Выделение Double Negative αβ Т-клеток из почек

1Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

ERRATUM NOTICE

Summary

DNabT клетки редки среди периферийных Т-клеток; однако, они широко распространены в определенных нелимфоидных тканей. Сложность выделения DN Т-клеток от не-лимфоидной ткани препятствует их функционального анализа, несмотря на рост признал патофизиологического значение. Мы опишем протокол нового для изоляции высокоочищенных DN Т-клеток из мышиных почки.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Martina, M. N., Bandapalle, S., Rabb, H., Hamad, A. R. Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney. J. Vis. Exp. (87), e51192, doi:10.3791/51192 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Там в настоящее время нет стандартный протокол для выделения DN Т-клеток от не-лимфоидных тканях, несмотря на их более сообщил участия в различных иммунных реакций. DN Т-клетки являются уникальной иммунной тип клеток, который был вовлечен в регуляции иммунных и аутоиммунных реакций и толерантность к аллотрансплантаты 1-6. DN Т-клетки, однако, редко встречается в периферической крови и вторичных лимфоидных органах (селезенке и лимфатических узлах), но являются основными жители здоровую почку. Очень мало известно об их патофизиологической функции 7 из-за их малочисленности на периферии. Мы недавно описал комплексную фенотипическую и функциональный анализ этой группы населения в почках 8 в стационарном состоянии и во время ишемии реперфузионного повреждения. Анализ функции DN Т-клеток будет значительно повышена путем разработки протокола для их изоляции от почки.

Здесь мы описываем новый протокол, позволяющий isolatioн высокочистых AB CD4 + CD8 + Т-клеток и DN Т-клеток от мышей почки. Вкратце, мы переварить ткань почки с помощью коллагеназы и изолировать почек одноядерные клетки (KMNC) по градиенту плотности. Далее следуют два этапа по обогащению гемопоэтических Т-клетки с 3% до 70% от KMNC. Первый шаг состоит из позитивной селекции кроветворных клеток с использованием CD45 + набор для выделения. На втором этапе, DN Т-клетки негативно выдел ют путем удалени не-желательных клеток с использованием CD4, CD8 и МНС класса II моноклональные антитела и CD1d α-GalCer тетрамер. Эта стратегия приводит к населением более 90% чистых DN Т-клеток. Поверхность окрашивание указанных выше антител с последующим анализом FACS используется для подтверждения чистоты.

Introduction

Периферийное αβTCR + CD3 + CD4 - CD8 - дважды отрицательный (DN) Т-клетки делятся на различные подмножества, которые обладают различные фенотипы и функции 1-4. DN Т-клетки плохо изучены, но все чаще участвуют в патофизиологических иммунных реакций в различных моделях болезни 4-6.

DN Т-клетки представляют собой уникальный тип клеток иммунной что все чаще участвует в регуляции различных иммунных и аутоиммунных реакций и модуляции аллотрансплантата толерантности. 4-6, 9 Они редки в периферической крови и вторичных лимфоидных органах (селезенке и лимфатических узлах ). Тем не менее, они являются основными жителями нормальной почек и кишечника эпителия 10-12. Очень мало известно об их функции 7 в почках в стационарном состоянии и при патологических состояниях, таких как острого повреждения почек (AKI), связанные с почечной Transplмуравей.

Из-за сложных ролей различных иммунных клеток в регуляции иммунных реакций, включая alloresponses, определение роли каждого игрока имеет решающее значение в понимании alloresponses и разработке новых терапевтических средств. Учитывая значительное число DN Т-клеток, присутствующих в почках под физиологических и различных болезненных состояний, Д. Н. Т-клетки, вероятно, играют важную роль в регуляции иммунных и аутоиммунных реакций у мышей и людей, и alloresponses в реципиентов. Накопление хотя все еще рассеянного доказательств подразумевает DN Т-клеток в обоих патогенных и иммуносупрессивных функций, но он плохо понимал, почему и как они проявляют определенную вредных или подавляющий функцию и, как окружающая среда влияет на них.

Из-за их низкой численности в почках, улучшенные методы выделения необходимы.

Там в настоящее время нет стандартный протокол для изоляции Ду Т-клеток из тон не-лимфоидных тканей. Наш протокол описывает новый способ для выделения DN Т-клеток из почки; Однако способ также может быть использован для различных нелимфоидных тканей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка инструментов, питательных сред и реактивов

  1. Инструменты: Подготовка реагентов в стерильных условиях и использовать под ламинаре.
  2. Подготовка 1 л RPMI тканевой культуральной среде, добавляют 5% фетальной бычьей сыворотки, 2,1 г бикарбоната, 10 мл глутамат 100x 10 мг HEPES, 1 мг пирувата натри и 10 мл 100x пенициллина / стрептомицина.
    Примечание: рекомендуется для культуры ткани средняя, ​​RPMI, взаимозаменяем с DMEM.
  3. Подготовка 5% раствором коллагеназы "D" (5 мл коллагеназы "D" в 9 мл тканевой культуральной среде).
  4. Сделать решение Перколла на трех различных концентрациях: 100%, 80% и 40%. Следующие концентрации рассчитаны на 1 выборку. Держите решения при комнатной температуре.
    1. Перколла решение: добавить 9 мл неразбавленного Перколла (от маточного раствора); добавить 1 мл PBS в 10 раз.
    2. Перколла решение: добавить 8 мл Перколла 100%; добавить 2 мл PBS 1x.
    3. Перколла решение:добавить 4 мл Перколла 80%; добавить 4 мл PBS 1X.
  5. Сделать 1 л флуоресценции активированных сортировки клеток (FACS) буфер; добавить 5 мл 10% BSA (0,1% BSA), 1 мл 10% азида натрия (0,1%), 2 мл ЭДТА агента, сделать до 1000 мл с 1x PBS.

2. Подготовка почек пищеварения

  1. Получив всю необходимую институциональную одобрение, жертвовать и обескровить мышей с использованием стандартных методов и следуя действующих правил и руководящих принципов по уходу за животными.
    1. Обезболить мышь с фенобарбиталом (0,07 мг / кг).
    2. Перейдите к обескровливания.
    3. Наведите в положении лежа на спине на хирургическом столе.
    4. Спрей области живота с 70% этанола.
  2. Добавьте 10 мл коллагеназы D раствора к чашке Петри.
  3. Снимите и decapsulate обе почки у каждой мыши.
    1. Откройте полость abdomimal, сделав срединный разрез через кожу живота и брюшины от грудины долобок.
    2. Проэкспонируйте левую почку, перемещая кишку в поперечном направлении в сторону.
    3. Аккуратно отделите левую капсулу с пинцетом.
      Примечание: Капсула выглядит как прозрачный слой, окружающий почку и частично покрываются за счет околопочечной жировой ткани.
    4. Снимите левую почку за счет сокращения ножки сосудов с использованием хирургического ножницы.
    5. Повторите ту же процедуру для правой почки.
      Примечание: Правая почка больше черепной и ближе к средней линии (стебельков короче).
  4. Поместите почку в чашке Петри.
  5. Разрежьте ткань почки на мелкие кусочки (1-2 мм в размерности) с помощью обычного ножа для обработки металла и поместить части в коллагеназы решение в течение 30-45 мин в инкубаторе при температуре 37 ° С (рис. 1).

3. Подготовка почек мононуклеарных клеток (KMNC) из почек пищеварения

  1. Получение суспензии клеток почкипищеварение путем механического разрушения ткани с использованием сетчатый фильтр (70 мкм) и ресуспендируют в 25 мл тканевой культуральной среде и перемешать.
  2. Центрифуга при 400 х г в течение 10 мин при 4 ° С для осаждения суспензии клеток.
  3. Повторное приостановить осадок в 4 мл 40% раствора перколла и осторожно наложить на 4 мл 80%-ного раствора перколла с передачей пластиковой пипетки, очень медленно и осторожно. Это приведет в два этапа четко разделенных полупрозрачного слоя. На вершине будет желтый слой, соответствующий липидов.
  4. Центрифуга при 1500 мкг в течение 30 мин при комнатной температуре с центрифуги в тормоза отключена.
  5. Удалить стремлением желтый и толстый верхний слой (около 1-2 мл).
  6. Соберите только небольшое беловатый полупрозрачный слой с поверхности раздела двух фаз с пипетки. Очень осторожно перенести этот суспензии в 15 мл коническую пробирку, содержащую 2 мл культуральной среде, а затем добавить 13 мл среды, чтобы сделать общий объем15 мл.
  7. Центрифуга при 400 мкг в течение 10 мин при 4 ° С.
  8. Ресуспендируют образцы в 1 мл среды.
  9. Подсчитайте количество KMNC использованием трипанового синего на гемоцитометре и выразить результаты в виде чисел KMNC в мл на почки.
  10. Промыть раз, как описано выше.

4. Выделение гемопоэтических (CD45 +) Клетки из KMNC (Этап I)

  1. Ресуспендируют клеток до 10 7 в 90 мкл рабочего буфера.
  2. Добавить 10 мкл CD45 микрошариков и инкубировать в течение 15 мин при 4 ° С.
  3. Добавить 1 мл подвижного буфера для остановки реакции. Центрифуга при 400 х г в течение 10 мин при 4 ° С и ресуспендируют в 500 мкл рабочего буфера.
  4. Подготовка магнитную колонку, поместив в магните и промыть 3 мл рабочего буфера.
  5. Pass клеточной суспензии через магнитное колонку и собирают немеченого клетки, которые проходят через колонку.
  6. Промыть клетки три раза 3 мл РуннING буфер. Тогда собрать стоки.
  7. Удалите столбец из сепаратора и пипеткой 5 мл рабочего буфера на колонках и немедленно промыть меченого фракции. Эта фракция содержит CD45 + клеток. Граф клеток.
  8. Чтобы вычислить абсолютное количество различных Т-клетки подмножеств в почках умножить общее количество KMNC на процент положительных клеток, определенной с помощью проточной цитометрии (рис. 2).

5. Выделение DN Т-клеток из CD45 + Подготовка по негативной селекции (II этап)

  1. Добавить 2,5 мкл (0,5 мг / мл, 1,25 мкг) каждой из следующих биотинилированных антител: анти-CD4, анти-CD8, анти-Fc рецептор (CD16/32), анти-МНС класса II (IA б), анти- CD1d PBS-57 тетрамером на каждые 10 7 кроветворных клеток.
  2. Инкубируйте клетки в течение 30 мин в холодном помещении.
  3. Добавить 1 мл анти-биотин микрошарики.
  4. Выдержите в течение 30 мин в холодной комнате.
  5. Поместите пробирку в тон магнит и перейти к истощению.
  6. Подсчет жизнеспособных клеток, чтобы определить общее количество Т-клеток DN в отрицательном фракции с помощью гемоцитометра.
  7. Проверьте чистоту DN Т-клеток с проточной цитометрии следуя литниковой стратегии: первые ворота CD45 +, вторые ворота TCRαβ +. Исключить CD1d + клеток. Участок CD4 + по сравнению с CD8 +, чтобы определить DN Т-клетки (рис. 3).
  8. Умножьте общее количество на процент определяется в чистоте.
    Примечание: С помощью этой результатов протокола в популяции более 90% чистых DN Т-клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Дикого типа C57BL / 6 (В6) почки содержит около 1,5-2,1 х 10 6 мононуклеаров на почки. Примерно менее 10% являются гемопоэтические клетки CD45 +. Для приготовления почек мононуклеарных клеток (KMNC), почки разрезают на маленькие кусочки, как показано на рисунке 1 с последующим расщеплением с использованием 5% коллагеназы.

За этим следует выполнения центрифугирования в градиенте плотности для сбора KMNC слой (рис. 2, слева). KMNC затем подвергались позитивной селекции с использованием CD45 + магнитные микрошарики, как описано в разделе 4 (ШАГ I). Колонка связан Клетки затем элюируют и анализируют на CD45 + по FACS. Это приводит к обогащению CD45 + клеток до примерно 80 до 95% по анализировали проточной цитометрией (рис. 2, средняя панель). Среди обогащенных гемопоэтических клеток CD45 +, около 40-60% было αβ TCR + (данные не показаны), приблизительно 30-60% были DN Т-клетки (рис. 2, справа).

Последним шагом участие подвергая обогащенные CD45 + клеток в негативной селекции маркировать и удалять CD4 +, CD8 +, МНС класса II + и CD16/32 + клеток с использованием биотин специфические моноклональные антитела и анти-биотин микрошарики и магнитные колонки. Этот результат в высокой степени очистки (90-95%) DN Т-клетки (рис. 3). После этого протокола можно было получить до 0,5 х 10 6 CD45 + гемопоэтических магнитно меченых клеток на мышь (две почки).

Рисунок 1
Рисунок 1. Получение почки для переваривания 5% раствором коллагеназы. Почки мыши разрезают на небольшие кусочки 1-2 мм и помещают в коллагеназы D 5% раствора в течение 30 мин для роютestion. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2
. Рисунок 2 Стратегия обогащения CD45 + гемопоэтических клеток из почки. Слева:. CD45 окрашивание почек MNC до обогащения с использованием CD45 + комплект на позитивной селекции центр: CD45 окрашивание почек MNC после обогащения с использованием CD45 + комплект на позитивной селекции правой.: CD4 и CD8 профиль αβTCR + клеток среди закрытых CD45 + клеток различные подмножества Т-клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фиGure.

Рисунок 3
Рисунок 3. Чистота изолированных DN Т-клеток. Слева: CD45 окрашивание изолированной почки DN Т-клеток негативной селекции Центр:.. TCRαβ окрашивание изолированной почки DN Т-клеток негативной селекции Справа: CD4 и CD8 окрашивание среди изолированных DN Т-клеток негативный отбор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. Лимфоциты в почках до очистки. Справа:.. CD45 окрашивание в почечной ткани перед очисткой Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Существует растущий интерес к DN Т-клеток, так как они в настоящее время участвуют в различных патологических состояний, таких как аутоиммунные расстройства, рак, терпимости трансплантата и первичных заболеваний почек, включая острого повреждения почек (AKI), гломерулонефрит 8, 13. Таким образом, существует необходимость, чтобы лучше понять и охарактеризовать патофизиологических функций DN Т-клеток. Тем не менее, в настоящее время существует недостаток в понимании функции этих клеток по сравнению с CD4 и CD8 Т-клеток. Основной причиной этого является нехватка DN Т-клеток в вторичных лимфоидных органах и, следовательно, трудности в получении достаточных клеток для анализа в пробирке и приемных экспериментов по передаче. DN Т-клетки преимущественно в нелимфоидных тканей, таких как почки 8, но отсутствие надежных методов их изоляции от твердого органа противодействия усилия для расследования их функции. Таким образом, наш протокол роман для изоляции Ду Т-клетокс из почки, как ожидается, ускорить исследования в зависимости от DN Т-клеток. DN Т-клетки накапливаются в лимфатических узлах в больших количествах в Fas дефицитом (LPR) или FasL дефицитом (ООВ) мышей и они могут быть легко выделены из лимфоидных органов 9, 14, 15, но это по-прежнему остается проблемой, чтобы изолировать эти клетки от друга тканей.

В соответствии с этим протоколом, почки от двух мышей получается примерно 0,5 х 10 6 кроветворных клеток (CD45 +) и около 0,2 х 10 6 DN Т-клеток. Это число достаточно выполнить в пробирке культуры, функциональных анализах и / или анализа FACS. Чистоту клеточной популяции Т DN должен быть подтвержден с помощью проточной цитометрии. Этот протокол обеспечивает население DN Т-клеток, которые могут быть как чисто как 98%. Хотя этот протокол предназначен для изоляции DN Т-клеток из почки, он может быть модифицирован для выделения Т-клеток из других не-лимфоидных органах, таких как сердце, щитовидная железа и т.д.

С DN Т-клетки представляют собой небольшое население, иногда бывает необходимо для повышения урожайности, выполняя дополнительные раунды очистки. Однако, если большее число DN Т-клеток требуется (выше, чем 0,5 х 10 6 клеток) мы рекомендуем выполнять сортировку разделение в целях сокращения времени и стоимости реагентов.

Таким образом, этот протокол описывает новый способ выделения DN Т-клеток из почки. Он состоит из препарата (через пищеварение и обогащение KMNC) стадию с последующей позитивной селекции, а затем отрицательного отбора истощение не-желаемых клеточных популяций. Таким образом, существует минимальный прямой манипуляции DN Т-клеток в процессе выделения. Следует отметить, что существующие протоколы для изоляции DN Т-клеток из периферической крови у мышей и человека и из вторичных лимфоидных органах, подобных тем, которые используются для изоляции обычных Т-клеток.

ove_content "> Потому что, как было показано, что некоторые DN Т-клетки выразить FCR-γ, альтернативным вариантом является не включать CD16/32 + в коктейле 16, 17. Успешная изоляция Ду Т-клеток требует большого внимания к деталям. Особенно важно шаги включают в себя: ткани пищеварение, резку почечной ткани на мелкие кусочки, и правильно выявление и сбор легкий слой в градиенту плотности целом, несколько раундов практике и некоторые ловкость рук необходимы для достижения желаемого результата..

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgements

Эта работа поддерживается NIH PBS (R21 AI095484). Мы благодарим NHI тетрамерное основной объект для CD1d тетрамере.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Laminar flow hood  Baker Company, Inc Or equivalent equipment 
Centrifuge Beckman Coulter Or equivalent equipment 
Hemocytometer Electron Microscopy Sciences 63514-11
Atmosphere-controlled incubator Fisher Scientific  (37 °C with 5% CO2)
Analytical flow cytometer LSR II
RPMI 1640 Media Tech 10-040-CV
Collagenase D Roche 11088858001
Percoll  GE Healthcare 17-0891-01
Fetal bovine serum  Corning Cellgro 35-011-CV
0.1% sodium azide (NaN3) Sigma-Aldrich S2002
Buffer phosphate buffered saline (PBS) Corning Cellgro 21-040-CV
PBS 10x Mediatech 46-013-CM
EDTA buffer  Sigma-Aldrich E1161
LS columns  MiltenyiBiotec 130-042-401
CD45+ microbeads MiltenyiBiotec 6.78E-51
Biotin microbeads  MiltenyiBiotec 130-090-485
anti-CD45 (clone: 30-F11)  PerCP  eBioscience G1397
anti-CD45 (clone: 30-F11)  APC-Cy7 Biolegend 103116
anti-TCR Pacific Blue  (ab-chain, clone: H57-597) Invitrogen HM3628
anti-CD4 PE eBioscience 12-0043
anti-CD8 FITC eBioscience 8011-0087
anti-CD4 biotinylated (GK1.5) BD 553728
anti-CD8 biotinylated  (clone 53-6.7) BD 553029
anti-MHC class II (I-A b) biotinylated BD 553609
AutoMACS Running Buffer - MACS Separation Buffer  MIlteny I Biotec 130-091-221
C57BL/6J mice Jackson Labs 000664 Kidneys - Lymph Nodes
Petri dish  BD Biosciences 356517
70 μm filter  Fisher Scientific 22363548
Plunger  Or equivalent equipment 
GeneMate Tubes 50 ml Bioexpress C-3394-3 Or equivalent equipment 
GeneMate Tubes 15 ml Bioexpress C-3394-1 Or equivalent equipment 
CD1d α-galcer tetramer NHI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, Z. X., Yang, L., Young, K. J., DuTemple, B., Zhang, L. Identification of a previously unknown antigen-specific regulatory T cell and its mechanism of suppression. Nat Med. 6, 782-789 (2000).
  2. Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, Z., Ohashi, P. S., Zhang, L. The immune regulatory function of lymphoproliferative double negative T cells in vitro and in vivo. J Exp Med. 196, 261-267 (2002).
  3. Ford McIntyre, M. S., Young, K. J., Gao, J., Joe, B., Zhang, L. Cutting edge: in vivo trogocytosis as a mechanism of double negative regulatory T cell-mediated antigen-specific suppression. J Immunol. 181, 2271-2275 (2008).
  4. Young, K. J., Yang, L., Phillips, M. J., Zhang, L. Donor-lymphocyte infusion induces transplantation tolerance by activating systemic and graft-infiltrating double-negative regulatory T cells. Blood. 100, 3408-3414 (2002).
  5. Chen, W., Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, L. Infusion of in vitro-generated DN T regulatory cells induces permanent cardiac allograft survival in mice. Transplant Proc. 35, 2479-2480 (2003).
  6. Young, K. J., DuTemple, B., Phillips, M. J., Zhang, L. Inhibition of graft-versus-host disease by double-negative regulatory T cells. J Immunol. 171, 134-141 (2003).
  7. Mohamood, A. S., et al. Gld mutation of Fas ligand increases the frequency and up-regulates cell survival genes in CD25+CD4+ TR cells. Int Immunol. 18, 1265-1277 (2006).
  8. Ascon, D. B., et al. Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire. J Leukoc Biol. 84, 1400-1409 (2008).
  9. Hamad, A. R., et al. B220+ double-negative T cells suppress polyclonal T cell activation by a Fas-independent mechanism that involves inhibition of IL-2 production. J Immunol. 171, 2421-2426 (2003).
  10. Rabb, H., et al. Pathophysiological role of T lymphocytes in renal ischemia-reperfusion injury in mice. Am J Physiol-Renal. 279, 525-531 (2000).
  11. Burne, M. J., et al. Identification of the CD4(+) T cell as a major pathogenic factor in ischemic acute renal failure. J Clin Invest. 108, 1283-1290 (2001).
  12. Yokota, N., Daniels, F., Crosson, J., Rabb, H. Protective effect of T cell depletion in murine renal ischemia-reperfusion injury. Transplantation. 74, 759-763 (2002).
  13. Crispin, J. C., et al. Expanded double negative T cells in patients with systemic lupus erythematosus produce IL-17 and infiltrate the kidneys. J Immunol. 181, 8761-8766 (2008).
  14. Igarashi, S., Takiguchi, M., Kariyone, A., Kano, K. Phenotypic and functional analyses on T-cell subsets in lymph nodes of MRL/Mp-lpr/lpr mice. Int Arch Allergy Appl Immunol. 86, 249-255 (1988).
  15. Dowdell, K. C., et al. Somatic FAS mutations are common in patients with genetically undefined autoimmune lymphoproliferative syndrome. Blood. 115, 5164-5169 (2010).
  16. Juvet, S. C., et al. FcRgamma promotes T cell apoptosis in Fas-deficient mice. J Autoimmun. 42, 80-93 (2013).
  17. Thomson, C. W., et al. FcR gamma presence in TCR complex of double-negative T cells is critical for their regulatory function. J Immunol. 177, 2250-2257 (2006).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney
Posted by JoVE Editors on 02/10/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney.

There was an error with an author's name. The author's given name had a typo, this was corrected to:

Samatha Bandapelle

instead of:

Samantha Bandapelle

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics