Utero-eileiders Embryo Transfer en vasectomie in het muismodel

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Utero-eileiders embryo transfer maakt gebruik van de utero-eileiders splitsing als een belemmering voor het embryo uitstroom die zich kunnen voordoen bij het uitvoeren van de baarmoeder overdracht te voorkomen. Vasectomized mannetjes zijn verplicht om pseudozwanger ontvangers krijgen voor embryotransplantatie. Beide technieken worden besproken.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Bermejo-Alvarez, P., Park, K. E., Telugu, B. P. Utero-tubal Embryo Transfer and Vasectomy in the Mouse Model. J. Vis. Exp. (84), e51214, doi:10.3791/51214 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

De overdracht van implantatie embryo's een vrouwelijke surrogaat is een verplichte stap voor de productie van genetisch gemodificeerde muizen of onderzoeken de effecten van epigenetische veranderingen ontstaan ​​tijdens de pre-implantatie ontwikkeling op latere foetale en volwassen gezondheid. Het gebruik van een effectieve en consistente embryo transfer techniek is cruciaal voor het genereren van genetisch gemodificeerde dieren verbeteren en het effect van verschillende behandelingen inplantingstarieven en overleving termijn bepalen. Embryo's in het blastocyst stadium worden meestal overgedragen door baarmoeder overdracht, het uitvoeren van een lek in de baarmoederwand aan de embryomanipulatie pipet introduceren. De opening uitgevoerd in de baarmoeder niet gesloten nadat de pipet is ingetrokken en de embryo kan uitstroom naar de buikholte door de positieve druk van de baarmoeder. De punctie kan produceren ook een bloeding die implantatie schaadt, blokkeert de overdracht pipet en van invloed kunnen embryo development, vooral wanneer embryo's zonder zona worden overgedragen. Bijgevolg, deze techniek resulteert vaak in zeer variabel en algehele lage embryo overleving. Het vermijden van deze negatieve effecten, baarmoeder-eileiders embryotransplantatie profiteren van de utero-eileiders splitsing als een natuurlijke barrière die embryo uitstroom belemmert en te voorkomen dat de punctie van de baarmoederwand. Vasectomized mannetjes zijn vereist voor het verkrijgen van pseudo-ontvangers. Een techniek om vasectomie uitvoeren wordt beschreven als een aanvulling op de utero-eileiders embryo transfer.

Introduction

Embryo overdracht is waarschijnlijk de meest voorkomende chirurgische ingreep in het muismodel. Deze techniek is essentieel om nakomelingen te verkrijgen van embryo's die in vitro manipulatie technieken en derhalve een noodzakelijke stap voor de ontwikkeling van genetisch gemodificeerde modellen van pronucleaire injectie, lentivirale transductie of chimeer vorming. Bovendien, de techniek kan de studie van de ontwikkeling van diverse effecten beledigingen die tijdens pre-implantatie ontwikkeling. Het gebruik van kunstmatige voortplantingstechnieken 1 of blootstelling aan abnormale concentraties van verschillende stoffen of metabolieten mei 2 embryoontwikkeling waardoor implantatie of placentatie storingen en de nakomelingen lange termijn beïnvloeden. Een betrouwbare en reproduceerbare embryo transfer techniek is cruciaal om de mogelijke negatieve effecten van de experimentele behandeling op de implantatie en de foetale ontwikkeling op een consistente man te testenner.

Muizen-implantatie embryo's kan worden overgedragen aan een ontvanger vrouwelijke ofwel in de eileider via de ampullen van 0,5 dagen na de coïtus (dpc) pseudozwanger ontvangers (eileider transfer) 3,4 of in de baarmoeder van 2,5 dpc pseudozwangere ontvanger (baarmoeder transfer) 5,6 Afhankelijk van hun ontwikkelingsfase. Embryo's in het blastocyst stadium, zoals die chimere muizen te genereren door injectie van embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen, wordt normaliter door baarmoeder overdracht. Blastocysten kunnen ook worden overgedragen aan de eileider van een 0,5 dpc ontvanger, maar het vormt een minder fysiologische test voor ontwikkelingsstoornissen verstoorders, omdat het embryo ondergaat diapause en heeft 2 dagen om te herstellen van de belediging voor implantatie plaatsvindt. Baarmoeder overdracht omvat aanprikken van de baarmoederwand met een smalle naald teneinde een opening die de toegang van een embryo manipulatie pipet kan in de baarmoeder lumen genereren. Eenoewel deze techniek kan goede resultaten opleveren, de overleving termijn (dwz het percentage van embryo's die zich ontwikkelen naar een pup) is vaak laag en onvoorspelbaar 7,8.

De punctie van de baarmoederwand is evenwel niet zonder schadelijke bijwerkingen. Eerst myometrium is een zeer gevasculariseerde weefsels en de punctie resulteert vaak in een kleine bloeding. Bloed kan de embryo transfer pipet blokkeren of binnenvallen de baarmoeder lumen waardoor embryonale sterfte en / of implantatie mislukking. Dit is met name relevant wanneer embryo's zonder zona worden overgedragen, als de bloedcellen en vuil kan hechten aan de blastomeren. Ten tweede, heeft de opening verricht niet dichten nadat de embryo's zijn overgebracht, zodat ze terug kan stromen door de opening en worden uitgezet naar de buikholte wanneer een te groot volume is te introduceren in de baarmoeder. De baarmoeder-eileiders embryotransplantatie hierin beschreven profiteren van de utero-eileiders afslag naar de embr leverenyos in de baarmoeder zonder prikken de baarmoederwand en aldus voorkomen de nadelige gevolgen 9.

De pseudo-ontvanger vrouwtjes gebruikt voor embryotransplantatie worden verkregen door natuurlijke bevruchting met vasectomized mannetjes 8. Het rudimentaire afscheidingen door een steriele mannelijke vereist de baarmoeder ontvankelijk voor de overgebrachte embryo worden. Om een ​​ontvanger te krijgen, maximaal 2 teefjes van 8 weken tot 6 maanden oud zijn ondergebracht bij een vasectomie mannelijke in de middag. De volgende ochtend, het koeien gecontroleerd op de aanwezigheid van een vaginale copulatie stekker, een klomp van gestolde eiwitten van de mannelijke zaadvloeistof. Als paring komt gewoonlijk tijdens middernacht, wordt de dag van de vaginale plug detectie beschouwd 0,5 dpc. Hoewel vasectomie mannetjes kunnen worden gekocht bij een aantal leveranciers, de hierin beschreven chirurgische procedure is relatief eenvoudig en vereist geen extra instrumenten nodig dan vereist voor embryotransfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dierproeven werden door de Beltsville Area Animal Care en gebruik Comites (BAACUC 11-015) goedgekeurd volgens USDA Animal Care en gebruik Guidelines.

1. Anesthesie en analgesie (Gemeenschappelijk voor beide Chirurgische ingrepen)

  1. Weeg de muis en plaats de volgende anesthetica en analgetica in twee 1 ml spuiten met 27 G naalden:
    1. Ketamine (0,1 mg / g: 0,01 ml / g van een 10 mg / ml oplossing) en xylazine (0,01 mg / g: 0,005 ml / g van een 2 mg / ml oplossing).
    2. Buprenorfine (0,1 ug / g: 0,01 ml van een 0,01 mg / ml oplossing).
  2. Immobiliseren de muis door het oppakken van de zijn nekvel zo dicht mogelijk bij de kaken mogelijk met de duim en wijsvinger en houdt de staart tussen de kleine en ringvinger.
  3. Injecteren Ketamine-Xylazine mengsel intraperitoneaal. Om te beschadigen interne organen, houdt de muis methaar hoofd iets onder het niveau van haar heupen (figuur 1A)
  4. Injecteren Buprenorfine subcutaan in het nekvel van de nek greep tussen de duim en wijsvinger (Figuur 1B).
  5. Laat de muis in de kooi (schoon en zonder andere dieren) op een warme fase.
  6. Eenmaal bewusteloos, controleer voor het ontbreken van de achterste voet reflex (gecontroleerd door teen knijpen). Solliciteer oogzalf droogheid van de ogen te vermijden en om te controleren op de afwezigheid van ooglidreflex (figuur 1C).
  7. Dit protocol verschaft een chirurgische anesthesie vlak ten minste 30 minuten, genoeg om de hieronder beschreven procedures uit te voeren (Protocollen 2 en 3). Als langere tijden vereist zijn, kan een bijkomende injectie van ketamine + xylazine met de helft van de in 1.1.1 dosering worden aangebracht na 30 minuten. Een verandering in het ademhalingspatroon om een ​​snellere en onregelmatige ene geeft de loss van de juiste anesthesie vliegtuig.

2. Vasectomie

  1. Gebruik een man met een bewezen paringsprestatie.
  2. Steriliseren chirurgische instrumenten, het reinigen van de oppervlakken waar de ingreep zal worden uitgevoerd en veeg ze met 70% ethanol.
  3. Voer anesthesie zoals eerder beschreven (protocol nr. 1), het controleren op verlies van reflexen.
  4. Plaats de muis op een warme fase, verwijder vacht met tondeuse uit het ventrale gebied tussen twee denkbeeldige transversale lijnen geplaatst 0,5 cm en 2,5 cm boven de penis (Figuur 2A).
  5. Sanitize het geschoren gebied door opeenvolgende afvegen met 10% povidonjood en 70% ethanol.
  6. Plaats de muis in rugligging met zijn staart naar de chirurg en de deksel met een steriele doek met een gat bloot het geschoren gebied. Verlichten het operatiegebied.
  7. Voer een 10-15 mm longitudinale huid incision in de mediale lijn van de buik, ongeveer 1 cm boven de penis. Houd de huid met dressing getande tang en knip met een schaar (Figuren 2A en 2B).
  8. Voer een 5-10 mm longitudinale incisie in de linea alba. Houd de spier met microdissecting getande pincet en knip met een schaar (figuur 2C).
  9. Pak de testis vet pad van de ene kant met micro ontleden getande tang en trek hem naar testis bloot, zaadleider en de bijbal. Zaadleider ligt mediaal van de testis en het is een duidelijk te onderscheiden gratis buis (niet verbonden aan de testis muur als de bijbal) een bloedvat langs een kant (figuur 2D).
  10. Houd de zaadleider met een micro ontleden getande tang, vlam dressing pincet totdat ze rood (figuur 2E de zaadleider gesneden en cauterize in twee punten in een keer (figuur 2F). De snede moet een gedeelte van ongeveer 5 mm te verwijderen en laat twee duidelijk gescheiden dichtgeschroeid uiteinden (figuur 2G).
  11. Verplaats de zaadbal, bijbal en zaadleider terug naar de buikholte.
  12. Ga verder met stap 9 in de andere testikel.
  13. Hecht de spier met een of twee horizontale matras steken gemaakt met 5/0 absorbeerbare hechtdraad (figuur 2H).
  14. Hecht de huid met een of twee wond clippers (figuur 2I).
  15. Identificeer de vasectomie mannelijke (oor ring, vinger tattoo ...), verplaatsen van de kooi geplaatst op een warme fase en observeren totdat hij herstelt van anesthesie (bewuste en borstligging te handhaven). Een 0.5-1 ml subcutane injectie van warme zoutoplossing verbetert rehersteltools. Noteer de mogelijke incidenten die zich tijdens vasectomie overdracht, voeg antibioticum aan het drinkwater.
  16. Wondklemmen verwijderd worden 10 dagen na vasectomie met een wond clipper remover of een paar tanden tang. De vasectomie mannelijke zal klaar zijn om 2 weken na de operatie paren zijn.
  17. Test de onvruchtbaarheid van de vasectomie mannelijke door paren met vruchtbare vrouwtjes alvorens het te gebruiken om ontvangers te verkrijgen.

3. Utero-eileiders Embryo Transfer

  1. Muis morulae of blastocysten kan deze techniek worden overgebracht naar een ontvanger vrouwelijk pseudo 2,5 dpc.
  2. Bereid embryomanipulatie glazen pipet:
    1. Pools de uiteinden van de glazen capillairen om te voorkomen beschadiging van de pipet houder.
    2. Zachter een middengedeelte van het glazen capillair door verhitting met een fijne vlam, enigszins draaiendede capillaire met beide handen synchroon. Zodra de sectie capillair wordt zacht en kneedbaar (lichtrode kleur), trek hem snel van de vlam en trek beide uiteinden aan de uitwendige diameter te beperken tot 130-150 urn.
    3. Wacht tot het glas afkoelen en snijd het door licht scoren het smalle deel met een diamant-punt potlood, schurende steen of nagelvijl en het trekken van beide kanten. De pauze moet schoon en loodrecht
  3. Polijst de tip door heel snel het vlammen, waardoor een 100-130 um diafragma. Pipetten kan worden opgeslagen voor later gebruik.
  4. Warm embryomanipulatie media (CZBH of M2, zie bespreking).
  5. Steriliseren chirurgische instrumenten, het reinigen van de oppervlakken waar de ingreep zal worden uitgevoerd en veeg ze met 70% ethanol.
  6. Voer anesthesie zoals eerder beschreven (protocol nr. 1), het controleren op verlies van reflexen.
  7. Het houden van thij muis op een warme fase, vacht verwijderen met elektrische tondeuse op het ruggedeelte tussen de knieën en de distale ribben (Figuren 3A en 3B).
  8. Sanitize het geschoren gebied door opeenvolgende afvegen met 10% povidonjood en 70% ethanol.
  9. Verplaats de embryo's uit de couveuse naar de voorverwarmde embryomanipulatie media.
  10. Verplaats de ontvanger naar een warme fase onder de stereomicroscoop en plaats deze in buikligging de zijkanten aan de chirurg (met zijn hoofd naar de rechter-of linkerkant van de chirurg).
  11. Bedek het gebied met een steriele doek met een gat waardoor de geschoren gebied en verlichten het operatiegebied.
  12. Voer een 1 cm transversale (verticale) incisie in de huid op een plek op de craniale ⅓ van de lijn tussen de laatste rib en de heupen en de dorsale ⅓ van de lijn tussen de rug en de buik (Figuur 3A eennd 3B). Houd de huid met dressing getande pincet en knip met een schaar (Figuur 3C).
  13. Nadat de huid is gesneden, kan ovarium (rood / oranje) of het vet pad rondom de eierstokken (wit) zichtbaar worden gemaakt door het lichaam muur. Voer een 0.3-0.5 cm transversaal (verticale) incisie in het lichaam muur boven de eierstok of vet pad op een plek waar de incisie niet knippen enige grote bloedvat. Houd de spier met micro ontleden getand pincet en knip met een schaar (Figuur 3D).
  14. Beweeg de muis om haar hoofd gericht naar de chirurg.
  15. Laad de embryomanipulatie pipet (figuur 3E):
    1. Laat CZBH media te stijgen door capillariteit door het nauwe gedeelte van de manipulatie pipet tot ongeveer 5 mm van het bredere gedeelte.
    2. Neem een ​​kleine luchtbel (0.2-0.5 mm).
    3. Introduceer de embryo's (5-10) ineen minimale hoeveelheid medium (2-4 mm).
    4. Neem nog een kleine luchtbel (0.2-0.5 mm) en een kleine hoeveelheid media (0.5-1 mm).
    5. Laat de glazen pipet die aan de mond aspirator houder of aan de met de hand bediende inrichting, klaar voor stap 3.17.
  16. Pak het vet pad rond de eierstok met micro ontleden getand pincet en trek hem naar de muis hoofd naar de eierstok, eileider, en een klein deel van de bovenste baarmoeder uit de buikholte (Figuren 3F en 3G) bloot te leggen.
  17. Houd de aspirator mondstuk in de mond, klaar om gebruikt te worden, pak het vet pad met micro ontleden gekartelde tang om de eileider te bewegen en de utero-eileiders kruispunt (dwz waar de eileider aan de baarmoeder) bloot te leggen.
  18. Houden van de utero-eileiders knooppunt bereikbaar, neem lichte gebogen micro dissectie pincet met je linkerhand (als rechtshandige) en plaats ze net onderde utero-eileiders knooppunt grijpen de eileider ongeveer 2 mm boven dat gedeelte.
  19. Houd de utero-eileiders kruising met de lichte gebogen micro dissectie pincet, doorboren de eileider gedeelte dicht bij de tang met een 27 G naald (Figuur 3H).
  20. Plaats de embryomanipulatie pipet in de opening uitgevoerd met de naald en ga verder naar de baarmoeder via de eileiders baarmoeder-junction (figuren 3I en 3J). Zodra de pipet de utero-eileiders junction (figuur 3K) is geslaagd voor het glijdt gemakkelijk. Niet erg ver vooruit in de baarmoeder endometrium schade (niet meer dan 3 mm) en pipet blokkering door het puin te voorkomen.
  21. Laat de embryo's in de baarmoeder door zachtjes te blazen (figuur 3L). Beide luchtbellen moet door de baarmoeder. Sommige van de media boven de eerste bubblekan ook worden vrijgegeven in de baarmoeder, maar voorkomen dat er meer lucht, omdat implantatie kunnen belemmeren.
  22. Verwijder de pipet net na embryo's zijn vrij in de baarmoeder.
  23. Verplaats de eileider en de eierstok naar de buikholte door grijpen de vet pad.
  24. Hecht de spier met een horizontale matras steek met 5/0 absorbeerbare hechtdraad (Figuur 3M).
  25. Hecht de huid met een wond clipper (figuur 3N).
  26. Ga verder met stap 10 aan de andere kant indien nodig.
  27. Identificeer de ontvanger (oor ring, vinger tattoo ...), verplaatsen naar zijn kooi (geplaatst op een warme fase) en observeren totdat hij herstelt van anesthesie (bewuste en borstligging te handhaven).
  28. Annoteren de mogelijke incidenten die zich tijdens embryotransplantatie en voeg antibiotica aan het drinkwater. Een 0.5-1 ml subcutane injectie van warme saline oplossing verbetert het herstel.
  29. Wond clips kunnen worden verwijderd 10 dagen na embryo transfer met een wond clipper remover of twee paar tang (figuur 3O). De ontvanger kan worden afgewogen op die dag aan de zwangerschap te beoordelen en schatten het aantal pups. Bieden genesteld materiaal aan de ontvanger 15 dagen na embryo transfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Utero-eileiders embryo transfer biedt een middel om embryo's over te dragen aan de baarmoeder vermijden van een aantal van de complicaties verbonden aan de baarmoeder embryo transfer 2,9,10. In tabel 1 tonen we enkele representatieve resultaten ons verkregen overbrengen CD1 blastocysten blootgesteld aan verschillende manipulaties CD1 ontvangers volgens de beschreven protocol. De term overleving (% van embryo resulteert in een pup) of overleving E15 (bij lentivirus blootgesteld) is gelijk embryo eenvoudig gekweekt in vitro van de zygote fase (IVC), embryo's die zijn iPSC injectie chimere pups genereren en embryo's die hadden hun zona verwijderd en werden blootgesteld aan lentivirus voor 7 uur voor embryotransplantatie. Daarom utero-eileiders embryo transfer is een betrouwbare techniek om embryo's bijzonder ingewikkeld zoals die ontbreekt zonapellucida en geïncubeerd met lentivirus overdragen.


Figuur 1. Injectie van anesthetica en analgetica. A) intraperitoneale injectie van ketamine-Xylazine. B) subcutane injectie van buprenorfine. C) Toepassing van oogzalf.

Figuur 2
Figuur 2. . Vasectomie protocol A) De incisie punt (afgebeeld met een rode 'X') is ongeveer 1 cm boven de penis geplaatst, verwijder bont 0,5-2,5 cm boven penis (zwarte lijnen) B) huidincisie C) Muscle incisie... D) Vas deferens (zwarte pijl) en testenis (*). E) Flaming van de tang voor cauterisatie. F) Uitbranden van de zaadleider in twee punten tegelijk. G) zaadleider duidelijk gescheiden in twee dichtgeschroeid uiteinden. H) spierhechting. I) Skin hechtdraad. Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 3
Figuur 3. Utero-eileiders embryo transfer protocol A, B) rug-en zijaanzicht van de incisie punt (afgebeeld met een rode 'X');. Zwarte lijnen tussen de laatste rib en heupen (A, B) en tussen rug en buik (B) als leidraad dienen. C) Huid incisie. E) Embryo manipulatie glazen pipet geladen met 5 blastocysts klaar om te worden overgedragen. F, G) Vertegenwoordiger eierstokken met (F) of zonder (G) corpora lutea, aangegeven met zwarte pijlen. HK) Voor representatie doeleinden , een simulatie van de baarmoeder-eileiders embryo transfer werd uitgevoerd laden van een glas manipulatie pipet met 0,4% trypaanblauwoplossing. H) Punctie van de eileider (zwarte pijl) in de buurt van de baarmoeder (*). I) Invoering van het embryo manipulatie pipet in de opening eerder uitgevoerd. J) De embryomanipulatie pipet vorderingen door de utero-eileiders kruising. K) Een volume van trypanblauw oplossing gelijkwaardig is aan die uitgebracht in een embryotransfer is uitgedreven in de baarmoeder lumen (zwarte pijl). L) Naar test de efficiënte sluiting door de utero-tubale verbinding, deinhoud van de manipulatie pipet werd uitgebracht in de baarmoeder, eileiders baarmoeder-splitsing (pijl) belemmert het terugstromen van de trypaanblauwoplossing vrijgelaten in de baarmoeder (*) M) spierhechting N) Skin hechtdraad O) Clip verwijderen.... P) 15 dagen na embryo transfer bieden genesteld materiaal aan de ontvanger. Q) Chimeric nest verkregen na deze techniek. Klik hier voor grotere afbeelding.

Behandeling Aantal overdrachten Embryo's Pups geleverd Overleving term (%)
IVC 11 110 82 74.5
IPSC injectie 3 50 35 70.0
Lentivirus 6 60 44 73.3

Tabel 1. Representatieve resultaten verkregen na het overbrengen van drie verschillende groepen van gemanipuleerde embryo's na utero-eileiders embryo transfer. 1) Embryo's in vitro gekweekte (IVC) van de zygote podium om de blastocyststadium, 2) In vivo geproduceerd blastocysts geïnjecteerd met 10 mouse iPSC chimere muizen te genereren, 3) In vivo geproduceerde blastocysten die hadden hun zona verwijderd en werden gedurende 7 uur met een lentivirus die GFP. De gegevens geven het aantal pups geboren uit het aantal embryo's overgebracht, behalve voor de lentivirus blootgestelde groep, waar zij vertegenwoordigen het aantal levensvatbare foetussen 10 dagen na embryo transfer, als de zwangerschap werd niet toe om verdere vooruitgang.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vasectomie is een relatief ongecompliceerd chirurgische techniek die grote moeilijkheden geen sprake. Bij het opschonen met povidonjood en ethanol ervoor te zorgen dat de laatste wasbeurt (met ethanol) verwijdert povidonjood, omdat het het buikvlies kan irriteren. De toegang tot zaadleider kan ook worden bereikt door het scrotum of het uitvoeren van een transversale incisie in de buik 8. Scrotum incisie is aanbevolen om buikinsnijding transversale te wijten aan de relatief kleinere incisie nodig is en iets betere postoperatieve gedrag 11. Echter, wij prefereren de abdominale incisie via scrotum omdat het gemakkelijker en duidelijker toegang tot de zaadleiders van beide testikels, waardoor beginnende chirurgen van tweemaal cauterisatie dezelfde vas deferens en laten een functionele vas deferens. Tussen beide abdominale technieken, geven wij de voorkeur de longitudinale incisie in de linea alba over de transversalesal omdat het gesneden elke abdominale spier vezels, het vermijden van de ontwikkeling van abdominale hernia. Echter, beide vasectomie en utero-eileiders embryotransfer protocollen worden aangepast aan de beschikbare uitrusting of de persoonlijke voorkeuren van de onderzoeker. Zo kan een glaskraal sterilisator worden gebruikt om de tang gebruikt om de vas deferens cauterize verwarmen. In ieder geval, is het essentieel om een ​​aseptische techniek volgen, om een ​​goede anesthesie en analgesie te verstrekken om het welzijn van dieren te optimaliseren, en om te voldoen aan lokale regelgeving.

Een ander aspect vatbaar voor wijzigingen is de anesthesie protocol. Als inhalatie-anesthesie (isofluraan) beschikbaar is, raden we het gebruik in plaats van parenterale (injecteerbare) anesthesie, omdat het een zeer stabiele anesthesie vliegtuig en snel herstel. Het is echter belangrijk te vermelden dat inhalatie verdoving vereist nog het gebruik van een pijnstillend middel intra-en post-operatory pijn, die admini moetgestoffeerde voor de operatie als premedicatie. Buprenorfine is een opiaat dat langdurige analgesie bij de muis 12 bieden. Parenterale verdoving biedt ook een goede verdoving vliegtuig voor korte procedures zoals vasectomie en embryotransplantatie. Ketamine-Xylazine is een zeer betrouwbare combinatie voor muis chirurgie 13 en we hebben nog nooit waargenomen enige verdoving complicaties met behulp van deze combinatie in combinatie met premedicatie met buprenorfine. Andere parenterale combinaties kunnen worden gebruikt 12, maar we hebben het gebruik van de verdovende mengsel avertin (tribroomethanol) ontmoedigen, aangezien slechts een enkele dosis kan toedienen en meerdere artikelen hebben gemeld diverse complicaties in verband met het gebruik ervan, zoals lokale irritatie, slechte analgesie, ileus , vezelachtige verklevingen in de buikholte, necrose van subperitoneal spiervezels en buikorganen oppervlak, en zelfs sterfte 14-18.

Embryo transfer vereist een goed beheer van zowel embryo's eend ontvanger. Als algemene regel voor zoogdieren embryo transfer, kan het ontwikkelingsstadium van het embryo zijn meer geavanceerd dan de pseudozwangerschap stadium van de ontvanger, maar niet omgekeerd. Met andere woorden, de embryo wachten voor de moeder, maar de moeder kan niet wachten op het embryo, zodat deze techniek kan worden gebruikt om morulae of blastocysten dragen, maar niet eerdere fasen. Utero-eileiders embryotransplantatie kan worden uitgevoerd twee dagen na de ontdekking van de vaginale plug van 's middags (2,5 dpc) om avond-nacht (3 dpc), wanneer de baarmoeder-eileiders knooppunt staat open voor de natuurlijke doorvoer van embryo's mogelijk te maken van de eileider naar baarmoederhoorns. Gezien het feit dat de overgebrachte embryo's mogelijk al last van een vorm van manipulatie, moeten embryo handling eventuele verdere schade te minimaliseren. Een uitstekende gids voor muizenembryo manipulatie vindt U in Nagy et al.. 8 De twee meest gebruikte muizenembryo manipulatie media, die een fysiologische pH houden normale bijatmosfeer, zijn CZBH 19 en 20 M2. Hoewel in vivo geproduceerd muisembryo's blootstelling aan koude temperatuur of abnormale pH langdurig 21 overwinnen, moet manipulatie media worden voorverwarmd. Als media wordt voorverwarmd in een cultuur schotel, vermijd opwarming gedurende lange perioden (meer dan 40 min), als de osmolariteit van de media zal toenemen als gevolg van verdamping van het water en dat kan schadelijker zijn dan koud manipulatie media. Evenzo moet de tijd doorgebracht in het embryo manipulatie pipet worden geminimaliseerd door het geringe volume in de pipet.

Het gebruik van een goede embryomanipulatie pipet is cruciaal voor het succes van het protocol. Manipulation pipetten kan worden gemaakt van glas capillairen met een dunne glaswand. Pasteurpipetten, vaak gebruikt om grote dieren embryo behandelen, kunnen ook worden gebruikt, maar vanwege de kortere afstand van het handvat aan het uiteinde, manipulatie pipetten van glas capillairen zijn comfortable te manoeuvreren. De blootstelling aan de vlam en de snelheid van het trekken bepalen de wanddikte en de binnendiameter van de pipet. Hoewel manipulatie pipetten gemakkelijk kan handmatig na enige oefening trekker en micro-smeden kunnen ook worden gebruikt. Het is belangrijk om tijd te investeren in de productie van verschillende optimale manipulatie pipetten. De manipulatie pipet diafragma moet breder zijn dan een embryo om een ​​vlotte doorstroming mogelijk te maken, maar klein genoeg om gemakkelijk binnendringen en vooruitgang door de utero-eileiders kruising. Als zonapellucida heeft vóór de overdracht is verwijderd, blastocysts meestal uit te breiden naar een grotere diameter. In dit geval is het raadzaam breder pipetten met een groter diafragma (130-180 um) maken om schade aan de trophectoderm cellen voorkomen. Tip polish is belangrijk om te voorkomen dat schade aan de eileider, baarmoederwand en het embryo - vooral als zona is verwijderd, en de pipet tip van geblokkeerd door puin te voorkomen. Echter, na het polijsten, het diafragma moet not te klein ten opzichte van de binnendiameter van de pipet, een scherpe daling in diameter zal abrupte stroomsnelheid veroorzaken. De aspirator mondstuk zorgt voor een meer nauwkeurige flow control evenals een meer comfortabele positie van de hand ten opzichte van met de hand bediende apparaten. Niettemin kan een met de hand bediende inrichting worden gebruikt indien nodig (bijvoorbeeld bij het manipuleren-lentivirus behandelde embryo's). Voor een optimale stroming en de overdracht van minerale olie te vermijden, is het ook nodig om een ​​nieuwe pipet gebruiken embryo transfer plaats daarvan gebruikt om de embryo's uit het kweekmedium naar de manipulatie media. Tot slot, terwijl de invoering van de pipet door de eileider, de capillair moet worden direct behandeld, dwz. grijpen het glas en niet het plastic handvat van de aspirator, om een ​​stevige grip te krijgen. De vergroting voor embryo transfer is een persoonlijke zaak die afhangt van de gezichtsscherpte van de chirurg. Wij verkiezen lage vergroting om een ​​breed gezichtsveld hebben,dus gebruiken we een 10X laatste vergroting (10x oculair en 1X objectief).

De ontvangers moeten minstens 8 weken oud zijn en wegen tussen de 27-40 g. Outbreed muizen zoals CD1 of Zwitserse Webster weer een goede gedrag van de moeder en zijn uitstekend ontvangers. Het is raadzaam om het opzetten van fokprogramma om extra ontvangers te verkrijgen, als die niet wordt gebruikt zal zijn normale fietsen activiteit in twee weken te herstellen. Ondanks dat gekoppeld, kunnen sommige vrouwen niet corpora lutea (Figuur 3G) en derhalve niet ontvankelijk voor de overgebrachte embryo's. Daarom moet eierstokken worden gecontroleerd op de aanwezigheid van corpora lutea, die 2,5 dpc kan duidelijk als heldere rode structuren in de eierstok (Figuur 3F). Tijdens de operatie is het belangrijk om het contact met de voortplantingsorganen minimaliseren door grijpen ovariële vet pad plaats, overmatige manipulatie van de eierstokken en de baarmoeder kan leiden luteolysis. De introductie van de manipulation pipet in de eileider is de meest gecompliceerde stap van het protocol. In sommige ontvangers, de eileider is zeer verdraaid en er geen 2 mm recht stuk van de verbinding met de baarmoeder. In dat geval regelen de eileider en het uitvoeren van het lek in de eerste bocht. Zoals hierboven is uiteengezet, een mooie manipulatie pipet maakt echt een verschil. Zodra de pipet heeft doorgegeven via de baarmoeder-eileiders kruising, het glijdt gemakkelijk. Als dit niet gebeurt, kan de pipet hebben afgeweken van de eileider en de baarmoeder lumen niet bereikt. Eenmaal in de baarmoeder, als de media niet stroomt, verplaatst u de pipet iets uit of in en probeer het opnieuw. Als het dan nog niet stroomt, wordt de pipet verstopt, neem het uit de baarmoeder, de inhoud in de schaal los met manipulatie media en herladen dezelfde of andere pipet. Levering vindt meestal plaats 17 dagen na embryo transfer. Om kannibalisme te voorkomen, bieden genesteld materiaal 2 dagen van tevoren en niet de kooi niet veranderen tijdens de eerste dagen na de bevalling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door fondsen van de Vakgroep Dierlijke en Avian Sciences aan BT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine VEDCO Ketaved ANADA 200-257 To be ordered by a licensed veterinarian.
Xylazine Lloyd Laboratories Anased NADA #139-236 To be ordered by a licensed veterinarian.
Buprenorphine Generic NDC 400-42-010-01 To be ordered by a licensed veterinarian.
Eye ointment Novartis Genteal
Antibiotic Pfizer Clavamox NADA #55-101. Added to drinking water (0.3 mg/ml of amoxicillin trihydrate and 0.075 mg/ml of clavulanate potassium). Add 1.5 ml of the reconstituted 15 ml bottle to 250 ml of water.
Dressing serrated forceps ROBOZ RS-8120 Any medium size surgical-grade steel straight forceps will work.
Microdissecting serrated forceps ROBOZ RS-5137 These ones are curved at a 90º angle. Straight forceps can be used if preferred.
Slight curved micro dissection forceps ROBOZ RS-5136 This model is particularly useful to hold the oviduct.
Scissors ROBOZ RS-5880 Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
27 G needles Beckton-Dickinson 305136 Smaller needles (30 G) can be also used. 25 G may be a bit too big.
Clip applier MiKRon 42763
9 mm Clips MiKRon 427631
Clip remover MiKRon 7637 Two pairs of teeth forceps (ROBOZ RS-8160) can be used instead.
Suture needle holder ROBOZ RS-7820
Suture Dowist Gell 5-0 Dexon S 7204-21 Can be substituted for any 4-0 to 6-0 absorbable suture with a narrow curved needle.
Glass capillaries VWR 100 ul calibrated pipettes 53432-921 It includes a mouth aspirator system that only requires to attach a 0.22 µm filter in the tubing to be ready to use. More information can be obtained in Nagy et al.8
Burner KISAG AG Typ 2002 Gas operated burner, can be charged with Kigas (CH-4512, from the same vendor). Alcohol burners may be also used, but gas provides a higher temperature and this burner provides a small and precise flame.
Stereomicroscope Leica MZFLIII This is an expensive estereomicroscope with fluorescence, that can be also used for other purposes. There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. It is better to use two stereomicroscopes, one for handling the embryos (which does not need to be a very nice one) and another one for the recipient. The one used for the recipient should display a long distance from the stage plate to the objective lense, in order to be able to focus 3-4 cm above the stage plate (where the oviduct will be placed) and still leave some room for the surgeon; most of the stereomicroscopes can do this, but some cannot. 
Fiber optics ilumination Dolan Jenner Fiber lite To iluminate the surgical area. There are different systems available.
Warm stages American scope http://store.amscope.com/tcs-100.html These can be placed over the stage plate of the stereomicroscope. Some modifications (inserting a stick to level the stage) may be needed if it is too short for the stereomicroscope. A big warm stage can be used for warming the cage if it is available. If not, a regular heating pad can be used, but temperature must be checked.
Culture dishes for embryo manipulation Falcon 353001 351008 may be also used; they made narrower drops.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fernandez-Gonzalez, R., et al. Long-term effect of in vitro culture of mouse embryos with serum on mRNA expression of imprinting genes, development, and behavior. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 101, 5880-5885 (2004).
  2. Bermejo-Alvarez, P., Roberts, R. M., Rosenfeld, C. S. Effect of glucose concentration during in vitro culture of mouse embryos on development to blastocyst, success of embryo transfer, and litter sex ratio. 79, 329-336 (2012).
  3. Tarkowski, A. K. Experiments on the development of isolated blastomers of mouse eggs. Nature. 184, 1286-1287 (1959).
  4. Whittingham, D. G. Fertilization of mouse eggs in vitro. Nature. 220, 592-593 (1968).
  5. McLaren, A., Biggers, J. D. Successful development and birth of mice cultivated in vitro as early as early embryos. Nature. 182, 877-878 (1958).
  6. McLaren, A., Michie, D. Studies on the transfer of fertilized mouse eggs to uterine foster-mothers. I. Factors affecting the implantation and survival of native and transferred eggs. J. Exp. Biol. 33, 394-416 (1956).
  7. Goto, Y., et al. The fate of embryos transferred into the uterus. J. Assist. Reprod. Gen. 10, 197-201 (1993).
  8. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2003).
  9. Chin, H. J., Wang, C. K. Utero-tubal transfer of mouse embryos. Genesis. 30, 77-81 (2001).
  10. Ramirez, M. A., Fernandez-Gonzalez, R., Perez-Crespo, M., Pericuesta, E., Gutierrez-Adan, A. Effect of stem cell activation, culture media of manipulated embryos, and site of embryo transfer in the production of F0 embryonic stem cell mice. Biol. Reprod. 80, 1216-1222 (2009).
  11. Miller, A. M., Wright-Williams, S. L., Flecknell, P. A., Roughan, J. V. A comparison of abdominal and scrotal approach methods of vasectomy and the influence of analgesic treatment in laboratory mice. Lab. Anim. 46, 304-310 (2012).
  12. Flecknell, P. A. Laboratory Animal Anaesthesia. Academic Press. Oxford, UK. (2009).
  13. Erhardt, W., Hebestedt, A., Aschenbrenner, G., Pichotka, B., Blumel, G. A comparative study with various anesthetics in mice (pentobarbitone ketamine-xylazine,carfentanyl-etomidate). Res. Exp. Med. 184, 159-169 (1984).
  14. Tarin, D., Sturdee, A. Surgical anaesthesia of mice: evaluation of tribromo-ethanol, ether, halothane and methoxyflurane and development of a reliable technique. Lab. Anim. 6, 79-84 (1972).
  15. Zeller, W., Meier, G., Burki, K., Panoussis, B. Adverse effects of tribromoethanol as used in the production of transgenic mice. Lab. Anim. 32, 407-413 (1998).
  16. Lieggi, C. C., et al. Efficacy and safety of stored and newly prepared tribromoethanol in ICR mice. Contemp. Top. Lab. Anim. Sci. 44, 17-22 (2005).
  17. Lieggi, C. C., et al. An evaluation of preparation methods and storage conditions of tribromoethanol. Contemp. Top. Lab. Anim. Sci. 44, 11-16 (2005).
  18. Meyer, R. E., Fish, R. E. A review of tribromoethanol anesthesia for production of genetically engineered mice and rats. Lab. Anim. 34, 47-52 (2005).
  19. Chatot, C. L., Lewis, J. L., Torres, I., Ziomek, C. A. Development of 1-cell embryos from different strains of mice in CZB medium. Biol. Reprod. 42, 432-440 (1990).
  20. Quinn, P., Barros, C., Whittingham, D. G. Preservation of hamster oocytes to assay the fertilizing capacity of human spermatozoa. J. Reprod. Fertil. 66, 161-168 (1982).
  21. Dios Hourcade, de, Perez-Crespo, J., Serrano, M., Gutierrez-Adan, A., A,, Pintado, B. In vitro and in vivo development of mice morulae after storage in non-frozen conditions. Reprod. Biol. Endocrinol. 10, 62 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics