마우스 모델에서 자궁 - 난관 배아 전송 및 정관

Biology

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Summary

자궁 - 난관 배아 입금 자궁 전송을 수행 할 때 발생할 수있는 배아 유출을 방지하는 장벽으로 자궁 - 난관 접합부를 사용한다. 과 vasectomized 남성은 배아 전송 pseudopregnant받는 사람을 얻기 위해 필요합니다. 두 가지 기술을 설명합니다.

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Bermejo-Alvarez, P., Park, K. E., Telugu, B. P. Utero-tubal Embryo Transfer and Vasectomy in the Mouse Model. J. Vis. Exp. (84), e51214, doi:10.3791/51214 (2014).

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Abstract

대리 여성에게 착상 전 배아의 전송은 성적인 변경의 효과는 이후의 태아 발달과 성인의 건강에 착상 전 개발 과정에서 발생한 연구하는 유전자 변형 마우스 또는 생산을위한 필수 단계입니다. 효과적이고 일관된 배아 전송 기술의 사용은 유전자 변형 동물의 생성을 향상시키고 주입 속도와 용어 생존에 다른 치료의 효과를 결정하기 위하여 중요하다. 배반포 단계의 배아는 일반적으로 배아 조작 피펫을 소개하는 자궁 벽에 구멍을 수행, 자궁 전송에 의해 전송됩니다. 피펫이 철회 된 후 자궁에서 수행 구멍이 닫히지 않습니다, 인해 자궁의 긍정적 인 압력에 복강에 배아 수 유출. 천자는 또한 주입을 손상 출혈을 생성 블록 전송 피펫 및 배아 D에 영향을 미칠 수 있습니다조나없이 배아가 전송 특히 evelopment. 따라서,이 기술은 종종 매우 변수 및 전반적인 낮은 배아 생존율가 발생합니다. 이러한 부정적인 효과를 방지, 자궁 - 난관 배아 전송 배아의 유출을 막는 자연 장벽 자궁 - 난관 접합을 활용하여 자궁 벽의 구멍을 피하십시오. 과 vasectomized 남성은 pseudopregnant받는 사람을 얻기 위해 필요합니다. 정관 수술을 수행 할 수있는 기술은 자궁 - 난관 배아 전송에 대한 보완 설명되어 있습니다.

Introduction

배아 전송 아마 마우스 모델에서 수행되는 가장 흔한 수술입니다. 이 기술은 시험 관내 조작 기술을 실시 배아에서 자손을 구하는 것이 필수적이며, 따라서, 전핵 주입, 렌티 바이러스 형질 도입, 또는 키메라 형성에 의해 유전자 변형 된 모델의 개발에 필요한 단계를 구성한다. 또한,이 기술은 착상 전 개발 과정에서 발생하는 다양한 모욕의 개발 효과에 대한 연구를 할 수 있습니다. 인공 재생 기술 또는 상이한 물질 또는 대사 2의 비정상적인 농도에 노출의 사용은 주입 또는 태반 장애 및 자손 장기 효과의 결과 배아 발달에 영향을 미칠 수있다. 신뢰성 및 재현성 배아 전송 기술은 일관된 남자 주입 및 태아 발달에 실험적 치료 가능한 부정적 영향을 시험하는 데있어 매우 중요NER.

쥐의 착상 전 배아는 0.5 일 포스트 교미의 ampullae (DPC) pseudopregnant받는 사람 (난관 전송) 3.4 또는 2.5의 DPC pseudopregnant받는 사람의 자궁 (자궁 전송) 5,6를 통해 난관에 하나를받는 여성에 전송 될 수 자신의 발달 단계에 따라 달라집니다. 예컨대 배아 또는 유도 된 다 능성 줄기 세포를 주입하여 키메라 생쥐를 생성하기 위해 사용되는 것과 같은 포배기 배아에서는, 보통 자궁 전송함으로써 전송된다. 배반포는 0.5 DPC받는 사람의 난관에 전송 될 수 있지만, 배아 주입이 발생하기 전에 모욕 복구에 2 일이 휴면을 거치고 있기 때문에 그것은, 발달 장애 물질에 대한 덜 생리적 테스트를 구성한다. 자궁 입금 자궁 내강으로 배아 조작 피펫의 액세스를 허용하는 개구를 생성하기 위해 좁은 바늘 자궁벽을 천공 포함한다.lthough이 기술은 좋은 결과를 얻을 수 있습니다, 용어 생존 (즉, 강아지에 개발 이전 배아의 비율)는 종종 낮은 7,8 예측할 수있다.

자궁 벽의 구멍은 어떤 해로운 부작용을 수반한다. 먼저, 근육층은 매우 혈관 조직이며 천자 종종 작은 출혈 초래한다. 혈액은 배아 전송 피펫을 차단하거나 배아 사망 및 / 또는 주입 실패의 원인이되는 자궁 내강에 침입 할 수 있습니다. 혈액 세포와 파편이 할구에 연결할 수 소나없이 배아가 전송되는 경우에 특히 적합합니다. 배아가 전송 된 이후에 두 번째로, 수행 개구는 밀봉되지 않기 때문에, 그들은 오리피스를 역류하고 너무 큰 부피 자궁에 도입되었을 때 복강으로 추방 될 수있다. 설명 자궁 - 난관 배아 전송이 여기에 EMBR을 제공하기 위해 자궁 - 난관 접합을 활용자궁벽을 천공함으로써 그 불리한 결과 구를 피할 필요없이 자궁 YOS.

배아 전송에 사용되는 pseudopregnant받는 여성은 남성과 vasectomized 8 자연 교배에 의해 얻을 수있다. 불임 남성에 의해 생성 된 정액 분비는 전송 된 배아를 수용하게됩니다 자궁 필요합니다. 받는 사람을 얻으려면 세 6 개월 8 주 2 여성의 최대 값은 오후에과 vasectomized 남성으로 배치됩니다. 다음 날 아침, 여성은 질 성교 마개, 남성의 정액에서 응고 단백질의 덩어리의 존재를 확인합니다. 정합은 보통 자정 중에 발생할 때, 질 플러그 검출의 일 0.5 DPC 것으로 간주된다. 과 vasectomized 남성은 일부 업체에서 구입 할 수 있지만, 여기에 기술 된 수술은 비교적 간단하고 배아 전송에 필요 이상으로 추가 장비가 필요하지 않습니다.

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Protocol

모든 동물 실험은 USDA 동물 관리 및 사용 지침에 따라 벨트 스빌 지역 동물 관리 및 사용 Comittees (BAACUC 11-015)에 의해 승인되었다.

1. 마취 및 진통제 (외과 적 치료 모두에 공통)

  1. 마우스의 무게를 27 G 바늘로 두 1 ㎖ 주사기에 다음과 같은 마취제 및 진통제를로드
    1. 케타민 (0.1 ㎎ / g : 0.01 ㎖ / 10 ㎎ / ㎖ 용액의 g)과 자일 라진 (0.01 ㎎ / g : 2 ㎎ / ㎖ 용액 0.005 ㎖ / g).
    2. 부 프레 노르 핀 (0.1 ㎍ / g : 0.01 ㎎ / ㎖ 용액 0.01 ㎖).
  2. 엄지와 집게 손가락으로 가능한 한 턱에 가까운 목의 목덜미를 따기와 새끼와 약지 사이의 꼬리를 잡고 마우스를 고정시킨다.
  3. 복강 케타민-자일 라진 혼합물을 주입. 내장 천공을 방지하기 위해,로 마우스를 길게약간의 엉덩이의 수준 이하의 머리 (그림 1A)
  4. 엄지 손가락과 집게 손가락 (그림 1B) 사이에 목 홀드의 목덜미에 부 프레 놀핀의 피하 주사.
  5. 따뜻한 무대에서 케이지 (깨끗하고 다른 동물 제외)에 마우스를 둡니다.
  6. 의식하면, (발가락 핀치에 의해 확인) 후방 발 반사의 부재를 확인합니다. 눈의 건조를 방지하고 눈꺼풀 반사 (그림 1C)의 부재를 확인하기 위해 눈 연고를 적용합니다.
  7. 이 프로토콜은 아래에 설명 된 절차를 수행 할 정도로 30 분의 최소 수술 마취 평면 제공 (프로토콜 2 및 3). 긴 시간이 필요한 경우, 1.1.1에 기술 된 투여 량의 절반 케타민 + 자일 라진의 추가 주입을 30 분 후에 적용될 수있다. 빠르고 불규칙한 하나에 호흡 패턴의 변화는 이오를 나타냅니다적절한 마취 비행기의 SS.

2. 정관 수술

  1. 검증 된 상대 성능을 남성을 사용합니다.
  2. , 수술 도구를 소독 수술을 수행 할 것입니다 표면을 청소하고 70 % 에탄올로 닦아주십시오.
  3. 이전 반사 손실에 대한 검사 (프로토콜 1) 설명 된대로 마취를 수행합니다.
  4. 제거, 따뜻한 무대에 마우스를 놓고 두 개의 가상 횡단 선 사이의 복부 지역에서 전기 가위 모피는 0.5 ㎝, 성기 이상 2.5 cm (그림 2A)를 배치했다.
  5. 10 % 포비돈 요오드 70 % 에탄올로 순차적으로 닦아 면도 영역을 소독합니다.
  6. 면도 영역을 노출 구멍 멸균 수건으로 외과 의사 및 커버 향해 꼬리를 위로 향한 위치에 마우스를 놓습니다. 수술 영역을 조명.
  7. 10-15mm 세로 피부 incisio를 수행N 약 1 ㎝의 음경 위 복부의 중간 라인. 톱니 모양의 집게를 드레싱 한 다음 (그림 2A와 2B) 가위로 잘라 피부를 잡습니다.
  8. 원격 교육의 알바 5~10밀리미터 세로 절개를 수행합니다. 톱니 모양의 집게를 microdissecting와 근육을 잡고 가위 (그림 2C)로 잘라.
  9. 톱니 모양의 집게를 해부 마이크로으로 한쪽 고환 지방 패드를 잡고 고환을 노출 잡아 당겨, 정관 및 부고환. 정관은 고환에 중간에 위치하고 있습니다 그것은 같은 고환 벽에 부착하지 명확하게 구별 할 수있는 무료 관 (이다 혈관 한쪽 (그림 2D)을 따라 실행과 부고환).
  10. 그들은 빨간색으로까지 마이크로 해부 톱니 모양의 집게, 불꽃 드레싱 포셉으로 정관을 잡고 (그림 2E (그림 2 층) 한 번에 두 지점에서 정관을 잘라 소작하기 위해 그들을 사용합니다. 컷은 약 5 ㎜의 일부를 제거하고 두 개의 분명히 구분 소작 끝 (그림 2G)를 남겨 두어야한다.
  11. 다시 복강에 고환, 부고환과 정관을 이동합니다.
  12. 다른 고환의 9 단계에서 진행합니다.
  13. 5 / 0 흡수성 봉합사 (그림 2H)으로 만든 하나 또는 두 개의 수평 매트리스 바늘로 근육을 봉합.
  14. 하나 또는 두 개의 상처 가위 (그림 2I)로 피부를 봉합.
  15. , vasectomised 남성 (귀 반지, 문신을 ...) 확인 그것을 따뜻한 스테이지에 배치 케이지를 이동하고 마취에서 회복 될 때까지 관찰 (의식과 흉골 드러 누움을 유지). 따뜻한 식염수 0.5 ㎖를 피하 주사는 재 향상covery. , 정관 전송시 발생 가능한 그런 일을 기록 식수에 항생제를 추가합니다.
  16. 상처 클립 10 일 상처 어선 제거 또는 치아 포셉 한 쌍의 정관 수술 후 제거 할 수 있습니다. 과 vasectomized 남성은 수술 후 2 주 동안 짝짓기를 할 준비가 될 것입니다.
  17. 받는 사람을 얻기 위해 그것을 사용하기 전에 비옥 한 여성과 짝짓기하여과 vasectomized 남성의 불임을 테스트합니다.

3. 자궁 - 난관 배아 전송

  1. 마우스 morulae 또는 배반 2.5 DPC에서 pseudopregnant받는 여성이 기술에 의해 전송 될 수 있습니다.
  2. 배아 조작 유리 피펫을 준비한다 :
    1. 피펫 홀더의 손상을 방지하기 위하여 유리 모세관의 끝을 연마하고 있습니다.
    2. 약간 회전하면서 미세 화염으로 가열하여 유리 모세관의 중간 부분을 연화기적으로 두 손으로 모세관. 모세관 부분은 부드럽고 (밝은 붉은 색) 전성 상태가되면 불에서 빨리 철회하고 130 ~ 150 μm의 외부 직경을 축소하기 위해 양쪽 끝을 잡아 당깁니다.
    3. 유리가 냉각 한 후 가볍게 다이아몬드 점, 색연필, 연마 돌 또는 네일 파일과 좁은 부분을 처치하고 양쪽에서 잡아 당겨 잘라 때까지 기다립니다. 휴식은 깨끗하고 수직이어야한다
  3. 100 ~ 130 ㎛의 구멍을 떠나, 매우 신속하게 타오르는로 끝을 연마하고 있습니다. 피펫은 나중에 사용하기 위해 저장할 수 있습니다.
  4. 따뜻한 배아 조작 미디어 (CZBH 또는 M2는 설명을 참조).
  5. , 수술 도구를 소독 수술을 수행 할 것입니다 표면을 청소하고 70 % 에탄올로 닦아주십시오.
  6. 이전 반사 손실에 대한 검사 (프로토콜 1) 설명 된대로 마취를 수행합니다.
  7. T를 유지그는 따뜻한 무대에서 마우스, 무릎 및 말초 리브 (그림 3a3b) 사이의 등의 지역에서 전기 가위와 모피를 제거합니다.
  8. 10 % 포비돈 요오드 70 % 에탄올로 순차적으로 닦아 면도 영역을 소독합니다.
  9. 데워진 배아 조작 미디어 인큐베이터에서 배아를 이동합니다.
  10. 실체 현미경 따뜻한 무대에받는 사람을 이동하고 (머리가 ​​오른쪽 또는 외과 의사의 왼쪽 측면을 찾고있는) 의사에 횡 방향으로 발생하기 쉬운 위치에 배치합니다.
  11. 면도 영역을 노출 구멍 멸균 수건으로 영역을 커버하고 수술 영역을 조명.
  12. 마지막 갈비뼈와 엉덩이와 허리와 복부 (그림 3A의 사이의 라인의 지느러미 ⅓ 사이의 라인의 두개골 ⅓에 위치한 자리에 피부에 1cm 횡단 (세로) 절개를 수행차 3B). 톱니 모양의 집게를 드레싱으로 피부를 잡고 가위 (그림 3C)으로 잘라.
  13. 피부가 절단되면, 난소 (레드 / 오렌지) 또는 난소 (흰색)를 둘러싼 지방 패드는 신체의 벽을 시각화 할 수 있습니다. 절개가 어떤 큰 혈관을 절단하지 않는 자리에 난소 또는 지방 패드에 몸 벽에 0.3 ~ 0.5 센티미터 횡단 (세로) 절개를 수행합니다. 마이크로 해부 톱니 모양의 집게로 근육을 잡고 가위 (그림 3D)으로 잘라.
  14. 머리가 외과 의사를 향하도록 마우스를 이동합니다.
  15. 배아 조작 피펫 (그림 3E)을로드합니다 :
    1. CZBH 미디어 넓은 부분의 약 5 ㎜까지 조작 피펫의 좁은 부분을 통해 모세관 현상에 의해 상승 할 수 있습니다.
    2. 작은 기포 (0.2 ~ 0.5 mm)를 채택한다.
    3. 에서 배아 (5-10) 소개미디어의 최소량 (2-4 ㎜).
    4. 또 다른 작은 기포 (0.2 ~ 0.5 mm) 및 미디어 소량 (0.5 mm)를 채택한다.
    5. 입 흡인기 홀더 또는 단계 3.17에 대한 준비가 수동 장치에 부착 된 유리 피펫을 남겨주세요.
  16. 마이크로 해부 톱니 모양의 집게로 난소를 둘러싼 지방 패드를 잡고 난소, 난관 및 복강 중 상부 자궁의 작은 부분 (그림 3 층3 세대)에 노출 마우스의 머리를 잡아 당깁니다.
  17. 난관을 이동하고 (난관 자궁을 충족 예) 자궁 - 난관 접합을 폭로 마이크로 해부 톱니 모양의 집게로 지방 패드를 잡고, 사용할 준비가 입에 흡입기 마우스 피스를 들고.
  18. 접근 자궁 - 난관 접합을 유지, (오른쪽 손으로하는 경우) 왼손으로 약간의 곡선 마이크로 해부 집게를 가지고 아래 사항들을 배치그 부분 위의 2mm에 대한 난관을 잡는 자궁 - 난관 접합.
  19. 약간의 곡선 마이크로 해부 집게로 자궁 - 난관 접합부를 잡고, 27 G 바늘 (그림 3H)와 집게에 가까운 난관 부분에 구멍을.
  20. 자궁 - 난관 접합을 통해 자궁에 바늘과 사전에 수행 된 구멍에 ​​배아 조작 피펫을 삽입 (3I3J 피규어). 피펫은 자궁 - 난관 접합부 (그림 3K)을 통과하면 쉽게 미끄러진다. 파편에 의한 자궁 내막의 손상 (더 이상 3 mm 이상) 및 피펫 차단을 방지하기 위해 자궁에 아주 멀리 진행하지 마십시오.
  21. 부드럽게 (그림 3 L)를 불어 자궁에 배아를 놓습니다. 두 기포가 자궁을 통과해야합니다. 첫 번째 거품 위의 미디어 중 일부또한 자궁 내로 방출 만 주입을 방해 할 수 있으므로, 더 많은 공기를 유입 방지 될 수있다.
  22. 배아가 자궁에 출시 된 직후 피펫을 제거합니다.
  23. 난관을 이동하고 지방 패드를 잡아서 다시 복강에 난소.
  24. 5 / 0 흡수성 봉합사 (그림 3M)와 수평 매트리스 스티치 근육을 봉합.
  25. 상처 깎기 (그림 3N)로 피부를 봉합.
  26. 필요한 경우 다른 쪽의 10 단계에서 진행합니다.
  27. 받는 사람 (귀 반지, 문신을 ...) 확인 (따뜻한 스테이지에 배치) 케이지로 이동하고 마취에서 회복 될 때까지 관찰 (의식과 흉골 드러 누움을 유지).
  28. 배아 전송 중에 발생 가능한 그런 일을 주석 및 식수에 항생제를 추가합니다. 따뜻한 SalI으로의 0.5 ~ 1 ㎖를 피하 주사NE 솔루션은 복구를 향상시킵니다.
  29. 상처 클립 10 일 상처 어선 제거 또는 집게 (그림 -30) 두 쌍의 배아 전송 후 제거 할 수 있습니다. 받는 사람이 임신을 평가하고 새끼의 수를 추정하는 그 날에 무게를 할 수 있습니다. 십오일 배아 전송 후받는 사람에게 새끼 자료를 제공합니다.

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Representative Results

자궁 - 난관 배아 전송은 자궁 배아 전송 2,9,10에 관련된 합병증을 방지 자궁에 배아를 전송하는 평균을 제공한다. 표 1에서 우리는 우리가 기술하는 프로토콜 다음 CD1받는 사람에게 조작의 종류를 실시 CD1의 배반포를 전송 얻은 몇 가지 대표적인 결과를 보여줍니다. 기간 (강아지의 결과로 태아의 %) 또는 (렌티 바이러스 노출의 경우) E15에 생존 생존은 수정란 단계 (IVC)에서 체외에서 단순히 배양 배아, 키메라 새끼를 생성하는 IPSC 주입을 실시 배아 사이의 유사하다 자신의 조나 제거했다 배아 전송하기 전에 7 시간 동안 렌티 바이러스에 노출 된 태아. 따라서, 자궁 - 난관 배아 전송, 특히 투명대가 부족한 것과 같은 복잡하고 렌티 바이러스 배양 배아를 전송하는 신뢰할 수있는 기술이다.


그림 1. 케타민-자일 라진. B) 눈 연고의 부 프레 놀핀. C) 응용 프로그램의 피하 주사 마취제 및 진통제의 주입.) 복강 내 주사.

그림 2
그림 2. . 빨간색 "X"로 묘사 정관 프로토콜) 절개 포인트 ()가 약 1 ㎝의 음경 위에 배치됩니다.. 음경 위 0.5 ~ 2.5 cm (검은 선) B) 피부 절개 C) 근육 절개에서 모피를 제거합니다. D) 정관 (검은 색 화살표) 및 테스트(*). E) 한 번에 2 점 정관의 소작. F) 소작의 집게의 불타는된다. G) 정관은 명확하게 두 소작 끝으로 분리. H) 근육의 봉합. I) 피부 봉합. 여기를 클릭하십시오 더 큰 이미지를 볼 수 있습니다.

그림 3
그림 3. 자궁 - 난관 배아 전송 프로토콜 A, B) 등 지느러미와 빨간색 "X"로 묘사 절개 포인트의 측면보기 ();. 마지막 갈비뼈와 엉덩이 사이의 블랙 라인 (A, B) 및 허리와 복부 사이의 (B) 가이드. C) 피부 절개 역할을합니다. E) 배아 조작 유리 피펫. F, G)의 (F) 또는 (G) 황체없이 대표 난소, 검은 색 화살표로 표시. HK를) 표현을 위해 , 자궁 - 난관 배아 전송의 시뮬레이션은 0.4 % 트리 판 블루 용액을 자궁에 가까운 난관의. H) 관통 (검은 색 화살표) (*). I) 배아 조작 피펫의 소개에 유리 조작 피펫을로드 하였다 구멍이 이전에 수행. J) 배아 조작 피펫은 배아 전송에 발표 된 것과 트리 판 블루 용액 상당의 볼륨이 자궁 내강 (검은 색 화살표로 추방 된 자궁 - 난관 접합부. K)). L)까지 진행 자궁 - 난관 접합에 의해 생성 된 효율적인 폐쇄 테스트, 모든조작 피펫의 함량은 자궁으로 방출되었다... 자궁 - 난관 접합 (화살표) 자궁 내로 방출 트리 판 블루 용액 (*) M) 근육 봉합사 N) 피부 봉합 O) 클립 제거의 역류를 막아. 배아 전송받는 사람이 기술을 다음 얻을. Q) 키메라 쓰레기에 잠시 멈춰서는 자료를 제공 P) 15 일 후. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

치료 전송 수 전송 된 태아 전달 새끼 t에 생존음 (%)
IVC 11 (110) 82 74.5
IPSC 주입 3 (50) 35 70.0
렌티 바이러스 6 (60) 44 73.3

표 1. 대표 결과는 자궁 - 난관 배아 전송 다음 조작 배아의 세 가지 그룹을 전송 후 얻을. 1) 배아 배양 시험관 (IVC) 수정란 단계에서 배반포 단계로, 2) 10 양해 각서 (MOU)를 주입 생체 생산 배반포에서E IPSC가 키메라 마우스를 생성하기 위해, 3) 생체 내 그들의 조나 제거했다 및 GFP를 발현하는 렌티 바이러스와 함께 12 시간 동안 배양 하였다 포배를 생산. 데이터는 임신이 더 진행하는 것을 허용하지 않은 한대로 10 일 배아 전송 후 실행 가능한 태아의 숫자를 나타냅니다 렌티 바이러스 노출 된 그룹을 제외하고 전송 된 배아의 수 태어난 새끼의 수를 나타냅니다.

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Discussion

정관 수술은 큰 어려움을 포함하지 않는 비교적 똑 바른 앞으로 수술 기법이다. 포비돈 요오드와 에탄올로 소독하는 경우는 복막을 자극 할 수 있으므로 (에탄올) 마지막 세척, 포비돈 요오드를 제거해야합니다. 정관에 프리 또한 음낭 또는 복부 8 횡 절개를 수행함으로써 달성 될 수있다. 음낭 절개로 인해 필요한 비교적 작은 절개를하고 조금 더 나은 수술 후 행동 (11) 복부 절개를 횡단하는 것을 권장하고있다. 그것은 두 번 같은 정관을 소작하고 기능 정관을 떠나는 초보자 외과 방지, 모두 고환에서 바사 deferentia에 쉽고 명확하게 액세스 할 수 있기 때문에, 우리는 음낭을 통해 복부 절개를 선호한다. 모두 복부 기술 사이에, 우리는 transver을 통해 원격 교육의 알바 세로 절개를 선호SAL이 복부 탈장의 개발을 피하고 모든 복부 근육 섬유를 절단하지 않기 때문에. 그러나 정관 및 자궁 - 난관 배아 전송 프로토콜 모두 사용할 장비 또는 연구원의 개인적인 좋아에 적응 될 수있다. 예를 들어, 유리 구슬 멸균기 정관을 소작하는데 사용 겸자를 가열하는데 사용될 수있다. 어떤 경우에는, 무균 기술을 따라 동물 복지를 극대화하기 위해 적절한 마취 및 진통제를 제공하기 위해, 그리고 지역 규정을 준수하는 것이 필수적입니다.

수정에 대한 감수성 또 다른 측면은 마취 프로토콜입니다. 흡입 마취 (이소 플루 란)를 사용할 수있는 경우는 매우 안정적인 마취 평면과 빠른 복구를 제공, 우리는 대신에 비경 구 (주 사용) 마취의 사용을 권장합니다. 그러나, 흡입 마취 여전히 admini되어야 인트라 및 사후 치료실 통증에 대한 진통의 사용을 필요로한다는 것은 중요전 처치와 수술 전 stered. 부 프레 노르 핀 마우스 (12)의 장기 진통을 제공 아편이다. 비경 마취 또한 정관 및 배아 전송 짧은 절차에 대한 좋은 마취 비행기를 제공합니다. 케타민-자일 라진 마우스 수술 13를위한 매우 신뢰할 수있는 조합이고 우리는 부 프레 노르 핀과 전 처치와 함께이 조합을 사용하는 마취 합병증을 관찰 적이 없다. 다른 비경 조합은 12을 사용할 수 있지만, 우리는 (tribromoethanol) AVERTIN 마약 혼합물의 사용을 권장, 단일 선량 관리 할 수있는 여러 기사는 현지 자극, 가난한 진통제, 장폐색 등의 사용과 관련된 다양한 합병증을보고있다 , 복강, subperitoneal 근육 섬유 및 복부 장기 표면의 괴사, 심지어 사망 14-18에서 섬유 유착.

배아 전송이 모두 배아의 좋은 관리를 필요로하는D받는 사람. 포유 동물의 배아 전송을위한 일반적으로, 태아의 발달 단계보다받는 사람의 pseudopregnancy 단계보다 진보 된, 그러나 그 반대가 될 수 있습니다. 즉, 배아는 어머니 대기 할 수 있지만, 어머니는 배아 기다릴 수 없기 때문에이 기술은 morulae 또는 배반포를 전송하는 데 사용될 수 있지만, 이전 단계하지. 자궁 - 난관 배아 전송 이틀 자궁 - 난관 접합부가 난관에서 배아의 자연 통과 할 수 있도록 열려있는 저녁 - 밤 정오 (2.5 DPC)에서 질 플러그의 검출 (3 DPC), 이후에 수행 할 수 있습니다 자궁 뿔에. 전송 된 배아가 이미 조작의 어떤 종류에서 고통을 수 있다는 것을 고려하면, 배아의 처리는 더 이상의 피해를 최소화해야한다. 마우스 배아의 조작을위한 훌륭한 가이드가 나기 등에서 찾을 수 있습니다. 8시에 정기적으로 생리적 산도를 유지 두 가지 가장 일반적으로 사용되는 마우스 배아의 조작 미디어,mosphere는 CZBH 19 M2 (20)이다. 생체 내 생산 마우스 배아에서 오랜 기간 21 저온 또는 이상 산도에 대한 노출을 극복 할 수 있지만, 조작 미디어 데워진해야합니다. 미디어가 배양 접시에 데워진 경우 미디어의 삼투압으로 인해 수분 증발을 증가하고 그 차가운 조작 미디어보다 더 해로울 수 있습니다로, 오랜 기간 (40 분)을 위해 따뜻하게하지 마십시오. 마찬가지로, 배아 조작 피펫 내부에 소요되는 시간으로 인해 피펫에 존재하는 작은 볼륨으로 최소화해야한다.

적절한 배아 조작 피펫의 사용은 프로토콜의 성공에 중요하다. 조작 피펫은 얇은 유리 벽과 유리 모세관에서 할 수있다. 종종 큰 동물의 배아를 처리하는 데 사용 파스퇴르 피펫이 또한 사용될 수 있으나 첨단까지 핸들로부터 짧은 거리로, 유리 모세관에서 만든 조작 피펫 추가 COMF 아르책략 ortable. 당김의 화염 속도에 노출 된 벽 두께 및 피펫의 내경을 결정한다. 연습, 끌어 당기는 마이크로 포지도 사용할 수 있습니다 후 조작 피펫은 손으로 쉽게 할 수 있지만. 그것은 여러 최적의 조작 피펫을 생산 시간을 투자하는 것이 중요합니다. 조작 피펫 구경이 원활한 흐름을 허용하도록 배아보다 넓게되지만 쉽게 침투 자궁 - 난관 접합부 통해 진행 충분히 작다.해야 투명대가 전송 전에 제거 된 경우, 포배는 일반적으로 더 큰 직경 확장. 이 경우에는 trophectoderm 세포의 손상을 방지하기 위해 더 넓은 개구 (130-180 μM)와 함께 넓은 피펫을 만드는 것이 바람직하다. 조나가 제거 된 경우 특히, 파편에 의해 차단되는 피펫 팁을 피하기 위해 - 팁 폴란드어 난관, 자궁 벽과 배아의 손상을 방지하는 것이 중요합니다. 그러나, 연마 후, 조리개 N해야직경 격감 흐름 속도의 급격한 변화를 야기하므로 OT는 피펫의 내경에 비해 너무 작다. 흡입기 마우스 피스가 더 정확한 흐름 제어뿐만 아니라 손으로 제어 장치에 비해 더 편안한 손의 위치를​​ 제공합니다. (예를 들어 렌티 바이러스 처리 된 배아를 조작 할 때) 필요한 경우 역시, 손으로 제어 장치가 사용될 수있다. 최적의 유동 및 미네랄 오일의 이동을 방지하기 위해, 대신 조작 매체 배지에서 배아를 이동시키는 데 사용하는 배아의 전송을 위해 새 피펫을 사용하는 것도 바람직하다. 마지막으로, 난관을 통해 펫을 소개하면서, 모세 혈관, 직접 처리해야한다. 확고한 그립을 구하는 것이 유리하지 흡인기의 플라스틱 손잡이를 잡아. 배아 전송에 사용되는 배율은 외과 의사의 시력에 따라 개인의 문제입니다. 우리는 넓은 시야를 가지고 낮은 배율을 사용하는 것을 선호,그래서 우리는 10X 최종 배율 (10 배 안구 및 1X 목적)를 사용합니다.

받는 사람은 최소 8 주 이전하고 27~40그램 사이에 무게를해야합니다. 이러한 CD1 또는 스위스 웹스터 같은 마우스는 좋은 어머니의 행동을 표시하고 우수한받는 사람입니다 Outbreed. 사용하지 않는 사람들은 2 주 만에 정상 순환 활동을 복구하므로 그것은 여분의받는 사람을 얻기 위해 사육을 설정하는 것이 좋습니다. 성관계에도 불구하고, 일부 여성은 황체 (그림 3G)이되지 않을 수 있으므로 전송 된 배아을 받아 들일 수 없습니다. 이러한 이유로, 난소 2.5에서 DPC는 명확 난소 (그림 3 층)에서 밝은 빨간색 구조로 식별 할 수있는 황체의 존재 여부를 확인해야합니다. 난소와 자궁의 과도한 조작 luteolysis이 발생할 수 있으며, 수술하는 동안 대신 난소 지방 패드를 잡아하여 생식 기관과의 접촉을 최소화하는 것이 중요합니다. manipulatio의 도입난관에 N 피펫은 프로토콜의 가장 복잡한 공정이다. 받는 사람 중 일부에서, 난관은 매우 트위스트하고 자궁과 접합에서 2mm 스트레이트 스트레치는 없습니다. 이 경우 난관을 준비하고 첫 번째 굽힘에 구멍을 수행합니다. 위에서 설명한 바와 같이, 좋은 조작 피펫은 정말 차이가 있습니다. 피펫은 자궁 - 난관 접합부를 통과 한 후에는 쉽게 슬라이드. 그렇지 않은 경우, 피펫은 난관에서 이탈 및 자궁 내강에 도달하지 수 있습니다. 미디어가 전달되지 않는 경우에 한 번 자궁 내부, 약간 밖으로 나에 피펫을 이동하고 다시 시도하십시오. 아직 전달되지 않는 경우, 피펫은 조작 미디어 접시에 콘텐츠를 해제하고 동일하거나 다른 펫을 다시 자궁에서 꺼내 차 있습니다. 배송은 일반적으로 배아 전송 후 십칠일 일어난다. 고기를 먹는 풍습을 방지하기 위해 사전에 이일 자료를 새끼 제공 및 배달 후 첫 일 동안 케이지를 변경하지 마십시오.

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Disclosures

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

이 작품은 BT에 대한 동물 및 조류 과학학과에서 기금에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine VEDCO Ketaved ANADA 200-257 To be ordered by a licensed veterinarian.
Xylazine Lloyd Laboratories Anased NADA #139-236 To be ordered by a licensed veterinarian.
Buprenorphine Generic NDC 400-42-010-01 To be ordered by a licensed veterinarian.
Eye ointment Novartis Genteal
Antibiotic Pfizer Clavamox NADA #55-101. Added to drinking water (0.3 mg/ml of amoxicillin trihydrate and 0.075 mg/ml of clavulanate potassium). Add 1.5 ml of the reconstituted 15 ml bottle to 250 ml of water.
Dressing serrated forceps ROBOZ RS-8120 Any medium size surgical-grade steel straight forceps will work.
Microdissecting serrated forceps ROBOZ RS-5137 These ones are curved at a 90º angle. Straight forceps can be used if preferred.
Slight curved micro dissection forceps ROBOZ RS-5136 This model is particularly useful to hold the oviduct.
Scissors ROBOZ RS-5880 Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
27 G needles Beckton-Dickinson 305136 Smaller needles (30 G) can be also used. 25 G may be a bit too big.
Clip applier MiKRon 42763
9 mm Clips MiKRon 427631
Clip remover MiKRon 7637 Two pairs of teeth forceps (ROBOZ RS-8160) can be used instead.
Suture needle holder ROBOZ RS-7820
Suture Dowist Gell 5-0 Dexon S 7204-21 Can be substituted for any 4-0 to 6-0 absorbable suture with a narrow curved needle.
Glass capillaries VWR 100 ul calibrated pipettes 53432-921 It includes a mouth aspirator system that only requires to attach a 0.22 µm filter in the tubing to be ready to use. More information can be obtained in Nagy et al.8
Burner KISAG AG Typ 2002 Gas operated burner, can be charged with Kigas (CH-4512, from the same vendor). Alcohol burners may be also used, but gas provides a higher temperature and this burner provides a small and precise flame.
Stereomicroscope Leica MZFLIII This is an expensive estereomicroscope with fluorescence, that can be also used for other purposes. There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. It is better to use two stereomicroscopes, one for handling the embryos (which does not need to be a very nice one) and another one for the recipient. The one used for the recipient should display a long distance from the stage plate to the objective lense, in order to be able to focus 3-4 cm above the stage plate (where the oviduct will be placed) and still leave some room for the surgeon; most of the stereomicroscopes can do this, but some cannot. 
Fiber optics ilumination Dolan Jenner Fiber lite To iluminate the surgical area. There are different systems available.
Warm stages American scope http://store.amscope.com/tcs-100.html These can be placed over the stage plate of the stereomicroscope. Some modifications (inserting a stick to level the stage) may be needed if it is too short for the stereomicroscope. A big warm stage can be used for warming the cage if it is available. If not, a regular heating pad can be used, but temperature must be checked.
Culture dishes for embryo manipulation Falcon 353001 351008 may be also used; they made narrower drops.

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References

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