Isolatie van bloedvatgeassocieerde afgeleid Multipotente Voorlopers van Human Skeletal Muscle

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bloedvaten in de menselijke skeletspier haven diverse multi-lineage voorloper populaties die ideaal is voor regeneratieve toepassingen zijn. Deze isolatie methode maakt gelijktijdige zuivering van drie multipotente precursor celpopulaties respectievelijk uit drie structurele lagen van de bloedvaten: myogene endotheelcellen van de intima, pericytes van media en adventitia cellen van adventitia.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Chen, W. C. W., Saparov, A., Corselli, M., Crisan, M., Zheng, B., Péault, B., Huard, J. Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (90), e51195, doi:10.3791/51195 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Sinds de ontdekking van mesenchymale stam / stromale cellen (MSC's) zijn de inheemse identiteit en lokalisatie van MSCs overschaduwd door hun retrospectieve isolatie in kweek. Onlangs, met fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS), wij en andere onderzoekers prospectief geïdentificeerd en gezuiverd drie subpopulaties van multipotente precursorcellen geassocieerd met het vaatstelsel van de menselijke skeletspier. Deze drie celpopulaties: myogene endotheelcellen (MEC), pericyten (PC) en adventitia-cellen (ACS), respectievelijk gelokaliseerd op de drie structurele lagen van bloedvaten: intima, media en adventitia. Al deze menselijk bloed-schip-afgeleide stamcellen (hBVSC) populaties niet alleen uiten klassieke MSC markers, maar ook beschikken over mesodermaal ontwikkelings mogelijkheden vergelijkbaar met typische MSC's. Eerder hebben MEC's, pc's, en ACS zijn geïsoleerd door middel van verschillende protocollen en vervolgens gekarakteriseerd in afzonderlijke studies. De huidige isolatie protocol, door wijzigingen van het isolatieproces en aanpassingen in het selectieve celoppervlak markers, kunnen we gelijktijdig zuiveren drie hBVSC subpopulaties door FACS uit een enkel menselijk spierbiopsie. Deze nieuwe methode zal niet alleen de isolatie van meerdere BVSC subpopulaties te stroomlijnen, maar ook toekomstige klinische toepassingen van hBVSCs voor verschillende therapeutische doeleinden te vergemakkelijken.

Introduction

Menselijke skeletspieren wordt beschouwd als een klinisch aantrekkelijke bron van stam / progenitorcellen. Skeletspieren bevat niet alleen gepleegd myogene voorouders, skeletmyoblasten, maar ook primitieve myogene stamcellen, met inbegrip van satelliet-cellen en-spier-afgeleide stamcellen (MDSCs) 1. Het gebruik van menselijke spier afgeleide stam / progenitorcellen, autologe of allogene, in regeneratieve geneesmiddel is uitgebreid onderzocht in preklinische diermodellen en klinische proeven. De regeneratieve toepassingen spier stam / progenitorcellen variëren van regenereren dystrofische spier in Duchenne spierdystrofie (DMD) patiënten herstel van de gewonde hart bij patiënten met een hartaanval.

Sinds de ontdekking van mesenchymale stam / stromale cellen (MSC's) en andere multipotente precursor celpopulaties, waaronder beenmerg afgeleide multipotente adulte progenitorcellen (MAPCs) en adipose afgeleide stamcellen (ADSCs), volwassen stamcellen /voorlopercellen cellen zijn uitgebreid onderzocht date 1-9. Niettemin hebben hun eigen identiteit en vestiging in situ overschaduwd door de retrospectieve isolatiewerkwijzen. Onlangs, met fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS), wij en andere groepen prospectief geïdentificeerd en gezuiverd drie multipotent precursor celpopulaties van bloedvaten in menselijke skeletspier en diverse andere organen: myogene endotheelcellen (MEC), pericyten (PC), en adventitia cellen (AC's) 10. Deze drie subpopulaties van humane bloedvatgeassocieerde afgeleide stamcellen (hBVSCs) respectievelijk worden in de drie structurele lagen van bloedvaten: tunica intima, tunica media en de tunica adventitia. Meer specifiek, MEC's ​​en pc's zijn gedetecteerd in bloedvaten en haarvaten en ACS zijn gelokaliseerd in de adventitia laag van grotere slagaders en aders. Elke precursor cel subsets drukt een unieke combinatie van celoppervlak antigenen: MEC (CD34 + / 56 + / 144 + / 45 -), PC (CD146 + / 34 - / 45 - / 56 -), en de ACS (CD34 + / 31 - / 45 - / 56 - / 146 -).

Verdere karakterisatie van deze hBVSC subsets bleek dat alle drie precursor celpopulaties bezitten mesodermale ontwikkelingsstoornissen potentialen Soortgelijke typische MSCs, zoals skelet myogenesis, osteogenese, chondrogenese en adipogenese. Alle hBVSC subsets vertonen ook klassieke MSC markers, zoals CD44, CD73, CD90 en CD105, vers en in de cultuur. Gezamenlijk deze bewijsstukken ondersteunde de vasculaire oorsprong van MSC's. Bovendien is de therapeutische mogelijkheden van MEC's, PC's en ACs onlangs aangetoond in afzonderlijke studies. MEC's ​​gesorteerd van de volwassen menselijke spier biopsieën werden getoond van de benadeelden en dystrofische skeletspieren en reparatie gewond hartspier efficiënter dan skeletmyoblasten en vasculaire endo regenererenthelial cellen (EC's). Gezuiverde PCs van verschillende menselijke organen bleken ook te repareren / regenereren gewonde en dystrofische skeletspieren en tot de satelliet celpool 13-16. Zeer recent hebben we aangetoond dat de pc's zijn afgeleid van de menselijke skeletspier effectief repareren het infarct hartspier via indirecte paracrien effect en directe cellulaire interacties 17. ACs, anderzijds, zijn hetzij rechtstreeks geïsoleerd uit geëxplanteerde bloedvaten of gezuiverd door FACS uit menselijk vetweefsel en skeletspier. Een opvallende pro-angiogene werking van ACS werd aangetoond in een muis achterpoot ischemie model 19. Bovendien zijn ACs ook aangetoond infarct myocardium bij conventionele MSCs herstellen en geeft de robuuste therapeutisch potentieel van ACS in ischemisch weefselherstel 20.

De huidige zuivering protocol subsidies gelijktijdige, prospectieve zuivering van MEC's, pc's, enACs van de vasculatuur van een menselijke skeletspier biopsie. Dit stelt ons in staat om te studeren en / of kies de optimale hBVSC subpopulatie voor verschillende therapeutische doeleinden. Bovendien, deze nieuwe techniek breidt het repertoire van stam / progenitorcellen die kunnen worden afgeleid uit humane skeletspier, waardoor het een ideale bron van multipotente precursorcellen regeneratieve geneeskunde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1 spierbiopsie Processing

  1. Behoud menselijke skeletspier biopsie op ijs in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 5% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine (P / S) tijdens het transport.
  2. Na ontvangst van de spierbiopsie, verwijdert het preparaat uit de transportcontainer en was tweemaal in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) aangevuld met 2% antibiotica-antifungale oplossing (A / A) onder steriele omstandigheden.
  3. Verwijder de aangehechte vet en bindweefsel met steriele scharen en pincetten in DMEM aangevuld met 2% A / A.
  4. Grote bloedvaten te verwijderen onder de dissectie microscoop en vervolgens snijd de spier specimen in kleine stukjes (<1 cm 2 in grootte).
  5. Behoud gesneden spier pieces (<5 g) in 20 ml conservering medium (PM, DMEM gesupplementeerd met 10% FBS en 1% P / S) en 4 ℃ tot 5 dagen.

2 Muscle Dissociation and Cell Isolation

  1. Op de dag van celisolatie verwijderen spier stukken uit uur en tweemaal wassen in PBS gesupplementeerd met 2% P / S. De verteringsoplossing, voegt type I, type II en type IV collagenasen (100 mg / ml) vers in PM.
  2. Hak en mechanisch gehakt spier stukken met een steriele schaar en pincet in een petrischaal met een kleine hoeveelheid van PM tot de oplossing passeert 10 ml serologische pipet zonder klonteren. Verwijder het resterende vet en bindweefsel tijdens dit proces. Gebruik minimaal 8-10 gram volwassen spieren of 2 gram foetale spier voor elke cel isolatie.
  3. Overdracht 4-5 gram gehakt volwassen spier 20 ml (of 2 gram gehakt foetale spier in 10 ml) Ofthe digestie oplossing met een 10 ml serologische pipet. Digest voor 50 - 60 minuten bij 37 ℃ op een orbitale schudder bij 70 - 80 rpm. Optimaliseer cel opbrengst oppervlakteantigeen bewaring door aanpassing van de digestie tijd en / of bewegingssnelheid derhalve gebaseerd op de hoeveelheidweefsel. Let op de spijsvertering Status elke 15-20 minuten, totdat de troebelheid verdwijnt bijna.
  4. Krachtig pipet het gedigereerde weefsel 3-5 keer met 10 ml serologische pipet. Voeg evenveel PM om de reactie te stoppen en centrifugeer bij 400 xg gedurende 4 minuten.
  5. Verwijder het supernatant voorzichtig; resuspendeer de pellet met 10 ml PM te wassen en vervolgens gefiltreerd door een 100 urn zeef cel.
  6. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 4 minuten en verwijder voorzichtig de bovenstaande vloeistof. Resuspendeer pellets in erytrocyten lysis buffer (155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mm EDTA), filtreer door een 70 um cel zeef om een enkele celsuspensie te verkrijgen en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Filtreer door een 70-m cel zeef weer of geen neerslag waargenomen.
  7. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 4 min en resuspendeer de cel pellet in 0,5 ml PBS. Tel het aantal cellen. Zorg voor een totaal van minstens 5 miljoen cellen voor cel sorteren. Verdun de enke celsuspensie tot minder dan 5 miljoen cellen per ml met PBS voor kleuring. Neem 50-100 ul van de celsuspensie en verdeeld in 11 buizen voor controle kleuringen (onbesmet controle, negatieve controles, en single-color positieve controles).

3 Cell Labeling en sorteren

  1. Incubeer de enkele celsuspensie gedurende 10 minuten bij 4 ℃ in muizenserum (verdund 1:10 in PBS) voor het blokkeren daartoe indien nodig.
  2. Add CD34-APC, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PE, en CD146-FITC (alle 1: 100) in de enkele celsuspensie en incubeer gedurende 20 minuten bij 4 ℃. Voor negatieve controle, voeg equivalente concentraties van APC APC-Cy7-, PE-Cy7-, PE-en FITC-geconjugeerde IgG isotype antilichamen en incubeer gedurende 20 minuten bij 4 ℃. Voor single-color positieve controles, voeg equivalente concentraties van CD34-APC, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, PE-CD144 en CD146-FITC afzonderlijk in elke buis en incubeer gedurende 20 minuten bij 4 ℃.
  3. Na incubatieCentrifugeer bij 400 xg gedurende 4 minuten te wassen. Resuspendeer de celpellet in 1 - 2 ml DMEM aangevuld met 5% FBS en 1% P / S. De eindconcentratie van de celsuspensie dient minder dan 5 miljoen cellen per ml. Voeg 7-AAD (1: 100) en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur dode cel uitsluiting. Voor negatieve controle en single-color positieve controles, resuspendeer celpellets in 0,5 ml DMEM aangevuld met 5% FBS en 1% P / S.
  4. Breng alle celsuspensies tot ronde bodem polystyreen flowcytometrie buizen. Bereid cel verzamelbuizen (elke buis is vooraf gevuld met 500 ul van de juiste kweekmedium: MPM voor MEC; EGM-2 PCs, AC medium voor ACs). Transport celsuspensies op ijs de cel sorter.
  5. Run celsuspensies op de cel sorter in de volgorde van de ongekleurde controle, negatieve controles, eenkleurige positieve controles, en de belangrijkste celsuspensie tijdens het instellen van de laser intensiteit, kanaal compensatie, en celpopulatie gating streng naar cel p maximaliserenurity (zie artikelen gepubliceerd door Jupiter en andere tijdschriften voor de details van flowcytometrie).
  6. Verzamel gewenste celpopulaties in de juiste verzameling buizen. Bewaar het verzamelde cellen op 4 ℃ als ze niet onmiddellijk zaaien.

4 Post-sortering Cell Culture

  1. Zaad vers naargelang MEC (P0) op <10.000 cellen / cm 2 in MPM op platen pre-coated met type-I collageen. Voor de daaropvolgende passage van MEC's, zaad 3.500 - 4.000 cellen / cm 2 in MPM op platen / flessen pre-coated met type-I collageen.
  2. Zaad vers naargelang PCs (P0) op <20.000 cellen / cm 2 in EGM-2 op platen vers gecoat met 0,2% gelatine. Voor de daaropvolgende passage van pc's, splitsen cellen op 1: 3 verhouding in PC (DMEM aangevuld met 20% FBS en 1% P / S) op regelmatige polystyreen cultuur platen tot P2. Vanaf P3 verder, zaad cellen bij 6.500 - 7.000 cellen / cm 2 in de PC-medium op regelmatige polystyreen cultuur platen / kolven.
  3. Zaad vers naargelang ACS (P0) op <20.000 cellen / cm 2 in AC (DMEM aangevuld met 20% FBS en 1% P / S) op regelmatige polystyreen cultuur platen. Voor de daaropvolgende passage van ACS, zaad cellen bij 6.500 - 7.000 cellen / cm 2 in AC medium op regelmatige polystyreen cultuur platen / kolven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

FACS parameters worden eerst gecorrigeerd op basis van de resultaten van de ongekleurde controle, negatieve controles, en single-color positieve controles data. Na uitsluiting van dode cellen, wordt fluorescentie gelabelde celsuspensie onderworpen aan een reeks van negatieve en positieve marker celoppervlak selecties. Eerst worden CD45 + cellen gated vóór CD56 + en CD56 - cellen worden gescheiden van de CD45 - fractie. De CD56 + fractie wordt verder onderworpen aan CD34-CD144 selectie waar alleen CD34 + / CD144 + (dual-positieve) cellen gemarkeerd als MEC's ​​(CD34 + / 56 + / 144 + / 45 -) en vervolgens opgevangen (figuur 1). Ook de CD56 - fractie wordt verder onderworpen aan CD34-CD146 selectie waar alleen CD34 - / CD146 + cellen worden gemarkeerd als PCs (CD146 + / 34 - / 45 - / 56 -) en vervolgens opgevangen ( + / CD146 - fractie wordt onderworpen aan een additionele negatieve CD31 selectie EC (CD34 + / CD31 +) en alleen CD34 + / CD31 inclusief - subset gemarkeerd als ACs (CD34 + / 31 - / 45 - / 56 - / 146 -) voor verzameling (Figuur 1). Om het proces te vereenvoudigen, kan CD144 worden gebruikt om CD31 vervangen voor uitsluiting van EC.

Vers gesorteerde cellen kan worden gezaaid in kweekomstandigheden gespecificeerd in het protocol voor verdere uitbreiding of direct gebruikt voor in vivo experimenten. Clonale expansie van hBVSC subsets kan worden bereikt door FACS Aria autoclone systeem of werkwijze met beperkende verdunning 13, 21. In tegenstelling tot de typische heterogene MSC's, culturen van hBVSC subsets blijven homogeen, zelfs na langdurige expansie. Representatieve morfologie gekweekte hBVSC subsets, gezuiverd uit spier biopsieën uit eendonor, weergegeven in figuur 2. Vergelijkingen tussen typische MSCs en gezuiverd hBVSC subsets zijn samengevat in tabel 1.

Figuur 1
Figuur 1 Vertegenwoordiger sorteren van de drie deelverzamelingen van menselijk bloed-schip-afgeleide stamcellen (hBVSCs) van een enkel menselijk skelet spierbiopsie. Zuiverheid van elke gesorteerde celpopulatie wordt verder bevestigd door post-soort analyse. Klik hier om te bekijken grotere versie van deze figuur.

Figuur 2
Figuur 2 De drie hBVSC subpopulaties, gesorteerd naar homogeniteit, tentoongesteld verschillende morfologie in cultuur (links naar rechts): myogene endotheelcellen (MEC), pericyte (PC), en adventitia cel (AC) (bij passage 4, schaal bars = 100 mm). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

MSC MEC PC's AC's
Zuiverheid Heterogene Homogene Homogene Homogene
Celoppervlak antigen profiel voor zuivering N / A CD34 + CD56 + CD144 CD45- + CD31- CD34 + CD45- CD146-
MSC marker expressie in cultuur CD29 + CD44 + CD73 + CD90 + CD105 + CD29 + CD44 + CD90 + CD105 + CD44 + CD73 + CD90 + CD105 + CD44 + CD73 + CD90 + CD105 +
Multipotent Myogenesis (+) adipogenese (+) Osteogenesis (+) chondrogenese (+) Myogenesis (+) adipogenese (+) Osteogenesis (+) chondrogenese (+) Myogenesis (+) adipogenese (+) Osteogenesis (+) chondrogenese (+) Myogenesis (N / A) adipogenese (+) Osteogenesis (+) chondrogenese (+)
Mogelijke toepassingen Skeletomuscular reparatie / regeneratie: bot, kraakbeen, pezen, gewrichtsbanden en skeletspieren; Cardiale reparatie; Vasculaire reparatie; Wondgenezing; Immunoregulatie Cardiale reparatie; Skeletspieren reparatie / regeneratie; Bot / kraakbeen reparatie / regeneratie Cardiale reparatie; Vasculaire reparatie / regeneratie; Skeletspieren reparatie / regeneratie; Botherstel Cardiale reparatie; Vasculaire reparatie / regeneratie; Botherstel
Anatomische lokalisatie in situ N / A Bloedvat Intima Bloedvat Media Bloedvat adventitia

Tabel 1: Vergelijking van de typische MSC's en multipotente hBVSC subpopulaties.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Identificatie en zuivering van hBVSC subpopulaties vertegenwoordigen een belangrijke stap vooruit in het begrijpen van MSC ontogenie. Er is steeds meer bewijs met vermelding van het perivasculaire herkomst van MSC en de associatie tussen weefsel-specifieke voorloper cellen en bloedvaten 22-25. Bovendien, het vermogen om homogene subpopulaties hBVSCs verder helpt het begrip van MSC heterogeniteit en vasculaire celbiologie 26 isoleren.

In de afgelopen jaren hebben MEC's, pc's en AC's zijn individueel geïdentificeerd en geïsoleerd door middel van verschillende protocollen in afzonderlijke studies. Er is echter geen poging gedaan om drie hBVSC subsets gelijktijdig zuivert van humane skeletspier vanwege moeilijkheden om het weefsel dissociatie procedure en de combinatie van selectieve cellijn markers identificeren MEC's, PC's en ACs geheel optimaliseren. Hier beschrijven we een nieuwe cel isolatie protocol dat gelijktijdige purif toelaaticatie van MEC's, PC's en ACs uit een enkel menselijk spierbiopsie door aanpassing van het weefsel dissociatie proces en toepassing van een nieuwe combinatie van selectieve celoppervlak markers (figuur 1). Voor het beste resultaat, de kritische stappen in het huidige protocol, dat extra aandacht nodig hebben zijn onder andere: 1 Versheid en het behoud van het weefsel specimen; 2 Optimalisatie van cel opbrengst en oppervlakte-antigeen behoud door zorgvuldige controle van het verteringsproces en het aanpassen van het weefsel dissociatie tijd; 3 Nauwkeurige kalibratie van de zes kleuren flowcytometrie. Deze parameters worden bepaald door individuele laboratorium volgens haar specifieke vraag / installeren van apparatuur.

Door de implementatie van dit nieuwe protocol, kan men niet alleen het stroomlijnen van de synchrone isolatie van meerdere hBVSC subpopulaties, maar ook het gebruik van hBVSCs voor fundamenteel onderzoek en translationeel toepassing, zoals de vergelijking van differentiële cellulaire gedrag tussen hBVS vergemakkelijkenC deelverzamelingen en de optimalisatie van enkele of combinatorische hBVSC deelverzameling (s) voor verschillende gepersonaliseerde therapeutische toepassingen. Echter de gelijktijdige isolatie van drie hBVSC subsets momenteel beperkt tot skeletspier omdat dat MEC's ​​niet zijn geïdentificeerd in andere humane weefsels. Trouwens, het is buiten de begrenzing van het huidige protocol bij de overgang en / of cellulaire hiërarchie tussen deze drie hBVSC subpopulaties onderscheiden.

Karakterisering van vers geïsoleerde en beschaafde MEC's, pc's en AC's is afzonderlijk aangetoond in eerdere studies MEC in cultuur houden van de expressie van de myogene marker CD56 maar verliezen geleidelijk de expressie van het EG-markers CD34 en CD144. Op klonale niveau MEC drukken MSC markers, zoals CD29, CD44, CD90 en CD105, en tonen mesenchymale differentiatie potentieel zoals chondrogenese, osteogenese, adipogenese, en myogenese. Bovendien klonale MEC behouden hun geneseic capaciteit na langdurige kweek, vormen capillaire-achtige netwerken in Matrigel cultuur en deelnemen aan neovascularisatie in vivo 21.

PC, vers of gekweekte, is aangetoond dat niet alleen MSC markers, zoals CD44, CD73, CD90, en CD105 expressie, maar vertonen ook mesodermale ontwikkelings capaciteiten bijvoorbeeld skelet myogenesis, osteogenese, chondrogenese en adipogenese 13. PC robuust scheiden verschillende trofische factoren, zelfs onder hypoxie, en dienen als regeneratieve eenheden via de paracriene functie direct differentiatie en cellulaire interactie gedurende het weefselherstel / regeneratieproces ACs, vergelijkbaar met pc, werden naar klassieke MSC markers tot expressie en differentiëren in belangrijke mesenchymale cellijnen 18. Samen met pc, ACs zijn ook voorgesteld als een van de ontwikkelings oorsprong van MSCs. Samenvatting vergelijken van de celoppervlaktemarker expressie, differentiatievermogen, en pOGELIJKE translationele toepassingen typisch tussen MSC en hBVSCs is opgenomen in tabel 1. Recentelijk Tang et al. geïdentificeerd vasculaire multipotente stamcellen (MVSCs) van de tunica media van grote bloedvaten in ratten en mensen 29. MVSCs niet alleen differentiëren in gladde spiercellen maar ook bijdragen aan vasculaire remodellering en neointima hyperplasie na bloedvatletsel 29. Of MVSCs delen ontwikkelings connecties met BVSCs die woonachtig zijn in de microvasculatuur en kleine vaartuigen, vergt nader onderzoek.

Het huidige protocol moet op tijd cell isolatie uit vers menselijk spierbiopsie, die soms niet toegankelijk in de klinische instellingen zijn. Alternatief, gebaseerd op een gemodificeerde reeks selectieve celoppervlak markers, is het mogelijk om MEC's ​​en PC's van gecryopreserveerde menselijke primaire skeletspiercellen celculturen zuiveren door flowcytometrie 30. Deze methode maakt het mogelijk potentiële purificatie van twee hBVSC subsets van opgespaarde de menselijke skeletspier cultuur voor therapeutische doeleinden. Omdat echter het gebrek aan CD34 expressie in gekweekte humane spiercellen, is het niet mogelijk om ACs verder scheiden met dit protocol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

De auteurs willen Alison Logar bedanken voor haar uitstekende technische bijstand met flowcytometrie. Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Ministerie van Defensie (JH), de Henry J. Mankin leerstoel (JH), en het ministerie van Onderwijs en Wetenschappen van de Republiek Kazachstan (AS). CWC werd mede ondersteund door de American Heart Association predoctorale fellowship (11PRE7490001). M.Corselli werd ondersteund door het California Institute for Regenerative Medicine training subsidie ​​(TG2-01169).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase type 1 Sigma C5894 Sterile vial
Collagenase type 2 Sigma C1764 Sterile vial
Collagenase type 4 Sigma C1889 Sterile vial
Anti-human CD34 APC BD Pharmingen 555824 Keep sterile
Anti-human CD45 APC-Cy7 BD Pharmingen 557833 Keep sterile
Anti-human CD56 PE-Cy7 BD Pharmingen  557747 Keep sterile
Anti-human CD144 PE Beckman Coulter A07481 Keep sterile
Anti-human CD146 FITC AbD Serotec MCA2141F Keep sterile
FACS Aria II Flow Cytometer Becton-Dickinson
EGM-2 complete medium Lonza CC-3162 For culturing PCs (only P0)
DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate Invitrogen 11965 For culturing PCs
DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, with sodium pyruvate Invitrogen 11995 For culturing MECs and ACs
Fetal bovine serum Invitrogen 10437-028
Heat-inactivated horse serum Invitrogen 26050-088
Penicillin/streptomycin Invitrogen 15140-122
Antibiotic-antimycotic (100X) Invitrogen 15240-062
Trypsin-EDTA 0.5% (10X) Invitrogen 15400-054
Dulbecco’s PBS without calcium and magnesium Invitrogen 14190-250
Chick embryo extract Accurate Chemical CE650T-10 Filter before use

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peault, B., et al. Stem and Progenitor Cells in Skeletal Muscle Development. Maintenance, and Therapy. Mol Ther. 15, 867-877 (2007).
  2. Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat Cell Biol. 3, 778-784 (2001).
  3. Zuk, P. A., et al. Human Adipose Tissue Is a Source of Multipotent Stem Cells. Mol. Biol. Cell. 13, 4279-4295 (2002).
  4. Zimmerlin, L., et al. Stromal vascular progenitors in adult human adipose tissue. Cytometry. 77, 22-30 (2010).
  5. Reyes, M., et al. Origin of endothelial progenitors in human postnatal bone marrow. The Journal of Clinical Investigation. 109, 337-346 (2002).
  6. Choi, Y., Ta, M., Atouf, F., Lumelsky, N. Adult pancreas generates multipotent stem cells and pancreatic and nonpancreatic progeny. Stem Cells. 22, 1070-1084 (2004).
  7. Zengin, E., et al. Vascular wall resident progenitor cells: a source for postnatal vasculogenesis. Development. 133, 1543-1551 (2006).
  8. Corselli, M., Chen, C. W., Crisan, M., Lazzari, L., Peault, B. Perivascular ancestors of adult multipotent stem cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30, 1104-1109 (2010).
  9. Ballas, C. B., Zielske, S. P., Gerson, S. L. Adult bone marrow stem cells for cell and gene therapies: Implications for greater use. Journal of Cellular Biochemistry. 85, 20-28 (2002).
  10. Chen, C. -W., Corselli, M., Péault, B., Huard, J. Human Blood-Vessel-Derived Stem Cells for Tissue Repair and Regeneration. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 597439 (2012).
  11. Zheng, B., et al. Prospective identification of myogenic endothelial cells in human skeletal muscle. Nat Biotech. 25, 1025-1034 (2007).
  12. Okada, M., et al. Myogenic Endothelial Cells Purified From Human Skeletal Muscle Improve Cardiac Function After Transplantation Into Infarcted Myocardium. Journal of the American College of Cardiology. 52, 1869-1880 (2008).
  13. Crisan, M., et al. A Perivascular Origin for Mesenchymal Stem Cells in Multiple Human Organs. Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).
  14. Park, T. S., et al. Placental Perivascular Cells for Human Muscle Regeneration. Stem Cells and Development. 20, 451-463 (2011).
  15. Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat Cell Biol. 9, 255-267 (2007).
  16. Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat Commun. 2, 499 (2011).
  17. Chen, C. -W., et al. Human pericytes for ischemic heart repair. STEM CELLS. 31, (2), 305-316 (2012).
  18. Corselli, M., et al. The tunica adventitia of human arteries and veins as a source of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 21, 1299-1308 (2012).
  19. Campagnolo, P., et al. Human Adult Vena Saphena Contains Perivascular Progenitor Cells Endowed With Clonogenic and Proangiogenic Potential. Circulation. 121, 1735-1745 (2010).
  20. Katare, R., et al. Transplantation of Human Pericyte Progenitor Cells Improves the Repair of Infarcted Heart Through Activation of an Angiogenic Program Involving Micro-RNA-132 / Novelty and Significance. Circulation Research. 109, 894-906 (2011).
  21. Zheng, B., et al. Human myogenic endothelial cells exhibit chondrogenic and osteogenic potentials at the clonal level. Journal of Orthopaedic Research. 31, 1089-1095 (2013).
  22. Caplan, A. I. All MSCs Are Pericytes. Cell Stem Cell. 3, 229-230 (2008).
  23. Feng, J., Mantesso, A., Sharpe, P. T. Perivascular cells as mesenchymal stem cells. Expert Opinion on Biological Therapy. 10, 1441-1451 (2010).
  24. Tang, W., et al. White Fat Progenitor Cells Reside in the Adipose Vasculature. Science. 322, 583-586 (2008).
  25. Krautler, N. J., et al. Follicular Dendritic Cells Emerge from Ubiquitous Perivascular Precursors. Cell. 150, 194-206 (2012).
  26. Phinney, D. G. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells: Implications for cell therapy. Journal of Cellular Biochemistry.113. 113, 2806-2812 (2012).
  27. Chen, C. -W., et al. Perivascular multi-lineage progenitor cells in human organs: Regenerative units, cytokine sources or both. Cytokine and Growth Factor Reviews. 20, 429-434 (2009).
  28. Lin, C. -S., Lue, T. F. Defining Vascular Stem Cells. Stem Cells Dev. 22, 1018-1026 (2013).
  29. Tang, Z., et al. Differentiation of multipotent vascular stem cells contributes to vascular diseases. Nat Commun. 3, 875 (2012).
  30. Zheng, B., et al. Isolation of myogenic stem cells from cultures of cryopreserved human skeletal muscle. Cell Transplant. 21, 1087-1093 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics