Utero-æggelederne Embryo Transfer og Sterilisation i musemodel

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Utero-tubal ægoplægning bruger utero-tubal krydset som en barriere for at forhindre embryo udstrømning, der kan opstå, når du udfører uterin overførsel. Vasectomized mænd er forpligtet til at indhente pseudogravide modtagere til ægoplægning. Begge teknikker er diskuteret.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Bermejo-Alvarez, P., Park, K. E., Telugu, B. P. Utero-tubal Embryo Transfer and Vasectomy in the Mouse Model. J. Vis. Exp. (84), e51214, doi:10.3791/51214 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Overførslen af ​​præimplantations embryoner til en surrogat kvinde er en nødvendig skridt til produktion af genetisk modificerede mus eller for at studere virkningerne af epigenetiske ændringer opstod under præimplantationsperioden udvikling på efterfølgende fosterudvikling og voksen sundhed. Brugen af ​​en effektiv og konsekvent ægoplægning teknik er afgørende for at forbedre den generation af genmodificerede dyr og til at bestemme effekten af ​​forskellige behandlinger på implantation satser og overlevelse til sigt. Embryoner på blastocyststadiet er normalt overføres af uterin overførsel, der udfører en punktering i livmodervæggen at indføre embryomanipulation pipette. Åbningen udføres i livmoderen ikke lukker efter pipetten er blevet trukket tilbage, og embryonerne kan udstrømningen bughulen på grund af det positive tryk i livmoderen. Punktering kan også producere en blødning, som forringer implantation, blokerer overførselspipetten og kan påvirke embryo ddvikling, især når embryoner uden zona overføres. Derfor denne teknik ofte resulterer i meget varierende og generelt lave embryo overlevelse. Undgå disse negative virkninger, utero-tubal ægoplægning drage fordel af den utero-tubal krydset som en naturlig barriere, der forhindrer embryo udstrømning og undgå punktur af livmodervæggen. Kræves vasectomized hanner for at opnå pseudogravide modtagere. En teknik til at udføre vasektomi er beskrevet som et supplement til den utero-tubal ægoplægning.

Introduction

Ægoplægning er formentlig den hyppigste kirurgiske indgreb udføres i musemodel. Denne teknik er afgørende for at opnå afkom fra fostre udsættes for in vitro-manipulation teknikker, og derfor er et nødvendigt skridt for udviklingen af genetisk modificerede modeller af pronuclear injektion, lentiviral transduktion eller kimære-dannelse. Udover, at teknikken tillader studiet af de udviklingsmæssige effekter af diverse fornærmelser opstår under præimplantationsperioden udvikling. Brugen af kunstige reproduktionsteknikker 1 eller udsættelse for unormale koncentrationer af forskellige stoffer eller metabolitter 2 maj påvirke embryo udvikling resulterer i implantation eller placentation fiaskoer og langtidsvirkninger i afkommet. En pålidelig og reproducerbar ægoplægning teknik er afgørende for at teste de mulige negative virkninger af den eksperimentelle behandling på implantation og fosterudvikling på en konsekvent mandner.

Murine præimplantations embryoner kan overføres til en recipient hun enten ind i æggelederen via ampuller på 0,5 dage efter coitum (dpc) pseudogravide modtagere (æggeleder overførsel) 3,4 eller i uterus på 2,5 dpc pseudodrægtig modtager (uterin overførsel) 5,6 afhængigt af deres udviklingsstadiet. Embryoner på blastocyststadiet, såsom dem der anvendes til at generere kimære mus ved injektion af embryonale eller inducerede pluripotente stamceller, der normalt overføres af uterin overførsel. Blastocyster kan også overføres til æggelederen af ​​en 0,5 DPC modtager, men den udgør en mindre fysiologisk test for udviklingsmæssige stoffer, fordi fosteret gennemgår diapause og har 2 dage til at komme sig fra den fornærmelse før implantation finder sted. Livmoder overførsel indebærer punktering af livmodervæggen med en smal kanyle for at generere en blænde, der giver mulighed for adgang af et foster manipulation pipette ind i livmoderen lumen. Aelv denne teknik kan give gode resultater, overlevelse til sigt (dvs. den procentdel af embryoner overføres der udvikle sig til en pup) ofte er lav og uforudsigelig 7,8.

Punktur af livmodervæggen medfører nogle skadelige bivirkninger. Først myometrium er en yderst vaskulariseret væv og punktering resulterer ofte i en lille blødning. Blod kan blokere ægoplægningen pipette eller invadere livmoderens hulrum forårsager fosterdød og / eller implantation fiasko. Dette er især relevant, når embryoner uden zona overføres, da blodlegemer og snavs kan knytte til blastomererne. For det andet betyder det udførte åbning ikke forsegle efter embryonerne er blevet overført, så de kan flyde tilbage gennem åbningen og blive udvist til bughulen, da en for stor volumen er blevet introducere ind i livmoderen. Den utero-tubal ægoplægning beskrevet heri drage fordel af den utero-tubal krydset at levere embryos i livmoderen uden behov for punktering livmodervæggen og derved undgå dens negative konsekvenser 9.

De pseudo modtagerlandene hunner anvendes til ægoplægning opnås ved naturlig parring med vasectomized hanner 8. Der kræves skelsættende sekreter produceret af en steril mand for livmoderen til at blive modtagelige for de overførte embryoner. For at opnå en modtager, er et maksimum på 2 hunner på 8 uger til 6 måneder anbringes med en vasectomized mandlig i eftermiddag. Den følgende morgen, er hundyr kontrolleres for tilstedeværelsen af ​​en vaginal samleje stik, en klump af koaguleret proteiner fra den mandlige sædvæsken. Som parring sker normalt i løbet midnat, er den dag i vaginalprop opdagelse anses for at være 0,5 DPC. Selvom vasectomized hanner kan købes fra nogle leverandører, den kirurgiske procedure, der er beskrevet heri, er forholdsvis let og kræver ingen yderligere instrumenter, end der kræves til ægoplægning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg blev godkendt af Beltsville Area Animal Care og brug komiteer (BAACUC 11-015) i overensstemmelse med USDA Animal Care og brug retningslinjerne.

1.. Anæstesi og Analgesi (Fælles for både kirurgiske procedurer)

  1. Musen vejes og indlæse følgende anæstesi og smertestillende i to 1 ml sprøjter med 27 g nåle:
    1. Ketamin (0,1 mg / g: 0,01 ml / g af en opløsning 10 mg / ml) og xylazin (0,01 mg / g: 0,005 ml / g af en 2 mg / ml).
    2. Buprenorphin (0,1 ug / g: 0,01 ml af en opløsning 0,01 mg / ml).
  2. Immobilisere musen ved optagning harmoniske af halsen så tæt til kæberne som muligt med tommel-og pegefinger og holde halen mellem de små og ring fingre.
  3. Injicer ketamin-xylazin-blanding intraperitonealt. For at undgå at punktere indre organer, holde musen medhovedet lidt under niveauet for sine hofter (figur 1A)
  4. Sprøjt Buprenorphin subkutant i Scruff af halsen hold mellem tommel-og pegefinger (figur 1b).
  5. Lad mus i buret (ren og uden andre dyr) på en varm fase.
  6. Når bevidstløs, kontrolleres for fravær af bageste fod refleks (kontrolleret ved tå knivspids). Anvend øjet salve for at undgå tørhed i øjet og for at kontrollere fraværet af øjenlågsreflekser (figur 1C).
  7. Denne protokol giver en kirurgisk anæstesi plan i mindst 30 minutter, nok til at udføre procedurerne beskrevet nedenfor (protokol 2 og 3). Hvis længere tid der kræves, kan en yderligere injektion af ketamin + xylazin med halvdelen af ​​den dosis, der er beskrevet i punkt 1.1.1 skal anvendes efter 30 min. En ændring i vejrtrækning til en hurtigere og uregelmæssig man angiver loss af korrekt anæstesi flyet.

2. Vasektomi

  1. Brug en mand med en dokumenteret parring ydeevne.
  2. Sterilisere kirurgiske instrumenter, rengøre overflader, hvor operationen vil blive udført, og tørre dem med 70% ethanol.
  3. Udfør anæstesi som tidligere beskrevet (Protokol 1), kontrol for tab af reflekser.
  4. Anbring musen på en varm scene, fjerne pels med elektriske klippere fra den ventrale område mellem to imaginære tværgående linjer placeret 0,5 cm og 2,5 cm over penis (figur 2A).
  5. Rens det barberede område ved sekventiel aftørring med 10% povidon-iod og 70% ethanol.
  6. Den placeres i liggende stilling med sin hale i retning af kirurgen og dæksel med en steril serviet med et hul udsætte barberede område. Oplys det kirurgiske område.
  7. Udfør en 10-15 mm langsgående hud incision i den mediale linje maven, omkring 1 cm over penis. Hold huden med dressing savtakkede pincet og derefter klippe med en saks (figur 2A og 2B).
  8. Udfør en 5-10 mm langsgående snit i linea alba. Hold musklen med microdissecting savtakkede pincet og skåret med en saks (Figur 2C).
  9. Grib testikel fedt pad på den ene side med mikro dissekere savtakkede pincet og træk det til at afsløre testiklerne, sædlederen og epididymis. Sædleder er placeret medialt til testiklerne, og det er et klart adskiller fri rør (ikke knyttet til testiklerne væggen som den epididymis) med et blodkar, der løber langs den ene side (figur 2D).
  10. Holding sædlederen med en mikro Dissecting savtakkede pincet, flamme dressing pincet, indtil de bliver røde (Figur 2E ætse sædlederen i to punkter på en gang (figur 2F). Snittet skal fjerne en del af ca 5 mm og efterlade to klart adskilte cauterized ender (figur 2G).
  11. Flyt testikel, epididymis og sædlederen tilbage til bughulen.
  12. Fortsæt fra trin 9 i den anden testikel.
  13. Suturere musklen med en eller to vandrette madras sting lavet med 5/0 resorberbar sutur (figur 2H).
  14. Suturere huden med en eller to sår neglesaks (Figur 2i).
  15. Identificer den vasektomeret mandlig (øre ring, finger tatovering ...), flytte det bur placeret på en varm scene og observere, indtil det genvinder fra anæstesi (bevidst og vedligeholde brystleje). En 0,5-1 ml subkutan injektion af varm saltvandsopløsning forbedrer reselvopdagende. Optag de mulige forekomster, der opstår under vasektomi overførsel, tilføje antibiotika til drikkevandet.
  16. Sårklemmer kan fjernes 10 dage efter vasektomi med et sår clipper remover eller et par tænder pincet. Den vasectomized mandlige vil være klar til at parre 2 uger efter operationen.
  17. Test infertilitet af vasectomized male ved at parre med frugtbare hunner, før du bruger det til at få modtagere.

3. Utero-æggelederne Embryo Transfer

  1. Mus morulae eller blastocyster kan overføres ved denne teknik til en pseudogravid modtager kvinde ved 2,5 DPC.
  2. Forbered embryomanipulation glaspipette:
    1. Polere spidserne af glaskapillarer for at undgå at beskadige pipetteholder.
    2. Blødgøre en midterdel af kapillarrøret ved opvarmning med en fin flamme mens lidt roterendekapillarrøret med begge hænder synkront. Når kapillærsektion bliver blød og smørbar (lys rød farve), trække den hurtigt fra flammen og træk begge ender for at indsnævre sit ydre diameter på 130-150 um.
    3. Vent på glasset for at køle ned og derefter skære den ved let at lave den smalle del med en diamant-point blyant, slibende sten eller neglefil og trække fra begge sider. Pausen skal være ren og vinkelret
  3. Polere spidsen meget hurtigt flammende, efterlader en 100-130 um blænde. Pipetter kan gemmes til senere brug.
  4. Varm embryomanipulation medier (CZBH eller M2, se diskussionen).
  5. Sterilisere kirurgiske instrumenter, rengøre overflader, hvor operationen vil blive udført, og tørre dem med 70% ethanol.
  6. Udfør anæstesi som tidligere beskrevet (Protokol 1), kontrol for tab af reflekser.
  7. Holde than mus på en varm fase, fjerne pels med elektriske klippere fra det dorsale område mellem knæene og de ​​distale ribber (figur 3A og 3B).
  8. Rens det barberede område ved sekventiel aftørring med 10% povidon-iod og 70% ethanol.
  9. Flyt embryoner fra inkubatoren til forvarmet embryomanipulation medier.
  10. Flyt modtager til en varm fase under stereomikroskop og placere den i bugleje sideværts til kirurgen (med sit hoved ser til højre eller venstre side af kirurgen).
  11. Dække området med en steril serviet med et hul udsætte barberede område og belyse det kirurgiske område.
  12. Udfør en 1 cm tværgående (lodret) snit i huden på en plet placeret på kranie ⅓ af linjen mellem ribben og hofter og ryg ⅓ af linjen mellem ryggen og maven (figur 3A ennd 3B). Hold huden med dressing savtakkede pincet og skåret med en saks (figur 3C).
  13. Når huden er blevet skåret, kan æggestok (rød / orange) eller fedt pad omkring æggestokken (hvid) visualiseres gennem kroppen væg. Udfør en 0,3-0,5 cm tværgående (lodret) indsnit i kroppen væggen over æggestok eller fedt pad på et sted, hvor snittet ikke skærer alle store blodkar. Hold musklen med mikro Dissecting savtakkede pincet og skåret med en saks (Figur 3D).
  14. Flyt musen for at få sit hoved vender mod kirurgen.
  15. Indlæse embryomanipulation pipette (Figur 3E):
    1. Tillad CZBH medier til at stige op af kapillære kræfter gennem den smalle del af manipulation pipette indtil omkring 5 mm i den bredere del.
    2. Tag en lille luftboble (0,2-0,5 mm).
    3. Indføre embryoner (5-10) ien minimal mængde af medier (2-4 mm).
    4. Tage op en anden lille luftboble (0,2-0,5 mm) og en lille mængde af medier (0,5-1 mm).
    5. Lad glaspipette knyttet til munden aspirator indehaveren eller til håndbetjent anordning klar til trin 3.17.
  16. Tag den fedt puden omkring ovariet med mikro Dissecting savtakkede pincet og træk mod muse hoved for at blotlægge ovarie, æggeleder, og en lille del af den øvre livmoderen ud af bughulen (figur 3F og 3G).
  17. Holding stykke aspirator munden i munden, klar til at blive brugt, tag fat i fedt pad med micro Dissecting savtakkede pincet til at flytte æggelederen og udsætte utero-tubal krydset (dvs. hvor æggelederen møder livmoderen).
  18. Holde utero-tubal krydset tilgængelige, tage små buede mikro dissektion pincet med din venstre hånd (hvis højrehåndet) og placere dem lige underden utero-tubal krydset sensationsprægede æggelederen omkring 2 mm over den del.
  19. Hold den utero-tubal krydset med den lille buede mikro dissektion pincet, punktere æggelederen sektion tæt på tang med en 27 G kanyle (figur 3H).
  20. Sæt embryomanipulation pipette i åbningen udført med nålen og gå videre til livmoderen gennem utero-tubal krydset (figur 3I og 3J). Når pipetten har bestået utero-tubal krydset (figur 3K) den glider nemt. Må ikke fremskridt meget langt ind i livmoderen for at forhindre endometrie skade (ikke mere end 3 mm) og pipette blokering af vragrester.
  21. Slip embryoner i livmoderen ved forsigtigt at blæse (figur 3L). Begge luftbobler skal passere gennem livmoderen. Nogle af mediet over den første boblekan også frigives i livmoderen, men undgå at indføre mere luft, da det kan hæmme implantation.
  22. Tag pipetten lige efter embryonerne er blevet frigivet i livmoderen.
  23. Flyt æggelederen og æggestok tilbage til bughulen ved at snuppe den fedt pad.
  24. Suturere musklen med en vandret madras sting med 5/0 resorberbar sutur (figur 3M).
  25. Suturere huden med et sår clipper (Figur 3N).
  26. Fortsæt fra trin 10 på den anden side, hvis det kræves.
  27. Identificer modtager (øre ring, finger tatovering ...), flytte den til dens bur (placeret på en varm etape) og observere, indtil det genvinder fra anæstesi (bevidst og vedligeholde brystleje).
  28. Anmærke de mulige forekomster, der opstår under ægoplægning og tilføje antibiotika til drikkevandet. En 0,5-1 ml subkutan injektion af varm saline løsning forbedrer opsving.
  29. Sårklemmer kan fjernes 10 dage efter ægoplægning med et sår clipper remover eller to par tænger (Figur 3O). Modtageren kan vejes på denne dag til at vurdere graviditet og estimere antallet af hvalpe. Giv nestling materiale til modtageren 15 dage efter ægoplægning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Utero-tubal ægoplægning giver et middel til at overføre embryoner til livmoderen undgå nogle af de komplikationer, der er forbundet til livmoderen ægoplægning 2,9,10. I tabel 1 viser vi nogle repræsentativt resultat, vi har opnået overføre CD1 blastocyster udsat for forskellige former for manipulationer CD1 modtagere efter protokollen beskrevet. Overlevelsen til termin (% af embryoner, i en pup) eller overlevelse til E15 (i tilfælde af lentivirus eksponerede) er ens mellem embryoner simpelthen dyrket in vitro fra zygoten etape (IVC), embryoner udsættes for IPSC injektion for at generere kimære museunger og embryoner, der havde deres zona fjernet og blev udsat for lentivirus i 7 timer før ægoplægning. Derfor utero-tubal embryo transfer er en pålidelig teknik til at overføre embryoner særlig kompliceret, såsom dem, der mangler zona pellucida og inkuberet med lentivirus.


Figur 1. Injektion af anæstetika og analgetika. A) intraperitoneal injektion af ketamin-xylazin. B) Subkutan injektion af buprenorphin. C) Anvendelse af øjet salve.

Figur 2
Figur 2. . Vasektomi protokol A) indsnit punkt (afbildet med et rødt "X") er placeret ca 1 cm over den penis, fjerne pels 0,5-2,5 cm over penis (sorte linjer) B) Hud snit C) Muskel indsnit... D) Sædleder (sort pil) og tester (*). E), Flaming af pincetten for cauterization. F) Cauterization af sædlederen i to punkter på en gang. G) Sædleder klart adskilt i to cauterized ender. H) Muscle sutur. I) Hud sutur. Klik her for at se større billede.

Figur 3
Figur 3. Utero-æggelederne ægoplægning protokol A, B) Dorsal og lateral udsigt over snittet punkt (afbildet med et rødt "X"). Sorte linjer mellem ribben og hofter (A, B) og mellem ryg og mave (B) tjene som vejledning. C) Hud snit. E) Embryo manipulation glaspipette lastet med 5 blastocyster klar til at blive overført. F, G) Repræsentative æggestokke med (F) eller uden (G) corpora lutea, angivet med sorte pile. HK) repræsentation formål , en simulering af livmoderen-tubal ægoplægning blev udført indlæsning af en glas manipulation pipette med 0,4% trypanblå løsning. H) punkteres æggelederen (sort pil) tæt på livmoderen (*). I) Indførelse af embryomanipulation pipette åbningen udført tidligere. J) Den embryomanipulation pipette frem af den utero-tubal krydset. K) Et volumen på trypanblå løsning svarende til den, udgivet i en ægoplægning er udvist i uterine lumen (sort pil). L) Til teste effektiv afslutning produceret af utero-tubal krydset, heleindholdet af manipulation pipette blev frigivet i livmoderen, utero-tubal krydset (pil) hæmmer tilbagestrømning af trypanblå løsning frigivet i livmoderen (*) M) Muscle sutur N) Hud sutur O) Klip fjernelse.... P) 15 dage efter ægoplægning give nestling materiale til modtageren. Q) Kimær kuld opnået efter denne teknik. Klik her for at se større billede.

Behandling Antal overførsler Embryoner overførte Hvalpe leveres Overlevelse til tERM (%)
IVC 11 110 82 74,5
IPSC injektion 3 50 35 70.0
Lentivirus 6 60 44 73,3

Tabel 1. Repræsentative resultater opnået efter overførsel tre forskellige grupper af genmanipulerede embryoner efter utero-tubal embryo transfer. 1) Embryoner dyrket in vitro (IVC) fra zygote etape til blastocyststadiet, 2) In vivo producerede blastocyster injiceret med 10 mouse IPSC at generere kimære mus, 3) In vivo producerede blastocyster, der havde deres zona fjernet og inkuberet i 7 timer med en lentivirus udtrykker GFP. Data repræsenterer antallet af unger er født ud af antallet af embryoner, der er overført bortset lentiviruset udsatte gruppe, hvor de repræsenterer antallet af levedygtige fostre 10 dage efter ægoplægningen, da svangerskabet ikke var muligt at komme videre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sterilisation er en forholdsvis ligetil kirurgisk teknik, der ikke indebærer store vanskeligheder. Ved desinfektion med povidon jod og ethanol sørge for, at den sidste vask (med ethanol) fjerner povidon jod, da det kan irritere bughinden. Adgangen til sædlederen kan også opnås ved pungen eller udfører en tværgående snit i maven 8.. Scrotal indsnit er blevet anbefalet til tværgående abdominal incision på grund af den forholdsvis mindre indsnit nødvendigt og lidt bedre postoperativ adfærd 11. Men vi foretrækker abdominal incision over scrotal, fordi det giver en lettere og klarere adgang til vasa deferentia fra begge testikler, forhindrer uerfarne kirurger fra ætsende to gange de samme sædlederen og forlader en funktionel sædlederen. Mellem begge abdominale teknikker, vi foretrækker den langsgående snit i linea alba over transverSal, fordi den ikke skære nogen abdominal muskuløs fibre, undgå udviklingen af ​​abdominale brok. Dog kan både vasektomi og utero-tubal ægoplægning protokoller tilpasses det udstyr til rådighed eller til de personlige sympatier for forskeren. For eksempel kan en glasperle sterilisator anvendes til opvarmning af tangen anvendes til at ætse sædlederen. Under alle omstændigheder er det vigtigt at følge en aseptisk teknik til at give ordentlig anæstesi og analgesi for at maksimere dyrevelfærd, og for at overholde de lokale regler.

Et andet aspekt er følsomme over for ændringer er anæstesi protokol. Hvis inhalationsanæstesi (isofluran) er tilgængelig, vi tilskynde til dens anvendelse i stedet for parenteral (injicerbar) anæstesi, da det giver en meget stabil anæstesi flyet og hurtig genopretning. Det er imidlertid vigtigt at bemærke, at inhalationsanæstesi stadig kræver anvendelse af et analgetikum til intra-og post-operatory smerte, som skal administreret før operationen som præmedicinering. Buprenorphin er et opioid at give langsigtet analgesi i mus 12. Parenterale anæstesi giver også en god bedøvelsesmiddel fly til korte procedurer såsom vasektomi og ægoplægning. Ketamin-Xylazin er en meget pålidelig kombination til mus kirurgi 13 og vi har aldrig observeret nogen bedøvende komplikationer ved hjælp af denne kombination i forbindelse med præmedicinering med buprenorphin. Andre parenterale kan bruges kombinationer af 12, men vi fraråder brug af narkotiske blanding avertin (tribromethanol), da kun en enkelt dosis kan administrere og flere artikler har rapporteret forskellige komplikationer forbundet med dets anvendelse, såsom lokal irritation, dårlig analgesi, ileus , fibrøse sammenvoksninger i bughulen, nekrose af subperitoneal muskelfibre og abdominale organer overfladen, og endda dødelighed 14-18.

Ægoplægning kræver god forvaltning af både fostre end modtageren. Som en generel regel for pattedyr ægoplægning kan udviklingsstadiet af embryonerne være mere avanceret end den pseudodrægtighed fase af modtageren, men ikke det modsatte. Med andre ord kan embryonerne vente til moderen, men moderen kan ikke vente på embryoner, så denne teknik kan bruges til at overføre morulae eller blastocyster, men ikke tidligere stadier. Utero-tubal ægoplægning kan udføres to dage efter påvisning af vaginal prop fra middag (2,5 DPC) til aften-nat (3 DPC), når livmoderen-tubal krydset er åben for at tillade naturlig transit af embryoner fra æggelederen til Uterushornene. I betragtning af at de overførte embryoner måske allerede har lidt af en form for manipulation, bør håndtering embryo minimere eventuelle yderligere skader. En fremragende guide for museembryo manipulation kan findes i Nagy et al. 8. De to mest almindeligt anvendte mus embryo manipulation medier, der har en fysiologisk pH i regelmæssig påen intens atmosfære, er CZBH 19 og M2 20. Selvom in vivo producerede museembryoer kan overvinde udsættelse for kulde temperatur eller unormal pH i lange perioder 21, bør manipulation medier blive forvarmet. Hvis mediet er forvarmet i en kultur fad, undgå opvarmning i lange perioder (mere end 40 min), da osmolaritet medier vil stige på grund af fordampning af vand, og det kan være mere skadeligt end kold manipulation medier. Ligeledes bør den tid embryoner brugt inde i manipulation pipetten blive minimeret på grund af den lille mængde til stede i pipetten.

Brugen af ​​en ordentlig embryomanipulation pipette er afgørende for en vellykket gennemførelse af protokollen. Manipulation pipetter kan være fremstillet af glas kapillærer med en tynd glasvæg. Pasteur-pipetter, som ofte bruges til at håndtere store dyreembryoer, kan også anvendes, men på grund af dens kortere afstand fra håndtaget til spidsen, manipulering pipetter af glas kapillærer mere comfortable at manøvrere. Eksponeringen for flammen og hastighed for at trække bestemme vægtykkelse og indre diameter af pipette. Selvom manipulation pipetter kan nemt gøres manuelt, efter lidt øvelse, aftrækker og mikro-smedje kan også anvendes. Det er vigtigt at investere tid i at producere flere optimale manipulation pipetter. Manipulation pipette blænde bør være bredere end et foster for at give en jævn strøm, men lille nok til nemt at trænge ind og fremskridt gennem utero-tubal krydset. Hvis æggeskallen er blevet fjernet inden overdragelsen, blastocyster normalt udvide til en større diameter. I dette tilfælde er det tilrådeligt at gøre bredere pipetter med en større blændeåbning (130-180 um) for at undgå eventuelle skader på trophectoderm celler. Tip polish er vigtigt at undgå at beskadige æggelederen, livmodervæggen og embryoet - specielt hvis zona er blevet fjernet, og for at undgå pipettespidsen fra at blive blokeret af snavs. Men efter polering, blænden skal not være for lille i forhold til den indre diameter af pipetten, som en skarp nedgang i diameter vil forårsage pludselige ændringer i strømningshastighed. Aspiratorboblen mundstykke giver en mere præcis flowkontrol samt en mere komfortabel hånd position i forhold til hånd-kontrollerede enheder. Ikke desto mindre kan en hånd-styret anordning om nødvendigt anvendes (for eksempel når manipulere lentivirus-behandlede embryoer). For et optimalt flow og for at undgå overførsel af mineralsk olie, er det også tilrådeligt at bruge en ny pipette til overførsel i stedet for den, der anvendes til at flytte embryoner fra kulturen medier til manipulation medier foster. Endelig men indfører pipetten gennem æggelederen, kapillarrøret skal håndteres direkte, dvs. opsigtsvækkende glasset og ikke plasthåndtag i sugeindretningen, for at opnå et fast greb. Forstørrelsen anvendes til overførsel embryo er en personlig sag, der afhænger af den visuelle skarphed af kirurgen. Vi foretrækker at bruge lav forstørrelse at have et bredt synsfelt,så vi bruger en 10X endelig forstørrelse (10X okular og 1X målsætning).

Modtagerne skal være mindst 8 uger gammel og vejer mellem 27-40 gram. Outbreed mus såsom CD1 eller schweiziske Webster vise en god moderens adfærd og er fremragende modtagere. Det er tilrådeligt at oprette avl for at opnå ekstra modtagere, som dem, der ikke bruges, vil genvinde sin normale cykling aktivitet i to uger. Trods bliver parret, kan nogle kvinder ikke har corpora lutea (figur 3G) og vil derfor ikke være modtagelige for de overførte embryoner. Af denne grund bør æggestokke kontrolleres for tilstedeværelsen af corpora lutea, som på 2,5 DPC klart kan identificeres som lyse røde strukturer i æggestokken (Figur 3F). Under kirurgi er det vigtigt at minimere kontakten med forplantningskanal ved at gribe ovarie fedt pad stedet, overdreven manipulation af æggestokkene og livmoderen kan resultere i luteolyse. Indførelsen af ​​manipulation pipette ind i æggelederen er den mest komplicerede trin i protokollen. I nogle modtagere æggelederen er meget snoet og der er ikke en 2 mm lige strækning fra krydset med livmoderen. I så fald arrangere æggelederen og udføre punkteringen i første sving. Som beskrevet ovenfor er en dejlig manipulation pipette virkelig gør en forskel. Når pipetten har passeret gennem utero-tubal krydset, den glider nemt. Hvis det ikke sker, kan pipetten har afveget fra æggelederen og ikke nået uterine lumen. Når inde i livmoderen, hvis medierne ikke flyder, flytte pipetten lidt ud eller ind og prøv igen. Hvis det stadig ikke flyder, bliver pipetten tilstoppet, tage det ud fra livmoderen, ikke indholdet i skålen med manipulation og læg det samme eller anden pipette. Levering finder normalt sted 17 dage efter ægoplægning. For at forhindre kannibalisme give nestling materiale 2 dage i forvejen, og ændrer ikke buret i løbet af de første dage efter levering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af midler fra Institut for Husdyrbiologi og Avian Sciences til BT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine VEDCO Ketaved ANADA 200-257 To be ordered by a licensed veterinarian.
Xylazine Lloyd Laboratories Anased NADA #139-236 To be ordered by a licensed veterinarian.
Buprenorphine Generic NDC 400-42-010-01 To be ordered by a licensed veterinarian.
Eye ointment Novartis Genteal
Antibiotic Pfizer Clavamox NADA #55-101. Added to drinking water (0.3 mg/ml of amoxicillin trihydrate and 0.075 mg/ml of clavulanate potassium). Add 1.5 ml of the reconstituted 15 ml bottle to 250 ml of water.
Dressing serrated forceps ROBOZ RS-8120 Any medium size surgical-grade steel straight forceps will work.
Microdissecting serrated forceps ROBOZ RS-5137 These ones are curved at a 90º angle. Straight forceps can be used if preferred.
Slight curved micro dissection forceps ROBOZ RS-5136 This model is particularly useful to hold the oviduct.
Scissors ROBOZ RS-5880 Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
27 G needles Beckton-Dickinson 305136 Smaller needles (30 G) can be also used. 25 G may be a bit too big.
Clip applier MiKRon 42763
9 mm Clips MiKRon 427631
Clip remover MiKRon 7637 Two pairs of teeth forceps (ROBOZ RS-8160) can be used instead.
Suture needle holder ROBOZ RS-7820
Suture Dowist Gell 5-0 Dexon S 7204-21 Can be substituted for any 4-0 to 6-0 absorbable suture with a narrow curved needle.
Glass capillaries VWR 100 ul calibrated pipettes 53432-921 It includes a mouth aspirator system that only requires to attach a 0.22 µm filter in the tubing to be ready to use. More information can be obtained in Nagy et al.8
Burner KISAG AG Typ 2002 Gas operated burner, can be charged with Kigas (CH-4512, from the same vendor). Alcohol burners may be also used, but gas provides a higher temperature and this burner provides a small and precise flame.
Stereomicroscope Leica MZFLIII This is an expensive estereomicroscope with fluorescence, that can be also used for other purposes. There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. It is better to use two stereomicroscopes, one for handling the embryos (which does not need to be a very nice one) and another one for the recipient. The one used for the recipient should display a long distance from the stage plate to the objective lense, in order to be able to focus 3-4 cm above the stage plate (where the oviduct will be placed) and still leave some room for the surgeon; most of the stereomicroscopes can do this, but some cannot. 
Fiber optics ilumination Dolan Jenner Fiber lite To iluminate the surgical area. There are different systems available.
Warm stages American scope http://store.amscope.com/tcs-100.html These can be placed over the stage plate of the stereomicroscope. Some modifications (inserting a stick to level the stage) may be needed if it is too short for the stereomicroscope. A big warm stage can be used for warming the cage if it is available. If not, a regular heating pad can be used, but temperature must be checked.
Culture dishes for embryo manipulation Falcon 353001 351008 may be also used; they made narrower drops.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fernandez-Gonzalez, R., et al. Long-term effect of in vitro culture of mouse embryos with serum on mRNA expression of imprinting genes, development, and behavior. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 101, 5880-5885 (2004).
  2. Bermejo-Alvarez, P., Roberts, R. M., Rosenfeld, C. S. Effect of glucose concentration during in vitro culture of mouse embryos on development to blastocyst, success of embryo transfer, and litter sex ratio. 79, 329-336 (2012).
  3. Tarkowski, A. K. Experiments on the development of isolated blastomers of mouse eggs. Nature. 184, 1286-1287 (1959).
  4. Whittingham, D. G. Fertilization of mouse eggs in vitro. Nature. 220, 592-593 (1968).
  5. McLaren, A., Biggers, J. D. Successful development and birth of mice cultivated in vitro as early as early embryos. Nature. 182, 877-878 (1958).
  6. McLaren, A., Michie, D. Studies on the transfer of fertilized mouse eggs to uterine foster-mothers. I. Factors affecting the implantation and survival of native and transferred eggs. J. Exp. Biol. 33, 394-416 (1956).
  7. Goto, Y., et al. The fate of embryos transferred into the uterus. J. Assist. Reprod. Gen. 10, 197-201 (1993).
  8. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2003).
  9. Chin, H. J., Wang, C. K. Utero-tubal transfer of mouse embryos. Genesis. 30, 77-81 (2001).
  10. Ramirez, M. A., Fernandez-Gonzalez, R., Perez-Crespo, M., Pericuesta, E., Gutierrez-Adan, A. Effect of stem cell activation, culture media of manipulated embryos, and site of embryo transfer in the production of F0 embryonic stem cell mice. Biol. Reprod. 80, 1216-1222 (2009).
  11. Miller, A. M., Wright-Williams, S. L., Flecknell, P. A., Roughan, J. V. A comparison of abdominal and scrotal approach methods of vasectomy and the influence of analgesic treatment in laboratory mice. Lab. Anim. 46, 304-310 (2012).
  12. Flecknell, P. A. Laboratory Animal Anaesthesia. Academic Press. Oxford, UK. (2009).
  13. Erhardt, W., Hebestedt, A., Aschenbrenner, G., Pichotka, B., Blumel, G. A comparative study with various anesthetics in mice (pentobarbitone ketamine-xylazine,carfentanyl-etomidate). Res. Exp. Med. 184, 159-169 (1984).
  14. Tarin, D., Sturdee, A. Surgical anaesthesia of mice: evaluation of tribromo-ethanol, ether, halothane and methoxyflurane and development of a reliable technique. Lab. Anim. 6, 79-84 (1972).
  15. Zeller, W., Meier, G., Burki, K., Panoussis, B. Adverse effects of tribromoethanol as used in the production of transgenic mice. Lab. Anim. 32, 407-413 (1998).
  16. Lieggi, C. C., et al. Efficacy and safety of stored and newly prepared tribromoethanol in ICR mice. Contemp. Top. Lab. Anim. Sci. 44, 17-22 (2005).
  17. Lieggi, C. C., et al. An evaluation of preparation methods and storage conditions of tribromoethanol. Contemp. Top. Lab. Anim. Sci. 44, 11-16 (2005).
  18. Meyer, R. E., Fish, R. E. A review of tribromoethanol anesthesia for production of genetically engineered mice and rats. Lab. Anim. 34, 47-52 (2005).
  19. Chatot, C. L., Lewis, J. L., Torres, I., Ziomek, C. A. Development of 1-cell embryos from different strains of mice in CZB medium. Biol. Reprod. 42, 432-440 (1990).
  20. Quinn, P., Barros, C., Whittingham, D. G. Preservation of hamster oocytes to assay the fertilizing capacity of human spermatozoa. J. Reprod. Fertil. 66, 161-168 (1982).
  21. Dios Hourcade, de, Perez-Crespo, J., Serrano, M., Gutierrez-Adan, A., A,, Pintado, B. In vitro and in vivo development of mice morulae after storage in non-frozen conditions. Reprod. Biol. Endocrinol. 10, 62 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics