Isolamento di Double Negative Cellule T αβ dal rene

1Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine
Immunology and Infection

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ERRATUM NOTICE

Summary

Cellule DNabT sono rari tra cellule T periferiche; tuttavia, sono abbondanti in alcuni tessuti non linfoidi. Difficoltà di isolare le cellule T DN dal tessuto linfoide non ostacola la loro analisi funzionale, nonostante l'aumento riconosciuto significato fisiopatologico. Descriviamo un nuovo protocollo per l'isolamento di cellule altamente purificate DN T di rene murino.

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Martina, M. N., Bandapalle, S., Rabb, H., Hamad, A. R. Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney. J. Vis. Exp. (87), e51192, doi:10.3791/51192 (2014).

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Abstract

Attualmente non esiste un protocollo standard per l'isolamento delle cellule T DN dai tessuti non linfoidi nonostante il loro coinvolgimento sempre segnalato in varie risposte immunitarie. Cellule DN T sono un tipo di cellula immunitaria unico che è stato implicato nella regolazione delle risposte immunitarie e la tolleranza e autoimmuni di allotrapianto 1-6. Cellule DN T sono, tuttavia, rare nel sangue periferico e negli organi linfoidi secondari (milza e linfonodi), ma sono i principali abitanti del rene normale. Molto poco si sa circa la loro funzione fisiopatologico 7 a causa della loro scarsità in periferia. Abbiamo recentemente descritto una vasta analisi fenotipica e funzionale di questa popolazione nel rene 8 in stato stazionario e durante ischemia riperfusione. Analisi della funzione delle cellule T DN sarà notevolmente migliorata con lo sviluppo di un protocollo per il loro isolamento dal rene.

Qui, descriviamo un nuovo protocollo che consente isolation di CD8 + cellule altamente puri ab CD4 + T e le cellule T DN dal rene murino. In breve, abbiamo digerire tessuto renale con collagenasi e isolare le cellule mononucleate del rene (KMNC) dal gradiente di densità. Questo è seguito da due passaggi per arricchire cellule T ematopoietiche dal 3% al 70% dal KMNC. La prima fase consiste in una selezione positiva di cellule ematopoietiche CD45 + utilizzando un kit di isolamento. Nella seconda fase, le cellule T sono DN negativamente isolati mediante rimozione delle cellule non desiderati utilizzando CD4, CD8, e MHC di classe II anticorpi monoclonali e CD1d α-GalCer tetramero. Questa strategia porta ad una popolazione di cellule pure oltre il 90% DN T. Colorazione della superficie con gli anticorpi suddetti seguita mediante analisi FACS è utilizzato per confermare la purezza.

Introduction

Periferico αβTCR + CD3 + CD4 - CD8 - doppio negativo cellule (DN) T sono suddivisi in vari sottogruppi che possiedono fenotipi e funzioni 1-4 distinte. Cellule DN T sono poco conosciuti, ma sempre più spesso coinvolti nelle risposte immunitarie fisiopatologiche in differenti modelli di malattia 4-6.

Cellule DN T sono un tipo di cellula immunitaria unico che è sempre più coinvolto nella regolazione delle varie risposte immunitarie e autoimmuni e la modulazione della tolleranza allotrapianto. 4-6, 9 sono rari nel sangue periferico e negli organi linfoidi secondari (milza e dei linfonodi ). Tuttavia, essi sono i principali abitanti della normale rene e intestino epitelio 10-12. Molto poco si sa circa la loro funzione 7 del rene in stato stazionario e in condizioni patologiche come danno renale acuto (AKI) associata a Transpl reneant.

A causa dei ruoli intricati di diverse cellule immunitarie nel regolare le risposte immunitarie, tra cui alloresponses, la definizione del ruolo di ogni giocatore è fondamentale per comprendere alloresponses e la progettazione di nuove terapie. Dato numero significativo di cellule DN T presenti nel rene in condizioni fisiologiche e diverse malattie, le cellule T DN sono suscettibili di svolgere un ruolo critico nel regolare le risposte immunitarie e autoimmuni nei topi e nell'uomo, e alloresponses nei pazienti trapiantati. Accumulare se prova ancora sparse implica cellule DN T in entrambe le funzioni patogeni e immunosoppressori, ma è poco conosciuta perché e come mostrano una funzione dannoso o soppressiva specifico e come l'ambiente li influenza.

A causa della loro bassa abbondanza nel rene, sono necessari metodi migliorati di isolamento.

Attualmente non esiste un protocollo standard per l'isolamento di cellule T DN da tegli tessuti non linfoidi. Il nostro protocollo descrive un nuovo metodo per l'isolamento di cellule T DN dal rene; Tuttavia, il metodo può essere utilizzata anche per vari tessuti non linfoidi.

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Protocol

1. Preparazione degli strumenti, Cultura Media e reagenti

  1. Strumenti: Preparare i reagenti in condizioni sterili e utilizzare sotto una cappa a flusso laminare.
  2. Preparare 1 L di terreno di coltura RPMI, aggiungere 5% di siero fetale bovino, 2,1 g di bicarbonato, 10 ml glutammato 100x, 10 mg di HEPES, 1 mg di piruvato di sodio e 10 ml di 100x penicillina / streptomicina.
    Nota: il terreno di coltura tissutale raccomandata, RPMI, è intercambiabile con DMEM.
  3. Preparare soluzione al 5% di collagenasi "D" (5 ml di collagenasi "D" a 9 ml di terreno di coltura tissutale).
  4. Preparare la soluzione di Percoll a tre diverse concentrazioni: 100%, 80% e 40%. I seguenti concentrazioni sono calcolati per 1 campione. Mantenere le soluzioni a temperatura ambiente.
    1. Soluzione Percoll: aggiungere 9 ml di diluito Percoll (da soluzione stock); aggiungere 1 ml di PBS 10x.
    2. Soluzione Percoll: aggiungere 8 ml di Percoll 100%; aggiungere 2 ml di PBS 1x.
    3. Soluzione Percoll:aggiungere 4 ml di Percoll 80%; aggiungere 4 ml di PBS 1x.
  5. Fare 1 L di cella fluorescenza-attivato (FACS) tampone; aggiungere 5 ml di 10% di BSA (0,1% BSA), sodio azide 1 ml 10% (0,1%), 2 agente ml EDTA, portare a 1000 ml con PBS 1x.

2. Preparazione del rene Digestione

  1. Avendo acquisito alcuna approvazione istituzionale necessario, sacrificare e exsanguinate i topi con metodi standard e seguendo le normative vigenti e le linee guida per la cura degli animali.
    1. Anestetizzare il mouse con pentobarbital (0,07 mg / kg).
    2. Procedere al dissanguamento.
    3. Posizionare il mouse in posizione supina su un tavolo operatorio.
    4. Spruzzare la zona addominale con etanolo al 70%.
  2. Aggiungere 10 ml di soluzione D collagenasi al piatto di Petri.
  3. Rimuovere e decapsulate entrambi i reni da ogni mouse.
    1. Aprire la cavità abdomimal facendo un'incisione mediana attraverso la pelle addominale e del peritoneo dallo sternoil pube.
    2. Esporre il rene sinistro spostando l'intestino lateralmente al lato.
    3. Separare con cautela la capsula sinistra con le pinze.
      Nota: La capsula appare come uno strato trasparente che circonda il rene e parzialmente coperta da tessuto adiposo perirenale.
    4. Rimuovere il rene sinistro tagliando le navi peduncolo con una forbice chirurgica.
    5. Ripetere la stessa procedura per il rene destro.
      Nota: Il rene destro è più craniale e più vicino alla linea mediana (pedicelli sono più corti).
  4. Posizionare il rene nel piatto di Petri.
  5. Tagliare il tessuto renale in piccoli pezzi (1-2 mm di dimensione) utilizzando una normale lama formatura dei metalli e disporre i pezzi nella soluzione di collagenasi per 30-45 min in incubatore a 37 ° C (Figura 1).

3. Preparazione di cellule mononucleate del rene (KMNC) dalla digestione rene

  1. Ottenere una sospensione di cellule di renedigestione interrompendo meccanicamente il tessuto utilizzando un filtro (70 micron) e risospendere in 25 ml di terreno di coltura tissutale e mescolare.
  2. Centrifugare a 400 xg per 10 min a 4 ° C per sedimentare la sospensione cellulare.
  3. Risospendere il pellet in 4 ml di 40% soluzione di Percoll e delicatamente sovrapporre su 4 ml di 80% soluzione di Percoll con una pipetta di plastica trasferimento, molto lentamente e con attenzione. Questo comporta due fasi nettamente separate da uno strato traslucido. Sulla parte superiore sarà uno strato giallo corrispondente ai lipidi.
  4. Centrifugare a 1500 xg per 30 min a temperatura ambiente con la centrifuga in modalità off freno.
  5. Rimuovere con aspirazione lo strato superiore di colore giallo e denso (circa 1-2 ml).
  6. Raccogliere solo il leggero strato biancastro traslucido dall'interfaccia delle due fasi con una pipetta di trasferimento. Trasferire molta attenzione questa sospensione in una provetta conica da 15 ml contenente 2 ml di terreno di coltura tissutale e quindi aggiungere 13 ml di terreno per fare un volume totale di15 ml.
  7. Centrifugare a 400 xg per 10 min a 4 ° C.
  8. Risospendere i campioni in 1 ml del mezzo.
  9. Contare il numero di KMNC utilizzando trypan blu su un emocitometro ed esprimere i risultati come numero di KMNC per ml al rene.
  10. Risciacquare una volta come sopra.

4. Isolamento del emopoietiche (CD45 +) Celle dal KMNC (Fase I)

  1. Risospendere le cellule fino a 10 7 in 90 ml di tampone di corsa.
  2. Aggiungere 10 ml di microsfere CD45 e incubare per 15 min a 4 ° C.
  3. Aggiungere 1 ml di tampone di corsa per arrestare la reazione. Centrifugare a 400 xg per 10 min a 4 ° C e risospendere in 500 ml di tampone di corsa.
  4. Preparare la colonna magnetico mettendo a magnete e risciacquare con 3 ml di tampone di corsa.
  5. Passare la sospensione cellulare attraverso la colonna magnetica e raccogliere le cellule non marcati che passano attraverso la colonna.
  6. Lavare le cellule tre volte con 3 ml di Running buffer. Poi raccogliere l'effluente.
  7. Rimuovere la colonna dal separatore e pipetta 5 ml di tampone di corsa sulle colonne e scovare la frazione etichettato immediatamente. Questa frazione contiene le cellule CD45 +. Contare le cellule.
  8. Per calcolare il numero assoluto di linfociti T diversi sottoinsiemi in reni moltiplicare il numero totale di KMNC per la percentuale di cellule positive determinata mediante citometria di flusso (Figura 2).

5. Isolamento di DN cellule T CD45 + da Preparazione per selezione negativa (Fase II)

  1. Aggiungere 2,5 ml (0,5 mg / ml, 1,25 microgrammi) di ciascuno dei seguenti anticorpi biotinilati: anti-CD4 e anti-CD8, anti-recettore Fc (CD16/32), anti-MHC di classe II (IA b), anti- CD1d PBS-57 tetramer ogni 10 cellule ematopoietiche 7.
  2. Incubare le cellule per 30 minuti nella camera fredda.
  3. Aggiungere 1 ml microsfere anti-biotina.
  4. Incubare per 30 min in una camera fredda.
  5. Porre il tubo in tegli magnete e procedere a esaurimento.
  6. Contare le cellule vitali per determinare il numero totale di cellule T DN nella frazione negativa utilizzando un emocitometro.
  7. Controllare la purezza delle cellule DN T con citometria a flusso seguendo questa strategia di gating: primo cancello CD45 +, secondo cancello TCRαβ +. Escludi + cellule CD1d. Plot CD4 + CD8 + vs identificare cellule DN T (Figura 3).
  8. Moltiplicare il numero totale per la percentuale determinata in purezza.
    Nota: utilizzando questo protocollo i risultati in una popolazione di cellule pure oltre il 90% DN T.

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Representative Results

Wild type C57BL / 6 (B6) rene contiene circa 1,5-2,1 x 10 6 cellule mononucleate al rene. Circa meno del 10% sono CD45 + cellule ematopoietiche. Per la preparazione di cellule mononucleate rene (KMNC), i reni sono tagliati in piccoli pezzi, come mostrato in Figura 1 seguito da digestione con collagenasi 5%.

Questo è seguito eseguendo una centrifugazione in gradiente di densità per raccogliere KMNC strato (figura 2, pannello di sinistra). KMNC sono stati poi sottoposti a selezione positiva utilizzando CD45 + microsfere magnetiche come descritto nella sezione 4 (FASE I). Le celle della colonna vincolato sono state poi eluiti ed analizzati per CD45 + da FACS. Ciò si traduce in arricchimento di cellule CD45 + da circa 80 a 95% come analizzata mediante citometria di flusso (figura 2, pannello centrale). Tra CD45 + cellule ematopoietiche arricchito, circa il 40-60% era TCR αβ + (dati non mostrati), circa 30-60% erano cellule DN T (Figura 2, pannello di destra).

Il passo finale coinvolto sottoponendo CD45 + cellule arricchite di selezione negativa per etichettare e rimuovere CD4 +, CD8 +, MHC di classe II + e + CD16/32 cellule utilizzando anticorpi monoclonali specifici biotina e microsfere anti-biotina e colonne magnetiche. Questo risultato altamente purificato (90-95%) DN cellule T (figura 3). A seguito di questo protocollo è stato possibile avere fino a 0,5 x 10 6 cellule ematopoietiche CD45 + marcate magneticamente per topo (due reni).

Figura 1
Figura 1. Preparazione del rene per digestione con collagenasi soluzione 5%. Il rene mouse viene tagliato in piccoli pezzi di 1-2 mm e posta in D soluzione di collagenasi 5% per 30 min per scavareestion. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
. Figura 2 Strategia per l'arricchimento di CD45 + cellule emopoietiche dal rene sinistro:.. CD45 colorazione del rene MNC prima di arricchimento utilizzando il kit CD45 + da una selezione positiva Centro: CD45 colorazione del rene MNC dopo arricchimento utilizzando il kit CD45 + da una selezione positiva destra.: CD4 e CD8 profilo di αβTCR + cellule tra CD45 + cellule chiuse diverse sottopopolazioni di cellule T. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
. Figura 3 purezza di isolate cellule T DN Sinistra:. CD45 colorazione delle cellule renali isolato DN T per selezione negativa Center.. TCRαβ colorazione delle cellule renali isolato DN T per selezione negativa Destra: CD4 e CD8 colorazione tra isolate cellule T da DN selezione negativa. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. Linfociti nel rene prima purificazione. destra:.. CD45 colorazione nel tessuto renale prima purificazione prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Vi è un crescente interesse in cellule T DN poiché sono stati implicati in diverse condizioni patologiche, come disturbi autoimmuni, il cancro, la tolleranza del trapianto e malattie primarie di rene compresa insufficienza renale acuta (AKI), glomerulonefrite 8, 13. Pertanto, non vi è necessità di comprendere meglio e caratterizzare le funzioni fisiopatologiche delle cellule T DN. Tuttavia, attualmente non vi è una mancanza di comprensione della funzione di queste cellule rispetto ai CD4 e le cellule T CD8. Uno dei motivi principali è scarsità di cellule DN T negli organi linfoidi secondari e quindi difficoltà di ottenere cellule sufficiente per l'analisi in vitro ed esperimenti di trasferimento adottivo. Cellule T DN si trovano principalmente nei tessuti non linfoidi come il rene 8, ma la mancanza di metodi affidabili per la loro isolamento da organi solidi sia di ostacolo allo sforzo di indagare la loro funzione. Pertanto, il nostro nuovo protocollo per l'isolamento di cellule T DNs dal rene dovrebbe accelerare la ricerca nella funzione delle cellule T DN. DN cellule T si accumulano nei linfonodi in gran numero in Fas carenti (lpr) o FasL carente (GLD) topi e possono essere facilmente isolati da organi linfoidi 9, 14, 15, ma rimane ancora una sfida per isolare queste cellule da altri tessuti.

Secondo questo protocollo, reni da due topi producono circa 0,5 x 10 6 cellule emopoietiche (CD45 +) e circa 0,2 x 10 6 cellule T DN. Questo numero è sufficiente effettuare la coltura in vitro, saggi funzionali e / o analisi FACS. La purezza della popolazione di cellule T DN deve essere confermata mediante citometria a flusso. Questo protocollo fornisce una popolazione di cellule T DN che possono essere come puro al 98%. Mentre questo protocollo è progettato per l'isolamento di cellule T DN dal rene, può essere modificato per l'isolamento di cellule T da altri organi non linfoidi tale come cuore, tiroide ecc

Poiché le cellule T DN rappresentano una piccola frazione, a volte è necessario aumentare il rendimento eseguendo cicli aggiuntivi di purificazione. Tuttavia, se un maggior numero di cellule T DN è necessaria (superiore a 0,5 x 10 6 cellule) si consiglia di eseguire classificare separazione al fine di ridurre i tempi ei costi reagente.

In sintesi, questo protocollo descrive un nuovo metodo per l'isolamento di cellule T DN dal rene. Si compone di un preparato (tramite la digestione e l'arricchimento di KMNC) passo seguita da selezione positiva e poi la selezione negativa per deplezione di popolazioni cellulari non desiderati. Pertanto, vi è la manipolazione diretta minimo di cellule T DN durante il processo di isolamento. È interessante notare che ci sono protocolli esistenti per l'isolamento di cellule DN T da sangue periferico nei topi e nell'uomo e da organi linfoidi secondari, simili a quelli utilizzati per l'isolamento di cellule T convenzionali.

ove_content "> Perché è stato dimostrato che alcune cellule DN T esprimono FCR-γ, un'opzione alternativa è di non includere CD16/32 + nel cocktail 16, 17. isolamento di successo di cellule T DN richiede grande attenzione ai dettagli. particolarmente cruciale passi seguenti: digestione tessuto, taglio del tessuto renale in piccoli pezzi, e identificare correttamente e raccogliendo il leggero strato in gradiente di densità globale, vari cicli di pratica e di destrezza manuale sono necessari per ottenere il risultato desiderato..

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

Questo lavoro è supportato dal NIH PBS (R21 AI095484). Ringraziamo core facility tetramer NHI per CD1d tetramero.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Laminar flow hood  Baker Company, Inc Or equivalent equipment 
Centrifuge Beckman Coulter Or equivalent equipment 
Hemocytometer Electron Microscopy Sciences 63514-11
Atmosphere-controlled incubator Fisher Scientific  (37 °C with 5% CO2)
Analytical flow cytometer LSR II
RPMI 1640 Media Tech 10-040-CV
Collagenase D Roche 11088858001
Percoll  GE Healthcare 17-0891-01
Fetal bovine serum  Corning Cellgro 35-011-CV
0.1% sodium azide (NaN3) Sigma-Aldrich S2002
Buffer phosphate buffered saline (PBS) Corning Cellgro 21-040-CV
PBS 10x Mediatech 46-013-CM
EDTA buffer  Sigma-Aldrich E1161
LS columns  MiltenyiBiotec 130-042-401
CD45+ microbeads MiltenyiBiotec 6.78E-51
Biotin microbeads  MiltenyiBiotec 130-090-485
anti-CD45 (clone: 30-F11)  PerCP  eBioscience G1397
anti-CD45 (clone: 30-F11)  APC-Cy7 Biolegend 103116
anti-TCR Pacific Blue  (ab-chain, clone: H57-597) Invitrogen HM3628
anti-CD4 PE eBioscience 12-0043
anti-CD8 FITC eBioscience 8011-0087
anti-CD4 biotinylated (GK1.5) BD 553728
anti-CD8 biotinylated  (clone 53-6.7) BD 553029
anti-MHC class II (I-A b) biotinylated BD 553609
AutoMACS Running Buffer - MACS Separation Buffer  MIlteny I Biotec 130-091-221
C57BL/6J mice Jackson Labs 000664 Kidneys - Lymph Nodes
Petri dish  BD Biosciences 356517
70 μm filter  Fisher Scientific 22363548
Plunger  Or equivalent equipment 
GeneMate Tubes 50 ml Bioexpress C-3394-3 Or equivalent equipment 
GeneMate Tubes 15 ml Bioexpress C-3394-1 Or equivalent equipment 
CD1d α-galcer tetramer NHI

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References

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Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney
Posted by JoVE Editors on 02/10/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney.

There was an error with an author's name. The author's given name had a typo, this was corrected to:

Samatha Bandapelle

instead of:

Samantha Bandapelle

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