिल की है डक्ट. वाम 4 वें की निकटता या draining वंक्षण लिम्फ नोड के लिए सही 9 वें वंक्षण स्तन ग्रंथियों ट्यूमर प्रगति के विभिन्न अस्थायी अंक के दौरान विरोधी ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए भी उपयोगी है. बाहर का साइटों मॉडल और अव्यक्त मेटास्टेसिस को ट्रैक करने के लिए, टीransgenic चूहों LSL-EYFP चूहों के साथ पार कर रहे थे. ट्यूमर के रूप में प्रगति ट्यूमर तेजी से (चित्रा 3) विकसित करने के लिए शुरू होने से पहले, कक्षा लिम्फ नोड के लिए ट्यूमर को जोड़ने वाहिका संरचना, पर लगभग 5 हफ्तों से थोड़ा engorged हो जाएगा. आखिरकार, 7-8 सप्ताह के बाद, lymphovascular आक्रमण कक्षा लिम्फ नोड (आंकड़े 3 ए और 3 बी) के भीतर ट्यूमर के विकास में परिणाम होगा. संवाददाता चूहों और रचनात्मक-loxP प्रौद्योगिकी का उपयोग करना, YFP के समावेश ट्यूमर प्रगति के दौरान बाहर का साइटों के लिए metastasizing ट्यूमर कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए एक मंच बनाता है. इस अव्यक्त मेटास्टेसिस को बढ़ावा देने कि सेलुलर और epigenetic तंत्र elucidating के उद्देश्य से अध्ययन की सुविधा कर सकते हैं. हमारे हाथ में, स्तन ट्यूमर सेल लाइनों ductal उपकला का लक्ष्य पुष्टि cytokeratin-8, mesothelin, एस्ट्रोजन रिसेप्टर α, और HER2/neu व्यक्त किया. हालांकि, प्रेरित उत्परिवर्तन पर और कारण कठिनाई और इंजेक्शन की परिवर्तनशीलता के लिए निर्भर करता है, हम अनुशंसा करते हैंमॉडल एक बार ट्यूमर के histological लक्षण वर्णन अच्छी तरह से प्रयोगशाला में स्थापित है.

स्तन कैंसर एक ऐसी घातक और व्यापक रोग 1,2 है, इसलिए यह सही ट्यूमर और मेजबान के बीच जटिल परस्पर क्रिया पुनरावृत्ति कि पशु मॉडल का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. यहाँ हम स्तन ट्यूमर की एक पूरी तरह से backcrossed C57BL 6 / murine मॉडल का वर्णन. सबसे पहले, देशी कोशिकाओं से ट्यूमर उत्प्रेरण द्वारा, हम ट्यूमर एक पूर्ण प्रतिरक्षा microenvironment में स्वाभाविक रूप से विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं. उन्नत माउस स्तन ट्यूमर में प्रतिरक्षा microenvironment सामान्यतः (चित्रा 4) मानव स्तन कैंसर में मनाया αβ की आबादी और γδ टी कोशिकाओं, माइलॉयड व्युत्पन्न शमन कोशिकाओं, और मैक्रोफेज स्मरण दिलाता है. हम डिम्बग्रंथि ट्यूमर को उत्पन्न करने के लिए adenovirus-Cre का उपयोग पहले से प्रकाशित किया है, हम वायरल इंजेक्शन इसी ट्यूमर पैठ और ट्यूमर प्रगति 28 पर नगण्य प्रभाव पड़ा मिला. दूसरा, अंत: स्रावी स्वतंत्रओंकोजीन की अभिव्यक्ति ट्यूमर कोशिकाओं लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति की लगातार उच्च स्तर को सुनिश्चित करता है कि. तीसरा, अव्यक्त म्यूटेशन का लाभ लेने से, हम ट्यूमर विकास की सटीक अस्थायी ट्रैकिंग की सुविधा के लिए tumorigenesis के समय को नियंत्रित कर सकते हैं. इस मॉडल के आवेदन ट्यूमर कोशिका जीव विज्ञान पर शोध में शामिल हैं, ट्यूमर microenvironment, विरोधी ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, और नई चिकित्सा विज्ञान की भी प्रभावकारिता मूल्यांकन में कारकों पर पढ़ाई. Cre पर loxP प्रणाली की उपलब्धता के माध्यम से, इस तकनीक में स्तन ट्यूमर की दीक्षा और प्रगति में अतिरिक्त परिवर्तन की एक विविध सरणी की जांच के लिए एक मंच के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. हम इस मॉडल का उपयोग स्तन कैंसर जीव विज्ञान की समझ बढ़ाने और अंततः metastatic स्तन कैंसर के इलाज के उद्देश्य से नई चिकित्सा विज्ञान के लिए नेतृत्व करेंगे.

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा.

Acknowledgments

इस काम NCI अनुदान RO1CA157664 और RO1CA124515 द्वारा समर्थित है, और एक स्तन कैंसर एलायंस पुरस्कार दिया गया था. हम Wistar फ्लो कोर सुविधा, Wistar इमेजिंग सुविधा से जेम्स हेडन, और उनके अमूल्य तकनीकी समर्थन के लिए Wistar संस्थान जानवरों की सुविधा का पूरा स्टाफ से जेफरी Faust, डेविड एम्ब्रोस, और स्कॉट वीस को धन्यवाद देना चाहूंगा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trp53tm1Brn Transgenic mice
K-rastm4Tyj Transgenic mice
Obtained from NCI mouse models of human cancer consortium Mice were backcrossed ten times to a full C57BL/6 background
B6.129X1-

Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J

Transgenic mice
Jackson Labs 006148
Primers p53loxP/loxP Integrated DNA Technologies 5'-AAGGGGTATGAGGGACAAGG-3'
5'-GAAGACAGAAAAGGGGAGGG-3'
Primers LSL-K-rasG12D/+ Integrated DNA Technologies 5'-CGCAGACTGTAGAGCAGCG-3'
5'-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC-3'
Primers for LSL-EYFP to detect Rosa promoter Integrated DNA Technologies 5'-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3'
5'-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3'
5'-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT-3'
Primers for detection of Mesothelin expression Integrated DNA Technologies 5'-TTGGGTGGATACCACGTCTG-3'
5'-CGGAGTGTAATGTTCTTCTGTC-3'
Primers for detection of Progesterone Receptor expression Integrated DNA Technologies 5'-GCAATGGAAGGGCAGCATAA-3'
5'-TGGCGGGACCAGTTGAATTT-3'
Primers for detection of Cytokeratin 8 expression Integrated DNA Technologies 5'-ATCAGCTCTTCCAGCTTTTCCC-3'
5'-GAAGCGCACCTTGTCAATGAAGG-3'
Primers for detection of Erbb2 expression Integrated DNA Technologies 5'-ACCTGCCCCTACAACTACCT-3'
5'-AAATGCCAGGCTCCCAAAGA-3'
Primers for detection of Estrogen Receptor A expression Integrated DNA Technologies 5'-ATGAAAGGCGGCATACGGAA-3'
5'-GCGGTTCAGCATCCAACAAG-3'
Primers for detection of Estrogen Receptor B expression Integrated DNA Technologies 5'-ACCCAATGTGCTAGTGAGCC-3'
5'-TGAGGACCTGTCCAGAACGA-3'
Primers for detection of B-Actin expression Integrated DNA Technologies 5'-GCCTTCCTTCTTGGGTATGG-3'
5'-CAGCTCAGTAACAGTCCGCC-3'
Adenovirus-Cre Gene Transfer Vector Core from the University of Iowa Ad5CMVCre Store aliquots of virus (4 x 108 pfu/aliquot) at -80 °C to avoid repeated freeze thaw cycles.
Adenovirus-mCherry Gene Transfer Vector Core from the University of Iowa Ad5CMVmCherry Store aliquots of virus (4 x 108 pfu/aliquot) at -80 °C to avoid repeated freeze thaw cycles.
Hamilton syringe Hamilton company 701RN 10 μl syringe, RN series.
Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.
Custom needle Hamilton company 7803-05 33 G 0.5 in long RN needle, with a 12° bevel. Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.
Surgical forceps Dumont 52100-58 Dumostar No. 5 forceps. Clean with 75% ethanol after each use, followed by autoclaving
MEM powder Cellgro 50 012 PB Store at 4 °C in powder and reconstituted form
Sodium Bicarbonate Fisher S233 Add to MEM and filter stearilize
Calcium Chloride Sigma C4901 Minimum 96%, anhydrous

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References

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Erratum

Formal Correction: Erratum: Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer
Posted by JoVE Editors on 10/20/2014. Citeable Link.

A correction was made to Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer. Protocol sections 3.1, 3.3.2, 3.4, and 4.7 were updated. The materials table was also updated.

Protocol section 3.1 was updated from:

3.1) Store adenovirus concentrated virus stocks at -80°C frozen in aliquots of 4 x 108 pfu each, sufficient for injecting 16 animals with 3 ml of 2.5 x 107 pfu of adenovirus particles.

to:

3.1) Store adenovirus concentrated virus stocks at -80°C frozen in aliquots of 4 x 108 pfu each, sufficient for injecting 16 animals with 3 µl of 2.5 x 107 pfu of adenovirus particles.

Protocol section 3.3.2 was updated from:

Mix aliquots containing 4 x 108 pfu adenovirus-Cre with sufficient 3% sucrose in sterile water for a final volume of 10 ml. Add 34 ml of MEM to the virus and gently mix. Then add 4 ml of the CaCl2 solution, gently mix, and incubate at room temperature for 15-20 min.

to:

Mix aliquots containing 4 x 108 pfu adenovirus-Cre with sufficient 3% sucrose in sterile water for a final volume of 10 µl. Add 34 µl of MEM to the virus and gently mix. Then add 4 µl of the CaCl2 solution, gently mix, and incubate at room temperature for 15-20 min.

Protocol section 3.4 was updated from:

Prior to each injection, gently flick the tube to make sure virus particles are mixed. Draw up 3 ml (2.5 x 107 pfu) of virus particles into the 10 ml syringe and prepare the mouse for the intraductal injection.

to:

Prior to each injection, gently flick the tube to make sure virus particles are mixed. Draw up 3 µl (2.5 x 107 pfu) of virus particles into the 10 µl syringe and prepare the mouse for the intraductal injection.

Protocol section 4.7 was updated from:

When the needle is appropriately placed into the mammary duct, release the 3 ml of virus precipitates (2.5 x 107 pfu of adenovirus-Cre) by gently plunging the syringe with the thumb of the hand holding the syringe. The nipple should slightly inflate as the liquid is added.

to:

When the needle is appropriately placed into the mammary duct, release the 3 µl of virus precipitates (2.5 x 107 pfu of adenovirus-Cre) by gently plunging the syringe with the thumb of the hand holding the syringe. The nipple should slightly inflate as the liquid is added.

Item 15 in the Materials table under Comments was updated from:

10ml syringe, RN series Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.

to:

10µl syringe, RN series Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.

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