मानव कंकाल की मांसपेशी से रक्त वाहिका व्युत्पन्न multipotent व्यापारियों का अलगाव

Biology

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Summary

पुनर्योजी अनुप्रयोगों के लिए आदर्श होते हैं कि मानव कंकाल की मांसपेशी बंदरगाह कई बहु वंश अग्रदूत आबादी के भीतर रक्त वाहिकाओं. Intima से myogenic endothelial कोशिकाओं, मीडिया से pericytes, और बाह्यकंचुक से adventitial कोशिकाओं: इस अलगाव विधि रक्त वाहिकाओं के तीन संरचनात्मक परतों से क्रमश: तीन multipotent अग्रदूत सेल आबादी का एक साथ शुद्धि की अनुमति देता है.

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Chen, W. C. W., Saparov, A., Corselli, M., Crisan, M., Zheng, B., Péault, B., Huard, J. Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (90), e51195, doi:10.3791/51195 (2014).

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Abstract

Mesenchymal स्टेम / stromal कोशिकाओं (MSCS) की खोज के बाद से, देशी पहचान और MSCs का स्थानीयकरण संस्कृति में उनके पूर्वव्यापी अलगाव से छिप गया है. हाल ही में, प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) का उपयोग करते हुए, हम और अन्य शोधकर्ताओं ने भावी मानव कंकाल की मांसपेशी की वाहिका संरचना के साथ जुड़े multipotent अग्रदूत साबित कोशिकाओं के तीन subpopulations पहचान और शुद्ध. इन तीन सेल आबादी: intima, मीडिया, और बाह्यकंचुक: myogenic endothelial कोशिकाओं (MECS), pericytes (पीसी), और adventitial कोशिकाओं (एसी), रक्त वाहिकाओं के तीन संरचनात्मक परतों को क्रमश स्थानीयकृत हैं. इन मानव रक्त वाहिका व्युत्पन्न स्टेम सेल (hBVSC) के सभी क्लासिक एमएससी मार्करों व्यक्त लेकिन यह भी ठेठ MSCs के समान mesodermal विकास क्षमता के अधिकारी आबादी न केवल. इससे पहले, MECS, पीसी, और एसी अलग प्रोटोकॉल के माध्यम से पृथक किया गया है और बाद में अलग अध्ययनों में होती है. वर्तमान अलगाव protocol, चयनात्मक कोशिका की सतह मार्कर में अलगाव की प्रक्रिया में संशोधन और समायोजन के माध्यम से, हमें एक साथ एक ही मानव मांसपेशी बायोप्सी से FACS द्वारा सभी तीन hBVSC subpopulations शुद्ध करने के लिए अनुमति देता है. इस नई विधि केवल कई बी.वी.एससी subpopulations के अलगाव को कारगर बनाने, लेकिन यह भी विशिष्ट चिकित्सीय उद्देश्यों के लिए hBVSCs के भविष्य के नैदानिक ​​अनुप्रयोगों की सुविधा नहीं होगी.

Introduction

मानव कंकाल की मांसपेशी स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की एक चिकित्सकीय आकर्षक स्रोत माना गया है. कंकाल की मांसपेशी केवल उपग्रह कोशिकाओं और मांसपेशियों व्युत्पन्न स्टेम सेल (MDSCs) 1 सहित myogenic progenitors, कंकाल myoblasts, लेकिन यह भी आदिम myogenic स्टेम सेल, प्रतिबद्ध नहीं होता है. पुनर्योजी चिकित्सा में मानव मांसपेशियों व्युत्पन्न स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं, ऑटोलॉगस या allogeneic, का उपयोग बड़े पैमाने पर पूर्व नैदानिक ​​पशु मॉडल और नैदानिक ​​परीक्षणों में जांच की गई है. मांसपेशी स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के पुनर्योजी अनुप्रयोगों दिल का दौरा पड़ने के साथ रोगियों में घायल दिल की मरम्मत करने के लिए Duchenne पेशी dystrophy (डीएमडी) के रोगियों में dystrophic मांसपेशी regenerating से लेकर.

अस्थि मज्जा व्युत्पन्न multipotent वयस्क पूर्वज कोशिकाओं (MAPCs) और वसा व्युत्पन्न स्टेम सेल (ADSCs), वयस्क स्टेम / सहित mesenchymal स्टेम / stromal कोशिकाओं (MSCS) और अन्य multipotent अग्रदूत सेल आबादी, की खोज के बाद सेपूर्वज कोशिकाओं बड़े पैमाने पर तिथि 1-9 करने के लिए जांच की गई है. फिर भी, बगल में उनके मूल पहचान और स्थानीयकरण पूर्वव्यापी अलगाव तरीकों से छिप गया है. हाल ही में, छँटाई प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल (FACS) का उपयोग करते हुए, हम और अन्य समूहों भावी पहचान की है और रक्त मानव कंकाल की मांसपेशी के भीतर जहाजों और कई अन्य अंगों से शुद्ध तीन multipotent अग्रदूत सेल आबादी: myogenic endothelial कोशिकाओं (MECS), pericytes (पीसी), और adventitial कोशिकाओं (एसी) 10. Tunica intima, Tunica मीडिया, और Tunica बाह्यकंचुक: मानव रक्त वाहिका व्युत्पन्न स्टेम सेल (hBVSCs) के इन तीन subpopulations क्रमशः रक्त वाहिकाओं के तीन संरचनात्मक परतों में पाया जा सकता है. एसी बड़ा धमनियों और नसों की बाह्यकंचुक परत में स्थानीयकृत हैं, जबकि अधिक विशेष रूप से, MECS और पीसी microvessels और केशिकाओं में पता चला रहे हैं. (सी MECS: प्रत्येक अग्रदूत सेल सबसेट कोशिका की सतह प्रतिजनों की एक अद्वितीय संयोजन व्यक्तD34 + / 56 + / 144 + / 45 -), पीसी (CD146 + / 34 - / 45 - 56 / -), और एसी (CD34 + / 31 - / 45 - / - 56/146 -).

इन hBVSC कैंपेन्स के आगे लक्षण वर्णन सभी तीन अग्रदूत सेल आबादी कंकाल myogenesis, अस्थिजनन, उपास्थिजनन, और adipogenesis सहित ठेठ MSCs के समान mesodermal विकास क्षमता के अधिकारी का पता चला. सभी hBVSC कैंपेन्स भी CD44, CD73, CD90, और CD105, हौसले और संस्कृति में शामिल क्लासिक एमएससी मार्कर, दिखा रहे हैं. सामूहिक रूप से सबूत के इन टुकड़ों MSCs की नाड़ी मूल का समर्थन किया. इसके अलावा, MECS, पीसी, और एसी की चिकित्सीय क्षमता हाल ही में अलग अध्ययनों में प्रदर्शन किया गया है. वयस्क मानव मांसपेशी बायोप्सी से क्रमबद्ध MECS घायल हो गए और dystrophic कंकाल की मांसपेशियों और मरम्मत घायल मायोकार्डियम अधिक कुशलता से कंकाल myoblasts और नाड़ी एंडो पुनर्जीवित करने के लिए दिखाया गयाthelial कोशिकाओं (ईसीएस). विभिन्न मानव अंगों से शुद्ध पीसी भी / मरम्मत घायल हो गए और dystrophic कंकाल की मांसपेशियों को पुनर्जीवित और उपग्रह सेल पूल 13-16 में योगदान करने के लिए दिखाया गया है. हाल ही में, हम मानव कंकाल की मांसपेशी से व्युत्पन्न पीसी प्रभावी ढंग से अप्रत्यक्ष पैराक्राइन प्रभाव और प्रत्यक्ष सेलुलर बातचीत के माध्यम से 17 infarcted मायोकार्डियम में सुधार दिखा दिया है कि. एसी, दूसरे हाथ पर, या तो कर दिया गया है सीधे explanted रक्त वाहिकाओं से अलग या मानव वसा ऊतकों और कंकाल की मांसपेशी से FACS द्वारा शुद्ध. एसी की एक उल्लेखनीय समर्थक वाहिकाजनक प्रभाव एक माउस हिंद अंग ischemia मॉडल 19 में प्रदर्शन किया गया. इसके अलावा, एसी भी इस्कीमिक ऊतकों की मरम्मत 20 में एसी की मजबूत चिकित्सीय क्षमता का संकेत है, और अधिक कुशलता से पारंपरिक MSCs से infarcted मायोकार्डियम में सुधार करने के लिए दिखाया गया है.

एक साथ वर्तमान शुद्धि प्रोटोकॉल अनुदान, MECS, पीसी के भावी शुद्धि, औरएक भी मानव कंकाल की मांसपेशी बायोप्सी की वाहिका संरचना से एसी. यह हमारे अध्ययन और / या विशिष्ट चिकित्सीय उद्देश्यों के लिए इष्टतम hBVSC subpopulation चुनने के लिए अनुमति देता है. साथ ही, यह नई तकनीक भविष्य में इसे और पुनर्योजी चिकित्सा के लिए multipotent अग्रदूत साबित कोशिकाओं का एक आदर्श स्रोत है, जिससे मानव कंकाल की मांसपेशी से प्राप्त किया जा सकता है कि स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के प्रदर्शनों की सूची का विस्तार.

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Protocol

1 बलवान बायोप्सी प्रसंस्करण

  1. है Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और के साथ पूरक (DMEM) में बर्फ पर मानव कंकाल की मांसपेशी बायोप्सी रक्षित 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन परिवहन के दौरान (पी / एस).
  2. मांसपेशी बायोप्सी की प्राप्ति के बाद, परिवहन कंटेनर से नमूना हटाने और बाँझ परिस्थितियों में 2% एंटीबायोटिक रोधी समाधान (ए / ए) के साथ पूरक फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में दो बार इसे धो लो.
  3. 2% ए / ए के साथ पूरक DMEM में बाँझ कैंची और संदंश के साथ संलग्न वसा और संयोजी ऊतक निकालें.
  4. विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे बड़े रक्त वाहिकाओं निकालें और बाद में छोटे टुकड़े (आकार में <1 सेमी 2) में पेशी नमूना काटा.
  5. 20 मिलीलीटर संरक्षण माध्यम में कटौती पेशी टुकड़े (<5 ग्राम) रक्षित (प्रधानमंत्री, DMEM 10% FBS और 1% पी / एस के साथ पूरक) के लिए 5 दिनों के लिए 4 ℃ पर.

2 स्नायु Dissociatआयन और सेल अलगाव

  1. सेल अलगाव के दिन, PM से पेशी टुकड़े को हटाने और पीबीएस में दो बार धोना 2% पी / एस के साथ पूरक. पाचन समाधान बनाने के लिये प्रकार I, प्रकार द्वितीय, और प्रकार चतुर्थ collagenases हौसले अपराह्न में (100 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ने.
  2. बारीक काट लें और समाधान नहीं थक्के के साथ 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट गुजरता जब तक यंत्रवत् प्रधानमंत्री की एक छोटी राशि के साथ एक पेट्री डिश में बाँझ कैंची और संदंश के साथ मांसपेशियों टुकड़े क़ीमा. इस प्रक्रिया के दौरान अवशिष्ट वसा और संयोजी ऊतक निकालें. वयस्क मांसपेशियों की कम से कम 8-10 ग्राम या प्रत्येक सेल अलगाव के लिए भ्रूण मांसपेशियों की 2 ग्राम का प्रयोग करें.
  3. 20 मिलीलीटर (या 10 मिलीलीटर में कीमा बनाया हुआ भ्रूण पेशी के 2 ग्राम) एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक विंदुक के साथ पाचन समाधान यापन करने के लिए कीमा बनाया हुआ वयस्क मांसपेशियों की 4-5 ग्राम स्थानांतरण. 80 आरपीएम - 70 में एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर 37 ℃ में 60 मिनट - 50 के लिए डाइजेस्ट. तदनुसार राशि पर आधारित पाचन समय और / या आंदोलन की गति का समायोजन करके सेल उपज और सतह प्रतिजन संरक्षण का अनुकूलनऊतक की. मैलापन लगभग साफ करता है जब तक पाचन स्थिति हर 15-20 मिनट पर गौर करें.
  4. सख्ती पचा ऊतक एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक विंदुक के साथ 3-5 बार पिपेट. प्रतिक्रिया बंद करो और फिर 4 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र को प्रधानमंत्री के बराबर राशि जोड़ें.
  5. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटाने; धोने के लिए 10 मिलीलीटर प्रधानमंत्री के साथ गोली resuspend, और फिर एक 100 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से फ़िल्टर्ड.
  6. 4 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र और ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटायें. एरिथ्रोसाइट lysis बफर (155 मिमी एनएच 4 सीएल, 10mm KHCO 3, 0,1mM EDTA), एक एकल कक्ष निलंबन प्राप्त करने के लिए एक 70 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से फिल्टर, और फिर आरटी पर 10 मिनट के लिए सेते में Resuspend छर्रों. किसी भी तेज़ी मनाया जाता है फिर एक 70 m सेल झरनी के माध्यम से फिल्टर.
  7. 4 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र और 0.5 मिलीलीटर पीबीएस में सेल गोली resuspend. कोशिकाओं की संख्या की गणना. सेल छँटाई के लिए कम से कम 5 लाख कोशिकाओं की कुल प्राप्त करते हैं. Singl पतलाधुंधला के लिए पीबीएस के साथ मिलीग्राम प्रति कम से कम 5 लाख कोशिकाओं को ई सेल निलंबन. नियंत्रण stainings के लिए 11 ट्यूब (बेदाग नियंत्रण, नकारात्मक नियंत्रण, और एकल रंग सकारात्मक नियंत्रण) में सेल निलंबन और विभाजन के 50-100 μl बाहर ले जाओ.

3 सेल लेबलिंग और छंटनी

  1. यदि आवश्यक प्रयोजन रोकने के लिए (पीबीएस में पतला 1:10) माउस सीरम में 4 ℃ पर 10 मिनट के लिए एकल कक्ष निलंबन सेते हैं.
  2. एकल कक्ष निलंबन में: (100 सब 1) और 4 ℃ पर 20 मिनट के लिए सेते CD34-एपीसी, CD45-APC-Cy7, CD56 पीई Cy7, CD144 पीई, और CD146-FITC जोड़ें. नकारात्मक नियंत्रण के लिए, APC-, एपीसी-Cy7-, पीई Cy7-, पीई, और FITC संयुग्मित निर्धारण आईजीजी के बराबर सांद्रता जोड़ने और 4 ℃ पर 20 मिनट के लिए सेते हैं. एकल रंग सकारात्मक नियंत्रण के लिए, व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक ट्यूब में CD34-एपीसी, CD45-APC-Cy7, CD56 पीई Cy7, CD144 पीई, और CD146-FITC के बराबर सांद्रता जोड़ने और 4 ℃ पर 20 मिनट के लिए सेते हैं.
  3. ऊष्मायन के बाद, 4 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र धोने के लिए. 5% FBS और 1% पी / एस के साथ पूरक 2 मिलीलीटर DMEM - 1 में सेल गोली Resuspend. सेल निलंबन के अंतिम एकाग्रता मिलीग्राम प्रति कम से कम 5 मिलियन कोशिकाओं होना चाहिए. 7 AAD (1: 100) जोड़ें और मृत सेल बहिष्कार के लिए आरटी पर 15 मिनट के लिए सेते हैं. नकारात्मक नियंत्रण और एकल रंग सकारात्मक नियंत्रण, 5% FBS और 1% पी / एस के साथ पूरक 0.5 मिलीलीटर DMEM में resuspend सेल छर्रों के लिए.
  4. ट्यूब cytometry दौर नीचे polystyrene प्रवाह करने के लिए सभी सेल निलंबन स्थानांतरण. (प्रत्येक ट्यूब पहले से भरे है उचित संस्कृति के माध्यम से 500 μl के साथ: MECS के लिए यूके, ईजीएम -2 पीसी के लिए, एसी के लिए एसी मध्यम) सेल संग्रह ट्यूबों तैयार. सेल सॉर्टर के लिए बर्फ पर परिवहन सेल निलंबन.
  5. बेदाग नियंत्रण, नकारात्मक नियंत्रण, एकल रंग सकारात्मक नियंत्रण, और मुख्य सेल निलंबन के क्रम में सेल सॉर्टर पर चलाने के लिए सेल निलंबन सेल पी अधिकतम करने के लिए इसरो gating लेजर तीव्रता, चैनल मुआवजा, और सेल की आबादी का समायोजन करते हुएurity (जौव और प्रवाह की जानकारी के लिए अन्य पत्रिकाओं cytometry द्वारा प्रकाशित लेख का संदर्भ लें).
  6. उपयुक्त संग्रह ट्यूब में वांछित सेल आबादी लीजिए. 4 ℃ पर स्टोर एकत्र कोशिकाओं तुरंत बोने नहीं है.

4 सेल संस्कृति के बाद छँटाई

  1. साथ पूर्व लेपित प्लेटों पर एम पी एम में <10,000 कोशिकाओं / 2 सेमी पर हौसले क्रमबद्ध MECS (P0) बीज टाइप I कोलेजन. MECS के बाद passaging के लिए, 3500 बीज - साथ पूर्व लेपित प्लेटें / बोतल पर एम पी एम में 4000 कोशिकाओं / 2 सेमी टाइप I कोलेजन.
  2. हौसले 0.2% जिलेटिन के साथ लेपित प्लेटों पर ईजीएम -2 में <20,000 कोशिकाओं / 2 सेमी पर हौसले क्रमबद्ध पीसी (P0) बीज. पीसी मध्यम में 3 अनुपात में p2 जब तक नियमित polystyrene संस्कृति प्लेटों पर (20% FBS और 1% पी / एस के साथ पूरक DMEM): पीसी के बाद passaging के लिए, 1 में कोशिकाओं को विभाजित. पी 3 से आगे, बीज कोशिकाओं 6,500 पर - नियमित polystyrene संस्कृति प्लेटों / बोतल पर पीसी माध्यम में 7000 कोशिकाओं / 2 सेमी.
  3. नियमित polystyrene संस्कृति प्लेटों पर (20% FBS और 1% पी / एस के साथ पूरक DMEM) एसी माध्यम में <20,000 कोशिकाओं / 2 सेमी पर हौसले क्रमबद्ध एसी (P0) बीज. नियमित polystyrene संस्कृति प्लेटों / बोतल पर एसी माध्यम में 7000 कोशिकाओं / 2 सेमी - 6500 पर बाद में एसी की passaging, बीज कोशिकाओं के लिए.

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Representative Results

FACS मापदंडों पहले बेदाग नियंत्रण, नकारात्मक नियंत्रण, और एकल रंग सकारात्मक नियंत्रण से प्राप्त आंकड़ों के आधार पर सही कर रहे हैं. मृत कोशिकाओं के बहिष्कार के बाद, प्रतिदीप्ति लेबल सेल निलंबन नकारात्मक और सकारात्मक कोशिका की सतह मार्कर की एक श्रृंखला के अधीन है. सबसे पहले, CD45 + कोशिकाओं CD56 + और ​​CD56 से पहले बाहर gated हैं - कोशिकाओं CD45 से अलग हो रहे हैं - अंश. CD56 + अंश आगे CD34-CD144 चयन के अधीन है, जहां केवल CD34 + / CD144 + (दोहरे सकारात्मक) कोशिकाओं MECS के रूप में चिह्नित कर रहे हैं (CD34 + / 56 + / 144 + / 45 -) और बाद में एकत्र (चित्रा 1). इसी तरह, CD56 - अंश आगे CD34-CD146 चयन के अधीन है, जहां केवल CD34 - / CD146 + पीसी के रूप में चिह्नित कर रहे हैं कोशिकाओं (CD146 + / 34 - / 45 - / - 56) और बाद में एकत्र ( + / CD146 - अंश ईसीएस + / CD31 (CD34 + / CD31 +), और केवल CD34 बाहर करने के लिए एक अतिरिक्त नकारात्मक CD31 चयन के अधीन है - सबसेट एसी (CD34 के रूप में चिह्नित है + / 31 - / - 56/45 - / 146 - संग्रह के लिए) (चित्रा 1). प्रक्रिया को सरल करने के लिए, CD144 ईसीएस के बहिष्कार के लिए CD31 स्थानापन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

हौसले क्रमबद्ध कोशिकाओं आगे विस्तार के लिए प्रोटोकॉल में निर्दिष्ट संस्कृति की स्थिति में वरीयता प्राप्त किया जा सकता है या इन विवो प्रयोगों के लिए तुरंत इस्तेमाल किया. HBVSC कैंपेन्स के क्लोनल विस्तार FACS Aria autoclone प्रणाली या कमजोर पड़ने विधि 13, 21 को सीमित करके प्राप्त किया जा सकता है. ठेठ विषम MSCs के विपरीत, hBVSC कैंपेन्स की संस्कृतियों भी लंबी अवधि के विस्तार के बाद सजातीय रहते हैं. एक की मांसपेशी बायोप्सी से शुद्ध सुसंस्कृत hBVSC सबसेट के प्रतिनिधि आकृति विज्ञान,एकल दाता, चित्रा 2 में दिखाया गया है. ठेठ MSCs और शुद्ध hBVSC सबसेट के बीच तुलना तालिका 1 में संक्षेप हैं.

चित्रा 1
मानव रक्त वाहिका व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं एक भी मानव कंकाल की मांसपेशी बायोप्सी से (hBVSCs). प्रत्येक क्रमबद्ध सेल आबादी की पवित्रता के तीन कैंपेन्स की संख्या 1 प्रतिनिधि छंटनी आगे के बाद सॉर्ट विश्लेषण से इसकी पुष्टि की है. एक देखने के लिए यहां क्लिक करें इस आंकड़े का बड़ा संस्करण.

चित्रा 2
एकरूपता के लिए क्रमबद्ध चित्रा 2 तीन hBVSC subpopulations, सी में अलग आकृति विज्ञान का प्रदर्शन(बाएं से दाएं) ulture: myogenic endothelial सेल (MEC), pericyte (पीसी), और adventitial सेल (एसी) (बीतने 4, स्केल सलाखों = 100 मिमी). इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

MSCs MECS पीसी एसी
पवित्रता विषम सजातीय सजातीय सजातीय
शुद्धि के लिए कोशिका की सतह प्रतिजन प्रोफाइल N / A CD34 + CD45- CD56 + CD144 + CD31- CD34 + CD45- CD146-
संस्कृति में एमएससी मार्कर अभिव्यक्ति CD29 + CD44 + CD73 + CD90 + CD105 + CD29 + CD44 + CD90 + CD105 + CD44 + CD73 + CD90 + CD105 + CD44 + CD73 + CD90 + CD105 +
Multipotency Myogenesis (+) Adipogenesis (+) अस्थिजनन (+) उपास्थिजनन (+) Myogenesis (+) Adipogenesis (+) अस्थिजनन (+) उपास्थिजनन (+) Myogenesis (+) Adipogenesis (+) अस्थिजनन (+) उपास्थिजनन (+) Myogenesis (एन / ए) Adipogenesis (+) अस्थिजनन (+) उपास्थिजनन (+)
संभावित अनुप्रयोगों Skeletomuscular मरम्मत / उत्थान: हड्डी, उपास्थि, पट्टा, बंधन, और कंकाल की मांसपेशी; कार्डिएक मरम्मत; संवहनी मरम्मत; घाव भरने; Immunoregulation कार्डिएक मरम्मत; कंकाल की मांसपेशी की मरम्मत / उत्थान; हड्डी / उपास्थि की मरम्मत / उत्थान कार्डिएक मरम्मत; संवहनी मरम्मत / उत्थान; कंकाल की मांसपेशी की मरम्मत / उत्थान; अस्थि पुनर्जनन कार्डिएक मरम्मत; संवहनी मरम्मत / उत्थान; अस्थि पुनर्जनन
बगल में शारीरिक स्थानीयकरण N / A रक्त वाहिका Intima रक्त वाहिका मीडिया रक्त वाहिका बाह्यकंचुक

ठेठ MSCs और multipotent hBVSC subpopulations की तालिका 1 तुलना करें.

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Discussion

HBVSC subpopulations की पहचान और शुद्धि एमएससी व्यक्तिवृत्त की समझ में एक प्रमुख अग्रिम का प्रतिनिधित्व करते हैं. MSCs की परिवाहकीय मूल और ऊतक विशेष अग्रदूत साबित कोशिकाओं और रक्त वाहिकाओं 22-25 के बीच सहयोग का संकेत बढ़ती सबूत नहीं है. इसके अलावा, क्षमता आगे एमएससी विविधता और नाड़ी कोशिका जीव विज्ञान 26 की समझ एड्स hBVSCs के सजातीय subpopulations अलग करने के लिए.

पिछले कुछ वर्षों में, MECS, पीसी, और एसी व्यक्तिगत रूप से पहचान की गई है और अलग अध्ययनों में अलग प्रोटोकॉल के माध्यम से अलग किया. हालांकि, कोई प्रयास ऊतक हदबंदी की प्रक्रिया और पूरी तरह MECS, पीसी, और एसी की पहचान चयनात्मक सेल वंश मार्कर के संयोजन का अनुकूलन के कारण कठिनाइयों को मानव कंकाल की मांसपेशी से एक साथ सभी तीन hBVSC सबसेट को शुद्ध करने के लिए किया गया है. यहाँ हम समवर्ती purif अनुमति देता है एक नया सेल अलगाव प्रोटोकॉल वर्णित(चित्रा 1) ऊतक हदबंदी की प्रक्रिया को संशोधित करने और चयनात्मक कोशिका की सतह मार्कर का एक नया संयोजन लगाने से एक भी मानव मांसपेशी बायोप्सी से MECS, पीसी, और एसी की ication. सबसे अच्छा परिणाम के लिए, अतिरिक्त ध्यान देने की जरूरत है कि मौजूदा प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं: 1 ताजगी और ऊतक नमूना के संरक्षण; सेल उपज और सावधान पाचन प्रक्रिया की निगरानी और ऊतक हदबंदी समय का समायोजन करके सतह प्रतिजन संरक्षण के 2 अनुकूलन; छह रंग की 3 सटीक अंशांकन प्रवाह cytometry. इन मानकों में अपनी विशिष्ट आपूर्ति / उपकरण सेटअप के अनुसार व्यक्ति प्रयोगशाला द्वारा निर्धारित किया जाना है.

इस नए प्रोटोकॉल को लागू करने से, एक ही कई hBVSC subpopulations की तुल्यकालिक अलगाव को कारगर नहीं कर सकते हैं, लेकिन यह भी इस तरह के hBVS के बीच अंतर सेलुलर व्यवहार की तुलना के रूप में बुनियादी अनुसंधान और translational आवेदन, के लिए hBVSCs के उपयोग की सुविधासी कैंपेन्स और विभिन्न व्यक्तिगत चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए एकल या मिश्रित hBVSC सबसेट (एस) के अनुकूलन. हालांकि, सभी तीन hBVSC कैंपेन्स की समवर्ती अलगाव वर्तमान वजह MECS अन्य मानव ऊतकों में पहचान नहीं किया गया है कि इस तथ्य के कंकाल की मांसपेशी तक सीमित है. इसके अलावा, यह इन तीन hBVSC subpopulations के बीच संक्रमण और / या सेलुलर पदानुक्रम भेद करने के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल की सीमा से परे है.

की विशेषता हौसले से अलग और सुसंस्कृत MECS, पीसी, और एसी अलग संस्कृति में myogenic मार्कर CD56 की अभिव्यक्ति को बनाए रखने, लेकिन धीरे धीरे चुनाव आयोग मार्कर CD34 और CD144 की अभिव्यक्ति खो पूर्व के अध्ययन MECS में प्रदर्शन किया गया है. प्रतिरूप स्तर पर, MECS CD29, CD44, CD90, और CD105 सहित, एमएससी मार्करों व्यक्त, और इस तरह के उपास्थिजनन, अस्थिजनन, adipogenesis, और myogenesis रूप mesenchymal भेदभाव क्षमता प्रदर्शित करते हैं. साथ ही, प्रतिरूप MECS उनके angiogen बनाए रखने केलंबे समय तक संस्कृति के बाद आईसी क्षमता, Matrigel संस्कृति में केशिका की तरह नेटवर्क बनाने और इन विवो 21 में neovascularization में भाग लेने.

ताजा या सुसंस्कृत पीसी, न केवल CD44, CD73, CD90, और CD105 सहित एमएससी मार्कर, व्यक्त, लेकिन यह भी उदाहरण, कंकाल myogenesis, अस्थिजनन, उपास्थिजनन, और adipogenesis 13 के लिए, mesodermal विकास क्षमताओं का प्रदर्शन करने के लिए दिखाया गया है. पीसी मजबूती भी हाइपोक्सिया के तहत, पौष्टिकता संबंधी कारकों की एक संख्या छिपाना, और ऊतकों की मरम्मत / उत्थान प्रक्रिया पीसी के लिए इसी तरह एसी के दौरान उनके पैराक्राइन समारोह, प्रत्यक्ष भेदभाव, और सेलुलर बातचीत के माध्यम से पुनर्योजी इकाइयों के रूप में सेवा, क्लासिक एमएससी मार्करों व्यक्त करने के लिए दिखाया गया और प्रमुख mesenchymal सेल प्रजातियों 18 में अंतर. साथ में पीसी के साथ, एसी भी MSCs के विकास के मूल में से एक के रूप में प्रस्तावित किया गया है. कोशिका की सतह मार्कर अभिव्यक्ति, भेदभाव क्षमता, और पी की तुलना एक सारांशठेठ MSCs और hBVSCs बीच ossible translational अनुप्रयोगों तालिका 1 में सूचीबद्ध किया गया है. हाल ही में, चूहे और मानव 29 में बड़े रक्त वाहिकाओं के Tunica मीडिया से तांग एट अल. पहचान multipotent संवहनी स्टेम कोशिकाओं (MVSCs). MVSCs केवल चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं में अंतर भी है लेकिन संवहनी चोट 29 के बाद संवहनी remodeling और neointimal hyperplasia के लिए योगदान नहीं. MVSCs BVSCs microvasculature और छोटे जहाजों में रहने के साथ विकास कनेक्शन साझा चाहे आगे जांच की आवश्यकता है.

मौजूदा प्रोटोकॉल समय पर, नैदानिक ​​सेटिंग में सुलभ नहीं हो सकता है, जो ताजा मानव मांसपेशी बायोप्सी से समय पर सेल अलगाव की आवश्यकता है. वैकल्पिक रूप से, चयनात्मक कोशिका की सतह मार्कर का एक संशोधित सेट के आधार पर, यह 30 प्रवाह cytometry द्वारा cryopreserved मानव प्राथमिक कंकाल की मांसपेशी सेल संस्कृतियों से MECS और पीसी को शुद्ध करने के लिए संभव है. इस विधि भावी purif अनुमति देता हैउपचारात्मक उद्देश्यों के लिए बैंकिंग मानव कंकाल की मांसपेशी संस्कृति से दो hBVSC कैंपेन्स के ication. फिर भी, कारण सुसंस्कृत मानव मांसपेशियों की कोशिकाओं में CD34 अभिव्यक्ति की कमी के कारण, यह आगे इस विशेष प्रोटोकॉल के साथ एसी अलग करना संभव नहीं है.

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Acknowledgments

लेखकों फ्लो के साथ उसे उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए एलिसन लोगार का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. इस काम के रक्षा विभाग (झा), हेनरी जे Mankin संपन्न चेयर (झा), और शिक्षा और कजाखस्तान गणराज्य के विज्ञान मंत्रालय (एएस) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. सीडब्ल्यूसी अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन predoctoral फैलोशिप (11PRE7490001) द्वारा समर्थित किया गया था. M.Corselli पुनर्योजी चिकित्सा प्रशिक्षण प्रदान करने के लिए कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट (TG2-01169) द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase type 1 Sigma C5894 Sterile vial
Collagenase type 2 Sigma C1764 Sterile vial
Collagenase type 4 Sigma C1889 Sterile vial
Anti-human CD34 APC BD Pharmingen 555824 Keep sterile
Anti-human CD45 APC-Cy7 BD Pharmingen 557833 Keep sterile
Anti-human CD56 PE-Cy7 BD Pharmingen  557747 Keep sterile
Anti-human CD144 PE Beckman Coulter A07481 Keep sterile
Anti-human CD146 FITC AbD Serotec MCA2141F Keep sterile
FACS Aria II Flow Cytometer Becton-Dickinson
EGM-2 complete medium Lonza CC-3162 For culturing PCs (only P0)
DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate Invitrogen 11965 For culturing PCs
DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, with sodium pyruvate Invitrogen 11995 For culturing MECs and ACs
Fetal bovine serum Invitrogen 10437-028
Heat-inactivated horse serum Invitrogen 26050-088
Penicillin/streptomycin Invitrogen 15140-122
Antibiotic-antimycotic (100X) Invitrogen 15240-062
Trypsin-EDTA 0.5% (10X) Invitrogen 15400-054
Dulbecco’s PBS without calcium and magnesium Invitrogen 14190-250
Chick embryo extract Accurate Chemical CE650T-10 Filter before use

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References

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