Transferência de Embrião Utero-tubária e vasectomia no Rato Modelo

Biology

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Summary

Transferência de embrião tubário utero-usa a junção útero-tubária como uma barreira para impedir a saída de embriões que podem ocorrer quando se realiza a transferência uterina. Machos vasectomizados são obrigados a obter destinatários pseudográvidas para transferência de embriões. Ambas as técnicas são discutidas.

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Bermejo-Alvarez, P., Park, K. E., Telugu, B. P. Utero-tubal Embryo Transfer and Vasectomy in the Mouse Model. J. Vis. Exp. (84), e51214, doi:10.3791/51214 (2014).

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Abstract

A transferência de embriões pré-implantação de uma fêmea de aluguel é um passo necessário para a produção de ratos geneticamente modificados ou para estudar os efeitos das alterações epigenéticas originou durante o desenvolvimento pré-implantação em desenvolvimento e adulto fetal subseqüente saúde. A utilização de uma técnica de transferência de embriões eficaz e consistente é importante para aumentar a geração de animais geneticamente modificados e para determinar o efeito de diferentes tratamentos sobre as taxas de implantação e sobrevivência a termo. Embriões no estádio de blastocisto são normalmente transferidos por transferência uterina, realizando um furo na parede uterina para introduzir a pipeta de manipulação de embriões. O orifício realizado no útero não fechar após a pipeta foi retirada, e os embriões podem saída para a cavidade abdominal devido à pressão positiva do útero. A punção também pode produzir uma hemorragia que prejudica a implantação, bloqueia a pipeta de transferência e pode afetar o embrião development, especialmente quando os embriões são transferidos sem zona. Consequentemente, esta técnica muitas vezes resulta em taxas de sobrevivência de embriões de baixa muito variáveis, e em geral. Evitar estes efeitos negativos, transferência de embrião tubário utero-aproveitar a junção útero-tubária como uma barreira natural que impede a saída do embrião e evitar a perfuração da parede uterina. Machos vasectomizados são necessários para a obtenção de destinatários pseudográvidas. Uma técnica para realizar a vasectomia é descrito como um complemento para a transferência de embriões útero-tubária.

Introduction

A transferência de embriões é provavelmente o procedimento cirúrgico mais realizado no modelo de mouse. Esta técnica é essencial para a obtenção de descendentes de embriões sujeitos a técnicas de manipulação in vitro e, por conseguinte, constitui um passo necessário para o desenvolvimento de modelos geneticamente modificadas através de injecção pronuclear, a transdução lentiviral, ou a formação de quimeras. Além disso, a técnica permite o estudo dos efeitos sobre o desenvolvimento de diversos insultos que ocorrem durante o desenvolvimento pré-implantação. O uso de técnicas de reprodução artificial 1 ou a exposição a concentrações anormais de diferentes substâncias ou metabólitos 02 de maio afetar o desenvolvimento do embrião, resultando em falhas de implantação ou de placentação e efeitos a longo prazo na prole. A técnica de transferência de embriões confiável e reprodutível é crucial para testar os possíveis efeitos negativos do tratamento experimental na implantação e desenvolvimento fetal em um homem consistentener.

Embriões de pré-implantação de murino pode ser transferido para uma fêmea receptora, quer para o oviduto através da ampola de 0,5 dias post coitum (DPC) destinatários pseudográvidas (transferência oviduto 3,4) ou no útero de 2,5 dpc pseudo-destinatário (transferência uterina) 5,6 dependendo do seu estágio de desenvolvimento. Os embriões na fase de blastocisto, tal como aqueles utilizados para gerar ratinhos quiméricos através da injecção de células estaminais embrionárias pluripotentes ou induzidos, são usualmente transferidas por transferência uterina. Blastocistos pode também ser transferido para o oviducto de um recipiente de 0,5 dpc, mas constitui um teste menos fisiológico para disruptores de desenvolvimento, porque o embrião sofre diapausa e tem 2 dias para se recuperar a partir do insulto antes da implantação ocorra. Transferência uterina envolve perfurar a parede uterina com uma agulha fina, a fim de gerar uma abertura que permite o acesso de uma pipeta de manipulação do embrião no lúmen uterino. Ambora esta técnica pode produzir bons resultados, a sobrevivência a prazo (ou seja, a percentagem de embriões transferidos que se desenvolvem a um filhote de cachorro) é geralmente baixa e imprevisível 7,8.

O punção da parede uterina implica alguns efeitos secundários prejudiciais. Em primeiro lugar, o miométrio é um tecido altamente vascularizado e seu punção muitas vezes resulta em uma pequena hemorragia. O sangue pode bloquear a pipeta de transferência de embriões ou invadir o lúmen do útero causando a morte embrionária e / ou falhas de implantação. Isto é particularmente relevante quando os embriões são transferidos sem zona, como as células do sangue e detritos pode anexar os blastômeros. Em segundo lugar, a abertura realizada não vedar depois os embriões foram transferidos, de modo que possa fluir para trás através do orifício e ser expulso para a cavidade abdominal, quando uma muito grande volume foi introduzir no útero. A transferência do embrião útero-tubária aqui descritas tomar vantagem da junção útero-tubária para entregar o embryos no útero, sem a necessidade de perfurar a parede uterina e assim evitar as suas consequências adversas 9.

As fêmeas receptoras pseudográvidas utilizados para transferência de embriões são obtidos por monta natural com machos vasectomizados 8. As secreções seminais produzidos por um macho estéril, que são necessários para o útero para se tornar receptivo para os embriões transferidos. Para obter um recipiente, um máximo de duas fêmeas de 8 semanas a 6 meses de idade, são colocados com um macho vasectomizado na parte da tarde. Na manhã seguinte, as fêmeas são verificadas quanto a presença de um tampão de cópula vaginal, um grupo de proteínas coaguladas do fluido seminal masculino. Como acasalamento ocorre geralmente durante a meia-noite, o dia de detecção do conector vaginal é considerado 0,5 dpc. Embora machos vasectomizados podem ser adquiridos a partir de alguns vendedores, o procedimento cirúrgico aqui descrito é relativamente fácil e não necessita de quaisquer instrumentos adicionais do que o necessário para a transferência de embriões.

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Protocol

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Animal Care e Use Comittees Beltsville Área (BAACUC 11-015), de acordo com o USDA Animal Care e Use Guidelines.

1. Anestesia e Analgesia (comum para ambos os procedimentos cirúrgicos)

  1. Pesar o mouse e colocar os seguintes anestésicos e analgésicos em duas seringas de 1 ml com 27 agulhas L:
    1. A cetamina (0,1 mg / g: 0,01 ml / g de uma solução a 10 mg / ml) e xilazina (0,01 mg / g: 0,005 ml / g de uma solução a 2 mg / ml).
    2. A buprenorfina (0,1 mg / g: 0,01 ml de uma solução 0,01 mg / ml).
  2. Imobilizar o mouse por pegar a nuca de seu pescoço, como perto das mandíbulas quanto possível, com o polegar eo dedo indicador e segurando a cauda entre os dedos mínimo e anular.
  3. Injetar mistura cetamina-xilazina por via intraperitoneal. A fim de evitar a perfuração de órgãos internos, segure o mouse comsua cabeça um pouco abaixo do nível dos seus quadris (Figura 1A)
  4. Injetar buprenorfina subcutânea na nuca do pescoço espera entre o polegar eo dedo indicador (Figura 1B).
  5. Deixe o rato na gaiola (limpo e sem qualquer outro animal) em um palco quente.
  6. Uma vez que inconsciente, para verificar a ausência de reflexo pé traseiro (marcado por toe pitada). Aplicar pomada para evitar o ressecamento do olho e para verificar a ausência de reflexo palpebral (Figura 1C).
  7. Este protocolo fornece um plano de anestesia cirúrgica para um mínimo de 30 minutos, suficiente para realizar os procedimentos descritos abaixo (Protocolos 2 e 3). Se forem necessários tempos mais longos, uma injeção adicional de cetamina + xilazina com a metade da dose descrita na 1.1.1 pode ser aplicado depois de 30 min. A mudança no padrão de respiração para uma mais rápida e irregular um indica o loss do plano de anestesia adequada.

2. Vasectomia

  1. Use um macho com uma performance de acasalamento comprovado.
  2. Esterilizar instrumentos cirúrgicos, limpar as superfícies onde a cirurgia será realizada e limpe-os com álcool 70%.
  3. Realizar anestesia como anteriormente descrito (Protocolo 1), verificando se há perda de reflexos.
  4. Posicione o mouse em uma fase quente, retire a pele com tosquiadeiras elétricas da área ventral entre duas linhas imaginárias transversais colocados 0,5 centímetros e 2,5 cm acima do pênis (Figura 2A).
  5. Higienizar a área raspada, limpando seqüencial com 10% de iodo povidona e 70% de etanol.
  6. Posicione o mouse na posição supina, com a cauda em direção ao cirurgião e cubra com uma toalha estéril com um buraco de expor a área depilada. Iluminar a área cirúrgica.
  7. Realize a 10-15 mm incisio pele longitudinaln na linha média do abdome, a cerca de 1 cm acima do pênis. Segure a pele com fórceps vestir serrilhados e depois cortar com uma tesoura (Figuras 2A e 2B).
  8. Realizar uma incisão longitudinal 5-10 mm na linha alba. Segurar o músculo com microdissecting fórceps serrilhados e cortados com tesouras (Figura 2C).
  9. Agarre o bloco adiposo testicular de um lado com micro dissecação fórceps serrilhados e puxe-o para expor testículo, canal deferente e epidídimo. Canal deferente está localizado medial para o testículo e é um tubo livre claramente distinguíveis (não ligado à parede do testículo como o epidídimo) com um vaso sanguíneo que corre ao longo de um lado (Figura 2D).
  10. Segurando o canal deferente com dissecação serrilhada micro fórceps, fórceps vestir chama até que eles ficam vermelhos (Figura 2E cauterizar os vasos deferentes, em dois pontos de uma só vez (Figura 2F). O corte deve remover uma porção de cerca de 5 mm e deixar duas extremidades cauterizados claramente separadas (Figura 2G).
  11. Mova o testículo, epidídimo e ducto deferente de volta para a cavidade abdominal.
  12. Continuar a partir do passo 9 na outra testículo.
  13. Suturar o músculo com um ou dois pontos de colchão horizontais feitas com 5/0 sutura absorvível (Figura 2H).
  14. Sutura da pele com um ou dois cortadores de ferida (Figura 2I).
  15. Identificar o vasectomizado (brinco, tatuagem dedo ...), mova-o da gaiola colocada em uma fase quente e observar até que ele se recupera da anestesia (consciente e manter decúbito esternal). A injeção subcutânea 0,5-1 ml de solução salina quente melhora a reperação. Anote as possíveis incidências ocorridas durante a transferência de vasectomia, adicionar antibióticos para a água potável.
  16. Clips ferida pode ser removido 10 dias após a vasectomia com um removedor ferida clipper ou um par de fórceps de dentes. O macho vasectomizado estará pronto para acasalar 2 semanas após a cirurgia.
  17. Teste a infertilidade do homem vasectomizado por acasalamento com fêmeas férteis antes de usá-lo para obter os destinatários.

3. Transferência de Embrião Utero-tubária

  1. Rato mórula ou de blastocisto pode ser transferido por esta técnica a uma fêmea receptora pseudogrï de 2,5 dpc.
  2. Prepare embrião pipeta de vidro manipulação:
    1. Polir as pontas dos capilares de vidro, a fim de evitar danificar o suporte da pipeta.
    2. Suavizar uma porção média do capilar de vidro por aquecimento com uma multa chama enquanto um pouco de rotaçãoo capilar com ambas as mãos de forma sincronizada. Uma vez que a secção capilar torna-se macia e maleável (cor vermelho claro), retirá-lo rapidamente do fogo e retire as duas extremidades para reduzir o seu diâmetro externo de 130-150 m.
    3. Aguarde até que o vidro esfriar e depois corte-o levemente marcando a parte estreita com um lápis com ponta de diamante-, pedra abrasiva ou lixa de unha e puxando a partir de ambos os lados. A pausa deve ser limpo e perpendicular
  3. Polir a ponta por muito rapidamente em chamas, deixando uma abertura de 100-130 m. Pipetas pode ser armazenado para uso posterior.
  4. Quente mídia manipulação de embriões (CZBH ou M2, ver discussão).
  5. Esterilizar instrumentos cirúrgicos, limpar as superfícies onde a cirurgia será realizada e limpe-os com álcool 70%.
  6. Realizar anestesia como anteriormente descrito (Protocolo 1), verificando se há perda de reflexos.
  7. Manter tele mouse em uma fase quente, retire a pele com tosquiadeiras elétricas da área dorsal entre os joelhos e as costelas distal (Figuras 3A e 3B).
  8. Higienizar a área raspada, limpando seqüencial com 10% de iodo povidona e 70% de etanol.
  9. Mova os embriões da incubadora para a mídia manipulação de embriões pré-aquecido.
  10. Mova o destinatário a um estágio quente sob o microscópio estereoscópico e colocá-lo em posição prona lateralmente para o cirurgião (com a cabeça olhando para o lado direito ou esquerdo do cirurgião).
  11. Cobrir a área com uma toalha estéril com um furo expondo a área raspada e iluminar a área cirúrgica.
  12. Executar de 1 cm transversal incisão (vertical) na pele em um ponto localizado na craniano ⅓ da linha entre a última costela e os quadris eo ⅓ dorsal da linha entre as costas eo abdômen (Figuras 3A and 3B). Segure a pele com fórceps vestir serrilhadas e corte com tesoura (Figura 3C).
  13. Uma vez que a pele tenha sido cortado, ovário (vermelho / laranja) ou a almofada adiposa em torno do ovário (branco) pode ser visualizada através da parede do corpo. Realize uma 0,3-0,5 cm transversal (vertical) incisão na parede do corpo sobre o ovário ou almofada adiposo em um local onde a incisão não cortar qualquer grande vaso sanguíneo. Segure o músculo com micro dissecação fórceps serrilhada e corte com tesoura (Figura 3D).
  14. Mova o rato para ter a sua cabeça virada para o cirurgião.
  15. Carregar a manipulação de embriões pipeta (Figura 3E):
    1. A mídia CZBH subir por capilaridade através da porção estreita da pipeta manipulação até cerca de 5 mm da parte mais larga.
    2. Tome-se uma pequena bolha de ar (0,2-0,5 mm).
    3. Introduzir os embriões (5-10) emuma quantidade mínima de meio (2-4 mm).
    4. Tome-se outra bolha de ar pequeno (0,2-0,5 mm) e uma pequena quantidade de mídia (0,5-1 mm).
    5. Deixe a pipeta de vidro preso no suporte aspirador na boca ou ao dispositivo operado manualmente, pronto para a etapa 3.17.
  16. Agarre o bloco adiposo em torno do ovário com micro dissecação fórceps serrilhados e puxe-o para a cabeça do rato para expor o ovário, oviduto, e uma pequena porção superior do útero fora da cavidade abdominal (Figuras 3F e 3G).
  17. Segurando o bocal do aspirador na boca, pronto para ser usado, pegue a almofada de tecido adiposo com micro dissecação fórceps serrilhada para mover o oviduto e expor a junção útero-tubária (ou seja, onde o oviduto encontra o útero).
  18. Mantendo a junção útero-tubária acessível, tomar pequenas pinças de dissecação micro curvas com a mão esquerda (se destro) e colocá-los logo abaixoa junção útero-tubária agarrando oviduto cerca de 2 mm acima a parte.
  19. Segurando a junção útero-tubária com as pequenas pinças de dissecação micro curvas, perfure a seção oviduto perto das pinças com uma agulha de 27 G (Figura 3H).
  20. Inserir a manipulação pipeta embrião dentro do orifício efectuada com a agulha e avançar para o útero através da junção útero-tubária (Figuras 3I e 3J). Uma vez que a pipeta passou a junção útero-tubária (figura 3K) que desliza facilmente. Não progredir muito longe dentro do útero para evitar danos endometrial (não mais de 3 mm) e bloqueio pipeta pelos destroços.
  21. Solte os embriões no útero, soprando suavemente (Figura 3E). Ambas as bolhas de ar deve passar pelo útero. Alguns meios de comunicação acima da primeira bolhatambém pode ser liberado para o útero, mas evitar a introdução de mais ar, pois pode impedir a implantação.
  22. Remova a pipeta logo após embriões foram lançados para dentro do útero.
  23. Mova o oviduto e ovário de volta para a cavidade abdominal, agarrando a almofada adiposo.
  24. Suturar o músculo com um ponto de colchão horizontal com 5/0 sutura absorvível (Figura 3M).
  25. Sutura da pele com um cortador de ferida (Figura 3 N).
  26. Continuar a partir do passo 10 no outro lado, se necessário.
  27. Identificar o destinatário (brinco, tatuagem dedo ...), mova-o para a sua gaiola (colocado em uma fase quente) e observar até que ele se recupera da anestesia (consciente e manter decúbito esternal).
  28. Anotar os possíveis incidentes que ocorrem durante a transferência de embriões e adicionar antibióticos para a água potável. A injeção subcutânea 0,5-1 ml de sali quentesolução ne melhora a recuperação.
  29. Clips ferida pode ser removido 10 dias após a transferência de embriões com um removedor ferida clipper ou dois pares de fórceps (Figura 3O). O destinatário pode ser pesado naquele dia para avaliar a gravidez e estimar o número de filhotes. Fornecer material de aninhada ao destinatário 15 dias após a transferência de embriões.

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Representative Results

Transferência de embriões útero-tubária fornece um meio para transferir os embriões para o útero evitar algumas das complicações associadas à transferência de embriões uterino 2,9,10. Na Tabela 1 mostram algum resultado representante obtivemos transferindo blastocistos CD1 submetidos a diferentes tipos de manipulações para destinatários CD1 seguindo o protocolo descrito. A sobrevivência a termo (% dos embriões resultantes em um cão) ou sobrevivência de E15 (no caso de lentivírus exposto) é semelhante entre os embriões simplesmente cultivadas in vitro a partir do estádio de zigoto (VCI), os embriões submetidos a injecção iPSC para gerar crias quiméricos e embriões que tiveram sua zona removido e foram expostos a lentivírus para 7 horas antes da transferência do embrião. Portanto, a transferência de embriões útero-tubária é uma técnica confiável para transferir embriões particularmente complicados, como aqueles que não possuem zona pelúcida e incubadas com lentivírus.


Figura 1. A injeção de anestésicos e analgésicos. A) injeção intraperitoneal de ketamina-xilazina. B) A injecção subcutânea de C) Aplicação de pomada Buprenorfina..

Figura 2
Figura 2. . Protocolo Vasectomia A) O ponto de incisão (representado com um "X" vermelho) é colocado a cerca de 1 cm acima do pênis; remover pele 0,5-2,5 cm acima do pênis (linhas pretas) incisão B) incisão da pele C) Músculo... deferente D) EVA (seta preta) e testeé (*). E) flamejante do fórceps para cauterização. F) cauterização dos vasos deferentes em dois pontos de uma só vez. deferente G) Vas claramente separados em duas extremidades cauterizados. H) sutura muscular. I) sutura da pele. Clique aqui para ver a imagem maior.

Figura 3
Figura 3. Protocolo Utero-tubária transferência de embriões A, B) Dorsal e vista lateral do ponto de incisão (representado com um "X" vermelho);. Linhas pretas entre a última costela e quadris (A, B) e entre costas e abdômen (B) servir como um guia. C) incisão da pele. E) pipeta de vidro de manipulação de embriões carregado com 5 blastocistos, prontos para ser transferidos. F, G) ovários representativos com (F) ou sem (L) do corpo lúteo, indicado com setas pretas. HK) Para fins de representação , uma simulação de transferência de embriões útero-tubária foi realizado o carregamento de uma pipeta de manipulação de vidro com solução de azul de tripan 0,4%. H) Punção do oviduto (seta preta) perto do útero (*). I) Introdução da pipeta manipulação de embriões em o orifício realizado anteriormente. J) A pipeta de manipulação de embriões avança através da junção útero-tubária. K) Um volume de azul de tripano solução equivalente ao que libertado em uma transferência de embrião foi expulso no lúmen uterino (seta preta). G) Para testar o encerramento eficaz produzida pela junção útero-tubária, tudo oconteúdo da pipeta manipulação foi lançado para dentro do útero; junção útero-tubária (seta) impede o fluxo de trás da solução de azul de tripan liberado no útero (*) remoção M) sutura muscular N) sutura da pele O) Clip.... P) 15 dias após a transferência de embriões fornecer material aninhada ao destinatário. Q) ninhada Chimeric obtida após esta técnica. Clique aqui para ver imagem ampliada.

Tratamento Número de transferências Embriões transferidos Filhotes entregues Sobrevivência a term (%)
IVC 11 110 82 74,5
injeção iPSC 3 50 35 70.0
Lentivirus 6 60 44 73,3

Tabela 1. Os resultados representativos obtidos após a transferência de três grupos diferentes de embriões manipulados na sequência de transferência de embrião tubário utero-. 1) Os embriões cultivados in vitro (IVC) a partir da fase do zigoto ao blastocisto, 2) in vivo produzida blastocistos injectados com 10 mouse iPSC para gerar ratinhos quiméricos, 3) in vivo produzida blastocistos que tiveram a sua zona removido e foram incubadas durante 7 horas com um lentivírus expressando GFP. Os dados representam o número de filhotes nascidos em relação ao número de embriões transferidos, exceto para o grupo lentivírus exposta, onde representam o número de fetos viáveis ​​de 10 dias após a transferência de embriões, como a gestação não foi permitir a progredir ainda mais.

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Discussion

A vasectomia é um procedimento cirúrgico relativamente simples que não envolve grandes dificuldades. Quando saneantes com iodo povidona e etanol ter certeza de que a última lavagem (com etanol) remove iodopovidona, pois pode irritar o peritônio. O acesso ao canal deferente também pode ser alcançado por executar o escroto ou uma incisão no abdómen 8. Incisão escrotal tem sido recomendado para transversal incisão abdominal devido a incisão menor comparativamente necessário e um pouco melhor o comportamento pós-operatório 11. No entanto, nós preferimos a incisão abdominal sobre o escrotal porque fornece um acesso mais fácil e mais claro para os vasos deferentes de ambos os testículos, impedindo que os cirurgiões iniciantes de cauterização duas vezes os mesmos canais deferentes e deixando um ducto deferente funcionais. Entre ambas as técnicas abdominais, somos a favor da incisão longitudinal na linha alba sobre o transversal, porque não corta qualquer fibra muscular abdominal, evitando o desenvolvimento de hérnias abdominais. No entanto, tanto a vasectomia e protocolos de transferência de embrião tubário-utero pode ser adaptado para o equipamento disponível ou para os gostos pessoais do investigador. Por exemplo, um esterilizador de contas de vidro pode ser usado para aquecer os fórceps utilizados para cauterizar os vasos deferentes. Em qualquer caso, é essencial seguir uma técnica asséptica, para fornecer anestesia adequada e analgesia, a fim de maximizar o bem-estar animal, e para cumprir com as regulamentações locais.

Outro aspecto susceptível de modificações, é o protocolo de anestesia. Se a anestesia inalatória (isoflurano) está disponível, nós o encorajamos a sua utilização em vez de anestesia parenteral (injetável), uma vez que fornece um avião anestesia muito estável e rápida recuperação. No entanto, é importante salientar que a anestesia inalatória ainda exige o uso de um analgésico para dor intra-e pós-operatória, o que deve ser admistered antes da cirurgia, como pré-medicação. A buprenorfina é um opiáceo que proporcionar analgesia a longo prazo em ratos 12. Anestesia parenteral também fornece um bom plano anestésico para procedimentos de curta duração, como vasectomia e transferência de embriões. Cetamina-xilazina é uma combinação muito confiável para a cirurgia do mouse 13 e nunca ter observado todas as complicações anestésicas utilizando essa combinação em conjunto com a pré-medicação com buprenorfina. Outras combinações parenterais podem ser utilizados 12, mas que desencorajam o uso da mistura de narcótico avertina (tribromoetanol), como uma única dose pode ser administrar e vários artigos relatam diversas complicações associadas com a sua utilização, tais como irritação local, falta de analgesia, íleo , aderências fibrosas na cavidade abdominal, necrose de fibras musculares e órgãos abdominais subperitoneais superfície, e até mesmo a mortalidade 14-18.

A transferência de embriões exige uma boa gestão de ambos os embriões de umad destinatário. Como regra geral, para a transferência de embriões de mamíferos, o estágio de desenvolvimento dos embriões pode ser mais avançada do que a fase de pseudo do destinatário, mas não o contrário. Em outras palavras, os embriões podem esperar para a mãe, mas a mãe não pode esperar para os embriões, assim que esta técnica pode ser usada para transferir mórulas ou blastocistos, mas não estágios anteriores. Transferência de embrião tubário-utero pode ser realizada de dois dias após a detecção do plug vaginal do meio-dia (2,5 dpc) a noite, a noite (3 dpc), quando a junção útero-tubária é aberta para permitir a passagem natural de embriões a partir do oviduto para cornos uterinos. Considerando-se que os embriões transferidos pode já ter sofrido algum tipo de manipulação, manipulação de embrião deve minimizar danos maiores. Um excelente guia para a manipulação de embrião de rato pode ser encontrado em Nagy et al. 8 Os dois rato meios de manipulação de embrião mais comumente usados, que possuem um pH fisiológico em regularmosfera, são CZBH 19 e 20 M2. Embora in vivo produzido embriões de camundongos pode superar a exposição à temperatura fria ou pH anormal por longos períodos de 21, a mídia de manipulação deve ser pré-aquecido. Se a mídia é pré-aquecido em uma placa de cultura, evitar o aquecimento por longos períodos (mais de 40 min), como a osmolaridade da mídia vai aumentar devido à evaporação da água e que pode ser mais prejudicial do que a mídia manipulação frio. Da mesma forma, o tempo, os embriões passou no interior da pipeta de manipulação devem ser minimizadas devido ao pequeno volume presentes na pipeta.

A utilização de uma pipeta adequada manipulação do embrião é crucial para o sucesso do protocolo. Pipetas de manipulação pode ser feita a partir de capilares de vidro com uma parede de vidro fino. Pipetas Pasteur, muitas vezes utilizado para lidar com grandes embriões animais, também podem ser utilizados, mas devido à sua distância mais curta entre a alça para a ponta, pipetas de manipulação feitas a partir de capilares de vidro são mais comfortable de manobrar. A exposição à chama e a velocidade de puxar determinar a espessura da parede e o diâmetro interior da pipeta. Apesar de pipetas de manipulação pode ser feito facilmente com a mão depois de alguma prática, extrator e micro-forja também pode ser usado. É importante investir tempo na produção de várias pipetas ideais de manipulação. A abertura pipeta manipulação deve ser maior do que um embrião para permitir um bom fluxo, mas pequena o suficiente para penetrar e progredir através da junção útero-tubária facilmente. Se a zona pelúcida foi removido antes da transferência, os blastocistos geralmente expanda para um diâmetro maior. Neste caso, é aconselhável fazer pipetas largos, com uma abertura maior (130-180 mm), para evitar qualquer dano às células trofectoderma. Ponta polonês é importante para evitar danos no oviduto, a parede uterina e o embrião - especialmente se zona foi removido, e para evitar a ponta da pipeta a partir bloqueados por detritos. No entanto, após o polimento, a abertura deveria not ser demasiado pequena em comparação com o diâmetro interior da pipeta, como uma diminuição acentuada de diâmetro, irá provocar mudanças bruscas no fluxo de velocidade. O bocal de aspiração proporciona um controlo mais preciso do fluxo, bem como uma posição de mão mais confortável em comparação com os dispositivos controlados à mão. No entanto, um dispositivo controlado por um lado, pode ser usado, se necessário (por exemplo, quando da manipulação de embriões tratados com lenti). Para obter um fluxo óptimo e para evitar a transferência de óleo mineral, que também é aconselhável a utilização de uma nova de pipeta para a transferência do embrião em vez do que é utilizado para mover os embriões a partir do meio de cultura para os meios de manipulação. Finalmente, enquanto se introduz a pipeta através do oviduto, o capilar deve ser tratado directamente, isto é. agarrando o vidro e não o cabo de plástico do aspirador, para obter um aperto firme. A ampliação usado para a transferência do embrião é uma questão particular que depende da acuidade visual do cirurgião. Nós preferimos usar baixa ampliação para ter um campo visual de largura,por isso usamos um aumento de 10x final (ocular de 10x e objetiva 1X).

Os recipientes devem ser de pelo menos 8 semanas de idade e pesam entre 27-40 g. Outbreed camundongos como CD1 ou Swiss Webster apresentar um bom comportamento maternal e são excelentes destinatários. É recomendável a criação de reprodução para obter destinatários extras, como aqueles não acostumados irá recuperar sua atividade normal de ciclismo em duas semanas. Apesar de ser acasalado, algumas mulheres podem não ter corpo lúteo (Figura 3G) e, portanto, não será receptivo aos embriões transferidos. Por esta razão, os ovários devem ser verificados quanto à presença de corpos lúteos, que de 2,5 dpc podem ser claramente identificados como estruturas brilhantes vermelho no ovário (Figura 3F). Durante a cirurgia é importante para minimizar o contato com o aparelho reprodutor, agarrando pad adiposo ovário em vez, a manipulação excessiva dos ovários e do útero pode resultar em luteólise. A introdução do manipulation pipeta no oviduto é o passo mais complicado do protocolo. Em alguns destinatários, a tuba uterina é muito torcido e não há um 2 milímetros trecho reto a partir da junção com o útero. Nesse caso providenciar o oviduto e realizar a punção na primeira curva. Conforme detalhado acima, uma boa manipulação pipeta realmente faz a diferença. Uma vez que a pipeta passou através da junção útero-tubária, que desliza facilmente. Se isso não acontecer, a pipeta pode ter desviado do oviduto e não chegou às lúmen uterino. Uma vez dentro do útero, se a mídia não fluir, passar a pipeta ligeiramente fora ou dentro e tente novamente. Se ainda não fluir, a pipeta está entupido, levá-la para fora do útero, liberar o conteúdo do prato com meios de manipulação e recarregar a mesma ou outra pipeta. Entrega normalmente ocorre 17 dias após a transferência de embriões. Para evitar o canibalismo, fornecer material aninhada 2 dias de antecedência e não mudar a gaiola durante os primeiros dias após o parto.

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Disclosures

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por fundos do Departamento de Animais e Avian Sciences para BT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine VEDCO Ketaved ANADA 200-257 To be ordered by a licensed veterinarian.
Xylazine Lloyd Laboratories Anased NADA #139-236 To be ordered by a licensed veterinarian.
Buprenorphine Generic NDC 400-42-010-01 To be ordered by a licensed veterinarian.
Eye ointment Novartis Genteal
Antibiotic Pfizer Clavamox NADA #55-101. Added to drinking water (0.3 mg/ml of amoxicillin trihydrate and 0.075 mg/ml of clavulanate potassium). Add 1.5 ml of the reconstituted 15 ml bottle to 250 ml of water.
Dressing serrated forceps ROBOZ RS-8120 Any medium size surgical-grade steel straight forceps will work.
Microdissecting serrated forceps ROBOZ RS-5137 These ones are curved at a 90º angle. Straight forceps can be used if preferred.
Slight curved micro dissection forceps ROBOZ RS-5136 This model is particularly useful to hold the oviduct.
Scissors ROBOZ RS-5880 Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
27 G needles Beckton-Dickinson 305136 Smaller needles (30 G) can be also used. 25 G may be a bit too big.
Clip applier MiKRon 42763
9 mm Clips MiKRon 427631
Clip remover MiKRon 7637 Two pairs of teeth forceps (ROBOZ RS-8160) can be used instead.
Suture needle holder ROBOZ RS-7820
Suture Dowist Gell 5-0 Dexon S 7204-21 Can be substituted for any 4-0 to 6-0 absorbable suture with a narrow curved needle.
Glass capillaries VWR 100 ul calibrated pipettes 53432-921 It includes a mouth aspirator system that only requires to attach a 0.22 µm filter in the tubing to be ready to use. More information can be obtained in Nagy et al.8
Burner KISAG AG Typ 2002 Gas operated burner, can be charged with Kigas (CH-4512, from the same vendor). Alcohol burners may be also used, but gas provides a higher temperature and this burner provides a small and precise flame.
Stereomicroscope Leica MZFLIII This is an expensive estereomicroscope with fluorescence, that can be also used for other purposes. There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. It is better to use two stereomicroscopes, one for handling the embryos (which does not need to be a very nice one) and another one for the recipient. The one used for the recipient should display a long distance from the stage plate to the objective lense, in order to be able to focus 3-4 cm above the stage plate (where the oviduct will be placed) and still leave some room for the surgeon; most of the stereomicroscopes can do this, but some cannot. 
Fiber optics ilumination Dolan Jenner Fiber lite To iluminate the surgical area. There are different systems available.
Warm stages American scope http://store.amscope.com/tcs-100.html These can be placed over the stage plate of the stereomicroscope. Some modifications (inserting a stick to level the stage) may be needed if it is too short for the stereomicroscope. A big warm stage can be used for warming the cage if it is available. If not, a regular heating pad can be used, but temperature must be checked.
Culture dishes for embryo manipulation Falcon 353001 351008 may be also used; they made narrower drops.

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References

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