Optimering og udnyttelse af

Biology
 

Summary

Forbigående protein produktion i Nicotiana anlæg baseret på vakuum infiltration med Agrobacteria transporterer lanceringen vektorer (tobakmosaikvirus-baseret) er en hurtig og økonomisk tilgang til at producere vaccineantigener og terapeutiske proteiner. Vi forenklet procedure og forbedret target ophobning ved at optimere betingelserne for dyrkning bakterier, vælge værtsart og co-indføre RNA silencing undertrykkere.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Shamloul, M., Trusa, J., Mett, V., Yusibov, V. Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana. J. Vis. Exp. (86), e51204, doi:10.3791/51204 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Agrobacterium-medieret forbigående proteinproduktion i planter er en lovende metode til at producere vaccineantigener og terapeutiske proteiner inden for en kort periode. Imidlertid er denne teknologi kun lige begyndt at blive anvendt på storstilet produktion så mange teknologiske hindringer for at skalere op, er nu ved at blive overvundet. Her vil vi vise en enkel og reproducerbar metode til industriel skala forbigående protein produktion baseret på vakuum infiltration af Nicotiana planter med Agrobacteria transporterer lanceringen vektorer. Optimering af Agrobacterium dyrkning i AB medium giver mulighed for direkte fortynding af bakteriekulturen i Milli-Q vand, forenkle infiltration processen. Blandt tre testede arter af Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior) blev valgt som den mest lovende vært på grund af den lethed, infiltration, højt niveau af reporter protein produktion, og omkring to-fgammel højere biomasseproduktion under kontrollerede miljøforhold. Induktion af Agrobacterium huser pBID4-GFP (tobakmosaikvirus-baseret) brug af kemikalier såsom acetosyringon og monosaccharid havde ingen effekt på produktionsniveauet protein. Infiltrerende anlæg under 50 til 100 mbar i 30 eller 60 sekunder resulterede i omkring 95% infiltration af plante bladvæv. Infiltration med Agrobacterium laboratoriestamme GV3101 viste den højeste proteinproduktion sammenlignet med Agrobacteria laboratoriestammer LBA4404 og C58C1 og vildtype-Agrobacterium-stammer AT6, at10, at77 og A4. Co-ekspression af et viralt RNA silencing suppressor, p23 eller p19, i N. benthamiana resulteret i tidligere ophobning og øget produktion (15-25%) af target protein (influenzavirus hemagglutinin).

Introduction

Planter er nu anerkendt som en sikker, pålidelig, skalerbar og billig platform til produktion af heterologe rekombinante biofarmaceutiske og industrielle proteiner 1-3 og har vigtige fordele i forhold mikrobielle og animalske celleekspressionssystemer 4. Planter er i stand til at udtrykke korrekt foldede proteiner med post-translationelle modifikationer, herunder samlet multimeriske antistoffer 5-7. Adskillige plantebaserede rekombinante farmaceutiske proteiner undergår klinisk evaluering 8. Disse omfatter patient-specifikke rekombinante idiotype vacciner (scFv) til behandling af non-Hodgkins lymfom 9, hemagglutinin-baserede pandemi og sæsonbestemte influenza vaccine kandidater 10,11 (Cummings et al., Der blev forelagt Vaccine), anti-Streptococcus overflade antigen I / II-antistof til behandling af caries 12 og humant insulin til behandling af diabetes 13. Derudover er menneskelig Recombinant glucocerebrosidase for enzymsubstitutionsterapi patienter med Gauchers sygdom er blevet godkendt i Israel og USA, og gives under programmet for forlænget adgang uden for USA 14,15.

Heterologe proteiner kan produceres i stabilt transformeret (transgen eller transplastomic) eller transient transformerede planter. Forbigående protein produktion giver flere fordele i forhold til produktionen i transgene planter, herunder kort tidshorisont for at opnå ekspression og akkumulering 16, og kan opnås ved at indføre bakterielle binære vektorer eller rekombinante plante virale vektorer i plantevæv 4. Den mest avancerede transient ekspression systemet er baseret på brugen af 'launch vektorer', der kombinerer elementer af plante virus og binære plasmider, og er leveret af agroinfiltration 17,18. Agroinfiltration for lancering vektor baseret på tobak (TMV) er blevet anvendt med succes på labskaleres til at producere vaccine antigener mod patogener såsom humant papillomvirus 19, Yersinia pestis 20, influenzavira A 21,22, Bacillus anthracis 23 og koppevirus 24 i N. benthamiana blade. Agrobacterium-medieret transient ekspression er også en lovende metode til samtidig produktion af multiple proteiner 2,25-27. For eksempel har plante Transiente ekspressionssystemer er blevet anvendt til at producere tumor-specifikke rekombinante antistoffer 28,29, et glycosyleret rekombinant antistof mod epidermal vækstfaktorreceptor 30, og et monoklonalt antistof specifikt for miltbrand beskyttende antigen 31,32. Co-infiltration af Nicotiana benthamiana planter med et mål-gen og en undertrykker af gendæmpning resulterer i forøget target protein udtryk 33,34.

Agroinfiltration er en fælles metode til ensartet introdusiering bakterier huser et gen af interesse i plantevæv 35-37. Vacuum infiltration af Agrobacterium til transient genekspression i intakt plante blade er en hurtig, skalerbar og brugbar metode til produktion af fremmede proteiner uden behov for at generere transgene planter 38-41. Under vakuum agroinfiltration, er planter vendt på hovedet og overjordiske dele nedsænket i Agrobacterium suspension. Derefter vakuum påføres forårsager gasser til at evakuere fra blad intercellulære rum gennem stomata. Hurtig re-tryksætning efter frigivelse af vakuum resulterer i infusion af Agrobacterium suspension i bladet. Efter vakuum infiltration af Agrobacteria, er planter dyrkes yderligere og mål udtryk overvåges. De højeste niveauer af mål udtryk er typisk observeret 2-3 dage efter infiltration (dpi) med en binær vektor og 4-7 dpi med en lancering vektor, hvorefter udtrykket niveau typisk decreases 17,18,42-45. Agrobacterium tumefaciens er den mest udbredte middel til at levere et gen af interesse i en plante til proteinproduktion. Agroinfiltration fungerer usædvanligt godt i N. benthamiana men relativt dårligt i de fleste andre planter, herunder Arabidopsis thaliana 46..

I denne undersøgelse har vi udviklet en enkel, effektiv og økonomisk metode til forbigående protein produktion i 5-6 uger gamle N. benthamiana hjælp A. tumefaciens infiltration. Den største ulempe ved industriel skalering af agroinfiltration teknik er centrifugering af høstede bakterier og resuspendering af den bakterielle pellet i medium indeholdende 4'-hydroxy-3 ', 5'-dimethoxyacetophenon (acetosyringon) monosaccharider, og 2 - (N-morpholino) -ethansulfonsyre (MES) puffer til induktion af vir-gener. Vi har været i stand til at overvinde disse problemer ved at optimere Agrobacterium N. benthamiana og N. træuld, samt hybrid N. excelsiana.

Protocol

1.. Planteavl

Til efterfølgende agroinfiltration vi evalueret to vildtype Nicotiana arter (N. benthamiana og N. Excelsior) og en hybrid (N. excelsiana) dyrket hydroponically på rockwool i indendørs faciliteter.

  1. Soak rockwool plader i en plante gødning løsning.
  2. Soen frø af vildtype N. benthamiana, N. excelsior og N. excelsiana (hybrid af N. benthamiana × N. excelsior) på de næringsstoffer gennemblødt rockwool overflade.
  3. Dyrke planter fra frø under kontrollerede betingelser (24 ° C og 40-65% relativ fugtighed) og en lang dag fotoperiode (14 timers lys og 10 timers mørke, med belysning af 130-150 uE m -2 sek -1) 4-5 uger for N. benthamiana og N. excelsiana og 5-6 uger for N. excelsior.

2.. Konstruktion af vektorer for Agroinfiltration

  1. Indsæt en syntetisk reporter gen (grønt fluorescerende protein [GFP]), fuld længde hæmagglutinin (HA) fra A/California/04/2009 stamme af influenza virus (HAC1), og omlagte lichenase enzym (LicKM) 18 separat i lanceringen vektor pBID4 18 (TMV-baserede vektor) for at opnå pBID4-GFP, pBID4-HAC1 og pBID4-LicKM hhv 18,32,41,47.
  2. Indførelse 10-50 ng pBID4 bærer GFP eller HAC1 i elektrokompetente celler af A. tumefaciens stamme GV3101 og LicKM i elektrokompetente celler af A. tumefaciens stammer GV3101, C58C1, GLA4404, AT06, AT10, At77 og A4 med genet MicroPulser elektroporator.
  3. Brug transformerede Agrobakterier for infiltration eksperimenter, medmindre andet er angivet.

3.. Støvsug Infiltration af Agrobacterium i Nicotiana Planter

  1. Grow A. tumefaciens stammer natten over (O / N) i LB-medium, YEB withium eller AB-medium suppleret med 50 mg / L kanamycin ved 28 ° C med omrystning ved 200-250 rpm.
  2. Fortynd Agrobakterier i Milli-Q-vand til en optisk densitet ved 600 nm (A600) på 0,5 eller centrifugeres Agrobacterium-celler dyrket i LB eller YEB eller AB ved 4.000 × g i 10 min ved 4 ° C, re-suspendere induktion medium (1x MS salt, 10 mM MES, 200 uM acetosyringon, 2% saccharose [MMA]) til A600 på 0,5, og der omrøres ved stuetemperatur i 1-3 time, med mindre andet er angivet.
  3. Infiltrere planter i et vakuumkammer ved at nedsænke Nicotiana plante luften væv i Agrobacterium suspension og at anvende en 50-400 mbar vakuum i 30 eller 60 sek. Den optimale infiltration anvendes rutinemæssigt ved 50-100 mbar i 60 sek.
  4. Når vakuummet er brudt, fjernes planterne fra vakuumkammer, skylles i vand, og vokse i 5-7 dage under de samme vækstbetingelser, der anvendes til præ-infiltration vækst.
  5. For at teste effektivitetenkemikalier inducerer Agrobacterium vir-genet, forskellige koncentrationer af acetosyringon (0, 100, 200 eller 400 pM) blev tilsat til Agrobacteria suspenderet i infiltration buffer (1x MS, 10 mM MES, 2% glucose). For effekten af monosaccharid på induktion af vir-genet forskellige procentdele af glukose (0, 1, 2 eller 4%) blev tilsat til Agrobacteria suspenderet i infiltration buffer (1x MS, 10 mM MES, 200 uM acetosyringon). N. benthamiana planter blev infiltreret som nævnt ovenfor i trin 3.3 og 3.4).
  6. Agrobacterium laboratoriestammer GV3101, C58C1 og LBA4404 og vildtypestammer A4, AT06, AT10 og At77 huser pBID4-LicKM vektor blev fortyndet i Milli-Q-vand til A 600 på 0,5. N. benthamiana planter blev infiltreret med hver enkelt stamme som nævnt ovenfor i trin 3.3 og 3.4.

4.. Co-agroinfiltration Procedure for Viral Silencing lyddæmper

  1. MIX, de Milli-Q vand fortyndet Agrobacterium GV3101 kulturer bærer GFP-genet og den virale undertrykkelse suppressor p19 tomat busket stunt virus (TBSV) ved 1:1, 2:1, 3:01 og 4:01 nøgletal. Infiltrere N. benthamiana planter som beskrevet ovenfor.
  2. Infiltrere N. benthamiana planter med en blanding af to Milli-Q vand fortyndet Agrobacterium GV3101 kulturer: den første bærer pBID4-HAC1 plasmid, og den anden bærer en af undertrykkelse undertrykkere - P19 af TBSV eller p23 Citrus tristeza virus, i pCassp plasmid ( pCassp19) og i PGR binære plasmid under 35S promotoren (PGR-P23), henholdsvis i forholdet 4:1.

5.. Western Blot analyse

  1. Saml tilfældige bladprøver fra N. benthamiana, N. excelsior eller N. excelsiana planter på 4-7 dpi og pulverisere i flydende nitrogen til et fint pulver.
  2. Tilsæt tre volumener 1x PBS-buffer indeholdende 0,5% TritonX-100 til hver prøve.
  3. Ryst forsigtigt de udtrukne prøver i 15 min ved 4 ° C.
  4. Spin ekstraktet i 5 minutter og indsamle totalt opløseligt protein i et rent Eppendorf-rør.
  5. Fortyndes ekstrakterne til en passende fortynding (1:50 1:100) i 1x PBS ekstraktionsbuffer, og der tilsættes 5 × prøvepuffer (250 mM Tris-HCI [pH 6,8], 10% SDS, 0,5% bromphenolblåt, 50% glycerol v / v, og 500 mM DTT) til en endelig 1 × koncentration.
  6. Kog prøver i 5 min.
  7. Separate proteiner ved 10% SDS-PAGE, overførsel til Immobilon-P overføringsmembran, og blokere med 0,5% I-blokken.
  8. Detect GFP under anvendelse af kanin polyklonalt anti-GFP-antiserum på 1:5000 og HAC1 anvendelse af muse-anti-polyhistidin-monoklonalt antistof på 1:1000 i blokerende opløsning i 1 time.
  9. Efter den primære antistof mærkning vaske membranerne tre gange i 10 minutter hver med 1 × PBST-20 og inkuberes med peberrodsperoxidase (HRP)-konjugeret anti-kanin-antistof på 1:5000 eller et HRP-konjugatd anti-muse-antistof ved 1:10.000 i 1 time for GFP og HAC1 detektion hhv.
  10. Proces Western blots under anvendelse af SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrat.
  11. Brug GeneTools Software til at analysere båndintensitet af proteinet og få båndet kalibreret mængde.

Protein produktion: (kalibreret mængde x fortynding af prøven) / prøvemængde lastet) x 4 = mg / kg.
Ligning: Protein produktion (P), Kalibreret mængde (C), fortynding af prøven (D) og prøvemængde indlæst (S).

6.. Zymogram Assay

  1. Saml pBID4-LicKM-infiltreret N. benthamiana tilfældig vævsprøver.
  2. Uddrag proteiner under anvendelse af de samme metoder som beskrevet ovenfor for Western blot-analyse, og derefter analysere ved 10% SDS-PAGE med 0,1% lichenan inkluderet i gelerne.
  3. Efter elektroforese vaskes gelerne to gange i 10 min i vaskepuffer (100 mM Tris-HCI [pH 8,0], og 0,1% Triton X-100), Og derefter inkuberes i vaskebuffer ved 65 ° C i 1 time.
  4. Efter inkubation kassere vaskepufferen og plette gelerne med 0,5% Congo Red i 5 minutter ved stuetemperatur.
  5. Skyl gelerne i Milli-Q-vand tre gange i 10 minutter hver, og der tilsættes 1 M NaCI for at visualisere lichenase aktivitet. Det oprensede bakterielle lichenase-protein blev anvendt som en positiv kontrol for enzymaktivitet.

7.. GFP Imaging

  1. Udfør visuel detektering af GFP-fluorescens i hele transient transformerede planter ved hjælp af en håndholdt langbølget UV-lampe.
  2. Foto forbigående transformerede planter med et digitalt kamera ved hjælp af en gul 8, ES 52 filter (eksponeringstid, 15 sek).
  3. Få billeder fra Western blot-analyser ved hjælp af GeneSnap software på en GeneGnome og kvantificere resultaterne ved hjælp af GeneTools software, med en kalibreringskurve baseret på renset GFP standard.
  4. Kvantificere HAC1-protein ved hjælp af en kalibreringskurve baseret på rensninged HAC protein standard fra A/Indonesia/05/05 stamme af influenzavirus.
  5. Beregn middelværdier 3-4 replikater for alle forsøg.

Representative Results

Næringsstof krav til plantevækst. Brugen af hydroponiske plante vækstmedium (Rockwool) og næringsstof løsning sikrer ensartethed N. benthamiana vækst og eliminerer kompleksiteten (mekanisk, lovgivningsmæssige og effektivitet), forbundet med at bruge jord til planteavl. Vi voksede N. benthamiana Rockwool plader dyppet i kommercielt tilgængelige gødning for at bestemme de optimale betingelser for planternes vækst og akkumulering af biomasse. Vi observerede 95-100% spiring. Man bør bemærke, at bl.a. fosfor er afgørende for at opnå spiring, fordi vi fandt, at næringsstof løsning mangler fosfor undladt at støtte spiring og vækst af N. benthamiana frø (figur 1a).

Effekter af Agrobacterium vækst og infiltration medier på plantesundhed og protein produktion. Vi har testet flere medier betingelser for at optimere effektiviteten af than agroinfiltration teknik til produktion i stor målestok. Bakterier (A. tumefaciens GV3101 stamme) huser pBID4-GFP-konstruktion blev dyrket O / N i forskellige medier betingelser (YEB, LB eller AB), og enten centrifugeret og resuspenderet i induktionsmedium (MMA) (indeholdende 1 × Murashige & Skoog [MS] Basal Salt Mixture, 10 mM MES pH 5,6, 20 g / L saccharose og 200 uM acetosyringon) eller fortyndet i Milli-Q vand til en 600 på 0,5, før du bruger af plantebeskyttelsesmidler infiltration. Vi observerede, vakuum infiltration af planter med bakterier fortyndet i vand resulterede i proteinproduktion kan sammenlignes med dem, der opnås med enhver infiltration medier i tidligere rapporter 42,48. I modsætning hertil, infiltration med ufortyndet Agrobacteria dyrkes i YEB eller LB-medier resulterede i fuldstændig visnen N. benthamiana blade i mindre end 24 timer efter infiltration, mens ufortyndede Agrobacteria dyrket i AB medium havde ingen effekt på sundheden hos infiltrerede planter (datet ikke vist). Som illustreret i figur 1B, planter infiltreret med Agrobacterium dyrket i YEB, LB eller AB medier og fortyndet med Milli-Q-vand (1:5, A 600 på 0,6-0,8 eller 1:10 A 600 0,3-0,4) viste ingen symptomer, og udviste en gennemsnitlig GFP produktion af 1645, 1520 og 1839, hhv. Agrobakterier centrifugeret og resuspenderet i induktionsmedium (MMA) viste ingen symptomer og ingen signifikant forskel i proteinproduktion sammenlignet med Agrobacteria direkte fortyndet i Milli-Q-vand ( 1671 ± 102 og 1667 ± 131 mg / kg). Der anbefales derfor Milli-Q-vand til fortynding af Agrobacterium kulturer til anlæg infiltration og blev rutinemæssigt anvendt i vores efterfølgende eksperimenter for at opnå en A 600 på 0,5.

Virkninger af Agrobacterium suspension celletæthed og tidsforløb på mål ekspression. Vi undersøgte dernæst, om bakteriel celledensitetpåvirker effektiviteten af ​​infiltration og niveauer af mål-udtryk. Til dette formål har vi vurderet fire forskellige cellesuspension tætheder af Agrobacterium bærer pBID4-GFP, A 600 på 1,0, 0,5, 0,1 og 0,05. Efter infiltration, N. benthamiana planter blev overvåget for synlige symptom udvikling og tidsforløbet af target udtryk ved at indsamle prøver på 4, 7 og 10 dpi. Ved 4 dpi, vi observerede mærkbare forskelle i GFP-fluorescens blandt planter infiltreret med forskellige celle suspension tætheder af Agrobacterium (ingen GFP-ekspression blev observeret ved en 600 på 0,05). Ved 7 dpi, GFP-fluorescens var ens i planter infiltreret ved celle suspension tætheder af A 600 1,0, 0,5 og 0,1, men var lavere i planter infiltreret på en A 600 på 0,05. Som vist i figur 1C, blev disse data bekræftet ved Western blot-analyser af prøver indsamlet ved 4 dpi, viser meget lav proteinproduktion ved A 600 A600 på 1,0 (1739 mg / kg). Ved 7 dpi viste planter ingen signifikante forskelle i skønnet GFP produktion på A 600 på 1,0, 0,5 og 0,1 (1.662, 1.870 og 1.890, henholdsvis), mens A 600 på 0,05 viste lavere GFP produktion (1.199 mg / kg). I modsætning hertil var ved 10 dpi observeret nogen forskel i GFP produktion blandt planter infiltreret med en af ​​de fire celle suspension tætheder (1.218, 1.181, 1.197 og 1.304).

Infiltration med alternative stammer af Agrobacterium. At øge mangfoldigheden af Agrobacterium-stammer til rådighed for forbigående protein produktion, vi testede vildtype-isolater. Disse stammer, isoleret fra kronen-galde naturlige værter, blev venligst stillet til rådighed af Dr. Gelvin (Purdue University, West Lafayette, Indiana). For at undersøge deres anvendelighed i forbigående protein produktion, vi infiltrerede N. benthamiana med følgende stammer Carrying pBID4-LicKM 18 A. rhizogenes (A4) og A. tumefaciens vildtype Nester stammer A348, A208 og A281 (opkaldt AT6, AT10 og At77, henholdsvis), såvel som konstruerede laboratoriestammer af A. tumefaciens GV3101, C58C1 og LBA4404. De infiltrerede blade blev opsamlet ved 7 dpi og niveauet af LicKM ekspression blev anslået ved Western blot-assay. Som vist i figur 2A, det højeste niveau af LicKM produktion kan opnås med stammerne GV3101, A4 og LBA4404 (~ 1.750 ± 163, 1650 ± 26 og 1.450 ± 117 mg / kg), med små forskelle; det laveste niveau af udtryk (~ 900 ± 102 mg / kg) med C58C1; og mellemliggende produktion med AT6, AT10 og At77 (~ 1.250 ± 19, 1.100 ± 42 og 1.200 ± 111 mg / kg). Det lichenase enzymatiske aktivitet blev påvist ved hjælp af Zymogram assay. Figur 2B viser, at lichenase produceret i infiltreret plantevæv ved hjælp af en afAgrobacterium-stammer blev enzymatisk aktivt. Man bør også bemærke, at N. benthamiana planter infiltreret med A4 og At77 stammer viste patologiske symptomer (nedsat vækst, petiole forlængelse og curling, og blad curling), mens med AT10 belaste symptomer var milde. Ingen symptomer blev observeret i N. benthamiana planter infiltreret med laboratoriestamme GV3101 (figur 2C).

Infiltration af alternative Nicotiana arter. Vi sammenlignede satserne for biomasse generation og protein produktion i to vildtype-arter af Nicotiana slægten (N. benthamiana og N. excelsior), og i en hybrid arter, N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior). Af de testede arter, N. benthamiana, en udbredt vært for forbigående proteinproduktion anvendelse af Agrobacterium-baserede eller viral-baserede ekspressionssystemer 2,34,49, når infiltration parathed inden 4-5 uger af spireevnen. Den nødvendige vækstperiode at generere det optimale niveau af biomasse er også 4-5 uger for N. excelsiana men er længere (6-7 uger) til N. excelsior. Desuden plante internodier er relativt korte for N. træuld forhold til andre Nicotiana arter.

Desuden observerede vi, at vakuum infiltration af N. benthamiana og N. excelsiana på 50-250 mbar i 60 sekunder er meget effektiv til agroinfiltration af hele blade, mens N. excelsior er svært at infiltrere på grund af deres lavere baldakin og læderagtige blade, selv når et vakuum blev anvendt tre gange i 1 minut hver i tilstedeværelse af ikke-ioniske overfladeaktive stoffer, såsom Sillwet-77 eller S240. Også spiring sats på N. excelsiana og N. Excelsior frø var ~ 40-50%; med henblik på at forøge spiring til 90-100%, skal frø behandlet med 10% Blealm i 1 time før såning. Under de samme vækstbetingelser, den højeste blad biomasse, der kan genereres fra N. excelsiana er cirka to gange højere sammenlignet med N. benthamiana (tabel 1).

Protein produktion blev undersøgt i N. benthamiana, N. excelsior og N. excelsiana infiltreret med Agrobacterium-stammen GV3101 huser pBID4-GFP. GFP ophobning blev vurderet ved 7 dpi i hele infiltreret blade med UV-lys, efterfulgt af Western blot-analyse Figur 3A viser en jævn fordeling af GFP i N.. benthamiana og N. excelsiana og ujævn fordeling i N. træuld (på grund af en vanskelighed infiltrere en hel bladareal N. excelsior). 3B viser omfanget af GFP-produktion estimeret ved UV-lys belysning i infiltrerede blade indsamlet fra tre Nicotiana arter på 7 dpi. GFP akkumuleredening niveau var højere i N. benthamiana (~ 2,23 g / kg) end i N. excelsiana og N. træuld (~ 1,89 og 1,54 g / kg). Det lave niveau af protein produktion i N. Excelsior er på grund af ujævn infiltration og distribution af akkumuleret GFP i de indsamlede blad.

Vi observerede, øverste blade direkte udsat for lys ofte udviser de tidligste og højeste niveauer af forbigående GFP akkumulation (2-4 dpi) end blade under baldakinen. Men i vores studier, GFP akkumulation var den højeste på 7 dpi og var fordelt ligeligt på tværs af de fleste blade, undtagen i infiltrerede nyligt voksende blade som ikke viser GFP akkumulering.

Effekter af vakuum pres og varighed på forbigående proteinproduktion. Vakuum infiltration øger forbigående ekspressionsniveauer sammenligne pres påføres manuelt injektion med en injektionssprøjte uden nål 42. Anvendelsen af ​​envakuum forårsager gasser til at evakuere fra neddykket plante blade gennem stomata. Når vakuummet brudt og trykket stiger hurtigt, er suspensionen af Agrobacterium drives ind i bladene til at erstatte de evakuerede gasser 50.

For at teste virkningen af vakuumtryk på bladene af N. benthamiana, vi infiltrerede planter med Agrobacterium-stammen GV3101 huser pBID4-GFP under forskellige undertryk (50-400 mbar) for 30 eller 60 sek. Det blev påvist, at jo stærkere vakuum (under 50 mbar) ansøgte om 30 eller 60 sec resulterer i mekanisk beskadigelse af infiltrerede blade, hvilket fører til væv visnen og plante død kort efter infiltration (24-48 timer). På den anden side er anvendelse af mildere vakuum (400 mbar) resulterer i infiltration af kun 50% af bladarealet og et nedsat niveau af GFP-produktion (303 ± 90 mg / kg) (figur 4A). Vigtigere er det, vi observeret nogen forskel i GFP produktion under 50, 100 og 200 mbar (1.651 ± 107, 1.688 ± 40, 1.594 ± 26 mg / kg) (figur 4A) og mild til ingen, skadelige virkninger på plantesundhed når undertryk 50-200 mbar blev ansøgt om 30 eller 60 sek. Derfor er 50-100 mbar vakuumtryk anbefales til infiltration eksperimenter.

Virkningen af varighed af vakuum på mål-ekspression blev vurderet ved at infiltrere en fladt N. benthamiana planter hver time med et A 600 på 0,5 af GV3101 huser pBID4 -. GFP i 8 timer i den samme Agrobacterium-kulturen Figur 4B viser, at graden af GFP-produktion var ens på alle-tidspunkter op til 8 timer, tyder på, at i denne periode Agrobacterium opretholder dens evne til at iværksætte en enkeltstrenget DNA.

Effekt af kemisk induktion på protein produktion. Visse plante phenol metabolitter og sukker kan INDUCE virulensgener A. tumefaciens 1,52. Som følge heraf har mange kemikalier og monosaccharaides blevet rapporteret at forbedre forbigående proteinproduktion i forskellige plantearter. Acetosyringon er mest almindeligt tilsættes til kulturer af A. tumefaciens at inducere vir operon før agroinfiltration 40,53-57.

Vi har vurderet effekten af forskellige koncentrationer af acetosyringon (0, 100, 200 og 400 uM) og glucose (0-4%) på forbigående GFP proteiner i N. benthamiana infiltreret med Agrobacterium-stammen GV3101 huser pBID4 - GFP. Til dette formål, vi re-suspenderet Agrobacterium celler i MMA induktion medier med forskellig koncentration af acetosyringon og glukose til 1-3 hr før infiltration. Ifølge resultaterne af både visuel observation (data ikke vist) og Western blot-analyse (figur 4C), ingen af de testede koncentrationaf disse forbindelser inducerede en signifikant stigning i GFP-fluorescens eller proteinproduktion sammenlignet med kontrol, hvor induktion medier indeholdt nogen acetosyringon eller glucose.

Effekt af co-infiltration af en lyddæmpning suppressor om forbigående produktion af GFP og HAC1 gener i N. benthamiana blade. Det er tidligere blevet påvist, at co-ekspression af et lyddæmpning suppressor (P19 tomat busket stunt virus [TBSV]) interfererer med posttranskriptionel gendæmpning (PTGS), hvilket resulterer i øget produktion af reporter proteiner 34.

Vi har vurderet effekten af co-infiltration af N. benthamiana med lanceringen vektor bærende GFP reporter genet (pBID4-GFP) og p19. Forud for infiltration, en à 600 0,5 fortyndinger af A. tumefaciens GV3101 kulturer huser pBID4-GFP og P19 blev henholdsvis blandet i forhold på 1:1, 2:1, 3:01 og 4:1. Expression af undertrykkelse suppressor var kontrolleret af blomkålsmosaikvirus 35S-promotoren. Som angivet af resultaterne af Western blot-analyse ved 7 dpi (figur 5A), har tilstedeværelsen af p19 ikke forøge eller formindske GFP produktion i N. benthamiana på ethvert forholdet mellem de to Agrobacterium suspensioner.

Vi har også sammenlignet effekten af ​​to virale gendæmpning undertrykkere - p23and P19 - om forebyggelse af PTGS for HAC1. Kulturer af Agrobacterium bærer lancering vektor pBID4-HAC1 (H1N1 A/California/04/2009) og en af de to virale lyddæmpningsvarianter suppressor plasmider blev fortyndet til et A 600 på 0,5, blandet i et forhold på 4:1, henholdsvis, og co-infiltreret i 4-5-uger gamle N. benthamiana. En suspension af A. tumefaciens bærer pBID4 - HAC1 alene blev infiltreret som kontrol. De infiltreret bladprøver blev indsamlet fra 3 til 8 dpi. Forsøget var Repeerede tre gange og gennemsnitlige niveauer af HAC1 udtryk bestemmes ved Western blot-analyse.

Som vist i figur 5B, co-infiltration af N. benthamiana med p23 eller p19 resulterede i (642 ± 157 og 764 ± 108 mg / kg) en stigning i HAC1 produktion sammenlignet med at bruge nogen lyddæmpning suppressor (ca. 15-25%, henholdsvis) ved 6 dpi. Dette antyder, at p23 og p19 er effektive i vores system. Dog skal det bemærkes, at ophobning af HAC1 opstod en dag tidligere, da pBID4-HAC1 blev co-infiltreret med p19. Derfor er vores resultater viser, at effekterne af undertrykkelse suppressor p19 på HAC1 og GFP ophobning er forskellige, hvilket tyder på selektiv forøgelse af transient ekspression og / eller stabilitet nogle proteiner i N. benthamiana.

Vi har også observeret, at både i nærvær og i fravær af en lyddæmpning suppressor niveauet af HAC1-protein production begyndte at falde ved 7 dpi. Dette indikerer, at timingen af nedgangen i den forbigående protein produktion i N. benthamiana infiltreret med lanceringen vektor er target-specifik.

Cellen bank Agrobacterium huser lanceringen vektor blev evalueret hvert år for målgenprodukt stabilitet, Agrobacterium levedygtighed og niveauet af protein ophobning. Glycerol bestand af cellen bank GV3101 stammen transformeret med pBID4-HAC1 der blev opbevaret ved -80 ° C har vist sig at være meget stabil i mere end tre år uden ændringer i niveauet for forbigående protein produktion i infiltreret N. benthamiana planter. Figur 5C viser, at HAC1 protein estimeres ved Western blotting i årene 2010, 2011, 2012 og 2013 var produktionen 670, 685, 566 og 683 mg / kg. Den gennemsnitlige HAC1 produktion i N. benthamiana planter var 651 ± 49,4 mg / kg.


Tabel 1. Sammenligning af N. benthamiana og N. excelsiana plantebiomasse produktion.

Figur 1
Fig. 1. Western blot-analyse af transient genekspression i N. benthamiana. (A) Seks uger gamle N. benthamiana 1) planter, der vokser i en gødning indeholdende 4,8% fosfor og 2) planter, der vokser i en gødning indeholdende 0% fosfor. Femogtyve ug frisk blad vaegt blev indlæst per bane. (B) Sammenligning af GFP produktion i planter vakuum infiltreret med pBID4-GFP-husning Agrobacterium GV3101 kulturer dyrket i tre forskellige medier: YEB, AB og LB. GV3101 kulturer dyrket O / N in YEB eller LB-medium blev centrifugeret ved lav hastighed og resuspenderet i induktionsmedium (MMA) (bane: MMA-1 og MMA-2, henholdsvis), eller dyrkes O / N in YEB, LB eller AB medier og direkte fortyndet til 1:5 eller 1:10 med Milli-Q vand (baner: YEB / 5 og YEB/10, AB / 5 og AB/10 LB / 5 og LB/10) (C) sammenligning. af GFP-ekspression på 4, 7 og 10 dpi følgende vakuum infiltration med forskellige koncentrationer (A 600 på 1,0, 0,5, 0,1 og 0,05) A. tumefaciens GV3101 stammen bærer pBID4-GFP.

Figur 2
Figur 2. Sammenligning af forbigående lichenase produktion og aktivitet efter vakuum infiltration af N. benthamiana anlæg med forskelleje stammer af Agrobacteria. Kulturerne af Agrobacteria stammer (GV3101, A4, At77, C58C1, AT6, AT10 og LBA4404) huser lanceringen vektor pBID4-LicKM var infiltreret individuelt i blade af N. benthamiana. Infiltreret blade blev indsamlet ved 7 dpi. (A) Lichenase produktion kvantificeres ved Western blotting. (B) Zymogram assay demonstrerer lichenase produktion gennem enzymatisk aktivitet. (C) Effekt af Agrobacterium (vildtype A4, AT10, At77 og laboratoriestamme GV3101) infiltration på N. benthamiana plantesundhed ved 7 dpi. Femogtyve ug friske blade vægtækvivalent blev påsat hver bane.

Figur 3
Fig. 3. Transient GFP-ekspression i blade af N. benthamiana, N. excelsiana og N. excelsior ved 7 dpi vakuum infiltration med A. tumefaciens huser lanceringen vektor pBID4 - GFP. (A) Visuel undersøgelse af GFP-ekspression under UV-lys. (B) Western blot-analyse af GFP-akkumulering.

Figur 4
Figur 4.. (A) Virkninger af vakuum pres på forbigående GFP udtryk og plantesundhed. N. benthamiana planter blev infiltreret med pBID4 -. GFP under vakuum pres på 400, 200, 100 eller 50 mbar ved vakuum holdetid på 30 eller 60 sek (B) Stabilitet og infektivitet af A. tumefaciens i N. benthamiana infiltreret med Agrobacterium GV3101 huser pBID4-GFP dyrket i AB medium og fortyndet til en A 600 på 0,5. Agroinfiltration blev udført ved at infiltrere en flad af N. benthamiana planter hver time i samme fortyndede Agrobacterium kultur (bane 0-8). (C) Effekt af forskellige koncentrationer af acetosyringon og glucose på transient ekspression af GFP. Agrobacterium-stammen GV3101 huser pBID4 - GFP blev dyrket O / N in YEB medier, centrifugeret og resuspenderet til en A600 på 0,5 i enten MMA indeholdende 2% glucose med acetosyringon ved 0, 100, 200 eller 400 uM eller MMA indeholdende 200 uM acetosyringon med glucose ved 0, 1, 2 eller 4%. Agrobacterium-suspensioner blev holdt i 3 timer ved stuetemperatur, før infiltration.

Figur 5
Figur 5.. Effekter af lyddæmpningssystemer undertrykkere på forbigående protein produktion i N. benthamiana blade. (A) Western blot-analyse af GFP-protein efter co-infiltration af pBID4-GFP og p19 i forskellige forhold. Prøver indsamlet ved 7 dpi (25 ug frisk blad vaegt blev indlæst per bane). (B) En kultur af Agrobacterium bærer pBID4-HAC1 var individuelt blandet i forholdet 4:1 med en kultur bærer p19 eller p23 lyddæmpning suppressor plasmider. De resulterende kombinationer af Agrobacterium kulturer blev vakuum infiltreret i planter. Infiltreret væv af HAC1 blev indsamlet dagligt op til 8 dpi til rekombinant protein kvantificering. (C) Stabilitet af Agrobacterium celle bank. Planter blev infiltreret med den samme batch af Agrobacterium cellebank hvert år for at evaluere proteinet akkumulering. Halvtreds ug frisk blad vaegt blev indlæst per vognbane. Klik her for at se en større version af ther figur.

Discussion

I denne undersøgelse har vi udviklet en simpel agroinfiltration protokol til rutinemæssig forbigående protein produktion i udvalgte Nicotiana art efter Agrobacterium stammer, der bærer lanceringen vektor. Desuden har vi identificeret de optimale betingelser for at opnå den højeste produktion af rekombinant protein-niveau i vores forbigående plante ekspressionssystem.

Vacuum infiltration af den fortyndede A. tumefaciens stamme GV3101 huser lanceringen vektor pBID4 i N. benthamiana, N. excelsiana og N. træuld resulterede i højere niveauer af målprotein produktion indenfor 7 dpi sammenlignet med andre plantearter, såsom Pisum sativum infiltreret med GV3101 huser Alfalfa mosaikvirus - eller Cucumber mosaic virus-baserede vektorer, der udtrykker GFP-reportergenet under 35S-promotoren 41 eller Lactuca sativa, Solanum Lycopersicum og Arabidopsis thaliana infiltreret med C58C1 stamme af A. tumefaciens bærer beta-glucuronidase-reportergenet 57. N. benthamiana og N. excelsiana var let at støvsuge infiltrere på 50 mbar for 30-60 sek, med 90-95% infiltration effektivitet. De resterende 5-10% af bladareal blev ikke infiltreret på grund af nogle flydende blade på overfladen af Agrobacterium suspension under påføring af vakuum. Siden lanceringen vektor har evnen til celle-til-celle-bevægelse 18 forekommer transient protein akkumulering i hele blade samt stilke ved 7 dpi. Ved 10 dpi, den anslåede GFP produktion var lidt lavere, fordi pBID4 ekspressionsvektoren er i stand til at bevæge sig fra celle til celle, men ikke at flytte systemisk 18; derfor behøver nyligt dyrkede blade ikke indeholde vektoren og ikke bidrager til produktionen af ​​målet. Desuden nedbrydning af det rekombinante protein med tiden may bidrage til reduceret proteinindhold på 10 dpi. Vores resultater viste, at infiltration af A. tumefaciens stamme GV3101 medierede høje niveauer af forbigående proteinproduktion i N. benthamiana. Endvidere kan målproteinet manipuleret som N-terminale, C-terminale eller interne fusioner til Lichenase (LicKM), β-1 ,3-1 ,4-glucanase, der er et termostabilt enzym fra Clostridium thermocellum og giver termostabilitet til mange mål proteinfusion 18. Infiltration af N. benthamiana med A. tumefaciens vildtypestammer (AT6, AT10 og at77) huser genet af interesse fremkaldte milde eller svære symptomer: blad curling, petiole forlængelse, og curling. Ingen patologiske symptomer blev observeret i N. benthamiana infiltreret med laboratoriet stamme GV3101 huser tom pBID4 vektor, mens nogle gener indsat i pBID4 og omdannet til laboratoriestammer GV3101, C58C1 eller LBA4404 fremkaldte mild nekrotiske svar og bladeklorose / gulfarvning symptomer i infiltrerede regioner af blade. Nekrotiske symptomer forårsaget af vildtype-Agrobacterium eller frakoblet stammer i natskyggefamilien planter er blevet rapporteret tidligere 56,57. Nekrotisk respons kunne medføre virulensfaktorer type III secerneringssystem, bakterielle proteiner overføres til plantecellen ved type IV secerneringssystem, og / eller følsomhed over for flagellin 58-60. Vi har fundet, at forbigående produktion af heterologe proteiner kan også fremkalde patogenicitet og en allergisk reaktion i infiltreret bladene. Mange forskere rapporterede, at agroinfiltration af forskellige plantearter med plante binære vektorer produceret op til 5-20 gange højere niveauer af forbigående protein produktion i forhold til stabilt transformerede planter 28,57. Vores data viser, at N. benthamiana infiltreret med GV3101 huser pBID4-GFP transient udtrykte høje niveauer af GFP, hvilket svarer til GFP udbytte rapporteret forN. benthamiana infiltreret med Agrobacteria bærer Pich-GFPSYS viral vektor (op til 80% af det totale opløselige protein) 44.. Agroinfiltration hjælp af vores lancering vektor resulterede i høj produktion af termostabile protein LicKM, 50-fold højere end den observeret ved anvendelse af en standard binært plasmid 18.

For at teste smitsomheden af A. tumefaciens og stabiliteten af lanceringen vektor, vi infiltrerede en flad af N. benthamiana hver time i op til 8 timer ved hjælp af den samme Milli-Q-vand-fortyndet kultur GV3101 huser pBID4-GFP plasmid. Vores data viste, at GV3101 stammen effektivt er smitsomt mindst 8 timer og pBID4 (lanceringen vektor) er meget stabil i 8 timer lange infiltration.

Glycerol bestand af GV3101 stamme, der huser lanceringen vektor pBID4-HAC1 (celle bank), opbevaret ved -80 ° C har vist sig at være meget stabil i tre år uden ændringer i forbigående protei produktionen i infiltrerede planter.

N. benthamiana planter dyrket under optimale betingelser, og mellem 35 og 42 dage efter såning var optimal for vakuum infiltration-medieret transient genekspression 40. Yngre planter (3-4 uger gamle) ikke kan infiltreret udelukkende på grund af blade flyder på cellesuspensionen overflade og vævsskade fra de mekaniske virkninger af anvendelse af et vakuum. I planter ældre end 45 dage, N. benthamiana boltning tidspunkt under optimale lysforhold anvendes, niveauet af transient ekspression er lav.

Lavmolekylære phenolforbindelser (acetosyringon) og monosaccharaides (glukose) er kendt for at inducere vir gener i A. tumefaciens 55,61. Desuden infiltration af N. benthamiana med den binære vektor pCAMBIA (GFP) i overværelse af acetosyringon på koncentrationerne af 50-600 uM blev vist at stige en smule forbigåendegenekspression 40. Vi undersøgte effekten af ​​forskellige koncentrationer af acetosyringon og glukose i vores system ved at tilføje disse forbindelser til GV3101 kulturer huser pBID4-GFP i MMA i 3 timer, og fandt ingen forskel i GFP udtryk. Interessant, GV3101 kulturer huser pBID4-GFP og udvandet i Milli-Q vand til en A 600 på 0,5 og infiltreret uden vir geninduktion udtrykte de samme mængder af GFP som dem infiltreret med inducerede kulturer. A. tumefaciens vir gen (er) kunne potentielt være fremkaldt af plante phenolforbindelser (acetosyringon og sinapininsyre) og plante monosaccharaides (glukose og fruktose) til stede i bladvæv. Derfor har vi spekulere, at tilsvarende niveauer af GFP-ekspression i nærvær eller fravær af exogene vir gen fremmere kan være et resultat af virkningen af cytoplasmatiske vir gen inducere stede under replikation af GFP-udtrykkende lancering vektoren i planteceller.

N. benthamiana har været anvendt som en model vært for forbigående proteinproduktion 49. Men N. benthamiana 's relativt lave biomasseudbytte hindrer sin ansøgning om storstilet produktion af rekombinante proteiner. Den optimale vært bør kombinere et højt transient ekspression, let vækst i et drivhus, og være modtagelige for Agrobacterium infiltration 2. Hvis du vil vælge en alternativ vært, vi infiltrerede to forskellige vildtype-arter af Nicotiana (N. benthamiana og N. excelsior) og en hybrid N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior) med A. tumefaciens stamme GV3101 huser pBID4-GFP plasmid. Blandt disse tre arter, omfanget af GFP-ekspression var lidt højere i N. benthamiana. N. Excelsior planter viste svært ved vakuum agroinfiltration grund af deres læderagtige blade, og N. excelsianaproduceret cirka to gange mere biomasse under de samme vækstbetingelser. Den forbigående produktion af GFP ved 7 dpi er forholdsvis ens i N. benthamiana og N. excelsiana. Derfor N. excelsiana kan være en mere egnet vært til produktion af rekombinante proteiner.

Agrobacterium-medieret forbigående proteinproduktion er begrænset af PTGS 26, som kan overvindes ved co-ekspression af gen silencing suppressorer af plantevirus-oprindelse 62. Forbigående proteinproduktion er tidligere blevet vist at blive forbedret 50 gange i nærvær af p19 proteinet af TBSV, som hæmmer PTGS i infiltreret væv 34. I vores undersøgelse har vi vurderet effekten af ​​to virale lyddæmpende undertrykkere (P19 og P23) separat co-infiltreret med lanceringen vektor pBID4-HAC1. Den co-infiltration af disse lyddæmpningssystemer undertrykkere syntes at have ringe indflydelse på transient ekspression af HAC1, med kun en svag stigning i HAC1protein akkumulation (15-25%) i tilstedeværelse af co-infiltreret p23 eller p19. Til positivt at påvirke protein-produktion, kan være nødvendigt at være specielt udvalgt til at være effektive for de målrettede plantearter og viral vektor 63. lyddæmpningssystemer undertrykkere. TMV helicase har en suppressor af RNA silencing aktivitet 64,65. Vores data bekræfter denne observation som co-infiltration af p23 eller p19 med pBID4-HAC1 resulterede ikke i nogen stigning i GFP eller en svag stigning i den forbigående HAC1 proteinproduktion.

Afslutningsvis har vi ændret og optimeret anlæg og Agrobacterium vækstbetingelser og forbedret effektiviteten af vakuum infiltration. Denne teknologi muligt for os at vokse og infiltrere hundrede kilo plantemateriale i et par timer. Vi har med held automatiseret planten forbigående udtryk teknik til produktion af høj-throughput vaccine mod industrielle skalaer under de nuværende Good Manufacturing Practice (cGMP) betingelser. For mere information ABOut automation og udnyttelse af anlægget forbigående proteinproduktion system til produktion af rekombinante proteiner, herunder underenhed vaccinekandidater under cGMP betingelser, er læserne henvises til hjemmesiden www.fhcmb.org/ .

Disclosures

Vi har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Fraunhofer USA Center for Molekylær Bioteknologi, Ibio, Inc. og Defense Advanced Research Projects Agency (tilskud # HDTRA1-07-C-0054). Forfatterne erkender de generøse gaver af Drs. Stanton Gelvin of Biological Science afd., Purdue University (Agrobacterium tumefaciens stammer) og Wayne Fitzmaurice af Large Scale Biology Corp (N. excelsiana frø) samt Jennifer Nicholson of US Nicotiana Collection, North Carolina State University (N. Excelsior frø ). Forfatterne takker Margaret Shillingford og Christopher Hull for at levere planter og fremragende teknisk assistance. Forfatterne takker også Drs. Stephen Streatfield og Natasha Kushnir til redaktionel assistance.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nicotiana benthamiana Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University PI 555478 TW16 Infiltration
Nicotiana excelsior Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University PI 555685 TW47 Infiltration
Nicotiana excelsiana Dr. Wayne Fitzmaurice, Large Scale Biology Corporation, Vacaville, CA LSBC EBA 042304.02 Infiltration
Vacuum skid Abbas, Ashland, MA Custom made Plant infiltration
Rockwool Grodan Inc., Ontario, Canada AO 50/40 Hydroponic media for growing plant
2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid Acros Organics, Thermo Fisher Scientific, NJ 172595000 Buffer
Murashige & Skoog salt (MS salt) Phyto Technology Lab M524 Tissue culture media
Acetosyringone Sigma-Aldrich, St. Louis, MO D134406-5G Agrobacterium induction
Immobilon-P transfer membrane Millipore, Billerica, MA IPVH00010 Western blotting
I-block Applied Biosystems, Foster City, CA T2015 Western blotting
Rabbit polyclonal anti-GFP antiserum  Washington Biotechnology, Baltimore, MD Western blotting
Mouse anti–poly-histidine monoclonal antibody Qiagen GmbH, Hilden 34670 Western blotting
Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit antibody  Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA 111-035-003 Western blotting
Horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse antibody Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA 115-035-003 Western blotting
SuperSignal® West Pico chemiluminescent substrate Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL 34078 Western blotting
Lichenan (1-3: 1-4-beta-D-glucan) Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland P-LICHN Lichenase Activity
Congo Red  Sigma-Aldrich, St. Louis, MO C6277 Gel staining
Digital camera  Olympus, Center Valley, PA C-8080 Chemiluminescence imaging
GeneGnome Syngene, Frederick, MD Chemiluminescence imaging 
GFP standard  Made in house Chemiluminescence imaging 
Plant fertilizer solution Griffin Greenhouse Nursery Supplies, Newark, DE 67-23-20 Plant growing
Lichenase Standard Purified in house Western blotting
MicroPulser Electroporator BioRad, Hercules, CA 165-2100 Agrobacterium transformation 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ma, J. K., Drake, P. M., Christou, P. The production of recombinant pharmaceutical proteins in plants. Nature Reviews Genetics. 4, 794-805 (2003).
  2. Sheludko, Y. V., Sindarovska, Y. R., et al. Comparison of several Nicotiana species as hosts for high-scale agrobacterium-mediated transient expression. Biotechnology and Bioengineering. 96, 608-614 (2007).
  3. Mett, V., Farrance, C. E., Green, B. J., Yusibov, V. Plants as biofactories. Biologicals. 36, 354-358 (2008).
  4. Yusibov, V., Rabindran, S. Recent progress in the development of plant derived vaccines. Expert Review of Vaccines. 7, 1173-1183 (2008).
  5. Stoger, E., Sack, M., Fischer, R., Christou, P. Plantibodies: Applications, advantages and bottlenecks. Current Opinion in Biotechnology. 13, 161-166 (2002).
  6. Mahmoud, K. Recombinant Protein Production: Strategic Technology and a Vital Research Tool. Research Journal of Cell and Molecular Biology. 1, 9-22 (2007).
  7. Rai, M. P. H. Expression systems for production of heterologous proteins. Current Science. 80, 1121-1128 (2001).
  8. Yusibov, V., Streatfield, S. J., Kushnir, N. Clinical development of plant-produced recombinant pharmaceuticals: vaccines, antibodies and beyond. Human Vaccines. 7, 313-321 (2011).
  9. McCormick, A. A., Reddy, S., et al. Plant-produced idiotype vaccines for the treatment of non-Hodgkin's lymphoma: Safety and immunogenicity in a phase I clinical study. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10131-10136 (2008).
  10. Medicago Inc, Available from: (accessed 17 January, 2013) http://www.medicago.com/English/Products/Pandemic-flu-vaccine/default.aspx (2013).
  11. Medicago Inc, Available from: (accessed 17 January, 2013) http://www.medicago.com/English/Products/Flu-vaccine/default.aspx (2013).
  12. Planet Biotechnology Inc, Available from: (accessed 17 January, 2013) www.planetbiotechnology.com/products.html (2013).
  13. Sys Genetics, S. emB. io Available from: (accessed 17 January, 2013) www.sembiosys.com/Products/Diabetis.aspx (2013).
  14. Protalix, Available from: (accessed 17 January, 2013) http://www.protalix.com/objects/docs/ELELYSO_Full-Prescribing-Information.pdf (2013).
  15. Protalix, Available from: (accessed 17 January 2013) http://www.protalix.com/product-development/taliglucerase-alfa.asp (2013).
  16. Plesha, M. A., Huang, T. -K., et al. Optimization of the bioprocessing conditions for scale-up of transient production of a heterologous protein in plants using a chemically inducible viral amplicon expression system). Biotechnology Progress. 25, 722-734 (2009).
  17. Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. Magnification - A new platform for expressing recombinant vaccines in plants. Vaccine. 23, 2042-2048 (2005).
  18. Musiychuk, K., Stephenson, N., et al. A launch vector for the production of vaccine antigens in plants. Influenza and Other Respiratory Viruses. 1, 19-25 (2007).
  19. Massa, S., Franconi, R., et al. Anticancer activity of plant-produced HPV16 E7 vaccine. Vaccine. 25, 3018-3021 (2007).
  20. Mett, V., Lyons, J., et al. A plant-produced plague vaccine candidate confers protection to monkeys. Vaccine. 25, 3014-3017 (2007).
  21. Mett, V., Musiychuck, K., et al. A plant-produced influenza subunit vaccine protects ferrets against virus challenge. Influenza and Other Respiratory Viruses. 2, 33-40 (2008).
  22. Shoji, Y., Chichester, J. A., et al. Plant expressed HA as a seasonal influenza vaccine candidate. Vaccine. 26, 2930-2934 (2008).
  23. Chichester, J. A., Musiychuk, K., et al. Immunogenicity of a subunit vaccine against Bacillus anthracis. Vaccine. 25, 3111-3114 (2007).
  24. Golovkin, M., Spitsin, S., et al. Smallpox subunit vaccine produced in Planta confers protection in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 6864-6869 (2007).
  25. Porta, C., Lomonossoff, G. Use of viral replicons for the expression of genes in plants. Molecular Biotechnology. 5, 209-221 (1996).
  26. Johansen, L. K., Carrington, J. C. Silencing on the spot: induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system. Plant Physiology. 126, 930-938 (2001).
  27. Vézina, L. P., Faye, L., et al. Transient co-expression for fast and high-yield production of antibodies with human-like N-glycans in plants. Plant Biotechnology Journal. 7, 442-455 (2009).
  28. Vaquero, C., Sack, M., et al. Transient expression of a tumor-specific single-chain fragment and a chimeric antibody in tobacco leaves. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 11128-11133 (1999).
  29. Galeffi, P., Lombardi, A., et al. Expression of single-chain antibodies in transgenic plants. Vaccine. 23, 1823-1827 (2005).
  30. Rodríguez, M., Ramírez, N. I., et al. Transient expression in tobacco leaves of an aglycosylated recombinant antibody against the epidermal growth factor receptor. Biotechnology and Bioengineering. 89, 188-194 (2004).
  31. Hull, A., Criscuolo, C. J., et al. plant-produced monoclonal antibody for the treatment of anthrax. Vaccine. 23, 2082-2086 (2005).
  32. Roy, G., Weisburg, S., Rabindran, S., Yusibov, V. A novel two-component Tobacco mosaic virus-based vector system for high-level expression of multiple therapeutic proteins including a human monoclonal antibody in plants. Virology. 405, 93-99 (2010).
  33. Silhavy, D., Molnar, A., et al. A viral protein suppresses RNA silencing and binds silencing-generated, 21-to 25-nucleotide double-stranded RNAs. EMBO Journal. 21, 3070-3080 (2002).
  34. Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P., Baulcombe, D. An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. Plant Journal. 33, 949-956 (2003).
  35. Bechtold, N., Pelletier, G. In planta Agrobacterium-mediated transformation of adult Arabidopsis thaliana plants by vacuum infiltration. Methods in Molecular Biology. 82, 259-266 (1998).
  36. Bechtold, N., Ellis, J., Pelletier, G. In planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. C. R. Academy of Science Paris, Life Sciences. 316, 1194-1199 (1993).
  37. Tague, B., Mantis, J. In planta Agrobacterium-mediated transformation by vacuum infiltration. Methods in Molecular Biology. 323, 223-215 (2006).
  38. Fischer, R., Vaquero-Martin, C., et al. Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants. Biotechnology and Applied Biochemistry. 30, 113-116 (1999).
  39. Horn, M. E., Woodard, S. L., Howard, J. A. Plant molecular farming: systems and products. Plant Cell Reports. 22, 711-720 (2004).
  40. Wydro, M., Kozubek, E., Lehmann, P. Optimization of transient Agrobacterium-mediated gene expression system in leaves of Nicotiana benthamiana. Acta Biochimica Polonica. 35, 289-298 (2006).
  41. Green, B. J., Fujiki, M., et al. Transient protein expression in three Pisum sativum (green pea) varieties. Biotechnology Journal. 4, 1-8 (2009).
  42. Kapila, J., DeRycke, R., Van Montagu, M., Angenon, G. An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves. Plant Science. 122, 108-101 (1997).
  43. Yang, Y., Li, R., Qi, M. In vivo analysis of plant promoters and transcription factors by agroinfiltration of tobacco leaves. Plant Journal. 22, 543-551 (2000).
  44. Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants. Nature Biotechnology. 23, 718-723 (2005).
  45. Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. Viral vectors for the expression of proteins in plants. Current Opinion in Biotechnology. 18, 134-141 (2007).
  46. Goodin, M. M., Zaitlin, D., Naidu, R. A., Lommel, S. A. Nicotiana benthamiana: Its history and future as a model for plant-pathogen interactions. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21, 1015-1026 (2008).
  47. Shoji, Y., Bi, H., et al. Plant-derived hemagglutinin protects ferrets against challenge infection with the A/Indonesia/05/05 strain of avian influenza. Vaccine. 27, 1087-1092 (2009).
  48. Llave, C., Kasshau, K. D., Carrington, J. C. Virus-encoded suppressor of posttranscriptional gene silencing targets a maintenance step in the silencing pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 13401-13406 (2000).
  49. McCormick, A. A., Kumagai, M. H., et al. Rapid production of specific vaccines for lymphoma by expression of the tumor-derived single-chain Fv epitopes in tobacco plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 703-708 (1999).
  50. Simmons, C. W., VanderGheynst, J. S., Upadhyaya, S. K. A model of agrobacterium tumefaciens vacuum infiltration into harvested leaf tissue and subsequent in planta transgene transient expression. Biotechnology and Bioengineering. 102, 965-970 (2009).
  51. Ankenbauer, R. G., Nester, E. W. Sugar-mediated induction of Agrobacterium tumefaciens virulence genes: structural specificity and activities of monosaccharides. Journal of Bacteriology. 172, 6442-6446 (1990).
  52. Cangelosi, G. A., Ankenbauer, R. G., Nester, E. W. Sugars induce the Agrobacterium virulence genes through a periplasmic binding protein and a transmembrane signal protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, 6708-6712 (1990).
  53. Stachel, S. E., Nester, E. W., Zambryski, P. C. A plant cell factor induces Agrobacterium tumefaciens vir gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 379-383 (1986).
  54. Rogowsky, P. M., Close, T. J., Chimera, J. A., Shaw, J. J., Kado, C. I. Regulation of the vir genes of Agrobacterium tumefaciens plasmid pTiC58. Journal of Bacteriology. 169, 5101-5112 (1987).
  55. Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant Journal. 6, 271-282 (1994).
  56. Vander Hoorn, J. A. L., Laurent, F., Roth, R., De Wit, P. J. G. M. Agroinfiltration is a versatile tool that facilitates comparative analyses of Avr9/cf-9-induced and Avr4/Cf-4-induced necrosis. Molecular Plant-Microbe Interactions. 13, 439-446 (2000).
  57. Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assay of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnology Journal. 3, 259-273 (2005).
  58. Salmond, G. P. C. Secretion of extracellular virulence factors by plant pathogenic bacteria. Annual Review of Phytopathology. 32, 181-200 (1994).
  59. Felix, G., Duran, J. D., Volko, S., Boller, T. Plants have a sensitive perception system for the most conserved domain of bacterial flagellin. Plant Journal. 18, 265-276 (1999).
  60. Goodner, B., Hinkle, G., et al. Genome sequence of the plant pathogen and biotechnology agent Agrobacterium tumefaciens C58. Science. 294, 2323-2328 (2001).
  61. Lee, Y. -W., Jin, S., Sims, W. -S., Nester, E. W. Genetic evidence for direct sensing of phenolic compounds by the vir A protein of Agrobacterium tumefaciens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 12245-12249 (1995).
  62. Voinnet, O., Pinto, Y. M., Baulcombe, D. C. Suppression of gene silencing: a general strategy used by diverse DNA and RNA viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 14147-14152 (1999).
  63. Voinnet, O. RNA silencing as a plant immune system against viruses. Trends in Genetics. 17, 449-459 (2001).
  64. Ding, X. S., Liu, J., et al. The Tobacco mosaic virus 126-kDa protein associated with virus replication and movement suppresses RNA silencing. Molecular Plant-Microbe Interactions. 17, 583-592 (2004).
  65. Harries, P. A., Palanichelvam, K., Bhat, S., Nelson, R. S. Tobacco mosaic virus 126-kDa protein increases the susceptibility of Nicotiana tabacum to other viruses and its dosage affects virus-induced gene silencing. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21, 1539-1548 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics