Initiation Metastasierende Mammakarzinom durch Targeting des duktalen Epithel mit Adenovirus-Cre: Eine neue transgene Maus-Modell der Brustkrebs

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Rutkowski, M. R., Allegrezza, M. J., Svoronos, N., Tesone, A. J., Stephen, T. L., Perales-Puchalt, A., Nguyen, J., Zhang, P. J., Fiering, S. N., Tchou, J., Conejo-Garcia, J. R. Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer. J. Vis. Exp. (85), e51171, doi:10.3791/51171 (2014).

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Abstract

Brustkrebs ist eine heterogene Erkrankung, die komplexen zellulären Interaktionen zwischen der Entwicklungs Tumor und Immunsystems, was schließlich in der exponentiellen Tumorwachstum und Metastasen in Geweben distalen und dem Zusammenbruch der Anti-Tumor-Immunität. Viele nützliche Tiermodelle existieren, um Brustkrebs zu studieren, aber keine, die das Fortschreiten der Krankheit beim Menschen auftritt vollständig rekapitulieren. Um ein besseres Verständnis der zellulären Interaktionen, die in der Bildung von latenten Metastasierung und verminderter Überleben zu gewinnen, haben wir einen induzierbaren transgenen Mausmodell von YFP-exprimierenden duktales Karzinom, die nach der Geschlechtsreife entwickelt in immunkompetenten Mäusen und wird angetrieben wird durch konsequente, endokrine unabhängige Onkogenexpression. Die Aktivierung von YFP, Ablation von p53, und Ausdruck einer onkogenen Form von K-ras wurde von der Lieferung eines Adenovirus Cre-Rekombinase in der Milchkanal von sexuell reifen, rein weiblichen Mäusen erreicht. Tumorenbeginnen zu 6 Wochen nach der Initiierung der onkogenen Ereignisse angezeigt. Nach Tumoren deutlich wird, Fortschritte sie sich langsam für etwa zwei Wochen, bevor sie, exponentiell zu wachsen beginnen. Nach 7-8 Wochen nach der Adenovirus-Injektion wird Gefäßsystem beobachtet Anschluss der Tumormasse zu distalen Lymphknoten, mit eventuellen lymphovascular Invasion von YFP + Tumorzellen mit den distalen axillären Lymphknoten. Infiltrierenden Leukozyten-Populationen sind ähnlich zu denjenigen in der menschlichen Brustkarzinome, einschließlich der Anwesenheit von αβ und γδ T-Zellen, Makrophagen und MDSCs gefunden. Dieses einzigartige Modell wird die Untersuchung der zellulären und immunologischen Mechanismen in latenter Metastasen und Ruhe zusätzlich zu nützlich für die Entwicklung neuer immun invasive Interventionen zur Behandlung von Brustkrebs beteiligt sind, erleichtern.

Introduction

Brustkrebs ist die am häufigsten auftretende Krebserkrankung bei Frauen in der ganzen Welt 1,2 und die zweithäufigste Ursache der durch Krebs verursachten Todesfälle 2. Komplexe genetische 3,4, 5 histologische und klinische Phänotypen 6 werden verwendet, um die verschiedenen Subtypen von Brustkrebs zu charakterisieren und werden oft als ein Mittel, um das Überleben vorherzusagen. Die Analyse einer großen Kohorte von Frauen mit Brustkrebs zeigte, dass die meisten (ca. 80%) der Patienten, die starben innerhalb von 10 yr Beitrag Entfernung des Primärtumors 7 wiedergekehrt war. Für die Mehrheit der invasiven Mammakarzinome hat lymphovascular Invasion gezeigt worden, um stark zu einem schlechten Ergebnis und aggressiveren klinischen Verlauf der Erkrankung korreliert werden 8.

Aufgrund der genetischen und phänotypischen Komplexität von Brustkrebs, gibt es keine Tiermodell, das den gesamten Verlauf der Krankheit rekapituliert. Menschliche Muttertumorzelllinien wurden mehrals Xenotransplantat oder orthotopen 9 Modelle von invasiven und metastatischen Brustkrebs bei immungeschwächten Mäusen verwendet. Obwohl informative treten diese Modelle in Abwesenheit von Immun Druck und weil es eine Quer Arten Transplantat, verzerren die Wirkung des gesamten Tumor-Mikroumgebung. Induzierbare genetische Mutationen durch Brust spezifische Promotoren, wie Maus-Mammatumorvirus (MMTV) und Molke saures Protein (WAP) angetrieben haben eine enorme Menge an Wissen über die genetische Beschaffenheit von Brustkrebs beigetragen. Jedoch ist die gewebespezifische Expression dieser Promotoren durch ihre Reaktionsfähigkeit mit dem endokrinen System 10-16 beeinträchtigt, was zu einer variablen Expression der induzierten genetischen Mutationen, spiegeln nicht die Expression von Onkogenen in der Regel in menschlichem Brustkrebs überexprimiert. Um endokrine Kontrolle des MMTV gesteuerte Expression von Onkogenen zu überwinden, Moody et al. Erzeugt eine bedingte, Doxycyclin induzierbaren Überexpression Modell Neu in der BrustEpithel 17. Dieses Modell ist nützlich für deinducing Neu nach Tumorbildung zu Regression und Wiederholung zu studieren, aber erfordert ständige Doxycyclin Verwaltung für konsistente, langfristige Onkogenexpression. Eine umfassende Diskussion der vielen relevanten Brusttumor-Modelle in der Übersicht von Vargo-Gogola et al. 10 gefunden werden

Unser Ziel war es, ein Mausmodell für Brustkrebs rückführbar auf Voll C57BL / 6 Hintergrund zu entwickeln, dass nach der ständigen Induktion der Mutationsereignisse, Modelle die Bildung einer entstehenden Tumor in der Anwesenheit von Immundruck. Wir führten ein Adenovirus Cre-Rekombinase in die Milchgänge von transgenen Mäusen enthält floxed Allele Tp53 und eine onkogene Form von K-ras und YFP. Cre-Expression Tp53 abträgt, eine häufig mutierte Gen in vielen Brustkrebs 18 und induziert eine onkogene Allel des K-ras neben YFP Ausdruck spezifischin der Brust duktalen Epithel. Obwohl Mutationen in K-ras sind selten bei Brustkrebs, in nur 6,5% der Brustkrebspatientinnen 19,20 auftritt, die Überexpression von stromaufwärtigen Kinasen wie Her2/neu und EGFR bewirken die konstitutive Aktivierung des Ras-Signalwegs in menschlichen Brusttumoren 21-23. Aktivierung des Ras-Signalwegs in vielen Brusttumorzelllinien wurde auch berichtet, 24,25. Wir werden den Beginn der Tumorbildung und die Technik der intraduktale Injektion eines Adenovirus Cre-Rekombinase in sexuell reifen, Jungfrau weiblichen Mäusen zu beschreiben. Dieses Modell von Brustkrebs entwickelt offene Läsionen, die exponentiell nach etwa 8 Wochen der langsamen Tumorprogression zu wachsen, mit lymphovascular Invasion und Metastasierung in die axillären Lymphknoten von 7-8 Wochen. Da diese Mäuse sind auf Voll C57BL / 6 Hintergrund und YFP-exprimierenden Tumorzellen sind rückführbar in distalen Lymphknoten, bietet dieses Modell eine entsprechende Werkzeug, um die ce studierenllular und immunologischen Mechanismen der Metastasierung latent und wird dazu beitragen, neue therapeutische Ansätze für die Behandlung von metastasierendem duktalen Brustkrebs zu entwickeln.

Protocol

Alle Tierversuche wurden von der Wistar-Institut Animal Care und Verwenden Committee genehmigt.

1. Erstellung und Wartung von transgenen Mäusen

  1. Rasse LSL-K-ras tm4Tyj 26 und Trp53 tm1Brn 27 (von NGI-Maus-Modellen der menschlichen Krebs Konsortium auf eine gemischte Hintergrund erhalten wird) zu einem vollen C57BL / 6 Hintergrund 28 durch Rückkreuzung mindestens 10 Generationen mit C57BL / 6 Mäusen. So verfolgen Tumormetastasen, Rasse B6.129X1-Gt (ROSA) 26Sor tm1 (EYFP) Cos / J (LSL-EYFP, von The Jackson Laboratory auf Voll C57BL / 6 Hintergrund erhalten) mit Doppel transgenen LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP Mäusen.
    Hinweis: Transgene LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP Mäuse haben loxP-Stellen flankieren eine transkriptionell Schweigen Allel des onkogenen K-ras und der endogenen p53-Locus, so dass bei Cre-vermittelte Exzision, die Überexpression eines onkogenen K-ras Mutante und Ablation von p53 ist achiEVED.
    Hinweis: Die LSL-EYFP Maus enthält ein Stopcodon flankieren, ein Gen für eine verstärkte gelb fluoreszierendes Protein (YFP), das nach Cre-vermittelter Exzision Ergebnisse der Expression von YFP in den Geweben, in denen die YFP Stop-Kassette wird herausgeschnitten.
    1. Rasse transgenen Mäusen zu LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP Mäusen oder LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP LSL-EYFP-Mäuse für intraduktale Injektionen erhalten.
      Hinweis: Die Mäuse werden als homozygot für p53 loxP / loxP und heterozygot für rassigen LSL-K-ras G12D / +, da Mäuse mit einer homozygote Deletion des K-ras sterben in utero. Verwenden naiv jungfräulichen Weibchen mindestens sechs Wochen alt für intraduktale Injektionen.
      Hinweis: Die Primer für die Genotypisierung floxed p53 Allel homozygot sind p53 - T010-fwd (5'-AAGGGGTATGAGGGACAAGG-3 ') und p53-T011-rev (5'-GAAGACAGAAAAGGGGAGGG-3'). Sie produzieren eine Wildtyp-Allel bei 391 bp und das p53-Allel floxed bei 461 bp 29,30.
      Hinweis: Die Primer, die mutierte Form des K-ras detektieren oIMR8273 (5'-CGCAGACTGTAGAGCAGCG-3 ') und oIMR8274 (5'-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC-3'). Sie produzieren das mutierte Bande bei 600 bp detektiert.
      Hinweis: Für die Dreifach-Reporter YFP transgenen Mäusen, um die Primer die ROSA Kassette erkennen (5'-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3 '), die das Wildtyp-Allel (5'-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3') und eine gemeinsame Allel (5'-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT -3 ') führen zur Verstärkung der Banden bei 320 bp für floxed Allel und 600 bp für das Wildtyp-Allel.

2. OP-Vorbereitung

  1. Saubere chirurgischen Materialien mit 75% EtOH und Autoklaven sie vor und nach den Injektionen.
  2. Führen Operation auf einem Labortisch ordentlich sauber desinfiziert in einem Zimmer in einer Tieranlage. Wischen Sie alle Oberflächen, einschließlich der Bühne und Zifferblätter des Operationsmikroskops mit einem Breitspektrum-Desinfektionslösung, gefolgt von 75% EtOH.
  3. Wiegen und Mäuse anästhesiert durch intraperitoneale Injektion einer Mischung aus Ketamin (80-100 mg / kg) und Xylazin (8-10 mg / kg) in steriler Kochsalzlösung.
  4. Sanft legen Mäuse wieder in ihre Käfige für 5 Minuten ungestört, während sie unter Narkose zu gehen. Während dieser Zeit erzeugen Virus Niederschläge (siehe Protokoll Nr. 3).
  5. Überprüfen Sie, ob Mangel an Reaktion auf Schmerzen, die durch Quetschung Zehe. Die Augen der narkotisierten Mäusen vorsichtig Abdeckung mit Tier Salbe, um übermäßige Hornhaut Austrocknen zu verhindern.
  6. Um Unterkühlung zu vermeiden, legen narkotisierten Mäusen auf einem Heizkissen auf kleiner Flamme während des chirurgischen Eingriffs eingestellt und bis sie sich zu erholen beginnen.
  7. Für die Behandlung von Schmerzen, verwalten Mäusen subkutan Meloxicam bei 1 mg / kg vor der Operation und 24 Stunden nach.

3. Erzeugung von Virus Niederschläge

VORSICHT: Adenovirus-Vektoren, wenn sie modifiziert worden sind und sich nicht replizieren, besteht das Risiko,Infektion. Griff Adenovirus mit Vorsicht. Alle Mitarbeiter sollten entsprechend den Richtlinien des Instituts für den Umgang mit BSL2 Agenten Nach intraduktale Injektion, entsorgen Adenovirus nach BSL2 Richtlinien geschult werden.

  1. Speicher Adenovirus konzentrierte Virusbestände bei -80 ° C in Aliquots von 4 x 10 8 pfu jedes ausreichend gefroren zum Einspritzen 16 Tiere mit 3 ml 2,5 x 10 7 pfu des Adenovirus-Partikel.
  2. Bewahren Adenovirus aliquoten auf Trockeneis, bis ca. 15-20 min vor Beginn der Injektionen.
    Hinweis: Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen als Virus-Titer sinkt deutlich zwischen jedem Zyklus.
    Hinweis: Adenovirus Niederschläge werden durch Modifizieren eines zuvor beschriebenen Protokolls 31 gebildet.
  3. Rekonstituieren 504 mg Pulver MEM mit 50 ml steriler Molekular Grad Wasser, Nahrungsergänzungsmittel mit 244 mg Natriumbicarbonat und Filter in sterilen Bedingungen und bei 4 ° C
      <li> Bereiten Sie die Calciumchlorid-Lösung durch Zugabe von 1,5 g Calciumchlorid in 50 ml molekular reines Wasser und Filter unter sterilen Bedingungen und bei 4 ° C
    1. Mischen Aliquots mit 4 x 10 8 pfu Adenovirus-Cre mit ausreichender 3% Saccharose in sterilem Wasser auf ein Endvolumen von 10 ml gelöst. In 34 ml MEM, um das Virus und vorsichtig mischen. Dann fügen Sie 4 ml der CaCl 2-Lösung, vorsichtig mischen, und bei Raumtemperatur für 15-20 min.
    2. Shop Adenovirus auf Trockeneis bis bereit, um Niederschläge zu bilden. Vermeiden Auftauen des Adenovirus und Speichern auf Eis oder bei Raumtemperatur für längere Zeiträume, sofern Niederschläge gebildet werden.
      Anmerkung: Es ist auch möglich, die Saccharose, MEM und CaCl 2 vor den Operationen mischen, wenn es nicht möglich ist, den Adenovirus-Aliquot aufgetaut und beginnen, fällt unmittelbar nach dem Entfernen von -80 ° C. Dieses Aliquot von Saccharose, MEM, und Kalzium kann auf Trockeneis, bis bereit, den Adenovirus hinzufügen gespeichert werden.
      Hinweis: Viruspartikel werden etwa 1 h stabil.
    3. Vor jeder Injektion, sanft Flick das Rohr, um sicherzustellen, Viruspartikel werden gemischt. Zeichnen bis 3 ml (2,5 x 10 7 pfu) von Viruspartikeln in den 10-ml-Spritze und bereiten Sie die Maus für die intraduktale Injektion.

4. Intraduktale Injektion von Viruspartikeln

  1. Sanft statt mit der Maus auf dem Rücken auf den beleuchteten Bühne von einem sauberen Dissektionsmikroskop. Beleuchten Sie die Bauchseite mit einer zusätzlichen Lichtquelle und suchen Sie die links oder rechts, 4. 9. Leistenbrustdrüse durch die kleinen weißen Flecken von Pelz (sichtbar auf C57BL / 6 Frauen) jeden Nippel umgibt.
  2. Reiben Sie die Brustwarze vorsichtig mit einer sterilen Ethanol getränkten Wattestäbchen, um Haare aus der Brustwarze zu löschen und die Injektionsstelle zu sterilisieren. Wenn sie schwer zu finden sind, vorsichtig eine dicke Schicht einer Enthaarungscreme oder Verwendung Schere, um die Brustwarzen freizulegen. Entfernen Sie das Keratin Stecker, eine Schicht aus dichtem abgestorbene Hautzellen, die Abdeckung wird die Brustwarze. Sobald die Nippel ausgesetzt ist, sollte das Keratin Stecker gut sichtbar unter der Dissektionsmikroskop sein.
  3. Sichern Sie die Brustwarze mit feinen chirurgischen Pinzette und ziehen Sie mit wenig Kraft um das Keratin Stecker entfernen.
  4. Stabilisieren Sie die Brustwarze zwischen der Zange.
  5. Setzen Sie vorsichtig die Nadel zwischen den Zangen, Kanülieren den Kanal Kanal bei 90 °. Geben Sie die Sauger etwas hinter der Abschrägung der Nadel (nicht mehr als 2 mm), um das Eindringen durch das Brustgewebe und in die serösen Membranen der ventralen Körperhöhle zu verhindern.
    1. Sie die Nadel zu tief einführen. Um die richtige Tiefe der Injektion zu gewährleisten, ziehen Sie die Nadel bis nach dem Einlegen in das Lumen des Kanals, zeichnen die Brustwarze bis an den Rändern der Nadel, wie es oben gezogen.
      Hinweis: Visualisierung der Injektion schwierig, deshalb practicE für diesen Schritt wird unter Verwendung von Trypanblau empfohlen.
  6. Wenn die Nadel in geeigneter Weise in der Brustkanal platziert, lassen Sie die 3 ml Virus Niederschläge (2,5 x 10 7 pfu des Adenovirus-Cre), indem Sie vorsichtig stürzen die Spritze mit dem Daumen der Hand hält die Spritze. Die Brustwarze sollte etwas aufblasen, wenn die Flüssigkeit aufgenommen ist.

5. Wiederherstellung von Mäusen

  1. Platzieren Sie die Maus wieder auf das Heizkissen nach der Injektion, bis sie beginnt, sich von der Narkose zu erholen.
  2. Sobald die Maus gewonnen, setzen Sie ihn wieder in einen sauberen Käfig und Monitor für vollständige Erholung und Bewegung.
  3. 24 Stunden nach der Injektion intraductal, subkutan verabreichen Meloxicam bei 1 mg / kg.

6. Überwachung Tumorprogression

  1. Tasten Sie die Brustdrüse injiziert am Tag 30 für die Erweiterung und Schwellungen.
    1. Überwachung der Tumorprogression alle 5-7 Tage einmal geschwollen und vergrößerte Brust Gland beobachtet.
  2. Messen Tumorvolumina alle 3-4 Tage für das Tumorwachstum Kinetik einmal tastbaren Tumoren erscheinen (ca. 50-60 Tage nach der Adenovirus-Injektion).
  3. Euthanize Mäusen als Tumorvolumen 10% des Körpergewichts der Mäuse überschreiten.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trp53tm1Brn Transgenic mice
K-rastm4Tyj Transgenic mice
Obtained from NCI mouse models of human cancer consortium Mice were backcrossed ten times to a full C57BL/6 background
B6.129X1-

Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J

Transgenic mice
Jackson Labs 006148
Primers p53loxP/loxP Integrated DNA Technologies 5'-AAGGGGTATGAGGGACAAGG-3'
5'-GAAGACAGAAAAGGGGAGGG-3'
Primers LSL-K-rasG12D/+ Integrated DNA Technologies 5'-CGCAGACTGTAGAGCAGCG-3'
5'-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC-3'
Primers for LSL-EYFP to detect Rosa promoter Integrated DNA Technologies 5'-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3'
5'-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3'
5'-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT-3'
Primers for detection of Mesothelin expression Integrated DNA Technologies 5'-TTGGGTGGATACCACGTCTG-3'
5'-CGGAGTGTAATGTTCTTCTGTC-3'
Primers for detection of Progesterone Receptor expression Integrated DNA Technologies 5'-GCAATGGAAGGGCAGCATAA-3'
5'-TGGCGGGACCAGTTGAATTT-3'
Primers for detection of Cytokeratin 8 expression Integrated DNA Technologies 5'-ATCAGCTCTTCCAGCTTTTCCC-3'
5'-GAAGCGCACCTTGTCAATGAAGG-3'
Primers for detection of Erbb2 expression Integrated DNA Technologies 5'-ACCTGCCCCTACAACTACCT-3'
5'-AAATGCCAGGCTCCCAAAGA-3'
Primers for detection of Estrogen Receptor A expression Integrated DNA Technologies 5'-ATGAAAGGCGGCATACGGAA-3'
5'-GCGGTTCAGCATCCAACAAG-3'
Primers for detection of Estrogen Receptor B expression Integrated DNA Technologies 5'-ACCCAATGTGCTAGTGAGCC-3'
5'-TGAGGACCTGTCCAGAACGA-3'
Primers for detection of B-Actin expression Integrated DNA Technologies 5'-GCCTTCCTTCTTGGGTATGG-3'
5'-CAGCTCAGTAACAGTCCGCC-3'
Adenovirus-Cre Gene Transfer Vector Core from the University of Iowa Ad5CMVCre Store aliquots of virus (4 x 108 pfu/aliquot) at -80 °C to avoid repeated freeze thaw cycles.
Adenovirus-mCherry Gene Transfer Vector Core from the University of Iowa Ad5CMVmCherry Store aliquots of virus (4 x 108 pfu/aliquot) at -80 °C to avoid repeated freeze thaw cycles.
Hamilton syringe Hamilton company 701RN 10 μl syringe, RN series.
Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.
Custom needle Hamilton company 7803-05 33 G 0.5 in long RN needle, with a 12° bevel. Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.
Surgical forceps Dumont 52100-58 Dumostar No. 5 forceps. Clean with 75% ethanol after each use, followed by autoclaving
MEM powder Cellgro 50 012 PB Store at 4 °C in powder and reconstituted form
Sodium Bicarbonate Fisher S233 Add to MEM and filter stearilize
Calcium Chloride Sigma C4901 Minimum 96%, anhydrous

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Erratum

Formal Correction: Erratum: Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer
Posted by JoVE Editors on 10/20/2014. Citeable Link.

A correction was made to Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer. Protocol sections 3.1, 3.3.2, 3.4, and 4.7 were updated. The materials table was also updated.

Protocol section 3.1 was updated from:

3.1) Store adenovirus concentrated virus stocks at -80°C frozen in aliquots of 4 x 108 pfu each, sufficient for injecting 16 animals with 3 ml of 2.5 x 107 pfu of adenovirus particles.

to:

3.1) Store adenovirus concentrated virus stocks at -80°C frozen in aliquots of 4 x 108 pfu each, sufficient for injecting 16 animals with 3 µl of 2.5 x 107 pfu of adenovirus particles.

Protocol section 3.3.2 was updated from:

Mix aliquots containing 4 x 108 pfu adenovirus-Cre with sufficient 3% sucrose in sterile water for a final volume of 10 ml. Add 34 ml of MEM to the virus and gently mix. Then add 4 ml of the CaCl2 solution, gently mix, and incubate at room temperature for 15-20 min.

to:

Mix aliquots containing 4 x 108 pfu adenovirus-Cre with sufficient 3% sucrose in sterile water for a final volume of 10 µl. Add 34 µl of MEM to the virus and gently mix. Then add 4 µl of the CaCl2 solution, gently mix, and incubate at room temperature for 15-20 min.

Protocol section 3.4 was updated from:

Prior to each injection, gently flick the tube to make sure virus particles are mixed. Draw up 3 ml (2.5 x 107 pfu) of virus particles into the 10 ml syringe and prepare the mouse for the intraductal injection.

to:

Prior to each injection, gently flick the tube to make sure virus particles are mixed. Draw up 3 µl (2.5 x 107 pfu) of virus particles into the 10 µl syringe and prepare the mouse for the intraductal injection.

Protocol section 4.7 was updated from:

When the needle is appropriately placed into the mammary duct, release the 3 ml of virus precipitates (2.5 x 107 pfu of adenovirus-Cre) by gently plunging the syringe with the thumb of the hand holding the syringe. The nipple should slightly inflate as the liquid is added.

to:

When the needle is appropriately placed into the mammary duct, release the 3 µl of virus precipitates (2.5 x 107 pfu of adenovirus-Cre) by gently plunging the syringe with the thumb of the hand holding the syringe. The nipple should slightly inflate as the liquid is added.

Item 15 in the Materials table under Comments was updated from:

10ml syringe, RN series Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.

to:

10µl syringe, RN series Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.

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