Transferencia de Embriones Utero-de trompas y vasectomía en el modelo de ratón

Biology

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Summary

La transferencia de embriones útero-tubárica utiliza la unión útero-tubárica como una barrera para impedir la salida de embriones que puede ocurrir cuando se realiza la transferencia uterina. Se requieren machos vasectomizados obtener destinatarios pseudopreñadas para la transferencia de embriones. Ambas técnicas se discuten.

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Bermejo-Alvarez, P., Park, K. E., Telugu, B. P. Utero-tubal Embryo Transfer and Vasectomy in the Mouse Model. J. Vis. Exp. (84), e51214, doi:10.3791/51214 (2014).

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Abstract

La transferencia de los embriones de preimplantación a una hembra sustituto es un paso necesario para la producción de ratones modificados genéticamente o para estudiar los efectos de las alteraciones epigenéticas originadas durante el desarrollo de preimplantación en la posterior desarrollo y adulto fetal salud. El uso de una técnica de transferencia de embriones eficaz y coherente es crucial para mejorar la generación de animales modificados genéticamente y para determinar el efecto de diferentes tratamientos en las tasas de implantación y la supervivencia a largo plazo. Los embriones en la etapa de blastocisto se transfieren generalmente por transferencia uterina, la realización de una punción en la pared uterina para introducir la pipeta de manipulación de embriones. El orificio realizado en el útero no se cierra después de que la pipeta ha sido retirada, y los embriones puede salida a la cavidad abdominal debido a la presión positiva del útero. La punción también puede producir una hemorragia que afecta la implantación, bloquea la pipeta de transferencia y puede afectar el embrión desarrollo, especialmente cuando se transfieren los embriones sin zona. En consecuencia, esta técnica a menudo resulta en tasas de supervivencia bajas embrión muy variables y globales. Evitar estos efectos negativos, la transferencia de embriones útero-tubárica tomar ventaja de la unión útero-tubárica como una barrera natural que impide la salida del embrión y evitar la punción de la pared uterina. Se requieren machos vasectomizados para la obtención de los receptores pseudopreñadas. Una técnica para llevar a cabo la vasectomía se describe como un complemento a la transferencia de embriones útero-tubárica.

Introduction

La transferencia de embriones es probablemente el procedimiento quirúrgico más frecuente se realiza en el modelo de ratón. Esta técnica es esencial para obtener la descendencia a partir de embriones sometidos a técnicas de manipulación in vitro en y, por lo tanto, constituye un paso necesario para el desarrollo de modelos modificados genéticamente mediante inyección pronuclear, la transducción lentiviral, o formación de quimeras. Además, la técnica permite el estudio de los efectos sobre el desarrollo de los diversos insultos que ocurren durante el desarrollo de preimplantación. El uso de técnicas de reproducción artificial 1 o la exposición a concentraciones anormales de diferentes sustancias o metabolitos 02 de mayo afectar el desarrollo del embrión que resulta en la implantación o placentación fallos y efectos a largo plazo en la descendencia. Una técnica de transferencia de embriones fiable y reproducible es crucial para probar los posibles efectos negativos del tratamiento experimental en la implantación y el desarrollo fetal en un hombre coherentener.

Preimplantación de embriones murinos se pueden transferir a una hembra receptora, ya sea en el oviducto a través de las ampollas de 0,5 días postcoital (dpc) receptores pseudopreñadas (de transferencia) 3,4 oviducto o al útero de 2,5 dpc pseudopreñada receptor (transferencia uterina) 5,6 dependiendo de su estado de desarrollo. Los embriones en la etapa de blastocisto, tales como los que se utilizan para generar ratones quiméricos mediante la inyección de células madre pluripotentes embrionarias o inducidas, se transfieren generalmente por transferencia uterina. Los blastocistos pueden también ser transferidos al oviducto de un DPC receptor 0.5, pero constituye una prueba menos fisiológica para los disruptores de desarrollo, debido a que el embrión se somete a diapausa y tiene 2 días para recuperarse de la lesión antes de la implantación tiene lugar. Transferencia uterina implica la punción de la pared uterina con una aguja estrecha con el fin de generar una abertura que permite el acceso de una pipeta de manipulación de embrión en el lumen uterino. Launque esta técnica puede dar buenos resultados, la supervivencia a plazo (es decir, el porcentaje de embriones transferidos que se desarrollan a un cachorro) suele ser baja e impredecible 7,8.

La perforación de la pared uterina conlleva algunos efectos secundarios perjudiciales. En primer lugar, miometrio es un tejido altamente vascularizado y su punción a menudo resulta en una pequeña hemorragia. La sangre puede bloquear la pipeta de transferencia de embriones o invadir el lumen uterino causando la muerte embrionaria y / o fallo de implantación. Esto es particularmente relevante cuando los embriones se transfieren sin zona, ya que las células de la sangre y los desechos pueden adherirse a los blastómeros. En segundo lugar, la apertura realizada no sella después de que los embriones se han transferido, por lo que puede fluir de vuelta a través del orificio y ser expulsado a la cavidad abdominal cuando un volumen demasiado grande ha sido introducir en el útero. La transferencia de embriones útero-tubárica se describe en el presente documento se aprovechan de la unión útero-tubárica para entregar el EMBRyos en el útero sin la necesidad de perforar la pared uterina y de ese modo evitar sus consecuencias adversas 9.

Las hembras receptoras pseudopreñadas utilizados para la transferencia de embriones se obtienen mediante monta natural con machos vasectomizados 8. Las secreciones seminales producidos por un macho estéril son necesarios para el útero a ser receptivo a los embriones transferidos. Para obtener un receptor, un máximo de 2 hembras de 8 semanas a 6 meses de edad se colocan con un hombre sometido a la vasectomía en la tarde. A la mañana siguiente, las hembras se comprueba la presencia de un tapón de la cópula vaginal, un grupo de proteínas coaguladas del líquido seminal masculino. Como el apareamiento ocurre generalmente durante la medianoche, el día de la detección de tapón vaginal se considera 0,5 dpc. Aunque los machos vasectomizados se pueden adquirir en algunos vendedores, el procedimiento quirúrgico descrito en el presente documento es relativamente fácil y no requiere ningún instrumentos adicionales a los requeridos para la transferencia de embriones.

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Protocol

Todos los experimentos con animales fueron aprobadas por el Cuidado de Animales y el empleo Comites Área Beltsville (BAACUC 11-015), de acuerdo con el USDA y Cuidado de Animales Pautas del uso.

1. Anestesia y Analgesia (comunes a los procedimientos quirúrgicos)

  1. Pesar el ratón y cargar los siguientes anestésicos y analgésicos en dos jeringas de 1 ml con 27 g de agujas:
    1. La ketamina (0,1 mg / g: 0,01 ml / g de una solución de 10 mg / ml) y xilazina (0.01 mg / g: 0,005 ml / g de una solución 2 mg / ml).
    2. La buprenorfina (0,1 g / g: 0,01 ml de una solución 0,01 mg / ml).
  2. Inmovilizar el ratón al levantar el pescuezo tan cerca de las mandíbulas como sea posible con el pulgar y los dedos índice y sosteniendo la cola entre los dedos meñique y anular.
  3. Inyectar mezcla de ketamina Xilazina intraperitoneal. Con el fin de evitar la punción de órganos internos, mantenga el ratón conla cabeza ligeramente por debajo del nivel de sus caderas (Figura 1A)
  4. Inyectar por vía subcutánea buprenorfina en la piel del cuello de retención entre el pulgar y el dedo índice (fig. 1B).
  5. Deja el ratón en la jaula (limpio y sin ningún otro animal) en un escenario cálido.
  6. Una vez inconsciente, comprobar la ausencia de reflejos del pie trasero (verificado por pizca dedo del pie). Aplicar pomada para los ojos para evitar la sequedad del ojo y para comprobar la ausencia de reflejo palpebral (fig. 1C).
  7. Este protocolo proporciona un plano quirúrgico de anestesia durante un mínimo de 30 minutos, suficiente para llevar a cabo los procedimientos descritos a continuación (Protocolos 2 y 3). Si se requieren tiempos más largos, una inyección adicional de ketamina + xilazina con la mitad de la dosis descrito en 1.1.1 se puede aplicar después de 30 min. Un cambio en el patrón de respiración de un ser más rápido e irregular indica la LOss del plano de anestesia adecuado.

2. Vasectomía

  1. Utilice un macho con una capacidad de apareamiento probada.
  2. Esterilizar los instrumentos quirúrgicos, limpiar las superficies donde se realizará la cirugía y secarlos con etanol al 70%.
  3. Lleve a cabo la anestesia como se detalla anteriormente (Protocolo 1), la comprobación de la pérdida de reflejos.
  4. Coloque el ratón en un escenario caliente, retire la piel con una maquinilla eléctrica de la zona ventral entre dos líneas transversales imaginarias colocó 0,5 cm y 2,5 cm por encima del pene (Figura 2A).
  5. Desinfecte el área afeitada por barrido secuencial con 10% de yodo povidona y etanol al 70%.
  6. Coloque el ratón en posición supina con la cola hacia el cirujano y cubierta con una toalla estéril con un agujero exponiendo la zona afeitada. Ilumine la zona quirúrgica.
  7. Realizar un 10-15 mm incisio piel longitudinaln en la línea media del abdomen, alrededor de 1 cm por encima del pene. Mantenga la piel con unas pinzas dentadas vestirse y luego se corta con tijeras (Figuras 2A y 2B).
  8. Realice una incisión longitudinal de 5-10 mm en la línea alba. Mantenga el músculo con microdissecting pinzas dentadas y cortar con tijeras (Figura 2C).
  9. Coge la almohadilla adiposa testicular de un lado con micro pinza de disección dentadas y tire de ella para exponer testículo, conducto deferente y el epidídimo. Conducto deferente se encuentra medial a los testículos y se trata de un tubo de conexión claramente distinguibles (no pegado a la pared como el testículo epidídimo) con un vaso sanguíneo que recorre uno de los lados (Figura 2D).
  10. La celebración de los conductos deferentes con disección serrado micro pinzas, fórceps vestidores llama hasta que se vuelvan de color rojo (Figura 2E cauterizar los vasos deferentes en dos puntos a la vez (Figura 2F). El corte debe retirar una porción de unos 5 mm y dejar dos extremos cauterizados claramente separados (Figura 2 G).
  11. Mueva los testículos, el epidídimo y el conducto deferente de nuevo a la cavidad abdominal.
  12. Proceda desde el paso 9 en el otro testículo.
  13. La sutura el músculo con uno o dos puntos de sutura de colchonero horizontales hechas con 5/0 sutura absorbible (Figura 2H).
  14. La sutura la piel con uno o dos máquinas de cortar de la herida (Figura 2I).
  15. Identificar los varones vasectomizados (anillo de oído, tatuaje dedo ...), lo mueve la jaula colocada en un escenario cálido y observar hasta que se recupere de la anestesia (consciente y mantener decúbito esternal). Una inyección subcutánea 0,5-1 ml de solución salina caliente mejora la rerecuperación. Registrar los posibles incidencias que ocurren durante la transferencia de la vasectomía, añadir antibiótico para el agua potable.
  16. Grapas para heridas pueden ser retirados 10 días después de la vasectomía con un removedor de las podadoras de la herida o un par de pinzas de dientes. El macho vasectomizado estará listo para aparearse 2 semanas después de la cirugía.
  17. Pruebe la infertilidad del varón vasectomizado por apareamiento con hembras fértiles antes de usarla para obtener los destinatarios.

3. Transferencia de Embriones Utero-tubárica

  1. Ratón mórula o blastocisto se pueden transferir mediante esta técnica a una hembra receptora pseudopreñada a 2,5 dpc.
  2. Preparar embrión pipeta de vidrio manipulación:
    1. Pulir las puntas de los capilares de vidrio con el fin de evitar daños en el soporte de pipetas.
    2. Suavizar una porción media del capilar de vidrio por calentamiento con una multa de llama mientras que girar ligeramenteel capilar con ambas manos de forma sincrónica. Una vez que la sección capilar se vuelve suave y maleable (rojo claro), retirar rápidamente del fuego y tirar de ambos extremos para reducir su diámetro externo a 130-150 micras.
    3. Espere a que el vidrio se enfríe y luego se corta por la ligera anotando la parte estrecha con un lápiz de punta de diamante, la piedra abrasiva o lima de uñas y tirando de ambos lados. La ruptura debe estar limpia y perpendicular
  3. Pulir la punta por flameado muy rápidamente, dejando una abertura de 100 a 130 micras. Las pipetas se pueden almacenar para su uso posterior.
  4. Warm medios manipulación de embriones (CZBH o M2, ver discusión).
  5. Esterilizar los instrumentos quirúrgicos, limpiar las superficies donde se realizará la cirugía y secarlos con etanol al 70%.
  6. Lleve a cabo la anestesia como se detalla anteriormente (Protocolo 1), la comprobación de la pérdida de reflejos.
  7. Mantener tque el ratón de un escenario caliente, retire la piel con una maquinilla eléctrica de la zona dorsal entre las rodillas y los nervios distales (Figuras 3A y 3B).
  8. Desinfecte el área afeitada por barrido secuencial con 10% de yodo povidona y etanol al 70%.
  9. Mueva los embriones de la incubadora a los medios de manipulación embrionaria precalentado.
  10. Mueva el receptor a una etapa caliente bajo el microscopio estereoscópico y colocarlo en posición de decúbito prono lateral para el cirujano (con su cabeza mirando a la derecha oa la izquierda del cirujano).
  11. Cubra el área con una toalla estéril con un agujero de la exposición de la zona afeitada e iluminar el área quirúrgica.
  12. Realice una incisión transversal 1 cm (vertical) en la piel en un lugar situado en la craneal ⅓ de la línea entre la última costilla y la cadera y el ⅓ dorsal de la línea entre la espalda y el abdomen (Figuras 3A unaND 3B). Mantenga la piel con unas pinzas dentadas vestir y cortar con tijeras (Figura 3C).
  13. Una vez que la piel ha sido cortado, ovario (rojo / naranja) o la almohadilla de tejido adiposo que rodea el ovario (blanco) se pueden visualizar a través de la pared del cuerpo. Realizar un 0,3-0,5 cm incisión transversal (vertical) en la pared del cuerpo sobre el ovario o almohadilla adiposa en un lugar donde la incisión no corta ningún vaso sanguíneo grande. Mantenga el músculo con micro pinza de disección dentadas y cortar con tijeras (Figura 3D).
  14. Mueve el ratón para tener frente a su cabeza hacia el cirujano.
  15. Cargue la pipeta manipulación de embriones (Figura 3E):
    1. Permita que el medio CZBH para ascender por capilaridad a través de la parte estrecha de la pipeta hasta la manipulación de unos 5 mm de la parte más ancha.
    2. Tome una pequeña burbuja de aire (0,2-0,5 mm).
    3. Introducir los embriones (5-10) enuna cantidad mínima de medios de comunicación (2-4 mm).
    4. Tome otra burbuja de aire pequeña (0,2-0,5 mm) y una pequeña cantidad de medio (0,5-1 mm).
    5. Deje la pipeta de vidrio adjunta al titular aspirador bucal o en el dispositivo de accionamiento manual, listo para el paso de 3.17.
  16. Coge la almohadilla adiposa que rodea el ovario con micro pinza de disección dentadas y tire de él hacia la cabeza del ratón para exponer el ovario, oviducto, y una pequeña porción de la parte superior del útero fuera de la cavidad abdominal (Figuras 3F y 3G).
  17. Sosteniendo la pieza de la boca de aspiración en la boca, listo para ser utilizado, agarrar la almohadilla adiposa con micro pinzas de disección dentadas para mover el oviducto y exponer la unión útero-tubárica (es decir, donde el oviducto se encuentra con el útero).
  18. Mantener la unión útero-tubárica accesible, tomar pequeñas pinzas de disección micro curvas con la mano izquierda (si es diestro) y colocarlos justo debajola unión útero-tubárica agarrando el oviducto sobre 2 mm por encima de la porción.
  19. Sosteniendo la unión útero-tubárica con el ligero fórceps de disección micro curvas, perfore la sección oviducto cerca de las pinzas con una aguja 27 G (Figura 3H).
  20. Inserte la manipulación pipeta embrión en el orificio realizado con la aguja y el avance hacia el útero a través de la unión útero-tubárica (Figuras 3I y 3J). Una vez que la pipeta ha pasado la unión útero-tubárica (Figura 3K) se desliza fácilmente. No progresar mucho en el útero para prevenir el daño endometrial (no más de 3 mm) y el bloqueo de la pipeta por los escombros.
  21. Suelte los embriones en el útero soplando suavemente (Figura 3L). Ambas burbujas de aire deben pasar por el útero. Algunos de los medios de comunicación por encima de la primera burbujatambién puede ser liberado en el útero, pero no introducir más aire, ya que puede impedir la implantación.
  22. Retire la pipeta justo después de los embriones han sido puestos en libertad en el útero.
  23. Mueva el oviducto y ovario de nuevo a la cavidad abdominal por el acaparamiento de la almohadilla adiposa.
  24. La sutura el músculo con un punto de colchonero horizontal con 5/0 sutura absorbible (Figura 3M).
  25. La sutura la piel con un clipper herida (Figura 3N).
  26. Proceder de la etapa 10 en el otro lado, si es necesario.
  27. Identificar el destinatario (el anillo de oído, tatuaje dedo ...), moverlo a su jaula (colocado en un escenario cálido) y observar hasta que se recupere de la anestesia (consciente y mantener decúbito esternal).
  28. Anotar las posibles incidencias que se producen durante la transferencia de embriones y añadir antibiótico para el agua potable. Una inyección subcutánea 0,5-1 ml de sali calientene solución mejora la recuperación.
  29. Grapas para heridas pueden ser retirados 10 días después de la transferencia de embriones con un removedor de las podadoras de la herida o dos pares de pinzas (Figura 3O). El destinatario puede ser pesado en ese día para evaluar el embarazo y estimar el número de crías. Proporcionar el material enclavado al destinatario 15 días después de la transferencia de embriones.

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Representative Results

Transferencia de embriones útero-tubárica proporciona un medio para transferir los embriones al útero para evitar algunas de las complicaciones asociadas a la transferencia de embriones del útero 2,9,10. En la Tabla 1 se muestra algún resultado representante hemos obtenido la transferencia de blastocistos CD1 sometidas a diferentes tipos de manipulaciones a destinatarios CD1 siguiendo el protocolo descrito. La supervivencia a plazo (% de los embriones resultantes en un cachorro) o la supervivencia a E15 (en el caso de los lentivirus expuesta) es similar entre embriones simplemente cultivadas in vitro a partir de la fase de cigoto (IVC), embriones sometidos a inyección de IPSC para generar crías quiméricas y los embriones que tenían su zona removida y se expusieron a lentivirus durante 7 horas antes de la transferencia de embriones. Por lo tanto, la transferencia de embriones útero-tubárica es una técnica fiable para transferir embriones especialmente complicados como los que carecen de la zona pelúcida y se incubaron con lentivirus.


Figura 1. La inyección de anestésicos y analgésicos. A) La inyección intraperitoneal de. Ketamina-xilazina B) La inyección subcutánea de la buprenorfina. C) La aplicación de pomada para los ojos.

Figura 2
Figura 2. . Protocolo Vasectomía A) El punto de incisión (representado con una "X" roja) se coloca alrededor de 1 cm por encima del pene, retire la piel 0,5-2,5 cm por encima del pene (líneas negras) de incisión B) de la incisión de la piel C) del músculo... deferentes D) Vas (flecha negro) y la pruebaes (*). E) llameante del fórceps de la cauterización. F) La cauterización de los vasos deferentes en dos puntos a la vez. deferentes G) Vas claramente separados en dos extremos cauterizados. H) sutura muscular. I) de la sutura de la piel. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 3
Figura 3. Protocolo Utero-tubárica transferencia de embriones A, B) dorsal y lateral del punto de incisión (representado con una "X" roja);. Líneas negras entre la última costilla y la cadera (A, B) y entre la espalda y el abdomen (B) servir de guía. C) incisión de la piel. E) pipeta de vidrio manipulación de embriones cargado con 5 blastocistos listos para ser transferidos. F, G) ovarios representativos con (F) o sin (G) cuerpo lúteo, indica con flechas negras. HK) Para fines de representación , se realizó una simulación de la transferencia de embriones útero-tubárica la carga de una pipeta de manipulación de vidrio con 0,4% de tripano solución de azul. H) Punción del oviducto (flecha negro) cerca del útero (*). i) la introducción de la pipeta en la manipulación de embriones el orificio realizado previamente. J) La pipeta de manipulación de embriones avanza a través de la unión útero-tubárica. K) Un volumen de solución de azul de tripano equivalente a la liberada en una transferencia de embriones ha sido expulsado en el lumen uterino (flecha negro). L) Para probar el cierre eficiente producido por la unión útero-tubárica, todos losel contenido de la pipeta de manipulación se libera en el útero; unión útero-tubárica (flecha) impide el flujo posterior de la solución de azul de tripano se libera en el útero (*) la eliminación M) de sutura muscular N) de sutura de la piel O) del clip.... P) 15 días después de la transferencia de embriones proporcionar material de pichones para el receptor. Q) camada quimérico obtenido siguiendo esta técnica. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Tratamiento Número de transferencias Los embriones transferidos Los cachorros entregados La supervivencia a term (%)
IVC 11 110 82 74.5
inyección de IPSC 3 50 35 70.0
Lentivirus 6 60 44 73.3

Tabla 1. Los resultados representativos obtenidos después de la transferencia de tres grupos diferentes de embriones manipulados tras la transferencia de embriones útero-tubárica. 1) Los embriones cultivados in vitro (IVC) de la fase de cigoto a la etapa de blastocisto, 2) En vivo producido blastocitos inyectados con 10 mouse IPSC para generar ratones quiméricos, 3) in vivo produce los blastocistos que tenían su zona retira y se incubaron durante 7 h con un lentivirus que expresan GFP. Los datos representan el número de crías nacidas con respecto al número de embriones transferidos, excepto para el grupo de lentivirus expuesta, donde representan el número de fetos viables 10 días después de la transferencia de embriones, ya que la gestación no se permite seguir avanzando.

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Discussion

La vasectomía es una técnica quirúrgica relativamente sencillo que no implica mayores dificultades. Cuando desinfecte con yodo povidona y etanol asegúrese de que el último lavado (con etanol) elimina la povidona yodada, ya que puede irritar el peritoneo. El acceso a los conductos deferentes también se puede lograr por el escroto o la realización de una incisión transversal en el abdomen 8. Incisión escrotal ha sido recomendado para transversales incisión abdominal debido a la incisión relativamente más pequeña sea necesario y ligeramente mejor comportamiento postoperatorio 11. Sin embargo, preferimos la incisión abdominal por encima del escroto, ya que proporciona un acceso más fácil y más claro a los conductos deferentes de ambos testículos, evitando que los cirujanos noveles de la cauterización de dos veces los mismos conductos deferentes y dejando un conducto deferente funcionales. Entre ambas técnicas abdominales, estamos a favor de la incisión longitudinal en la línea alba sobre la transversalidadSal porque no corta cualquier fibra muscular de abdominal, evitando el desarrollo de las hernias abdominales. Sin embargo, tanto la vasectomía y protocolos de transferencia de embrión útero-tubárica se pueden adaptar a la disponibilidad del equipo o a los gustos personales del investigador. Por ejemplo, un esterilizador de perlas de vidrio se puede utilizar para calentar los fórceps usados ​​para cauterizar los vasos deferentes. En cualquier caso, es esencial seguir una técnica aséptica, para proporcionar anestesia y analgesia adecuada con el fin de maximizar el bienestar animal, y para cumplir con las regulaciones locales.

Otro aspecto susceptible de modificaciones es el protocolo de anestesia. Si la anestesia inhalatoria (isoflurano) está disponible, le recomendamos su uso en lugar de parenteral (inyectable) la anestesia, ya que proporciona un plano de anestesia muy estable y rápida recuperación. Sin embargo, es importante señalar que la anestesia inhalatoria todavía requiere el uso de un analgésico para el dolor intra-y post-operatoria, que debe ser adminisstrada antes de la cirugía como premedicación. La buprenorfina es un opiáceo que proporcionan analgesia a largo plazo en ratones 12. Anestesia parenteral también proporciona un buen plano anestésico para procedimientos cortos, tales como la vasectomía y la transferencia de embriones. La ketamina-xilazina es una combinación muy fiable para la cirugía del ratón 13 y nunca hemos observado ningún tipo de complicaciones anestésicas mediante esta combinación junto con la premedicación con buprenorfina. Otras combinaciones parenterales se pueden usar 12, pero no recomendamos el uso de la mezcla narcótica avertina (tribromoethanol), ya que sólo una única dosis puede administrar y múltiples artículos han reportado diversas complicaciones asociadas a su uso, tales como irritación local, la mala analgesia, íleo , adherencias fibrosas en la cavidad abdominal, la necrosis de fibras musculares y órganos abdominales subperitoneales de la superficie, e incluso mortalidad 14-18.

La transferencia de embriones requiere una buena gestión de los dos embriones de und destinatario. Como regla general para la transferencia de embrión de mamífero, la etapa de desarrollo de los embriones puede ser más avanzado que la etapa de la pseudopreñez del receptor, pero no al revés. En otras palabras, los embriones pueden esperar a que la madre, pero la madre no pueden esperar a que los embriones, por lo que esta técnica puede ser utilizada para transferir mórula o blastocisto, pero no las etapas anteriores. Transferencia de embriones-Utero de trompas puede realizarse dos días después de la detección del tapón vaginal a partir del mediodía (2,5 dpc) a la tarde-noche (3 DPC), cuando la unión útero-tubárica está abierto para permitir el tránsito natural de los embriones del oviducto a cuernos uterinos. Teniendo en cuenta que los embriones transferidos pueden ya han sufrido algún tipo de manipulación, manipulación de los embriones debe minimizar cualquier daño adicional. Una excelente guía para la manipulación de embriones de ratón se puede encontrar en Nagy et al. 8 Los dos medios de manipulación de embriones de ratón más comúnmente usados, que tienen un pH fisiológico en regular enatmósfera, son CZBH 19 y 20 M2. Aunque en vivo producido embriones de ratón se puede superar la exposición al frío oa temperatura pH anormal durante largos períodos de 21, los medios de manipulación deben ser precalentado. Si los medios de comunicación se precalienta en un plato de cultivo, evitar el calentamiento por períodos largos (más de 40 minutos), ya que la osmolaridad de los medios de comunicación se incrementará debido a la evaporación del agua y que puede ser más perjudicial que la manipulación mediática frío. Del mismo modo, el tiempo de los embriones pasaron el interior de la pipeta de manipulación debe reducirse al mínimo debido al pequeño volumen presente en la pipeta.

El uso de una pipeta adecuada manipulación de embriones es crucial para el éxito del protocolo. Pipetas de manipulación se pueden hacer de capilares de vidrio con una pared de cristal fino. Pipetas Pasteur, a menudo usados ​​para manejar grandes embriones de animales, también se pueden emplear, pero debido a su distancia más corta desde el mango hasta la punta, pipetas de manipulación elaborados a partir de capilares de vidrio son más COMFortable para maniobrar. La exposición a la llama y la velocidad de tirar de determinar el espesor de pared y el diámetro interior de la pipeta. Aunque pipetas de manipulación se puede hacer fácilmente a mano después también se pueden usar un poco de práctica, extractor y micro-fragua. Es importante invertir tiempo en la producción de varias pipetas óptimas de manipulación. La abertura de la pipeta de manipulación debe ser más ancho que un embrión para permitir un flujo suave, pero lo suficientemente pequeñas como para penetrar fácilmente y progresar a través de la unión útero-tubárica. Si zona pelúcida se ha eliminado antes de la transferencia, los blastocistos por lo general se expanden hasta un diámetro mayor. En este caso, es recomendable hacer las pipetas más amplias con una apertura más amplia (130-180 m) para evitar cualquier daño a las células trophectoderm. Polaco Consejo es importante para no dañar el oviducto, la pared uterina y el embrión - especialmente si zona se ha eliminado, y para evitar la punta de pipeta de ser bloqueado por escombros. Sin embargo, después de pulir, la abertura debe nOT ser demasiado pequeño comparado con el diámetro interior de la pipeta, como una fuerte disminución en el diámetro causará cambios bruscos en la velocidad de flujo. La boquilla de aspiración proporciona un control de flujo más precisa, así como una posición más cómoda de la mano en comparación con los dispositivos de control manual. Sin embargo, un dispositivo de control manual puede ser utilizado en caso necesario (por ejemplo, cuando la manipulación de embriones tratados con lentivirus). Para un flujo óptimo y para evitar la transferencia de aceite mineral, también es recomendable utilizar una nueva pipeta para la transferencia de embriones en lugar de que se utiliza para mover los embriones de los medios de cultivo a los medios de manipulación. Por último, mientras que la introducción de la pipeta a través del oviducto, el capilar debe ser manejado directamente, es decir. agarrar el vaso y no el asa de plástico del aspirador, para obtener un agarre firme. El aumento que se usa para la transferencia de embriones es un asunto personal que depende de la agudeza visual del cirujano. Nosotros preferimos utilizar bajo aumento para tener un campo visual amplio,así que utilizamos un final 10X de aumento (ocular 10X y objetivo 1X).

Los destinatarios deben tener al menos 8 semanas de edad y un peso de entre 27 a 40 g. Endogámico ratones como CD1 o Swiss Webster muestran un buen comportamiento maternal y son excelentes receptores. Es aconsejable establecer la cría para obtener destinatarios adicionales, como los que no se utiliza se recuperará su actividad normal en bicicleta en dos semanas. A pesar de ser acoplado, algunas mujeres pueden no tener el cuerpo lúteo (Figura 3G) y por lo tanto no serán receptivos a los embriones transferidos. Por esta razón, los ovarios deben ser revisados ​​para detectar la presencia de cuerpo lúteo, el cual en el 2,5 dpc se puede identificar claramente como estructuras de color rojo brillante en el ovario (Figura 3F). Durante la cirugía, es importante para reducir al mínimo el contacto con el tracto reproductivo por el acaparamiento de la almohadilla adiposa de ovario lugar; manipulación excesiva de los ovarios y el útero puede resultar en la luteólisis. La introducción de la manipulation de la pipeta en el oviducto es el paso más complicado del protocolo. En algunos receptores, el oviducto es muy retorcida y no hay un 2 mm tramo recto de la unión con el útero. En ese caso, disponer el oviducto y realizar la punción en la primera curva. Como se detalla más arriba, un buen pipeta manipulación realmente hace la diferencia. Una vez que la pipeta ha pasado a través de la unión útero-tubárica, se desliza fácilmente. Si no lo hace, la pipeta puede haber desviado del oviducto y no alcanza el lumen uterino. Una vez en el interior del útero, si los medios de comunicación no fluye, mover la pipeta ligeramente hacia fuera o en y vuelva a intentarlo. Si aún no fluye, la pipeta está obstruido, sacarlo desde el útero, a conocer el contenido de la cápsula con medios de manipulación y volver a cargar la misma u otra pipeta. Entrega normalmente se lleva a cabo 17 días después de la transferencia de embriones. Para evitar el canibalismo, proporcionar material enclavado 2 días de antelación y no cambie la jaula durante los primeros días después del parto.

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Disclosures

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por fondos del Departamento de Ciencia Animal y de aves de BT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine VEDCO Ketaved ANADA 200-257 To be ordered by a licensed veterinarian.
Xylazine Lloyd Laboratories Anased NADA #139-236 To be ordered by a licensed veterinarian.
Buprenorphine Generic NDC 400-42-010-01 To be ordered by a licensed veterinarian.
Eye ointment Novartis Genteal
Antibiotic Pfizer Clavamox NADA #55-101. Added to drinking water (0.3 mg/ml of amoxicillin trihydrate and 0.075 mg/ml of clavulanate potassium). Add 1.5 ml of the reconstituted 15 ml bottle to 250 ml of water.
Dressing serrated forceps ROBOZ RS-8120 Any medium size surgical-grade steel straight forceps will work.
Microdissecting serrated forceps ROBOZ RS-5137 These ones are curved at a 90º angle. Straight forceps can be used if preferred.
Slight curved micro dissection forceps ROBOZ RS-5136 This model is particularly useful to hold the oviduct.
Scissors ROBOZ RS-5880 Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
27 G needles Beckton-Dickinson 305136 Smaller needles (30 G) can be also used. 25 G may be a bit too big.
Clip applier MiKRon 42763
9 mm Clips MiKRon 427631
Clip remover MiKRon 7637 Two pairs of teeth forceps (ROBOZ RS-8160) can be used instead.
Suture needle holder ROBOZ RS-7820
Suture Dowist Gell 5-0 Dexon S 7204-21 Can be substituted for any 4-0 to 6-0 absorbable suture with a narrow curved needle.
Glass capillaries VWR 100 ul calibrated pipettes 53432-921 It includes a mouth aspirator system that only requires to attach a 0.22 µm filter in the tubing to be ready to use. More information can be obtained in Nagy et al.8
Burner KISAG AG Typ 2002 Gas operated burner, can be charged with Kigas (CH-4512, from the same vendor). Alcohol burners may be also used, but gas provides a higher temperature and this burner provides a small and precise flame.
Stereomicroscope Leica MZFLIII This is an expensive estereomicroscope with fluorescence, that can be also used for other purposes. There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. It is better to use two stereomicroscopes, one for handling the embryos (which does not need to be a very nice one) and another one for the recipient. The one used for the recipient should display a long distance from the stage plate to the objective lense, in order to be able to focus 3-4 cm above the stage plate (where the oviduct will be placed) and still leave some room for the surgeon; most of the stereomicroscopes can do this, but some cannot. 
Fiber optics ilumination Dolan Jenner Fiber lite To iluminate the surgical area. There are different systems available.
Warm stages American scope http://store.amscope.com/tcs-100.html These can be placed over the stage plate of the stereomicroscope. Some modifications (inserting a stick to level the stage) may be needed if it is too short for the stereomicroscope. A big warm stage can be used for warming the cage if it is available. If not, a regular heating pad can be used, but temperature must be checked.
Culture dishes for embryo manipulation Falcon 353001 351008 may be also used; they made narrower drops.

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References

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