Utéro-tubaire transfert d'embryons et la vasectomie dans le modèle de souris

Biology

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Summary

Le transfert d'embryons utéro-tubaire utilise la jonction utéro-tubaire comme une barrière pour empêcher l'écoulement de l'embryon qui peut se produire lors de l'exécution de transfert de l'utérus. Les hommes ayant subi une vasectomie sont nécessaires pour obtenir bénéficiaires pseudo-pour le transfert d'embryon. Ces deux techniques sont discutées.

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Bermejo-Alvarez, P., Park, K. E., Telugu, B. P. Utero-tubal Embryo Transfer and Vasectomy in the Mouse Model. J. Vis. Exp. (84), e51214, doi:10.3791/51214 (2014).

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Abstract

Le transfert d'embryons de pré-implantation à une femme de substitution est une étape nécessaire à la production de souris génétiquement modifiées ou pour étudier les effets de modifications épigénétiques origine au cours du développement préimplantatoire sur le développement et la santé du fœtus adulte ultérieure. L'utilisation d'une technique de transfert d'embryons efficace et uniforme est essentielle pour améliorer la production d'animaux génétiquement modifiés, et à déterminer l'effet de différents traitements sur les taux d'implantation et de survie à long terme. Des embryons au stade de blastocyste sont généralement transférés par transfert de l'utérus, la réalisation d'une ponction dans la paroi utérine pour introduire la pipette de la manipulation de l'embryon. L'orifice effectué dans l'utérus ne se ferme pas après la pipette est retirée, et les embryons peuvent écoulement à la cavité abdominale, en raison de la pression positive de l'utérus. La ponction peut également produire une hémorragie qui affecte l'implantation, bloque la pipette de transfert et peut affecter l'embryon développement, en particulier lorsque les embryons sont transférés sans zona. Par conséquent, cette technique entraîne souvent des taux de survie faible embryon très variables et globaux. Éviter ces effets négatifs, le transfert d'embryon utéro-tubaire profiter de la jonction utéro-tubaire comme une barrière naturelle qui empêche l'embryon sorties et éviter la ponction de la paroi utérine. Les hommes ayant subi une vasectomie sont nécessaires pour obtenir bénéficiaires pseudo-. Une technique pour effectuer la vasectomie est décrite en tant que complément au transfert d'embryons utéro-tubaire.

Introduction

Le transfert d'embryons est probablement l'intervention chirurgicale le plus souvent réalisée dans le modèle de souris. Cette technique est essentielle pour obtenir la progéniture d'embryons in vitro soumis à des techniques de manipulation dans et, par conséquent, constitue une étape nécessaire pour le développement de modèles génétiquement modifiés par injection pronucléaire, transduction lentivirus, ou la formation de chimère. En outre, la technique permet l'étude des effets sur le développement de diverses insultes qui se produisent au cours du développement préimplantatoire. L'utilisation des techniques de reproduction artificielle 1 ou l'exposition à des concentrations anormales de différentes substances ou métabolites 2 mai affecter le développement de l'embryon, entraînant des échecs d'implantation ou placentation et les effets à long terme sur la progéniture. Une technique de transfert d'embryons fiable et reproductible est cruciale pour tester les effets négatifs possibles du traitement expérimental sur l'implantation et le développement du fœtus chez un homme cohérentner.

Embryons préimplantatoires murins peuvent être transférés à un destinataire femelle soit dans l'oviducte par les ampoules de 0,5 jours après le coït (DPC) des destinataires pseudo-(transfert de l'oviducte) 3,4 ou dans l'utérus de 2,5 dpc destinataire pseudogestante (transfert de l'utérus) 5,6 en fonction de leur stade de développement. Des embryons au stade de blastocyste, tels que ceux qui sont utilisés pour générer des souris chimères par injection de cellules souches embryonnaires pluripotentes ou induites, sont généralement transférés par transfert de l'utérus. Blastocystes peuvent aussi être transférées à l'oviducte d'une DPC bénéficiaire de 0,5, mais il constitue un test moins physiologique pour les perturbateurs de développement, parce que l'embryon subit diapause et dispose de 2 jours pour récupérer de l'insulte avant l'implantation a lieu. transfert de l'utérus implique la perforation de la paroi de l'utérus avec une aiguille étroit afin de générer une ouverture qui permet l'accès d'une pipette manipulation de l'embryon dans la lumière utérine. Aien que cette technique peut donner de bons résultats, la survie à long terme (à savoir le pourcentage d'embryons transférés qui se développent à un chiot) est souvent faible et imprévisible 7,8.

La perforation de la paroi utérine entraîne des effets secondaires néfastes. Tout d'abord, le myomètre est un tissu très vascularisé et sa perforation en résulte souvent une petite hémorragie. Le sang peut bloquer la pipette de transfert d'embryons ou d'envahir la lumière utérine causant la mort de l'embryon et / ou de l'échec de l'implantation. Ceci est particulièrement pertinent lorsque les embryons sont transférés sans zona, comme les cellules sanguines et les débris peuvent joindre les blastomères. Deuxièmement, l'ouverture réalisée n'est pas étanche après les embryons ont été transférés, de sorte qu'ils peuvent circuler à travers l'orifice et être expulsé de la cavité abdominale quand un trop grand volume a été d'introduire dans l'utérus. Le transfert de l'embryon in utero-tubaire décrit ici profiter de la jonction utéro-tubaire de livrer le embryo dans l'utérus sans avoir besoin de perforer la paroi utérine et ainsi éviter ses conséquences néfastes 9.

Les femmes bénéficiaires de pseudo-utilisés pour le transfert d'embryons sont obtenus par accouplement naturel avec des hommes ayant subi une vasectomie 8. Les sécrétions séminales produites par un mâle stérile sont nécessaires pour l'utérus à devenir réceptive aux embryons transférés. Pour obtenir un destinataire, un maximum de 2 femelles de 8 semaines à 6 mois d'âge sont placés avec un mâle vasectomisé dans l'après-midi. Le lendemain matin, les femmes sont vérifiés pour la présence d'un bouchon de copulation vaginale, un bouquet de protéines coagulées du liquide séminal masculin. Comme l'accouplement a lieu habituellement pendant minuit, le jour de la détection de bouchon vaginal est considéré comme 0,5 dpc. Bien que les mâles vasectomisés peuvent être achetés auprès de certains fournisseurs, la procédure chirurgicale décrite ici est relativement facile et ne nécessite pas d'instruments supplémentaires que nécessaire pour le transfert d'embryons.

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Protocol

Toutes les expériences animales ont été approuvés par la Région Beltsville soin et l'utilisation des animaux Comités (BAACUC 11-015) en conformité avec l'USDA Animal Care et Directives d'utilisation.

Une. Anesthésie et l'analgésie (commune pour les deux interventions chirurgicales)

  1. Peser la souris et charger les anesthésiques et analgésiques suivants dans deux seringues de 1 ml avec 27 g d'aiguilles:
    1. La kétamine (0,1 mg / g: 0,01 ml / g d'une solution à 10 mg / ml) et de xylazine (0,01 mg / g: 0,005 ml / g d'une solution à 2 mg / ml).
    2. La buprénorphine (0,1 pg / g: 0,01 ml d'une solution à 0,01 mg / ml).
  2. Immobiliser la souris en décrochant le peau du cou au plus près des mâchoires que possible avec le pouce et l'index et tenant la queue entre les petits et l'annulaire.
  3. Injecter mélange de kétamine-xylazine par voie intrapéritonéale. Pour éviter de percer les organes internes, tenir la souris avecsa tête légèrement au-dessous du niveau de ses hanches (figure 1A)
  4. Injecter buprénorphine sous-cutanée dans la peau du maintien de cou entre le pouce et l'index (figure 1B).
  5. Laissez la souris dans la cage (propre et sans aucun autre animal) sur une scène chaude.
  6. Une fois inconscient, vérifier l'absence de réflexes du pied arrière (vérifié par pincement de l'orteil). Appliquer une pommade pour les yeux pour éviter la sécheresse de l'œil et de vérifier l'absence de réflexe palpébral (figure 1C).
  7. Ce protocole prévoit un plan d'anesthésie chirurgicale pour un minimum de 30 minutes, assez pour effectuer les procédures décrites ci-dessous (les protocoles 2 et 3). Si des temps plus longs sont nécessaires, une injection supplémentaire de la kétamine + xylazine avec la moitié du dosage décrit dans 1.1.1 peut être appliquée après 30 min. Un changement dans le mode de respiration pour une plus rapide et une irrégularité indique le loss du plan d'anesthésie appropriée.

2. Vasectomie

  1. Utilisez un homme avec une capacité d'accouplement prouvé.
  2. Stériliser les instruments chirurgicaux, nettoyer les surfaces où la chirurgie sera effectuée et les essuyer avec 70% d'éthanol.
  3. Effectuer anesthésie détaillé précédemment (Protocole 1), la vérification de la perte des réflexes.
  4. Placez la souris sur une scène chaude, enlever la fourrure avec une tondeuse électrique de la région ventrale entre deux lignes transversales imaginaires placé 0,5 cm et 2,5 cm au-dessus du pénis (figure 2A).
  5. Désinfecter la zone rasée par essuyage séquentiel avec 10% de l'iode de povidone, et de 70% d'éthanol.
  6. Placez la souris en position couchée avec sa queue vers le chirurgien et la couverture avec une serviette stérile avec un trou d'exposer la zone rasée. Éclairer la zone chirurgicale.
  7. Effectuez une incisio de la peau longitudinale 10-15 mmn à la ligne médiane de l'abdomen, à environ 1 cm au-dessus du pénis. Maintenez la peau avec dressing pince dentelées et puis couper avec des ciseaux (Figures 2A et 2B).
  8. Effectuer une incision longitudinale de 5-10 mm dans la ligne blanche. Tenez le muscle avec microdissecting forceps dentelées et couper avec des ciseaux (figure 2C).
  9. Prenez le coussin adipeux des testicules d'un côté avec micro dissection forceps dentelées et tirez pour exposer les testicules, les canaux déférents et l'épididyme. Canaux déférents est situé en dedans de l'testicule et il est un tube sans distinguer clairement (pas attaché à la paroi du testicule comme l' épididyme) avec un vaisseau sanguin le long d'un côté (figure 2D).
  10. Tenir le canal déférent avec dissection dentelée micro forceps, pinces à pansement flamme jusqu'à ce qu'ils deviennent rouges (figure 2E cautériser le canal déférent de deux points à la fois (figure 2F). La coupe doit enlever une partie d'environ 5 mm et laisser deux extrémités cautérisés clairement séparés (figure 2G).
  11. Déplacez les testicules, épididyme et le canal déférent vers la cavité abdominale.
  12. Passez à l'étape 9 dans l'autre testicule.
  13. Suturer le muscle avec un ou deux points de suture de matelassier horizontale à base de 5/0 suture absorbable (figure 2H).
  14. Suturer la peau avec un ou deux tondeuses de la plaie (figure 2I).
  15. Identifier le vasectomisé (de boucle d'oreille, tatouage doigt ...), déplacer la cage placée sur une étape chaleureuse et observer jusqu'à ce qu'il récupère de l'anesthésie (conscient et maintenir décubitus sternal). Une injection sous-cutanée de 0,5 à 1 ml de solution saline chaude améliore redécouverte. Enregistrer les incidents pouvant se produire pendant le transfert vasectomie, ajouter antibiotique à l'eau potable.
  16. Clips plaies peuvent être retirés 10 jours après la vasectomie avec un dissolvant blessure de tondeuse ou une paire de pinces à dents. Le mâle vasectomisé sera prête à s'accoupler 2 semaines après la chirurgie.
  17. Testez l'infertilité du mâle vasectomisé par accouplement avec des femelles fertiles avant de l'utiliser pour obtenir des bénéficiaires.

3. Utéro-tubaire de transfert d'embryons

  1. Souris morula ou blastocyste peuvent être transférés par cette technique à un destinataire femelle pseudo à 2,5 dpc.
  2. Préparer embryon pipette en verre de manipulation:
    1. Polir les extrémités des capillaires en verre, afin d'éviter d'endommager le porte-pipette.
    2. Adoucir une partie médiane du capillaire de verre par chauffage d'une amende flamme tout en tournant légèrementle capillaire avec les deux mains de manière synchrone. Une fois la section capillaire devient mou et malléable (rouge clair), le retirer rapidement de la flamme et tirez les deux extrémités pour réduire son diamètre externe de 130-150 um.
    3. Attendez que le verre refroidisse et le couper en marquant légèrement la partie étroite avec un crayon pointe de diamant, pierre abrasive ou lime à ongles et en tirant des deux côtés. La rupture doit être propre et perpendiculaire
  3. Polir la pointe à la flamme très rapidement, laissant une ouverture de 100-130 um. Les pipettes peuvent être stockés pour une utilisation ultérieure.
  4. Chaud médias de manipulation de l'embryon (CZBH ou M2, voir la discussion).
  5. Stériliser les instruments chirurgicaux, nettoyer les surfaces où la chirurgie sera effectuée et les essuyer avec 70% d'éthanol.
  6. Effectuer anesthésie détaillé précédemment (Protocole 1), la vérification de la perte des réflexes.
  7. Garder til la souris sur une scène chaude, retirez la fourrure avec une tondeuse électrique de la région dorsale entre les genoux et les nervures distales (figures 3A et 3B).
  8. Désinfecter la zone rasée par essuyage séquentiel avec 10% de l'iode de povidone, et de 70% d'éthanol.
  9. Déplacez les embryons de l'incubateur pour les médias de manipulation de l'embryon préchauffé.
  10. Déplacez le destinataire à un stade chaud sous la loupe binoculaire et placez-le en position latérale sujettes au chirurgien (avec sa tête regardant vers la droite ou la gauche du chirurgien).
  11. Couvrir la zone avec une serviette stérile avec un trou d'exposer la zone rasée et éclairer la zone chirurgicale.
  12. Effectuer un 1 cm transversale (verticale) incision dans la peau à un endroit situé sur le crâne ⅓ de la ligne entre la dernière côte et les hanches et le ⅓ dorsale de la ligne entre le dos et l'abdomen (figures 3A unee 3B). Maintenez la peau avec dressing pince dentelées et couper avec des ciseaux (figure 3C).
  13. Une fois que la peau a été coupée, de l'ovaire (rouge / orange) ou le pad adipeux entourant l'ovaire (blanc) peuvent être visualisées à travers la paroi du corps. Effectuez une 0,3-0,5 cm transversale (verticale) incision dans la paroi du corps sur l'ovaire ou un coussin adipeux dans un endroit où l'incision ne coupe pas tout navire grande de sang. Tenez le muscle avec micro dissection pince dents de scie et couper avec des ciseaux (figure 3D).
  14. Déplacez la souris pour avoir sa tête tournée vers le chirurgien.
  15. Chargez la manipulation pipette de l'embryon (figure 3E):
    1. Permettre aux médias CZBH à monter par capillarité à travers la partie étroite de la pipette de manipulation jusqu'à environ 5 mm de la partie la plus large.
    2. Prenez une petite bulle d'air (0,2-0,5 mm).
    3. Présentez les embryons (5-10) dansune quantité minimale de supports (2-4 mm).
    4. Prenez une autre petite bulle d'air (0,2-0,5 mm) et une petite quantité de médias (0,5-1 mm).
    5. Laisser la pipette en verre fixé au support de l'aspirateur de la bouche ou au dispositif actionné à la main, prêt à l'étape 3.17.
  16. Prenez le coussin adipeux entourant l'ovaire avec micro dissection forceps en dents de scie et tirez-le vers la tête de la souris pour exposer l'ovaire, oviducte, et une petite partie de l'utérus supérieure de la cavité abdominale (figures 3F et 3G).
  17. Maintien de la pièce aspirateur à bouche dans la bouche, prêt à être utilisé, prenez le pad adipeux avec micro dissection pince dents de scie pour déplacer l'oviducte et exposer la jonction utéro-tubaire (c'est à dire où l'oviducte répond l'utérus).
  18. Garder la jonction utéro-tubaire accessible, prendre de légères micro pinces à dissection courbes de la main gauche (pour un droitier) et les placer juste en dessousla jonction utéro-tubaire saisissant l'oviducte sur 2 mm au-dessus de la partie.
  19. Tenir la jonction utéro-tubaire avec les légères micro pinces à dissection courbes, percer la section oviducte à proximité de la pince avec une aiguille de calibre 27 (figure 3H).
  20. Insérez l'embryon manipulation pipette dans l'orifice effectué avec l'aiguille et l'avance de l'utérus à travers la jonction utéro-tubaire (figures 3I et 3J). Une fois la pipette a passé la jonction utéro-tubaire (Figure 3K), il se glisse facilement. Ne pas progresser très loin dans l'utérus pour éviter d'endommager l'endomètre (pas plus de 3 mm) et le blocage de la pipette par des débris.
  21. Relâchez les embryons dans l'utérus par soufflant doucement (Figure 3L). Les bulles d'air doivent passer par l'utérus. Certains médias-dessus de la première bullepeuvent également être disséminés dans l'utérus, mais éviter d'introduire plus d'air, car il pourrait entraver l'implantation.
  22. Retirer la pipette juste après embryons ont été libérés dans l'utérus.
  23. Déplacez l'oviducte et de l'ovaire vers la cavité abdominale en saisissant le pad adipeux.
  24. Suturer le muscle avec un point de matelassier horizontale avec 5/0 suture absorbable (figure 3M).
  25. Suturer la peau avec une tondeuse de la plaie (figure 3N).
  26. Passez à l'étape 10 de l'autre côté si nécessaire.
  27. Identifier le destinataire (boucle d'oreille, tatouage doigt ...), le déplacer vers sa cage (placé sur une scène chaude) et observer jusqu'à ce qu'il récupère de l'anesthésie (conscient et maintenir décubitus sternal).
  28. Annoter les incidences possibles survenant pendant le transfert d'embryons et d'ajouter des antibiotiques à l'eau potable. Un 0,5-1 ml injection sous-cutanée de sali chaudsolution ne améliore la récupération.
  29. Clips plaies peuvent être retirés 10 jours après le transfert d'embryon avec un dissolvant plaie de coupe ou deux paires de pinces (Figure 3O). Le destinataire peut être pesé ce jour pour évaluer la grossesse et estimer le nombre de chiots. Fournir du matériel niché au destinataire 15 jours après le transfert d'embryon.

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Representative Results

Transfert d'embryons utéro-tubaire fournit un moyen de transférer les embryons dans l'utérus d'éviter certaines des complications associées au transfert d'embryon de l'utérus 2,9,10. Dans le tableau 1, nous montrons un résultat représentatif, nous avons obtenu le transfert de blastocystes CD1 soumis à différents types de manipulations aux bénéficiaires CD1 suivant le protocole décrit. La survie à long terme (% des embryons résultant en un chiot) ou la survie à E15 (dans le cas des lentivirus exposée) est similaire entre les embryons simplement de culture in vitro de la phase de zygote (IVC), les embryons soumis à injection iPSC pour générer chiots chimères et les embryons qui ont eu leur zona enlevé et ont été exposés à lentivirus pendant 7 heures avant le transfert d'embryon. Par conséquent, le transfert de l'embryon in utero-tubaire est une technique fiable pour transférer les embryons particulièrement complexes tels que ceux qui n'ont pas pellucide zona et incubées avec des lentivirus.


Figure 1. Injection d'anesthésiques et des analgésiques. A) L'injection intrapéritonéale de kétamine-xylazine. B) d'injection sous-cutanée de la buprénorphine. C) Application de pommade ophtalmique.

Figure 2
Figure 2. . Protocole vasectomie A) le point d'incision (représenté avec un "X" rouge) est placé à environ 1 cm au-dessus du pénis; enlever la fourrure de 0,5 à 2,5 cm au-dessus du pénis (lignes noires) B) incision de la peau C) Muscle d'incision... déférent D) Vas (flèche noire) et essaiest (*). E) flamboyant de la pince pour la cautérisation. F) La cautérisation des canaux déférents à deux points à la fois. déférent G) Vas clairement séparés en deux extrémités cautérisation. H) Muscle suture. I) suture de la peau. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 3
Figure 3. Utéro-tubaire protocole de transfert d'embryons A, B) vue dorsale et latérale du point d'incision (représenté avec un "X" rouge);. Lignes noires entre la dernière côte et les hanches (A, B) et entre dos et l'abdomen (B) servir de guide C) de l'incision de la peau.. E) pipette en verre de la manipulation d'embryons chargé avec 5 blastocystes prêts à être transférés. F, G) ovaires représentatifs avec (F) ou sans (G) corps jaunes, indiquée par des flèches noires. HK) Aux fins de représentation , une simulation de transfert d'embryons utéro-tubaire a été effectué le chargement d'une pipette de manipulation de verre avec une solution de bleu de 0,4% de trypan. H) à la perforation de l'oviducte (flèche noire) près de l'utérus (*). I) Introduction de la pipette de la manipulation des embryons dans l'orifice effectué précédemment. J) La pipette de manipulation de l'embryon avance à travers la jonction utéro-tubaire. K) Un volume de solution de bleu trypan équivalent à celui publié en un transfert d'embryon a été expulsé dans la lumière utérine (flèche noire). L) Pour tester la fermeture efficace produite par la jonction utéro-tubaire, tous lescontenu de la pipette de manipulation a été libéré dans l'utérus; utéro-tubaire jonction (flèche) empêche l'écoulement de retour de la solution de bleu trypan libéré dans l'utérus (*) de l'enlèvement M) Muscle suture N) suture de la peau O) Clip.... P) 15 jours après le transfert d'embryon fournir du matériel niché au destinataire. Q) de la litière chimère obtenue suite à cette technique. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Traitement Nombre de transferts Embryons transférés Chiots livrés Survie à term (%)
IVC 11 110 82 74,5
injection iPSC 3 50 35 70,0
Lentivirus 6 60 44 73,3

Tableau 1. Les résultats représentatifs obtenus après transfert de trois différents groupes d'embryons manipulés suivant le transfert d'embryons utéro-tubaire. 1) Les embryons cultivés in vitro (IVC) à partir du stade zygote au stade de blastocyste, 2) Dans les blastocystes in vivo produit une injection de 10 mouse COPSi pour générer des souris chimériques, 3) produites in vivo des blastocystes qui ont eu leur zona retiré et ont été incubées pendant 7 heures avec un lentivirus exprimant la GFP. Les données représentent le nombre de petits nés sur le nombre d'embryons transférés, sauf pour le groupe de lentivirus exposée, où ils représentent le nombre de fœtus viables 10 jours après le transfert d'embryons, la gestation a été comme pas permis de progresser encore.

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Discussion

La vasectomie est une technique chirurgicale relativement simple qui ne comporte pas de difficultés majeures. Quand la stérilisation avec de la povidone iode et de l'éthanol assurez-vous que le dernier lavage (avec de l'éthanol) supprime povidone iode, car il peut irriter le péritoine. L'accès au canal déférent peut également être obtenue par le scrotum ou la réalisation d'une incision transversale dans l'abdomen 8. Incision scrotale a été recommandé de transversales incision abdominale en raison de la relativement petite incision nécessaire et un peu mieux le comportement post-opératoire 11. Cependant, nous préférons l'incision abdominale sur le scrotum, car il fournit un accès plus facile et plus clair pour les canaux déférents des deux testicules, empêchant chirurgiens novices de cautériser deux fois les mêmes canaux déférents et laissant vas fonctionnels déférent. Entre les deux techniques abdominaux, nous privilégions l'incision longitudinale dans la ligne blanche sur le Transversal, car il ne coupe pas la fibre musculaire abdominale, éviter le développement de hernies abdominales. Cependant, tant la vasectomie et les protocoles de transfert de l'embryon in utero-tubaire peuvent être adaptés à l'équipement disponible ou aux goûts personnels du chercheur. Par exemple, un stérilisateur à billes de verre peut être utilisée pour chauffer les pinces utilisées pour cautériser le canal déférent. Dans tous les cas, il est essentiel de suivre une technique aseptique, de fournir l'anesthésie et l'analgésie appropriée afin de maximiser le bien-être des animaux, et de se conformer à la réglementation locale.

Un autre aspect susceptible de modifications est le protocole de l'anesthésie. Si une anesthésie par inhalation (isoflurane) est disponible, nous encourageons son utilisation au lieu d'parentérale (injectable) l'anesthésie, car il fournit un plan d'anesthésie très stable et une récupération rapide. Cependant, il est important de préciser que l'anesthésie par inhalation nécessite encore l'utilisation d'un analgésique pour la douleur intra-et post-opératoire, qui devrait être adminisSTERED avant la chirurgie comme une prémédication. La buprénorphine est un opioïde qui fournissent une analgésie à long terme chez la souris 12. Anesthésie parentérale fournit également un bon plan anesthésique pour interventions de courte durée telles que la vasectomie et le transfert d'embryons. La kétamine-xylazine est une combinaison très fiable pour la chirurgie de la souris 13 et nous n'avons jamais observé de complications anesthésiques utilisant cette combinaison en conjonction avec une prémédication par buprénorphine. D'autres combinaisons parentérale peuvent être utilisés 12, mais nous découragent l'utilisation du mélange stupéfiant Avertin (tribromoéthanol), comme une seule dose peut être administrer et plusieurs articles ont rapporté des complications diverses liées à son utilisation tels que l'irritation locale, pauvres analgésie, iléus , adhérences fibreuses dans la cavité abdominale, la nécrose des fibres musculaires sous-péritonéal et les organes abdominaux de surface, et même de mortalité 14-18.

Le transfert d'embryons exige une bonne gestion des deux embryons und destinataire. En règle générale pour le transfert de l'embryon de mammifère, le stade de développement des embryons peut être plus avancé que le stade pseudogestation du destinataire, mais pas le contraire. En d'autres termes, les embryons peuvent attendre pour la mère, mais la mère ne peuvent pas attendre pour les embryons, si cette technique peut être utilisée pour transférer morula ou blastocyste, mais pas les étapes précédentes. Transfert d'embryons utéro-tubaire peut être effectuée deux jours après la détection du bouchon vaginal de midi (2,5 dpc) au soir-nuit (3 DPC), lorsque la jonction utéro-tubaire est ouverte pour permettre le passage naturel des embryons de l'oviducte à cornes utérines. Considérant que les embryons transférés peuvent avoir déjà souffert d'une sorte de manipulation, manipulation des embryons doit minimiser tout dommage supplémentaire. Un excellent guide pour la manipulation d'embryon de souris peut être trouvée dans Nagy et al. 8 Les deux milieux de manipulation d'embryons les plus couramment utilisés de souris, qui maintiennent un pH physiologique dans régulière à laatmosphère, sont CZBH 19 et 20 M2. Bien que in vivo les embryons de souris peuvent surmonter l'exposition au froid ou pH anormal pendant de longues périodes de 21, les médias de manipulation doivent être préchauffé. Si le support est préchauffé dans une boîte de culture, évitez de chauffer pendant de longues périodes (plus de 40 min), comme l'osmolarité des médias va augmenter en raison de l'évaporation de l'eau et qui peut être plus dommageable que les médias de manipulation froid. De même, le temps que les embryons ont passé à l'intérieur de la pipette de manipulation doit être réduite au minimum en raison du faible volume présente dans la pipette.

L'utilisation d'une pipette appropriée de la manipulation de l'embryon est cruciale pour la réussite du protocole. pipettes de manipulation peuvent être fabriqués à partir de capillaires en verre avec un mur de verre mince. pipettes Pasteur, souvent utilisés pour traiter de grandes embryons animaux, peuvent aussi être utilisés, mais en raison de sa distance de la poignée à la pointe, pipettes de manipulation fabriqués à partir de capillaires en verre sont plus confortable à manœuvrer. L'exposition à la flamme et la vitesse de traction de déterminer l'épaisseur de paroi et le diamètre intérieur de la pipette. Bien que les pipettes de manipulation peut être facilement fait à la main après un peu de pratique, extracteur et micro-forge peuvent également être utilisés. Il est important d'investir du temps dans la production de plusieurs pipettes de manipulation optimales. L'ouverture de la pipette de manipulation doit être plus large que d'un embryon pour permettre une bonne circulation, mais assez petites pour pénétrer facilement et progresser à travers la jonction utéro-tubaire. Si la zone pellucide a été éliminée avant le transfert, les blastocystes dilatent généralement à un diamètre plus grand. Dans ce cas, il est conseillé de faire pipettes plus larges avec une ouverture plus grande (130-180 pm) pour éviter tout dommage aux cellules du trophectoderme. Astuce polonais est important pour éviter d'endommager l'oviducte, paroi utérine et l'embryon - surtout si zona a été supprimé, et pour éviter la pointe de la pipette d'être bloqué par des débris. Cependant, après le polissage, l'ouverture devrait not est trop faible par rapport au diamètre intérieur de la pipette, comme une forte diminution de diamètre conduit à des changements brusques de la vitesse d'écoulement. Le bec d'aspiration permet un contrôle plus précis de l'écoulement ainsi qu'une position de la main plus confortable par rapport aux dispositifs à commande manuelle. Néanmoins, un dispositif à commande manuelle peut être utilisée si nécessaire (par exemple lors de la manipulation des embryons de lentivirus traités). Pour un débit optimal et d'éviter le transfert de l'huile minérale, il est également conseillé d'utiliser une nouvelle pipette pour le transfert de l'embryon à la place de celui qui est utilisé pour déplacer les embryons de milieux de culture pour les médias de manipulation. Enfin, alors que l'introduction de la pipette par l'oviducte, le capillaire doit être manipulé directement, soit. saisissant le verre et non le manche en plastique de l'aspirateur, pour obtenir une prise ferme. Le grossissement utilisé pour le transfert d'embryons est une question personnelle qui dépend de l'acuité visuelle de l'opérateur. Nous préférons utiliser un faible grossissement d'avoir un large champ visuel,nous utilisons donc un grossissement 10X finale (10X oculaire et objectif 1X).

Les bénéficiaires doivent être âgés d'au moins 8 semaines et pèsent entre 27-40 g. Outbreed souris tels que CD1 ou suisse Webster affichent un bon comportement maternel et sont d'excellents receveurs. Il est conseillé de mettre en place l'élevage pour obtenir bénéficiaires supplémentaires, comme ceux qui n'ont pas utilisé de récupérer son activité cycliste normale dans deux semaines. En dépit d'être accouplés, certaines femmes peuvent ne pas avoir de corps jaunes (figure 3G) et ne seront donc pas être à l'écoute des embryons transférés. Pour cette raison, les ovaires doivent être vérifiés pour la présence de corps jaunes, qui à 2,5 dpc peut être clairement identifié comme structures rouge vif dans l'ovaire (figure 3F). Au cours de la chirurgie, il est important de minimiser le contact avec l'appareil reproducteur en saisissant tampon adipeux au lieu de l'ovaire; manipulation excessive de l'ovaire et de l'utérus peut entraîner une lutéolyse. L'introduction de la manipulation pipette dans l'oviducte est l'étape la plus compliquée du protocole. Dans certains bénéficiaires, l'oviducte est très tordu et il n'y a pas 2 mm ligne droite de la jonction avec l'utérus. Dans ce cas organiser l'oviducte et effectuer la ponction dans le premier virage. Comme détaillé ci-dessus, une belle pipette de manipulation fait vraiment une différence. Une fois que la pipette est passée à travers la jonction utéro-tubaire, elle glisse facilement. Si ce n'est pas, la pipette peut avoir dévié de l'oviducte et pas atteint la lumière utérine. Une fois à l'intérieur de l'utérus, si les médias ne coule pas, déplacez la pipette légèrement hors ou en et essayez à nouveau. Si elle ne coule toujours pas, la pipette est bouché, le sortir de l'utérus, divulguer le contenu dans le plat avec les médias de manipulation et recharger le même ou un autre pipette. La livraison prend habituellement 17 jours après le transfert d'embryon. Pour éviter le cannibalisme, fournir du matériel nichée 2 jours à l'avance et ne pas changer la cage pendant les premiers jours après l'accouchement.

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Disclosures

Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par des fonds du ministère des animaux et aviaires Sciences de BT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine VEDCO Ketaved ANADA 200-257 To be ordered by a licensed veterinarian.
Xylazine Lloyd Laboratories Anased NADA #139-236 To be ordered by a licensed veterinarian.
Buprenorphine Generic NDC 400-42-010-01 To be ordered by a licensed veterinarian.
Eye ointment Novartis Genteal
Antibiotic Pfizer Clavamox NADA #55-101. Added to drinking water (0.3 mg/ml of amoxicillin trihydrate and 0.075 mg/ml of clavulanate potassium). Add 1.5 ml of the reconstituted 15 ml bottle to 250 ml of water.
Dressing serrated forceps ROBOZ RS-8120 Any medium size surgical-grade steel straight forceps will work.
Microdissecting serrated forceps ROBOZ RS-5137 These ones are curved at a 90º angle. Straight forceps can be used if preferred.
Slight curved micro dissection forceps ROBOZ RS-5136 This model is particularly useful to hold the oviduct.
Scissors ROBOZ RS-5880 Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
27 G needles Beckton-Dickinson 305136 Smaller needles (30 G) can be also used. 25 G may be a bit too big.
Clip applier MiKRon 42763
9 mm Clips MiKRon 427631
Clip remover MiKRon 7637 Two pairs of teeth forceps (ROBOZ RS-8160) can be used instead.
Suture needle holder ROBOZ RS-7820
Suture Dowist Gell 5-0 Dexon S 7204-21 Can be substituted for any 4-0 to 6-0 absorbable suture with a narrow curved needle.
Glass capillaries VWR 100 ul calibrated pipettes 53432-921 It includes a mouth aspirator system that only requires to attach a 0.22 µm filter in the tubing to be ready to use. More information can be obtained in Nagy et al.8
Burner KISAG AG Typ 2002 Gas operated burner, can be charged with Kigas (CH-4512, from the same vendor). Alcohol burners may be also used, but gas provides a higher temperature and this burner provides a small and precise flame.
Stereomicroscope Leica MZFLIII This is an expensive estereomicroscope with fluorescence, that can be also used for other purposes. There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. It is better to use two stereomicroscopes, one for handling the embryos (which does not need to be a very nice one) and another one for the recipient. The one used for the recipient should display a long distance from the stage plate to the objective lense, in order to be able to focus 3-4 cm above the stage plate (where the oviduct will be placed) and still leave some room for the surgeon; most of the stereomicroscopes can do this, but some cannot. 
Fiber optics ilumination Dolan Jenner Fiber lite To iluminate the surgical area. There are different systems available.
Warm stages American scope http://store.amscope.com/tcs-100.html These can be placed over the stage plate of the stereomicroscope. Some modifications (inserting a stick to level the stage) may be needed if it is too short for the stereomicroscope. A big warm stage can be used for warming the cage if it is available. If not, a regular heating pad can be used, but temperature must be checked.
Culture dishes for embryo manipulation Falcon 353001 351008 may be also used; they made narrower drops.

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References

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