गुर्दे से डबल नकारात्मक αβ टी कोशिकाओं के अलगाव

1Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine
Immunology and Infection

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ERRATUM NOTICE

Summary

DNabT कोशिकाओं परिधीय टी कोशिकाओं के बीच में दुर्लभ हैं; हालांकि, वे कुछ गैर lymphoid ऊतकों में प्रचुर मात्रा में हैं. गैर lymphoid ऊतक से डी.एन. टी कोशिकाओं को अलग करने की कठिनाई pathophysiologic महत्व को मान्यता दी वृद्धि के बावजूद उनके कार्यात्मक विश्लेषण hinders. हम murine गुर्दे से उच्च शुद्ध डी.एन. टी कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक उपन्यास प्रोटोकॉल का वर्णन.

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Martina, M. N., Bandapalle, S., Rabb, H., Hamad, A. R. Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney. J. Vis. Exp. (87), e51192, doi:10.3791/51192 (2014).

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Abstract

गैर lymphoid ऊतकों से डी.एन. टी कोशिकाओं के अलगाव के लिए कोई मानक प्रोटोकॉल विभिन्न प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में उनके तेजी से सूचना मिली की भागीदारी के बावजूद वर्तमान में है. डी.एन. टी कोशिकाओं allotransplants 1-6 करने के लिए प्रतिरक्षा और autoimmune प्रतिक्रियाओं और सहिष्णुता को विनियमित करने में शामिल किया गया है कि एक अद्वितीय प्रतिरक्षा सेल प्रकार के होते हैं. डी.एन. टी कोशिकाओं परिधीय रक्त और माध्यमिक lymphoid अंगों (प्लीहा और लिम्फ नोड्स) में दुर्लभ है, तथापि, कर रहे हैं, लेकिन सामान्य गुर्दे के प्रमुख निवासी हैं. बहुत कम होने के कारण परिधि में उनकी कमी को उनके pathophysiologic समारोह 7 के बारे में जाना जाता है. हमने हाल ही में स्थिर अवस्था में और ischemia reperfusion चोट दौरान गुर्दे 8 में इस आबादी के लिए एक व्यापक प्ररूपी और कार्यात्मक विश्लेषण का वर्णन किया. डी.एन. टी सेल समारोह का विश्लेषण बहुत गुर्दे से उनके अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल के विकास के द्वारा बढ़ाया जाएगा.

यहाँ, हम isolatio अनुमति देता है एक उपन्यास प्रोटोकॉल का वर्णनmurine गुर्दे से अत्यधिक शुद्ध एबी सीडी 4 + सीडी 8 + टी कोशिकाओं और डी.एन. टी कोशिकाओं के एन. संक्षेप में, हम collagenase का उपयोग गुर्दे ऊतक को पचाने और घनत्व ढाल से गुर्दे की कोशिकाओं mononuclear (KMNC) को अलग. इस KMNC से 70% से 3% से hematopoietic टी कोशिकाओं को समृद्ध करने के लिए दो चरणों के बाद है. पहला कदम एक CD45 + अलगाव किट का उपयोग कर hematopoietic कोशिकाओं का एक सकारात्मक चयन के होते हैं. दूसरे चरण में, डी.एन. टी कोशिकाओं नकारात्मक सीडी 4, सीडी 8, और MHC वर्ग द्वितीय मोनोक्लोनल एंटीबॉडी और CD1d α-galcer टेट्रामर का उपयोग गैर वांछित कोशिकाओं को हटाने से अलग कर रहे हैं. यह रणनीति अधिक से अधिक 90% शुद्ध डी.एन. टी कोशिकाओं की आबादी की ओर जाता है. FACS विश्लेषण द्वारा पीछा ऊपर उल्लेख किया एंटीबॉडी के साथ भूतल धुंधला शुद्धता की पुष्टि करने के लिए प्रयोग किया जाता है.

Introduction

परिधीय αβTCR + CD3 + सीडी 4 - सीडी 8 - डबल नकारात्मक (डी.एन.) टी कोशिकाओं अलग phenotypes और कार्यों 1-4 कि अधिकारी विभिन्न सबसेट में विभाजित हैं. डी.एन. टी कोशिकाओं खराब समझ रहे हैं लेकिन तेजी से विभिन्न रोग मॉडल 4-6 में pathophysiological प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में फंसाया जा रहा है.

डी.एन. टी कोशिकाओं तेजी से विभिन्न प्रतिरक्षा और autoimmune प्रतिक्रियाओं के विनियमन और allotransplant सहिष्णुता के मॉडुलन में फंसा है कि एक अद्वितीय प्रतिरक्षा सेल प्रकार के होते हैं. 4-6, 9 वे प्लीहा और लिम्फ नोड्स (परिधीय रक्त और माध्यमिक lymphoid अंगों में दुर्लभ हैं ). हालांकि, वे सामान्य गुर्दे और आंत उपकला 10-12 के प्रमुख निवासी हैं. बहुत कम स्थिर अवस्था में गुर्दे में उनके कार्य 7 के बारे में और इस तरह के गुर्दे transpl के साथ जुड़े तीव्र गुर्दे चोट (अकी) के रूप में रोग की स्थिति के तहत जाना जाता हैचींटी.

क्योंकि प्रत्येक खिलाड़ी की भूमिका को परिभाषित करने, alloresponses सहित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को विनियमित करने में अलग प्रतिरक्षा कोशिकाओं का जटिल भूमिकाओं के alloresponses को समझने और नई चिकित्सा विज्ञान को डिजाइन करने में महत्वपूर्ण है. शारीरिक और विभिन्न रोग परिस्थितियों में किडनी में मौजूद डी.एन. टी कोशिकाओं की बड़ी संख्या को देखते हुए, डी.एन. टी कोशिकाओं प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं में एक महत्वपूर्ण चूहों और इंसानों में प्रतिरक्षा और autoimmune प्रतिक्रियाओं को विनियमित करने में भूमिका, और alloresponses खेलने की संभावना है. अभी भी बिखरे सबूत हालांकि जमते दोनों रोगजनक और immunosuppressive कार्यों में डी.एन. टी कोशिकाओं implicates लेकिन क्यों और कैसे वे एक विशिष्ट हानिकारक या दमनकारी समारोह प्रदर्शन और पर्यावरण उन्हें प्रभावित करती है कि कैसे यह बुरा समझा जाता है.

कारण गुर्दे में उनकी कम बहुतायत के लिए, अलगाव के तरीकों में सुधार जरूरी हैं.

टी से डी.एन. टी कोशिकाओं के अलगाव के लिए कोई मानक प्रोटोकॉल वर्तमान में हैवह गैर lymphoid ऊतकों. हमारे प्रोटोकॉल गुर्दे से डी.एन. टी कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक उपन्यास विधि का वर्णन करता है; हालांकि, विधि भी विभिन्न गैर lymphoid ऊतकों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Protocol

1. साधनों की तैयारी, संस्कृति, मीडिया और अभिकर्मकों

  1. उपकरण: बाँझ शर्तों के तहत अभिकर्मकों तैयार है और एक लामिना का प्रवाह हुड के नीचे का उपयोग करें.
  2. भ्रूण गोजातीय सीरम के 5%, बाइकार्बोनेट की 2.1 ग्राम, 10 मिलीलीटर ग्लूटामेट 100x, HEPES के 10 मिलीग्राम, 1 मिलीग्राम सोडियम पाइरूवेट और 10 मिलीलीटर 100x के पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन जोड़ने, RPMI टिशू कल्चर माध्यम के 1 एल तैयार करें.
    नोट: अनुशंसित टिशू कल्चर मध्यम, RPMI, DMEM के साथ परस्पर विनिमय है.
  3. 5% collagenase 'डी' समाधान (ऊतक संस्कृति के माध्यम से 9 मिलीलीटर collagenase 'डी' के 5 एमएल) तैयार करें.
  4. 100%, 80% और 40%: तीन अलग सांद्रता में Percoll समाधान करें. निम्नलिखित सांद्रता 1 नमूना के लिए गणना कर रहे हैं. कमरे के तापमान पर समाधान रखें.
    1. Percoll समाधान: (शेयर समाधान से) undiluted Percoll के 9 मिलीलीटर जोड़ने; पीबीएस 10x के 1 मिलीलीटर जोड़ें.
    2. Percoll समाधान:; Percoll के 8 एमएल 100% जोड़ें पीबीएस 1x के 2 मिलीलीटर जोड़ें.
    3. Percoll समाधान:Percoll 80% की 4 मिलीलीटर जोड़ने; पीबीएस 1x के 4 एमएल जोड़ें.
  5. (FACS) बफर छँटाई प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल का 1 एल बनाओ; 5 एमएल 10% BSA (0.1% बीएसए), 1 मिलीलीटर 10% सोडियम azide (0.1%), 2 मिलीलीटर EDTA एजेंट, 1x पीबीएस के साथ 1,000 मिलीग्राम के लिए कर जोड़ें.

किडनी पाचन की 2. तैयारी

  1. , किसी भी आवश्यक संस्थागत अनुमोदन प्राप्त कर लिया मानक तरीकों के साथ चूहों बलिदान और रक्तहीन और मौजूदा नियमों और जानवरों की देखभाल दिशा निर्देशों का पालन करने के बाद.
    1. Pentobarbital (0.07 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ माउस anesthetize.
    2. Exsanguination के लिए आगे बढ़ें.
    3. एक शल्य चिकित्सा की मेज पर एक लापरवाह स्थिति में माउस रखें.
    4. 70% इथेनॉल के साथ पेट क्षेत्र स्प्रे.
  2. पेट्री डिश के लिए collagenase डी समाधान के 10 मिलीलीटर जोड़ें.
  3. निकालें और प्रत्येक माउस से दोनों गुर्दे decapsulate.
    1. करने के लिए उरोस्थि से पेट की त्वचा और पेरिटोनियम के माध्यम से एक midline चीरा द्वारा abdomimal गुहा खोलेंpubis.
    2. पक्ष को laterally आंत ले जाकर छोड़ दिया गुर्दे बेनकाब.
    3. ध्यान संदंश के साथ छोड़ दिया कैप्सूल अलग.
      नोट: कैप्सूल गुर्दे आसपास एक पारदर्शी परत के रूप में प्रकट होता है और आंशिक रूप से पेरिनेफ्रिक वसा ऊतकों द्वारा कवर किया.
    4. एक शल्य कैंची का उपयोग कर डंडी वाहिकाओं काटने से बायां गुर्दा निकालें.
    5. सही गुर्दे के लिए एक ही प्रक्रिया दोहराएँ.
      नोट: सही गुर्दा अधिक कपाल और midline (pedicels कम कर रहे हैं) के करीब है.
  4. पेट्री डिश में गुर्दे रखें.
  5. एक नियमित रूप से आकार देने धातु ब्लेड का उपयोग कर छोटे टुकड़ों में गुर्दे ऊतक (आयाम में 1-2 मिमी) में कटौती और चित्रा (1) 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 30-45 मिनट के लिए collagenase समाधान में टुकड़े जगह है.

किडनी पाचन से गुर्दे की कोशिकाओं mononuclear (KMNC) 3. तैयारी

  1. गुर्दे की एक सेल निलंबन प्राप्तयंत्रवत् ऊतक संस्कृति के माध्यम से 25 एमएल में एक झरनी (70 माइक्रोन) और resuspend का उपयोग और मिश्रण ऊतक में बाधा पहुँचा द्वारा पाचन.
  2. सेल निलंबन गोली 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र.
  3. बहुत धीरे धीरे और सावधानी से, 40% Percoll समाधान के 4 एमएल में गोली पुनः निलंबित और धीरे से एक हस्तांतरण प्लास्टिक विंदुक के साथ 80% Percoll समाधान के 4 एमएल पर उपरिशायी. यह स्पष्ट रूप से एक पारदर्शी परत से अलग दो चरणों में होगा और परिणाम. शीर्ष पर लिपिड को इसी एक पीले रंग की परत हो जाएगा.
  4. ब्रेक बंद मोड में अपकेंद्रित्र के साथ कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 1500 XG पर अपकेंद्रित्र.
  5. आकांक्षा से पीला और मोटी ऊपर परत (लगभग 1-2 एमएल) निकालें.
  6. एक हस्तांतरण विंदुक के साथ दो चरणों के इंटरफ़ेस से ही से सफेद और पारदर्शी परत लीजिए. बहुत सावधानी से टिशू कल्चर मध्यम 2 मिलीलीटर युक्त एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में इस निलंबन हस्तांतरण और तब की कुल मात्रा बनाने के लिए माध्यम के 13 मिलीलीटर जोड़ने15 मिलीलीटर.
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र
  8. माध्यम से 1 मिलीलीटर में नमूने Resuspend.
  9. एक hemocytometer पर trypan नीले बहिष्कार का उपयोग KMNC की संख्या की गणना और किडनी प्रति मिलीलीटर प्रति KMNC की संख्या के रूप में परिणाम व्यक्त करते हैं.
  10. एक बार ऊपर के रूप में धो लें.

KMNC से 4. Hematopoietic के अलगाव (CD45 +) कक्ष (चरण मैं)

  1. चल बफर के 90 μl में 10 से 7 कोशिकाओं Resuspend.
  2. CD45 microbeads की 10 μl जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते
  3. प्रतिक्रिया को रोकने के लिए चल रहे बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें. चल बफर के 500 μl में 4 डिग्री सेल्सियस और resuspend पर 10 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र.
  4. चुंबक पर रखकर चुंबकीय स्तंभ को तैयार है और चल बफर के 3 मिलीलीटर के साथ कुल्ला.
  5. चुंबकीय स्तंभ के माध्यम से सेल निलंबन पास और स्तंभ के माध्यम से पारित है कि unlabeled कोशिकाओं को इकट्ठा.
  6. Runn के 3 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं तीन बार धोएंबफर आईएनजी. फिर प्रवाह इकट्ठा.
  7. विभाजक और पिपेट स्तंभों पर चल बफर के 5 मिलीलीटर से स्तंभ निकालें और तुरंत लेबल अंश बाहर निकलवाने. इस अंश CD45 + सेल शामिल हैं. कक्षों की गणना.
  8. गुर्दे में विभिन्न टी कोशिकाओं कैंपेन्स की पूर्ण संख्या की गणना करने के लिए प्रवाह cytometry द्वारा निर्धारित सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत (चित्रा 2) द्वारा KMNC की कुल संख्या गुणा.

नकारात्मक चयन द्वारा CD45 + तैयारी से डी.एन. टी सेल के 5. अलगाव (द्वितीय चरण)

  1. निम्नलिखित biotinylated एंटीबॉडी में से प्रत्येक के 2.5 μl (0.5 मिलीग्राम / एमएल, 1.25 माइक्रोग्राम) जोड़ें: विरोधी सीडी 4, विरोधी सीडी 8, विरोधी एफसी रिसेप्टर (CD16/32), विरोधी MHC वर्ग द्वितीय (आइए ख), विरोधी हर 10 7 hematopoietic कोशिकाओं के लिए CD1d पीबीएस-57 टेट्रामर.
  2. ठंडे कमरे में 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं.
  3. 1 मिलीलीटर विरोधी बायोटिन microbeads जोड़ें.
  4. एक ठंडे कमरे में 30 मिनट के लिए सेते हैं.
  5. टी में ट्यूब प्लेसवह चुंबक और कमी करने के लिए आगे बढ़ें.
  6. एक hemocytometer का उपयोग करके नकारात्मक अंश में डी.एन. टी कोशिकाओं की कुल संख्या का निर्धारण करने के लिए व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना.
  7. पहले गेट CD45 +, दूसरे गेट TCRαβ +: इस gating रणनीति का पालन करके प्रवाह cytometry साथ डी.एन. टी कोशिकाओं की शुद्धता की जाँच करें. CD1d + कोशिकाओं को बाहर निकालें. सीडी 8 + बनाम प्लॉट सीडी 4 + डी.एन. टी कोशिकाओं (चित्रा 3) की पहचान करने के लिए.
  8. पवित्रता में निर्धारित प्रतिशत से कुल संख्या गुणा.
    नोट: अधिक से अधिक 90% शुद्ध डी.एन. टी कोशिकाओं की आबादी में इस प्रोटोकॉल के परिणाम का उपयोग करना.

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Representative Results

जंगली प्रकार C57BL / 6 (बी -6) गुर्दे गुर्दे के अनुसार लगभग 1.5-2.1 x 10 6 कोशिकाओं mononuclear होता है. लगभग कम से कम 10% hematopoietic CD45 + कोशिकाओं हैं. 5% collagenase का उपयोग पाचन द्वारा पीछा चित्र 1 में दिखाया के रूप में गुर्दे की कोशिकाओं mononuclear (KMNC) की तैयारी के लिए, गुर्दे छोटे टुकड़ों में काट रहे हैं.

इस KMNC परत (चित्रा 2, बाएं पैनल) इकट्ठा करने के लिए एक घनत्व ढाल centrifugation प्रदर्शन के बाद है. KMNC तो धारा 4 (कदम मैं) में वर्णित के रूप में CD45 + चुंबकीय microbeads का उपयोग सकारात्मक चयन के अधीन थे. स्तंभ बाध्य कोशिकाओं तो FACS द्वारा eluted और CD45 + के लिए विश्लेषण किया गया. इस फ्लो (चित्रा 2, मध्यम पैनल) द्वारा विश्लेषण के रूप में लगभग 80 से 95% तक CD45 + कोशिकाओं के संवर्धन में यह परिणाम है. समृद्ध hematopoietic CD45 + कोशिकाओं के अलावा, के बारे में 40-60% TCR + (नहीं दिखाया डेटा) αβ था, के बारे में 30-60% डी.एन. टी कोशिकाओं (चित्रा 2, सही पैनल) थे.

सीडी 4 +, सीडी 8 +, MHC वर्ग द्वितीय + और ​​बायोटिन विशिष्ट mAbs और विरोधी बायोटिन microbeads और चुंबकीय स्तंभों का उपयोग CD16/32 + कोशिकाओं लेबल और दूर करने के लिए नकारात्मक चयन करने के लिए समृद्ध CD45 + कोशिकाओं को subjecting शामिल अंतिम चरण. (चित्रा 3) डी.एन. टी कोशिकाओं (90-95%) उच्च शुद्ध में यह नतीजा है. इस प्रोटोकॉल के बाद यह 0.5 x 10 6 hematopoietic CD45 + माउस (दोनों गुर्दे) के अनुसार चुंबकीय लेबल कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए संभव था.

चित्रा 1
चित्रा 1. 5% collagenase समाधान के साथ पाचन के लिए गुर्दे की तैयारी. माउस गुर्दे 1-2 मिमी के छोटे टुकड़ों में काट और खुदाई के लिए 30 मिनट के लिए collagenase डी 5% समाधान में रखा गया हैestion. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
. गुर्दे से CD45 + hematopoietic कोशिकाओं के संवर्धन के लिए चित्रा 2 रणनीति वाम:.. सकारात्मक चयन द्वारा CD45 + किट का उपयोग संवर्धन से पहले गुर्दा बहुराष्ट्रीय कंपनी के CD45 धुंधला केंद्र: सकारात्मक चयन द्वारा CD45 + किट का उपयोग संवर्धन के बाद गुर्दे की बहुराष्ट्रीय कंपनी के CD45 धुंधला हो जाना सही है.: gated CD45 + कोशिकाओं टी कोशिकाओं के विभिन्न सबसेट के बीच αβTCR + कोशिकाओं की सीडी 4 और सीडी 8 प्रोफाइल. इस फाई का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंgure.

चित्रा 3
. अलग डी.एन. टी कोशिकाओं की चित्रा 3 पवित्रता वाम:. नकारात्मक चयन द्वारा पृथक गुर्दे डी.एन. टी कोशिकाओं की CD45 धुंधला केंद्र:.. नकारात्मक चयन द्वारा पृथक गुर्दे डी.एन. टी कोशिकाओं की TCRαβ धुंधला अधिकार: पृथक डी.एन. टी कोशिकाओं के बीच CD4 और CD8 धुंधला द्वारा नकारात्मक चयन. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
शुद्धि से पहले गुर्दा में 4. लिम्फोसाइटों चित्रा. सही:.. गुर्दे ऊतक में CD45 धुंधला शुद्धि से पहले इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

वे इस तरह autoimmune विकार, कैंसर, भ्रष्टाचार सहिष्णुता, और तीव्र गुर्दे चोट (अकी) सहित गुर्दे की प्राथमिक रोगों के रूप में विभिन्न वैकृत शर्तों में फंसाया जा रहा है कर रहे हैं के बाद से डी.एन. टी कोशिकाओं में बढ़ती रुचि है, 8, 13 स्तवकवृक्कशोथ. इसलिए, बेहतर डी.एन. टी कोशिकाओं की pathophysiologic कार्यों को समझने और करने के लिए चिह्नित की आवश्यकता है. हालांकि, वर्तमान में CD4 और CD8 टी कोशिकाओं की तुलना में इन कोशिकाओं को 'समारोह की समझ में कमी है. एक प्रमुख कारण माध्यमिक lymphoid अंगों में डी.एन. टी कोशिकाओं की कमी है और इसलिए इन विट्रो विश्लेषण और दत्तक हस्तांतरण प्रयोगों के लिए पर्याप्त कोशिकाओं को प्राप्त करने में कठिनाई है. डी.एन. टी कोशिकाओं मुख्य रूप से इस तरह के गुर्दे 8 के रूप में गैर lymphoid ऊतकों में स्थित हैं, लेकिन ठोस अंग से उनके अलगाव के लिए विश्वसनीय तरीकों की कमी उनके कार्य की जांच करने के लिए प्रयास बाधा है. इसलिए, डी.एन. टी सेल के अलगाव के लिए हमारे उपन्यास प्रोटोकॉलगुर्दे से एस डी एन टी कोशिकाओं के समारोह में अनुसंधान में तेजी लाने की उम्मीद है. डी.एन. टी कोशिकाओं फैस कमी (LPR) या FasL कमी (GLD) चूहों में बड़ी संख्या में लिम्फ नोड्स में जमा है और वे आसानी से lymphoid अंगों 9, 14, 15 से अलग किया जा सकता है, लेकिन यह अभी भी एक दूसरे से इन कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक चुनौती बनी हुई है ऊतकों.

इस प्रोटोकॉल के अनुसार, दो चूहों से गुर्दे लगभग 0.5 x 10 6 hematopoietic कोशिकाओं (CD45 +) और चारों ओर 0.2 x 10 6 डी.एन. टी कोशिकाओं उपज. यह संख्या इन विट्रो संस्कृति, कार्यात्मक assays और / या FACS विश्लेषण में प्रदर्शन करने के लिए पर्याप्त है. डी.एन. टी सेल की आबादी की शुद्धता फ्लो द्वारा पुष्टि की जानी चाहिए. इस प्रोटोकॉल 98% के रूप में शुद्ध किया जा सकता है कि डी.एन. टी कोशिकाओं की आबादी प्रदान करता है. इस प्रोटोकॉल गुर्दे से डी.एन. टी कोशिकाओं के अलगाव के लिए बनाया गया है, जबकि यह अन्य गैर lymphoid अंगों से टी कोशिकाओं के अलगाव के लिए संशोधित किया जा सकता है इस तरह के दिल के रूप में, थायराइड आदि

डी.एन. टी कोशिकाओं एक छोटी सी आबादी का प्रतिनिधित्व करते हैं, यह शोधन की अतिरिक्त राउंड प्रदर्शन से उपज में वृद्धि करने के लिए कभी कभी आवश्यक है. डी.एन. टी कोशिकाओं के एक उच्च संख्या (अधिक से अधिक 0.5 x 10 6 कोशिकाओं) की आवश्यकता है लेकिन अगर हम समय और अभिकर्मक लागत को कम करने के क्रम में जुदाई छँटाई प्रदर्शन सलाह देते हैं.

संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल गुर्दे से डी.एन. टी कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक उपन्यास विधि का वर्णन करता है. यह सकारात्मक चयन और फिर गैर वांछित सेल आबादी की कमी के लिए नकारात्मक चयन के बाद कदम (पाचन और KMNC के संवर्धन के माध्यम से) एक तैयारी से बना है. इसलिए, अलगाव की प्रक्रिया के दौरान डी एन टी कोशिकाओं की न्यूनतम प्रत्यक्ष हेरफेर है. यह चूहों और इंसानों में परिधीय रक्त से और पारंपरिक टी कोशिकाओं के अलगाव के लिए इस्तेमाल किया उन लोगों के लिए इसी तरह माध्यमिक lymphoid अंगों, से डी.एन. टी कोशिकाओं के अलगाव के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल है कि वहाँ उल्लेखनीय है.

ove_content "> यह कुछ डी.एन. टी कोशिकाओं FCR-γ व्यक्त दिखाया गया है कि क्योंकि, एक वैकल्पिक विकल्प कॉकटेल 16, 17 में CD16/32 + शामिल करने के लिए नहीं है. डी.एन. टी कोशिकाओं के सफल अलगाव विस्तार करने के लिए महान ध्यान की आवश्यकता है. विशेष रूप से महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं: ऊतक पाचन, छोटे टुकड़ों में गुर्दे ऊतक के काटने, और सही ढंग से पहचान करने और घनत्व ढाल में प्रकाश परत एकत्रित कुल मिलाकर, अभ्यास और कुछ मैनुअल निपुणता के कई दौर के वांछित परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं..

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgements

इस काम एनआईएच पीबीएस (R21 AI095484) द्वारा समर्थित है. हम CD1d टेट्रामर के लिए NHI टेट्रामर कोर सुविधा धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Laminar flow hood  Baker Company, Inc Or equivalent equipment 
Centrifuge Beckman Coulter Or equivalent equipment 
Hemocytometer Electron Microscopy Sciences 63514-11
Atmosphere-controlled incubator Fisher Scientific  (37 °C with 5% CO2)
Analytical flow cytometer LSR II
RPMI 1640 Media Tech 10-040-CV
Collagenase D Roche 11088858001
Percoll  GE Healthcare 17-0891-01
Fetal bovine serum  Corning Cellgro 35-011-CV
0.1% sodium azide (NaN3) Sigma-Aldrich S2002
Buffer phosphate buffered saline (PBS) Corning Cellgro 21-040-CV
PBS 10x Mediatech 46-013-CM
EDTA buffer  Sigma-Aldrich E1161
LS columns  MiltenyiBiotec 130-042-401
CD45+ microbeads MiltenyiBiotec 6.78E-51
Biotin microbeads  MiltenyiBiotec 130-090-485
anti-CD45 (clone: 30-F11)  PerCP  eBioscience G1397
anti-CD45 (clone: 30-F11)  APC-Cy7 Biolegend 103116
anti-TCR Pacific Blue  (ab-chain, clone: H57-597) Invitrogen HM3628
anti-CD4 PE eBioscience 12-0043
anti-CD8 FITC eBioscience 8011-0087
anti-CD4 biotinylated (GK1.5) BD 553728
anti-CD8 biotinylated  (clone 53-6.7) BD 553029
anti-MHC class II (I-A b) biotinylated BD 553609
AutoMACS Running Buffer - MACS Separation Buffer  MIlteny I Biotec 130-091-221
C57BL/6J mice Jackson Labs 000664 Kidneys - Lymph Nodes
Petri dish  BD Biosciences 356517
70 μm filter  Fisher Scientific 22363548
Plunger  Or equivalent equipment 
GeneMate Tubes 50 ml Bioexpress C-3394-3 Or equivalent equipment 
GeneMate Tubes 15 ml Bioexpress C-3394-1 Or equivalent equipment 
CD1d α-galcer tetramer NHI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney
Posted by JoVE Editors on 02/10/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney.

There was an error with an author's name. The author's given name had a typo, this was corrected to:

Samatha Bandapelle

instead of:

Samantha Bandapelle

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